Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование травы репейничка волосистого

На правах рукописи

mmL

Ханина Марина Георгиевна

Фармакогностическое исследование травы репейничка волосистого (Agrimonia pilosa Ledeb.)

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 л о;_Ь 7013

Самара-2013

005049571

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Белоусов Михаил Валерьевич

Официальные оппоненты:

Халиуллин Феркат Адельзяпович - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, заведующий кафедрой

Денисенко Олег Николаевич - доктор фармацевтических наук, профессор, Пятигорский филиал Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармации факультета последипломного образования, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «¿V » 201-3 г. в ■/¿>со часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Автореферат разослан « ¿Оу> Л-ис ¿-/>-¿-2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, л

кандидат фармацевтических наук, доцент Ирина Константиновна Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время одной из приоритетных задач отечественного здравоохранения является расширение ассортимента используемых лекарственных средств за счет внедрения в медицинскую практику новых препаратов растительного происхождения (Киселева Т.Л. и др., 2010; Самылина И.А. и др. 2008). В рамках региональной программы "Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока" и комплексной целевой программы СО РАМН "Здоровье человека в Сибири" предусмотрены комплексные фармакогностпческие исследования, включающие изучение химического состава лекарственных растений, выделение и идентификацию биологически активных соединений и изучение фармакологических свойств перспективных видов.

К числу перспективных лекарственных растений относится репейничек волосистый (Agrimonia pilosa Ledeb., Rosaceae) - многолетнее травянистое растение, широко распространенное на территории Сибири. Данное растение применяется в народной и традиционной медицине при различных заболеваниях, но наиболее часто при заболеваниях печени (Растительные ресурсы СССР, 1987; Растительные ресурсы России, 2009). Растения рода репейничек (Agrimonia L.) включены в Британскую Травяную Фармакопею и применяются в качестве противовоспалительного и вяжущего средства (British Herbal Pharmacopoeia, 1996). Биологическая активность Agrimonia pilosa подтверждена экспериментальными исследованиями. В частности установлено, что данный вид обладает стимулирующей (Неграш А.К., 1984), гастропротективной, кардиотонической, диуретической, натрийуретической, антикоагулянтной, тромболитической, антифунгалыюй, цитотоксической (на клетках линии MV12), антимутагенной, антиоксидантной (Брюханов В.М., 1989; Не С., 2009), сосудорасширяющей (Hua C.L., 2006), гепатопротекотрной (Park E.-J., 2004; Дудко В.В., 2009), противораковой (Murayama Т., 1992), иммуномодулируюшей (Bukovsky М., 1994), антибактериальной (Карташова Г.С., 1998) активностью, улучшает реологические свойства крови (Хапкин И.С., 1994), восстанавливает баланс ионов натрия, кальция и калия, нарушенный в мозге крыс при экспериментальном гепатите (Дудко В.В., 2006). Однако в отечественной официнальной медицине Agrimonia pilosa не применяется. Учитывая широкий ареал Agrimonia pilosa, значительные запасы сырья (надземная часть) н широкий спектр биологической активности считаем целесообразным проведение подробного фармакогностического исследования данного растения для введения его в качестве нового объекта в отечественную фармацевтическую практику.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое исследование надземной части Agrimonia pilosa для обоснования возможности ее использования в качестве источника для разработки новых эффективных лекарственных средств.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение фитохимического анализа надземной части Agrimonia pilosa Ledeb.

2. Установление основных групп биологически активных веществ, разработка методик их количественного определения, проведение исследования динамики накопления действующих веществ в надземной части Agrimonia pilosa Ledeb.

3. Разработка технологической схемы получения экстракта сухого из надземной части Agrimonia pilosa Ledeb.

4. Проведение исследования биологической активности экстракта сухого Agrimonia pilosa Ledeb.

5. Проведение анатомо-морфологических исследований для установления макро- и микроскопических признаков сырья Agrimonia pilosa Ledeb.

6. Проведение товароведческого анализа для установления показателей подлинности и норм качества лекарственного растительного сырья.

7. Обобщение полученных данных и разработка проекта нормативного документа на траву Agrimonia pilosa Ledeb.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное фитохимическое изучение надземной части Agrimonia pilosa Ledeb., заготовленной в разных географических зонах, в результате которого была показана их идентичность по качественному и количественному содержанию флавоноидов, гидроксикоричных кислот, кумаринов, аминокислот, дубильных веществ, полисахаридов, каротиноидов, хлорофиллов. Изучен компонентный и мономерный состав, динамика накопления биологически активных соединений (БАС) в разные фазы вегетации, по морфологическим частям растения и в зависимости от места произрастания.

Микроскопический анализ проведен по морфологическим группам (лист, стебель, соцветия), и впервые установлены микродиагностические признаки сырьевой части Agrimonia pilosa Ledeb.

Изучен компонентный состав соединений фенольного комплекса надземной части Agrimonia pilosa. Впервые установлено наличие хлорогеновой и шронс-коричной кислот, умбеллиферона, скополетина, эскулина, эскулетина.

Исследован состав фракций полисахаридов, и их содержание в надземной части Agrimonia pilosa в зависимости от места произрастания, впервые изучен мономерный состав водорастворимых полисахаридов и установлено наличие арабинозы, ксилозы, маннозы, глюкозы, галактозы, рамнозы, глюкуроновой кислоты.

Исследован компонентный состав и определено содержание суммы аминокислот в надземной части Agrimonia pilosa и экстракте сухом. Впервые установлено присутствие вапина, гистидина, лейцина, метионина, треонина, изо-лейцина, фенилаланина, триптофана, аланина, серина, пролина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина.

Впервые из надземной части Agrimonia pilosa, произрастающего в сибирском регионе, методом перегонки с перегретым водяным паром получено эфирное масло, исследован его компонентный состав, включающий до 36 компонентов, из которых идентифицированы: н-тридекан, н-тетрадекан, н-пентадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-октадекан, неофитодиен, гексагидрофарнезилацетон, н-нонадекан, пальмитиновая кислота, н-эйкозан, н-генейкозан, фитол, н-докозан, н-трикозан, н-тетракозан и установлена их структура.

Проведен анализ динамики содержания химических элементов в надземной части Agrimonia pilosa в зависимости от фазы развития, морфологической части растения и места произрастания. Впервые в траве установлено наличие 50 элементов, в листьях, стеблях, соцветиях - 62 элементов.

Скрининговые исследования противовоспалительной активности экстракта Agrimonia pilosa сухого (ЭР), свидетельствуют о его влиянии на экссудативную и пролиферативную стадии воспалительного процесса.

На различных моделях экспериментальных патологий печени установлены гепатопротективные свойства ЭР, сопоставимые с активностью референтных препаратов сравнения (карсил, дигидрокверцетин).

Практическая значимость. Предложены методики количественного определения суммы флавоноидов, гидроксикоричных кислот, дубильных веществ в траве Agrimonia pilosa Ledeb., которые введены в практику научных исследований и учебного процесса на кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава РФ.

Разработанная методика количественного определения суммы аминокислот в надземной части Agrimonia pilosa Ledeb. может быть использована при анализе других видов растительного сырья. Данные о фотохимическом составе, полученные в результате проведенных исследований, могут быть использованы при целенаправленном создании новых фитопрепаратов из травы Agrimonia pilosa Ledeb., а также для введения растения в официнальную медицину.

Определены сроки и оптимальная фаза вегетации для заготовки сырья.

Полученные в результате исследований цифровые микрофотографии препаратов морфологических частей репейничка волосистого включены в проект НД на сырье. Разработаны критерии, позволяющие установить подлинность сырья - травы Agrimonia pilosa Ledeb., определены показатели его доброкачественности. Результаты работы использованы при разработке проекта ФСП на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Репейничка волосистого трава».

Определены оптимальные технологические параметры получения экстракта Agrimonia pilosa сухого, режим и способ его введения для эффективной гепатопротекции на экспериментальной модели патологии печени.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава РФ по теме «Поиск, изучение, создание и внедрение новых лекарственных средств растительного и синтетического происхождения и организационных форм фармацевтической деятельности» (№ государственной регистрации 01200807420) и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 01.9.2002479).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фитохимического анализа компонентного состава и количественного содержания основных групп БАС травы Agrimonia pilosa Ledeb.

2. Результаты исследований биологической активности экстракта Agrimonia pilosa сухого.

3. Результаты анатомо-морфологического исследования сырья Agrimonia pilosa Ledeb.

4. Результаты определения параметров стандартизации сырья Agrimonia pilosa Ledeb.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

ежегодной конкурс-конференция студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2006, 2007, 2008 гг.); II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007 г.); 62-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007 г.); научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов лекарственного происхождения» (Пермь, 2008 г.); научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета ЯГМА «Современные вопросы теории и практики лекарствоведения» (Ярославль, 2007 г.); 3-го Международного форума (8-й Международной конференции) «Актуальные проблемы современной науки, естественные, биологические науки» (Самара, 2007 г.); Международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых (Черновцы, 2008 г.); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири - развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств», посвященной 300-летию М.В.Ломоносова (Новосибирск, 2011 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 14 научных работах, из которых 7 статей, опубликованных в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК», 7 статей и тезисов докладов в журналах, сборниках и материалах научных конференций регионального, межрегионального и международного уровней.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет (НГМУ)» Минздрава РФ; кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава РФ; кафедре фармакологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава РФ; а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: кафедры фармации ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава РФ, лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава РФ (г. Томск); Института Цитологии и Генетики СО РАН (г. Новосибирск), Центрального Сибирского ботанического сада: лаборатории Гербария (ЦСБС)

СО РАН (г. Новосибирск), ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова» (г. Новосибирск), Сотрудникам данных подразделений и научных учреждений выражаем искреннюю признательность и благодарность. Особую признательность выражаем д.м.н., профессору O.P. Греку, д.м.н., профессору Т.А. Агеевой, д.м.н., профессору C.B. Поздняковой, д.м.н., профессору В.И. Шарапову, с.н.с. Т.Е. Алешиной, к.х.н. И.Н. Азаровой, к.фарм.н., доценту Д.Л. Макаровой.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методам исследований, 4-х глав собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 173 наименований, в т.ч. 37 источников иностранных авторов, и 3-х приложений (1. Проект ФСП на сырье «Репейничка волосистого трава»; 2. Фотографии хроматограмм аминокислот репейничка волосистого; 3. Акт внедрения результатов диссертационных исследований в учебный процесс ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава РФ). Работа содержит 60 таблиц и 63 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Характеристика объектов и методов исследования

Объектами исследования являлись гербаризированные образцы Agrimonia pilosa Ledeb. и образцы свежего, консервированного и воздушно-сухого сырья репейничка волосистого (надземная часть), собранные в различных местах естественного произрастания в период 2005 -2011 гг. на территории Новосибирской, Ярославской областей, Республики Бурятия и Алтайского края.

Обнаружение основных групп БАС, компонентный состав и их количественное содержание определяли с помощью общепринятых в фитохимическом анализе и современных методов исследования, в частности БХ, ТСХ, ВЭЖХ, спектрофотометрии (СФ-56), хромато-спектрофотометрии, дифференциальной спектрофотометрии, хромато-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой, хромато-масс-спектрометрии (Кузнецова, Г.А., 1967, Высочина, Г.И. и др., 1987, Запрометов, М.Н., 1993, Куркин В.А. и др., 2005, Ложкин, A.B. и др., 2006, Корулькин, Д.Ю. и др., 2007).

Обнаружение БАС методом ВЭЖХ проводили на отечественном жидкостном хроматографе «Милихром А - 02» с многоволновым детектором и последующей компьютерной обработкой результатов анализа с помощью программы «МультиХром» для Windows.

Хромато-масс-спектрометрические данные получены на газовом хроматографе Agilent 5890N с квадрупольным масс-селективным детектором (масс-спектрометром) Agilent 5973N EI/PCI. Количественное содержание компонентов эфирных масел вычислялось по площадям газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ проводили путем сравнения линейных индексов удерживания и полных масс-спектров компонентов с соответствующими данными чистых соединений и данными специализированной библиотеки (Ткачев A.B., 2008).

Элементный анализ проводили с применением метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе «ELAN - DRC».

Анатомо-морфологический анализ проводили в соответствии с требованиями общих фармакопейных статей «Методы анализа лекарственного растительного сырья», «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ XI, 1987) на микроскопах «Микмед» при увеличениях от 70 до 600 раз. Микроскопические признаки фиксировали с помощью рисовального аппарата РА-7У и фотографии на микроскопах Axio Vision и Leika при увеличении от 100 до 600 раз с использованием насадок с цифровыми фотоаппаратами. Присутствие различных включений доказывали проведением общепринятых гистохимических реакций (Долгова A.A. и др, 1977, Самылина И.А. и др., 2010).

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI, XII. При разработке проекта ФСП на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества ЛС. Основные положения».

Исследования биологической активности выполнены на белых беспородных мышах-самцах массой тела 18-22 г. и крысах-самцах массой тела 180-200 г.

Экспериментальные исследования и все манипуляции с лабораторными животными выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» (1987), с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001) и «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Министерством здравоохранения РФ.

Исследование острой токсичности (LD50) экстракта Agrimonia pilosa сухого (ЭР) проводили на 30 беспородных белых мышах-самцах средней массой 18-20 г. Экстракт вводили однократно в желудок через зонд в виде водного раствора в дозах от 1000 до 5000 мг/кг. Проводили необходимые наблюдения в течение 14 дней. По результатам эксперимента определяли класс опасности исследуемого объекта.

Противовоспалительные свойства ЭР исследовали согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ»:

А). Острое асептическое воспаление изучали на модели «карраген»нового отёка».

Б). Пролифератнвное хроническое воспаление исследовали на модели «ватной гранулемы».

Гепатопротекторную активность ЭР исследовали:

А). На модели экспериментального токсического гепатита, индуцированного парацетамолом. Исследовали показатели белкового обмена, билирубина, мочевины, активности аланннамшютрансферазы (АЛТ) и матриксных металлопротеиназ (ММП-2,7) в сыворотке крови крыс. Препарат сравнения - карсил ("Sophamia"). Содержание белковых фракций в сыворотке крови крыс оценивали методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках. Содержание общего белка определяли биуретовым методом. Концентрацию общего и прямого билирубина, мочевины и активность АлТ определяли с использованием наборов (PLIVA-Lachema Diagnosticum, Чехия), активность ММП-2,7 - по методу Nagase et al. с использованием флуоресцентного субстрата (Calbiochem, США).

Б). При повреждении печени полихимиотерапией (ПХТ). Цнтотоксическую модель создавали однократным введением животным внутрибрюшпнно комплекса противоопухолевых препаратов в дозах равных 1/5 ЛД5() (цнклофосфан («ЛЭНС-Фарм», Москва) - 50 мг/кг, доксорубиции («ЛЭНС-Фарм», Москва) - 4 мг/кт, винкристин («ЛЭНС-Фарм», Москва) - 0,1 мг/кг и преднизолон («Никомед», Норвегия) - 5 мг/кг массы тела). Опытным животным вводили ЭР и препарат сравнения дигидрокверцетнн в дозе по 100 мг/кг и 50 мг/кг соответственно, до и после проведения ПХТ.

Для морфологического исследования забирхпи печень экспериментальных животных. Гистологические препараты изучали на световом микроскопе Axioimager Al ("ZEISS", Германия). При морфометрическом исследовании печени подсчптывхти объемные плотности (Vv, %) нормальных гепатоцитов, дистрофически измененных гепатоцитов, некрозов паренхимы печени, суммарных альтератнвных изменений, а также численную плотность двуядерных гепатоцитов (Nai).

При обработке результатов экспериментов использовали методы математической статистики. В частности использовали программы Gel-Pro Analyzer 4.0 и VideoTes Morphology 5. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ статистической обработки данных Statistica MS Excel, OriginPro 7.5. Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стыодента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Фитохимнческое исследование травы Agrimonia pilosa Ledeb.

В надземной части Agrimonia pilosa присутствуют полисахариды, полифенольные окисляемые соединения (дубильные вещества преимущественно гидролизуемой группы), флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, кумарины, аскорбиновая кислота, аминокислоты, каротиноиды, сапонины. Отсутствуют алкалоиды, антраценпроизводные, сердечные гликозиды.

Анализ хроматографических (БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ-МС) данных водного, хлороформного извлечений и извлечений, полученных на 20%, 40% и 70% этаноле, показал, что в траве Agrimonia pilosa содержится не менее 29 фенольных соединений, из них идентифицированы 11 соединений (4 флавоноида - рутин, кверцетин, кверцетина рамнозид, апигенин, 4 кумарина -эскулетин, эскулин, умбеллиферон и скополетин, 3 гидроксикоричных кислоты - кофейная, хлорогеновая и транс-коричная) (табл.1).

Таблица 1

Результаты анализа компонентного состава основных групп БАВ

Группа БАС Трава Acrimonia pilosa

Гидроксикоричные кислоты Хлорогеновая, кофейная, транс-коричная кислоты

Фенол карбоновые кислоты Галловая кислота

Флавоноиды Рутин, кверцетин и кверцетина рамнозид, апигенин

Кумарины Умбеллиферон, скополетин, эскулин, эскулетин

Полифенольные окисляемые соединения Преимущественно гидролизуемой группы

Аминокислоты Валин, гистидин, лейцин, метионин, треонин, изо-лейцин, фенилаланин, триптофан, аланин, серин, пролин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин

Полисахариды Слизи, пектины, гемицеллюлоза А, гемицеллюлоза В

Сахара (мономерный состав) Глюкоза, галактоза, арабиноза, манноза, рамноза, ксилоза

Хлорофиллы Хлорофилл а

Химические элементы 62 элемента

Эфирное масло н-Тридекан, н-тетрадекан, н-пентадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-октадекан, неофитодиен, гексагидрофарнезилацетон, н-нонадекан, пальмитиновая кислота, н-эйкозан, н-генейкозан, фитол, н-докозан, н-трикозан, н-тетракозан

Каротиноиды Р-Каротин

При сравнительном анализе хроматограмм исследуемых образцов выявлено, что вещество, идентифицированное как кислота хлорогеновая, является преобладающим в сумме гидроксикоричных кислот надземной части Agrimonia pilosa. Присутствие хлорогеновой кислоты подтверждено ВЭЖ-хроматографией (Рис.1).

І'ис. 1. ВЭЖ-хроматограмма суммарного извлечения из надземной части Agrimonia pilosa Ledeb.

При хроматографическом исследовании флавоноидов Agrimonia pilosa идентифицированы: рутин, кверцетин, кверцитрин, апигенин.

Из результатов ВЭЖХ суммарного извлечения из травы Agrimonia pilosa (рис. I) следует, что рутин является доминирующим компонентом в сумме флавоноидов.

При хроматографическом исследовании компонентного состава суммы кумаринов травы Agrimonia pilosa идентифицировано 4 вещества (табл.1), из которых умбеллиферон является преобладающим. Данный факт подтверждается при сравнении спектров поглощения суммарного извлечения из травы Agrimonia pilosa, очищенного от сопутствующих веществ и СОВС умбеллиферона (рис. 2).

Рис. 3. Очищенная сумма кумаринов из надземной части Agrimonia pilosa (в 96% спирте этиловом в УФ-свете)

Длина волны, нн

I ' 1 ' 1 I 1 1 ' ' I 1 1 1 1 I 1 ' 1 ' I

200 230 300 350 400

Рис.2. Электронный спектр поглощения суммарного извлечения из травы Agrimonia pilosa (2) и СОВС умбеллиферона (I) (тах ).=326 нм)

2.2. Количественное содержание групп БАС фенольной природы

На основании полученных результатов (табл. 2) подобраны оптимальные условия для определения количественного содержания флавоноидов, гидроксикоричных кислот и кумаринов.

Таблица 2

Результаты определения влияния условий экстракции на выход флавоноидов, кумаринов и гидроксикоричных кислот из травы Agrimonia pilosa Ledeb. (M±m; n=3)

Условия Содержание суммы Содержание суммы Содержание суммы

экстракции флавоноидов гидроксикоричных кислот кумаринов

(в пересчете на рутин, %) (в пересчете на хлорогеновую (в пересчете на

кислоту, %) умбеллиферон, %)

Экстрагент

96% этанол 1,19 ±0,02 0,80 ±0,01 0,53 ±0,04

70% этанол 2,30 ±0,01 1,51 ±0,03 1,16 ± 0,02

40% этанол 3, 45 ± 0,03 2,27 ± 0,01 1,42 ±0,01

20% этанол 2, 19± 0,01 1,97 ±0,02 1,13 ±0,03

Вода очищенная 1,81 ±0.04 1,67 ± 0,02 1,01 ±0,01

Размер частиц сырья, мм

7 1,84±0.05 1,93±0.06 1,27±0,01

5 1,92±0,04 1,66±0,10 1,09±0,5

3 1,95±0,05 1,51 ±0,04 1,04 ±0,1

1 2,15±0.06 1,46±0,05 0,97±0,01

0.5 3,48±0,05 2,37±0,07 1,50±0,03

Соотношение сырья и экстрагента

1 20 2,09± 0.03 1,51 ±0,02 1.07± 0,01

1 30 2,15± 0,01 1,66±0,03 1,09± 0,02

1 40 2,47± 0,02 1,78±0,01 1,17± 0,03

1 50 2,90± 0.03 2,11± 0,02 1,19± 0,01

1 60 3,50± 0,01 2,40± 0,02 1,45± 0,04

1 70 3,51± 0,02 2,41 ±0,03 1,48±0,02

1 80 3,54± 0,03 2,44± 0.01 1,49± 0,01

Для анализа содержания флавоноидов использовались различные варианты методики спектрофотометрии: прямой вариант анализа, вариант с очисткой от сопутствующих веществ с помощью хроматографии на бумаге (с рабочей длиной волны 361 нм) и дифференциальной спектрофотометрии (после реакции комплексообразования с AICI,) с рабочей длиной волны -410 нм, являющейся общей для спиртового извлечения Agrimonia pilosa и доминирующего флавоноида рутина.

Содержание гидроксикоричных кислот определяли с использованием прямого варианта методики спектрофотометрии (с хроматографической очисткой от сопутствующих веществ И без нее).

Для определения содержания кумаринов использовали прямой вариант методики спектрофотометрии после очистки суммарного извлечения от сопутствующих веществ (рис. 3).

Определение содержания дубильных веществ (полифенольных окисляемых веществ) в образцах надземной части Agrimonia pilosa, собранных в фазу цветения, проводили двумя методами: прямой спектрофотометрией в пересчете на танин и титриметрически (ГФ XI) (табл.3).

Таблица 3

Содержание основных групп БАС фенолыюй природы в траве Agrimonia pilosa Ledeb. _(в % от абсолютно сухого сырья) (М±т; п=3) _

Исследуемые образцы Содержание кумаринов*** Содержание флавоноидов* Содержание гидроксикоричных кислот*** Содержание полифенольных окисляемых веществ**

1. 1,22±0,03 2,24±0,05 2.06±0.03 -

2. 1,25±0,02 2.86±0,02 2,16±0,02 -

3. 1,31 ±0,02 2,82±0,03 2,30±0,01 -

4. 1,43±0,02 3,56±0,01 2,42±0,01 13,6±0,02

5. 1,24±0,01 2,50±0,01 2,31 ±0,03 -

6. 2,35±0.03 4,70±0,01 3,47±0,02 21,6±0,02

7. 0,61 ±0,01 1,01 ±0,02 0,91 ±0,01 3,4±0,02

8. 2,10±0,01 3,56±0,02 3,05±0,01 7,8±0,02

0. 1,25±0,03 2.66±0,01 2,30±0,01 14.5±0,02

10. 1,60±0.02 3,45±0,02 2,86±0,02 9,7±0,02

11. 1,67±0,03 3,42±0,03 2,80±0,03 13,8±0,02

Примечание: * дифференциальный вариант СФ метола, ** метол тнтриметрин; *** прямой вариант СФ метола. Обозначения: I -трава, фай прорастания, Новосибирская область (НСО), 2 - трава, фаза вегетации, 3 - трава, фаза бутонизации, 4 - трава, фаза цветения, ИСО, 5 - трава, фаза плодоношения, НСО; 6 - листья, фаза цветения, НСО, 7 - стебли, фаза цветения, НСО, 8 - соцветия, фаза цветения, НСО; 9 - трава, фаза цветения. Ярославская область; 10 - трава, фаза цветения, Респ. Бурятия; 11 - трава, фаза цветения, Алтайский край.

Проведенные исследования позволили установить: а) сырьевую часть (вся надземная часть), б) фазу заготовки (фаза цветения) и в) ареал произрастания Agrimonia pilosa, пригодного для заготовки сырья (Сибирский регион и Европейская часть России).

2.3. Анализ аминокислот

При хроматографическом исследовании суммарных извлечений из образцов надземной Agrimonia pilosa, собранных в фазе цветения, установлено наличие 15 аминокислот, которые были идентифицированы в сравнении с СОВС аминокислот по хроматографическому поведению (бумага FN6, системы растворителей - БУВ (4:1:5), БДЭУВ (9:6:3:1), хромогенный реактив - 0,2% спиртовый раствор нингидрина). Идентифицированные аминокислоты: валин, гистидин, лейцин, метионин, треонин, изо-лейцнн, фенилаланин, триптофан, апанин, серии, пролин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин.

Содержание аминокислот в надземной части и экстракте Agrimonia pilosa сухом определяли в пересчете на преобладающую аминокислоту - гистидин (рис. 4, 5).

Рис.4. Спектры поглощения продуктов реакции Рис.5. Спектр поглощения продукта реакции СОВС гистидина, аминокислот надземной части СОВС гистидина с 0,2% спиртовым раствором и экстракта Agrimonia pilosa сухого с 0,2% нингидрина

спиртовым раствором нингидрина

Установлено, что сумма аминокислот в надземной части и в экстракте Agrimonia pilosa сухом составляет 1,04% и 2,28% соответственно.

2.4. Анализ эфирного масла

Эфирное масло из воздушно-сухого сырья экстрагировали перегретым водяным паром. Время перегонки составило 6 ч. Надземная часть Agrimonia pilosa в фазе цветения содержит от 0,05 до 0,1% эфирного масла. Образцы эфирного масла при комнатной температуре (20 °С) представляют собой густую массу светло-желтого цвета, без запаха.

Эфирное масло образца Agrimonia pilosa, собранного в НСО содержит 36 компонентов (рис.6), из которых идентифицировано 16 веществ.

J_Ul

jjji-j

i/"

Рис.6. Хроматограмма эфирного масла Agrimonia pilosa Ledeb.*

Примечание * Надземная часть, фаза цветения, НСО, Колыванский р-он, Кудряшовский бор

Идентифицированными компонентами являются: н-тридекан, н-тетрадекан, н-пентадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-октадекан, неофитодиен, гексагидрофарнезилацетон, н-нонадекан, пальмитиновая кислота, н-эйкозан, н-генейкозан, фитол, н-докозан, н-трикозан, н-тетракозан (масс-спектры некоторых компонентов приведены на рис. 7-Ю).

М(Ю СыНзо 198 742 000029-59-4 teiradecaiie, п-

" ти/-

Рис.7. Масс-спектр соединения со временем удерживания 22,78 (н-тетрадекан)

2000 СА 282 745 000112-95-8 CÍCOS8DC, n-

І і

ЯЮ 150

• m/г

Рис. 9. Масс-спектр соединения со временем удерживания 39,13 (н-эйкозан)

1846 СщіІзоО 2С8 492 U00SU5-G9-2 lirxahvdrofanipsyl acfitonc

гШЇ ? s*

-> m/г

Рис.8. Масс-спектр соединения со временем удерживания 35,36 (гексагидрофарнезилацетон)

2100 СазН+ї ¿08 75« (HW62ÍMM-7

Ihüií-Í'-i.suiii'. г.- J

'-'Г !•'.". th'j . . . —-> mi:

0 ад iuO і'-" «0 **>

Рис.10. Масс-спектр соединения со временем удерживания 41,43 (н-гснейкозан)

Сравнительный анализ компонентного состава образцов эфирного масла, полученных из образцов надземной части Agrimonia pilosa, собранных из разных точек ареала показал, что эколого-географический фактор в пределах Сибирского региона не оказывает значительного влияния на состав компонентов, однако наблюдаются различия в их соотношениях.

2.5. Анализ полисахаридов

В надземной части Agrimonia pilosa исследована динамика содержания фракций полисахаридного комплекса (ПСК) в зависимости от морфологической части растения и места произрастания (табл. 4). Содержание ВРПС и ПВ (в сумме) в надземной части Agrimonia pilosa составляет от 10% (НСО, Ярославская область), до 15% (Республика Бурятия). При анализе распределения полисахаридов по морфологическим частям растения, то наибольшее их содержание установлено для соцветий -16,6%, в листьях их 14%, в стеблях - 8% (табл. 4).

Таблица 4

Содержание фракций ПСК в надземной части Agrimonia pilosa Ledeb. в зависимости

от морфологической части растения н места произрастания (М±ш; п=3)

Исследуемые образцы №№ Фракции полисахаридов

Водорастворимые полисахариды (ВРПС) Пектины (ПВ) Гемицеллюлоза А Гемицеллюлоза В

1. 2,2±0,1 9,9±0,5 22,6±0,5 15,0±0,4

2. 2,4±0,1 12,5±0,4 25,1 ±0,4 20,6±0,2

3. 2,9±0,2 6,3±0,3 28,3±0,5 14,2±0,3

4. 3,5±0,4 7,5±0,5 10,9±0,3 4,9±0,1

5. 4,6±0,3 9,5±0,4 . 10,9±0,2 4,6±0,3

6. 1,9±0,2 6,8±0,2 9,2±0,2 4,8±0,5

7. 6,1 ±0,4 10,5±0,4 12,9±0,4 4,8±0,4

Обозначения: №№ исследуемых образцов 1 - трава, фаза цветения. Новосибирская обл.; 2. - трава, фаза цветения, Респ. Бурятия; 3 - трава, фаза цветения. Ярославская обл.; 4 - трава, фаза цветения, НСО; 5 -листья, фаза цветения, НСО; 6 - стебли, фаза цветения, НСО; 7 - соцветия, фаза цветения, НСО.

Природные ПС обладают широким спектром биологической активности, обусловленным особенностями их структуры. Для предварительного прогнозирования структурных типов полисахаридов Agrimonia pilosa проведено исследование компонентного состава мономеров и их количественных соотношений после предварительного гидролиза кислотой трифторуксусной с последующей их дериватизацией.

В результате сравнительного ГХ-МС анализа исследуемых образцов и производных стандартных моносахаров были идентифицированы 7 мономерных компонентов, установлено их количественное содержание (рис. 15 - 20, табл. 5).

Таблица 5

Количественное содержание углеводов в исследуемых образцах Agrimonia pilosa Ledeb.

Исследуемый образец Относительное содержание моносахаров в исследуемых образцах (%)

Ara Xyl Man Gly Gal Каш Gal.Ac НИ*

Гидролизат ПС из надземной части Agrimonia pilosa 21,686 2,196 0,466 4,881 55,825 5,576 - 9,37

Гидролизат ПС из экстракта Agrimonia pilosa 17,532 1,755 3,227 9,594 39,401 6,608 0,181 21,702

*НИ - не идентифицированные вещества

Руководствуясь результатами данного исследования о качественном составе моносахаров и их количественных соотношениях, можно сделать предварительное заключение о возможной структуре исходного ПС, имеющего нейтральную природу по составу мономеров и, с определённой долей вероятности, относящегося к арабиногалактанам.

4

'Jr

т

dt

\ / % „А

45 i W 147 - „хТх. i 217 k 231 273 , 30S »3.....

ш^гш M«™. e<jeo<yí J ффрпЯцМВД L-

Рис. 17. Масс-спектр триметилсилильного производного рамнозы

Ifefeaj

(ми). "Г

Рис.15. Газовая хроматограмма триметилсилнлированного гидролизата ПС из надземной части Agrimonia pilosa Lcdeb.

Рис. 16. Газовая хроматограмма триметилсилнлированного гидролизата ПС из экстракта Agrimonia pilosa сухого

т.:щ

»1 зоб зп ш

80 ' 120 WC МО J.0 1Ю 320 ХО ЛОО "О *вО S20

Рис. 18. Масс-спектр триметилсилильного производного маннозы

JbmJUj

X Л-

л4 ^

изам ( Ш356 ЗЙЗ

i» 1Ó0 МО 2« гво юо мо ««

В) &SUOMI Z.3.4.S.frOOIlta*»-CHWOC«>»1W>

Рис. 19. Масс-спектр триметилсилильного производного галактозы

Х-Т

IM 270 ХО МО 300 МО .20 «О

Рис. 20. Масс-спектр триметилсилильного производного ксилозы

2.6. Анализ макро- ■■ мнкроэлементного состава

В образцах надземной части Agrimonia pilosa, собранных по фазам вегетации, обнаружено 61 элемент (табл. 6), из них: 4 макроэлемента (Na, Mg, К, Са), 9 жизненно необходимых (Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, Со, Cr, Se, 1), 7 условно жизненно необходимых (В, Si, Ni, V, Br, As, Li), 15 токсичных и условно токсичных микроэлементов (Sn, Ag, Sr, Ti, Al, Pb, Cd, Hg, TI, Pb, B¡, Be, Te, Pt, Au, Ba) и 26 микро- и ультромикро-элементов, физиологическая роль которых в настоящее время не изучена.

Таблица 6

Содержание элементов в надземной части Agrimonia pilosa Ledcb.no фазам развития (в мкг/г на воздушно сухое сырье) (хср., п=5)

Элемент Исследуемые образны №№ Элемент Исследуемые образны №№

1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4.

Li 0.080 0.10 0.22 0.048 Cd 0.17 0.16 0.15 0.077

Be 0.0069 0.014 0.001 0.021 Sn 0.061 0.039 0.10 0.054

В 27.2 34.1 34.7 30.7 Sb 0.21 0.15 0.19 0.12

Na 52.1 39.8 74.3 27.2 1 0.23 0.19 0.01 0.17

Ме 2222 3011 2513 3039 Cs 0.015 0.0 ІЗ 0.026 0.010

Al 165 147 279 103 Ba 75.0 68.6 69.9 49.8

Si 426 308 363 324 La 0.10 0.091 0.15 0.070

Р 4252 5162 3602 3919 Ce 0.16 0.17 0.22 0.14

К 29470 23005 24556 25290 Pr 0.021 0.020 0.028 0.013

Са 10969 11493 10699 10525 Nd 0.082 0.073 0.11 0.051

Ті 8.94 8.24 13.2 5.89 Sm 0.022 0.016 0.023 0.0083

V 0.51 0.49 0.69 0.43 Eu 0.0047 0.0025 0.0034 0.0031

С г 1.65 1.41 1.33 1.22 Cid 0.014 0.013 0.021 0.011

Мп 64.6 60.1 52.4 62.9 Tb 0.0017 0.0018 0.0037 0.0015

Fe 140 156 187 138 Dv 0.011 0.012 0.019 0.0076

Со 0.15 0.13 0.16 0.14 Но 0.0022 0.0016 0.0048 0.0020

Ni 1.76 1.65 1.78 2.30 Er 0.0056 0.0055 0.013 0.0032

Cu 5.95 7.92 6.16 7.04 Tm 0.0009 0.0012 0.0027 0.0007

Zn 39.3 55.0 24.0 26.9 Yb 0.0056 0.0048 0.014 0.0024

Ga 0.053 0.073 0.091 0.048 Lu 0.0014 0.0010 0.0031 0.0006

Ge 0.0001 0.0034 0.0043 0.0033 Hf 0.0071 0.0066 0.013 0.0043

As 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 Ta 0.0033 0.0023 0.0064 0.0022

Se 0.69 0.83 0.44 0.40 W 0.023 0.023 0.040 0.033

Br 4.81 2.10 5.32 5.73 Au 0.0015 0.0003 0.0005 0.00074

Rb 6.82 6.33 5.53 6.49 Hg 0.0060 0.0043 0.0053 0.0050

Sr 71.5 64.3 66.2 73.8 TI 0.0044 0.0032 0.0039 0.0021

Y 0.066 0.061 0.13 0.041 Pb 0.91 0.54 0.70 0.47

Zr 0.36 0.29 0.52 0.21 Bi 0.017 0.011 0.025 0.015

Nb 0.038 0.029 0.057 0.022 Th 0.024 0.022 0.050 0.015

Mo 0.21 0.47 0.33 0.39 U 0.012 0.0071 0.017 0.0065

Ap 0.0042 0.0015 0.033 0.0095

Обозначения: 1 - трава, фаза вегетации, НСО, 2 - трава, фаза бутоиизации, НСО, 3 - трава, фаза цветения, НСО, 4 - трава, фаза плодоношения, НСО.

При сравнительном анализе образцов надземной части, собранной по фазам развития растения установлено, что по качественному составу элементов они различий не имеют, количественное содержание варьирует в незначительных пределах.

Анализ эндогенной и сезонной динамики элементов показал, что содержание большинства элементов (35 элементов) увеличивается к фазе цветения, а морфологические части растения (лист, стебель, соцветие) дополняют друг друга по содержанию отдельных элементов, что свидетельствует о том, что в качестве сырья надо использовать всю надземную часть растения.

При сравнительном анализе образцов травы Agrimonia pilosa, собранных в Юго-Западной (Алтайский край), Северо-Восточной Сибири (Республика Бурятия) и в Европейской части России (Ярославская область), установлено, что по качественному составу элементов они не различаются; отмечено варьирование в содержании отдельных жизненно-важных и токсичных элементов (Se, Мо, Cd, Ва, Li, Pb). Содержание необходимых для жизни элементов (Са, Na, К, Mg, Zn, Cu, Fe, Si, Cr, Ba, Li, Ni) во всех исследуемых образцах Agrimonia pilosa сопоставимо и соответствует значениям среднего содержания элементов в растениях по В.В.Добровольскому.

При изучении элементного состава особое внимание обращали на содержание токсичных элементов - свинца, ртути, кадмия, мышьяка. По содержанию токсичных элементов исследуемые образцы сырья отвечают требованиям стандарта для БАД, не превышая ПДК (СанПиН 2.3.2.1078-01).

3. Разработка параметров стандартизации надземной части Agrimonia pilosa Ledeb.

Стандартизацию сырья предложено проводить по двум группам веществ - флавоноидам и полисахаридам, так как предполагается, что они имеют наибольшую значимость в проявлении биологической активности травы Agrimonia pilosa.

3.1. Методика количественного определения флавоноидов

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 1 г сырья (точная навеска), помещают в колбу на 100 мл и заливают 20 мл спирта этилового 40 %, соединяют с обратным холодильником и настаивают на водяной бане в течение 30 мин с момента закипания экстрагента. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют дважды в тех же условиях. Фильтраты объединяют и замеряют объем полученного извлечения. 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 4 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 40% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки 40% спиртом этиловым (раствор сравнения А). Параллельно готовят раствор ГСО рутина. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 40% спирта этилового при нагревании на водяной бане, после охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят 40% спиртом этиловым до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят до метки 40% спиртом этиловым (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл, и доведенный 40% спиртом этиловым до метки (раствор сравнения Б рутина). Измерение оптической плотности проводят при длине волны 410 нм после приготовления всех растворов.

Расчет количественного содержания флавоноидов производили по формуле:

X = Dx moxVx50x2xl00x 100 / D0xmx2><50x25x(100 - W), где

D - оптическая плотность исследуемого раствора;

D0 - оптическая плотность ГСО рутина;

m - масса сырья, г;

гп0 - масса ГСО рутина, г;

V - объем извлечения, мл;

W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

Метрологическая характеристика метода количественного определения флавоноидов в траве Agrimonia pilosa представлена в таблице № 7.

Таблица 7

Метрологическая характеристика метода количественного определения флавоноплов в траве Agrimonia pilosa Ledeb.

п Г Хер. S" s Р, % t (р, 0 Дхср с,%

10 9 3,56 0,016 0,124 95 2,23 0,088 2,13

Для проверки воспроизводимости разработанной методики проводили 10 независимых определений для каждого образца сырья, относительные ошибки методики не превышали 5%. Предложенная методика количественного определения флавоноплов в пересчете на рутин в траве Agrimonia pilosa надежна и дает воспроизводимые результаты. Опыты с добавками образца PCO рутина к исследуемому раствору показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки при использовании данной методики.

3.2. Показатели подлинности сырья

На основании проведенных исследований установлены микродиагностические признаки травы Agrimonia pilosa:

Лист - амфистоматический. Клетки верхней и нижней эпидермы извилистостенные, более извилистые стенки у клеток нижней эпидермы. Устьичиый аппарат аномоцитного типа, устьица погруженные. Эпидерма покрыта толстым слоем складчатой кутикулы. На поверхности листа с верхней и нижней стороны встречаются трихомы: простые одноклеточные волоски с толстой клеточной стенкой и узкой полостью, головчатые многоклеточные волоски и железки. Все трихомы железистые. Места прикрепления трихом приподняты над поверхностью эпидермы, клетки эпидермы в местах прикрепления волосков и железок образуют розетку. В паренхиме листа присутствуют включения в виде друз и призматических кристаллов разного размера (рис. 21 - 26).

Черешок треугольной формы. Покровная ткань - эпидерма, на ней обилие трихом: простые одноклеточные и многоклеточные головчатые, и те н другие - железистые. Под эпидермой залегает первичная механическая ткань уголковая колленхима (на выпуклой стороне черешка в несколько слоев (6-7), па вогнутой - 1-2 слоя). В паренхиме центральной части черешка залегают проводящие коллатеральные пучки. Над флоэмой залегает мощный слой склеренхимы (рис. 27, 28).

Стебель на поперечном срезе округлой формы с нечетко выраженными гранями. На поверхности стебля однослойный эпидермис, выполненный округлыми (в поперечном сечении) эпидермальнымн клетками, внешняя клеточная стенка которых сильно утолщена. На эпидерме в обилии встречаются трихомы - простые одноклеточные, железистые волоски и многоклеточные головчатые, железистые волоски. Под эпидермой последовательно залегают слои гиподермы и хлоренхнмы. В верхней части стебель имеет пучковый тип проводящей системы, в нижней части - непучковый тип. В верхней части стебля механическая ткань (склеренхима) залегает отдельными участками (над флоэмой), в нижней части стебля наблюдается сплошное склеренхимное кольцо. Центральная часть стебля (серцевина) выполнена тонкослойной паренхимой.

Клетки эпидермы стебля прямостенные, прозенхимные. IIa эпидерме встречаются трихомы такого же строения, что и на листе, простые одноклеточные волоски очень длинные, в отличие от простых волосков на листьях, а так же устьица аномоцитного типа. Все трихомы железистые, содержат секрет желтого или красно-коричневого цвета (рис. 29 - 31).

Эпидерма чашелистиков выполнена слабо-извилистостенными клетками, устьичный аппарат апамоцитиого типа, устьица погруженные, трихомы железистые - простые одноклеточные и головчатые многоклеточные. В паренхиме чашелистиков обилие кристаллических включений - друз (рис. 32, 33).

Рис. 22. Простые одноклеточные волоски по краю

Рис. 21. Лист: верхняя эпидерма, эпидерма

Рис. 23.Фрагмент паренхимы листа: включения в _виде друз

Рис. 25. Простой одноклеточный волосок над жилкой Рис. 26. Эпидерма листа, железки, железистые

волоски (люминисцеитная микроскопия)

Рис. 27. Черешок листа, поперечный срез, железистые трихомы, проводящие пучки

Рис. 28. Черешок листа, поперечный срез (люминисцентная микроскопия)

шшш

Рис. 29. Эпидерма стебля, простой железистый трихом

Рис. 30. Эпидерма стебля, волоски простые, одноклеточные, железистые, волоски головчатые многоклеточные

Рис. З !. Поперечный срез стебля

Рис. 32. Верхушка чашелистика, простые одноклеточные железистые волоски, железистый волосок на кончике чашелистика

Рис. 33. Простые одноклеточные, железистые волоски по краю чашелистика, друзы в паренхиме

Рис. 34. Эпидерма лепестка, папиллы, четковндные утолщения на боковых стенках эпидермы (люминисцентная микроскопия)

Эпидерма лепестков выполнена прозенхимными клетками с извилистыми стенками, имеющими утолщения в виде четок. Отдельные клетки эпидермы имеет папиллы. В паренхиме лепестков обнаружены друзы (рис. 34).

3.3. Показатели доброкачественности сырья

Согласно перечню разделов фармакопейной статьи на лекарственное растительное сырье, утвержденному ОСТ 91500.05.001-00, установлены числовые показатели для стандартизации сырья (табл. 8).

Таблица 8

Спецификации в ФСП «Репейничка волосистого трава» _и «Экстракт репейничка волосистого сухой»_

Показатели Методы Нормы

Репейничка волосистого трава Экстракт репейничка волосистого сухой

Описание, внешние признаки Визуальные, органолептические В соответствии с ФСП В соответствии с ФСП

Подлинность

Флавоноиды Визуально К 1 мл извлечения, полученного экстракцией при нагревании 40% этанолом прибавляют 0,1 г порошка магния и 1мл концентрированной хлороводородной кислоты; постепенно появляется оранжево-красное окрашивание. К 1 мл извлечения, полученного экстракцией при нагревании 40% этанолом прибавляют 0,1 г порошка магния и 1мл концентрированной хлороводородной кислоты; постепенно появляется оранжево-красное окрашивание.

Гидроксикоричные кислоты Визуально Реакция Паули (к 1 мл извлечения прилить 1 мл 5% раствора гидроксида натрия в 95% спирте этиловом, прилить 1 мл свежеприготовленного раствора диазотированной сульфаниловой кислоты) - должно появиться вишнево-красное окрашивание Реакция Паули (к 1 мл извлечения прилить 1 мл 5% раствора гидроксида натрия в 95% спирте этиловом, прилить 1 мл свежеприготовленного раствора диазотированной сульфаниловой кислоты) - должно появиться вишнево-красное окрашивание

Полисахариды Визуально К 1 мл водного извлечения прилить 3 мл 95% спирта этилового - появление мути К 1 мл водного извлечения прилить 3 мл 95% спирта этилового - появление мути

Числовые показатели

Потеря в массе при высушивании Гравиметрический Не более 10% Не более 5%

Зола общая Гравиметрический ГФ XII Не более 10% Не более 20%

Сульфатная зола Гравиметрический ГФ XII Не более 0,5% Не более 0,5%

Тяжелые металлы ГФХІІ Не более 0,01% Не более 0,01%

Содержание побуревших, пожелтевших и почерневших частей растения Гравиметрический Не более 3%

Количественное определение:

Флавоноидов в пересчете на рутин Спектрофотометрический Не менее 2% Не менее 5%

Полисахаридов Гравиметрический Не менее 2% Не менее 10%

Микробиологическая чистота ГФХИ Категория ЗБ Категория ЗБ

Маркировка В соответствии с ФСП

Храпение В защищенном от света месте при температуре 1215 °С

Срок годности 3 года | 3 года

4. Исследование химического состава экстракта

Сухой экстракт, полученный из надземной части Agrimonia pilosa представляет собой аморфный порошок коричневого цвета, со слабым запахом и приятным горьковато-вяжущим вкусом. Легко растворяется в воде, гигроскопичен.

Химический анализ показал, что экстракт Agrimonia pilosa сухой (ЭР) содержит все основные группы соединений, характерные для исходного сырья (табл. 9).

Таблица 9

Содержанке основных групп БАС в экстракте Agrimonia pilosa сухом (M±m; n=3)

№ п/п Группа биологически активных веществ Экстракт Agrimonia pilosa сухой (ЭР)

1 Полисахариды, % 10,05±0,08

2 Аскорбиновая кислота, мг% 14,63±0,05

3 Дубильные вещества, % 33,08±0,05

4 Гидроксикоричпые кислоты, % 5,98±0,06

5 Флавоноиды, % 5,14±0,04

6 Кумарины 3,87±0,02

7 Хлорофиллы 7,09±0,03

5. Исследование биологической активности экстракта Agrimonia pilosa сухого (ЭР)

Острая токсичность. Репейннчка волосистого экстракт сухой (ЭР), согласно ГОСТ 121007-76 (Государственный стандарт на вредные вещества), относится к 4 классу опасности «Вещества малоопасные».

Противовоспалительные свойства. Проведенные скрининговые исследования свидетельствуют о наличии системной противовоспалительной активности у ЭР с влиянием, как на экссудатнвную стадию воспалительного процесса, так и на пролиферативную.

Установлено, что ЭР и препарат сравнения (ацетилсалициловая кислота) в дозах 100 и 20 мг/кг соответственно ослабляли флогогенное действие каррагенина, снижая отек воспаленной лапы на 50% и 52,2 % соответственно, по сравнению с группой контроля.

Изучение антипролиферативного действия ЭР на модели «ватной гранулемы» показало, что его введение в дозе 100 мг/кг способствовало снижению воспалительного разрастания гранулематозно-фиброзной ткани у животных на 36,6 % по сравнению с крысами контрольной группы. В то же время, введение ацетилсалициловой кислоты в дозе 20 мг/кг не приводило к динамике процессов пролиферации.

Массу экссудата в очаге хронического воспаления ацетилсалициловая кислота (20 мг/кг) и ЭР (100 мг/кг) уменьшали на 23,1 % и 37,8 % соответственно.

Оценка гепатопротекторной активности ЭР на модели экспериментального токсического гепатита, индуцированного парацетамолом. Целью данного фрагмента

исследования являлось изучение влияния ЭР и референтного препарата карсил на показатели белкового обмена, билирубина, мочевины и активности аланннаминотрансферазы (АлТ) и матриксных металлопротеиназ (ММП-2,7) в сыворотке крови крыс в условиях экспериментального токсического повреждения печени, вызванного внутрижелудочным введением парацетамола.

Исследование белковых фракций показало, что при введении парацетамола незначительно снижается процентное содержание альбуминов, возрастает доля с(|, сь р;-глобулинов и снижается доля у-глобулинов по сравнению с контрольной группой животных (табл.10). Предварительное введение карсила сохраняло содержание альбуминов в норме, при этом а,. а2, Ргглобулпны оставались повышенными. Введение ЭР сохраняло долю альбуминов и р2 - глобулинов в норме, однако, (XI. аз-глобулины остались повышенными по отношению к интактным животным. Было отмечено, что ни карсил, ни ЭР не оказывали достоверного влияния на содержание у-глобулинов на фоне введения парацетамола. О противовоспалительном действии ЭР свидетельствует снижение уровня агглобулина, как маркера острого воспалительного процесса в печени с признаками распада тканей. ЭР предупреждает нарушения белок-синтетической функции печени, вызванные парацетамолом, о чем свидетельствует содержание альбумина в крови (ннтактные животные - 48,8+0,97%; животные, получавшие парацетамол - 41,8+0,87%; животные, получавшие парацетамол на фоне ЭР - 46,8±1,53%) (табл. 10).

Таблица 10

Содержание белковых фракций в сыворотке крови крыс

при введении парацетамола, карсила и ЭР (М±ш)_

Группы Альбумины, Глобулины,%

животных % «1 0-1 Р1 Р: У

Иптактныс (п=20) 48,8 ± 0.97 11,3±0,54 5,5 + 0,31 5,9 ±0,33 15,3 ±0,33 13,2+0,57

Парацетамол 41,810,87 16,6±0,88 7,5±0,81 6,1 ±0,6 17,3±0,74 10,7±0,58

<п=6) [>,.-<0,001 Р|_:<0,001 Р,.;<0.05 Pi-2<0,05 Р|.2<0,01

Парацетамол 46,1 ±0,93 15,1 + 1,25 7,7±0.55 8,4+1,2 14.0+0,92 9,9±0,55

+ карсил(п=6) Р-.,<0,01 Рм<0,01 Рм<0,01 Pi.,<0.05 Рм<0,05 Pi.3<0,001

Парацетамол + ЭР (п=7) 46,8±1,53 Р;.5<0,01 13,5+0,86 Р|_5<0,05 Р;.5<0,05 9,2±0,53 Р|.5<0,001 6,6±0,47 14,9±0,82 Р;-5<0,05 9,3+0,61 Р| _5<0,001

Сравнительная морфологическая оценка гепатопротекторных свойств ЭР при повреждении печени лекарственными препаратами - полихимиотерапией (ПХТ) и парацетамолом. При микроскопическом изучении ткани печени после введения парацетамола и комплекса цптостатпков (ПХТ) в печеночной ткани животных были выявлены однотипные патоморфологические изменения - дистрофия и некрозы гепатоцитов. Морфометрический анализ состояния паренхимы печени после введения парацетамола и комплекса цптостатпков выявил, что доля неповрежденных гепатоцитов (нормальной паренхимы) при введении обоих повреждающих агентов была примерно одинаковой - 65,5% и 63,4%, но соотношение дистрофически измененной н некротнзированной паренхимы существенно различалось: доля некрозов при использовании парацетамола была в 2,3 раза выше, чем при введении ПХТ, а введение комплекса цптостатпков сопровождалось преимущественным развитием тяжелых диффузных дистрофических изменений.

После введения парацетамола использование ЭР и карсила способствовало защите пареихимы печени крыс, о чем свидетельствовало заметное снижение деструктивных

изменений гепатоцитов. При введении обоих гепатопротекторов происходило сопоставимое снижение, как доли некрозов, так и доли дистрофических изменений гепатоцитов, причем более существенно снизилась именно доля некротизированной печеночной ткани - в 4,3 раза для ЭР и в 2,9 раза при использовании карсила. Данный факт свидетельствует о лучших гепатопротекторных свойствах ЭР относительно референтного препарата в данных условиях эксперимента. Морфометрическое исследование гистологических препаратов печени выявило значительное улучшение структурного состояния печеночной ткани на модели ПХТ при введении ЭР. Введение животным ЭР в дозе 100 мг/кг в условиях введения комплекса цнтостатиков было проведено в 3-х экспериментальных режимах: в течение 3 дней до ПХТ, в течение 6 дней после ПХТ и по схеме «3 дня до ПХТ- введение цнтостатиков - 6 дней после ПХТ». Наиболее эффективной оказалась последняя схема введения ЭР: доля некрозов гепатоцитов была минимальной, а доля морфологически неповрежденной ткани печени возросла на 32,6% в сравнении с показателем контрольной группы (ПХТ), что свидетельствует о выраженном позитивном биологическом эффекте ЭР в условиях цитостатически-индуцированного поражения печени.

ВЫВОДЫ

1. В надземной части Agrimonia pilosa Ledeb., произрастающей на территории Сибири и Европейской части России установлено наличие фенольных соединений, представленных гидроксикоричными кислотами, флавоноидами, кумаринами, полифенольными окисляемыми соединениями; а так же эфирного масла, полисахаридов, аминокислот, Сахаров, хлорофилла, каротиноидов, аскорбиновой кислоты. Показано, что качественный состав основных групп БАС Agrimonia pilosa (флавоноиды, кумарины, гидроксикоричные кислоты, полисахариды) остается постоянным, независимо от места произрастания растения.

2. Идентифицированный компонентный состав БАС в надземной части Agrimonia pilosa представлен рутином, кверцетином, кверцетина рамнозидом, апигенином (флавоноиды); хлорогеновой, кофейной, транс-коричной кислотами (гидроксикоричные кислоты); умбеллифероном, скополетином, эскулином, эскулетином (кумарины); валином, гистидином, лейцином, метионином, треонином, изо-лейцином, фенилаланином, триптофаном, аланином, серином, пролином, глутаминовой и аспарагиновой кислотами, цистеином, глутамином (аминокислоты); галактозой, арабинозой, маннозой, рамнозой, ксилозой (моносахара) и 16 терпеноидами эфирного масла.

3. С помощью химических и гравиметрических методов анализа из надземной части Agrimonia pilosa выделены фракции полисахаридов и установлено их содержание. В зависимости от места произрастания (Сибирский регион и Европейская часть России) содержание фракций полисахаридов значительно варьирует (слизи - от 2,1% до 3,5%, пектины -от 6% до 12,5%, гемицеллюлоза А - от 11% до 28%, гемицеллюлоза В - от 4,6% до 20,6%). Наибольшее количество водорастворимых полисахаридов содержится в репродуктивных органах и листьях в фазе цветения. Методом ГЖХ-МС установлен мономерный состав и количественное соотношение компонентов водорастворимых полисахаридов травы Agrimonia pilosa, что позволило предположить структуру исходного полисахарида, имеющего нейтральную природу и относящегося к арабиногалактанам.

4. Выявлено, что по составу макро- и микроэлементов (61 элемент) надземная часть Agrimonia pilosa, произрастающая на территории Сибири и Европейской части России различий не имеет. Анализ отдельных органов растения по составу элементов и их содержанию показывает, что морфологические части растения дополняют друг друга по содержанию отдельных элементов. Содержание токсичных элементов не превышает значения ПДК.

5. Определены закономерности распределения основных групп БАС в органах Agrimonia pilosa и динамика их накопления. Наибольшее количество БАС содержится в репродуктивных

органах и листьях в фазе цветения. Рекомендуемые сроки сбора сырья травы Agrimonia pilosa -фаза цветения.

6. Установлены микро-диагностические признаки сырья Agrimonia pilosa, заключающиеся в типах трихом, их расположении на эпидерме листа, стебля, наличию друз в паренхиме листа, чашелистиков и лепестков, пучковом типе строения в верхней части, переходном - в средней части и не пучковом - в нижней части стебля.

7. Оптимальными технологическими параметрами для получения экстракта Agrimonia pilosa сухого являются: экстрагент - спирт этиловый 40%; размер частиц сырья - 0,5мм; гидромодуль - 1:60; кратность экстракции - 3; продолжительность экстракции - 30 мин. Предварительная УЗ-обработка смеси сырья и экстрагента повышает % выхода основных групп БАС, в результате экстракт Agrimonia pilosa сухой соответствует исходному сырью по составу основных групп БАС, но превосходит по их удельному содержанию.

8. Экстракт Agrimonia pilosa сухой обладает на различных моделях экспериментальных патологий выраженными противовоспалительными и гепатопротективными свойствами и является перспективным для углублённых фармакологических исследований.

9. Разработанные параметры стандартизации сырья Agrimonia pilosa положены в основу проекта фармакопейной статьи предприятия «Репейничка волосистого трава - Agrimoniae pilosae herba», в качестве средства, обладающего противовоспалительным действием и снижающего токсическое воздействие на печень лекарственных средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Макарова, Д.Л. Фитохимическое исследование растений флоры Сибири / Д.Л. Макарова, В.В. Величко, Н.Е Ким, М.Г. Ханина и др. И Фармация. - 2008. - № 3. - С. 19-22.

2. Валов, Р.И. Сорбция природных биологически активных веществ на наноалмазах / Р.И. Валов, И.С. Ларионова, М.Г. Ханина, А.П. Родин и др.// Фармация. - 2010. -№ 6. - С. 28-31.

3. Ханина, М.Г.Элементный состав Agrimonia pilosa Ledeb. / М.Г. Ханина, M. А. Ханина, А.П. Родин // Химия растительного сырья. - 2010. - № 2. - С. 99 -104.

4. Ханина, М.Г. Аминокислоты Agrimonia pilosa Ledeb., Arctium tomentosum Mill / М.Г. Ханина, B.B. Никулич, B.B. Иванова, M.A. Ханина и др. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 3/1. - С. 77 - 78.

5. Позднякова, С.П. Противовоспалительные свойства экстрактов Agrimonia pilosa Ledeb. и бересты Betula pendula Roth. / С.П. Позднякова, М.Г. Ханина, В.В. Иванова, C.B. Мишенина // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. -№ 5. - С. 39- 41.

6. Ханина, М.Г. Элементы надземной части Agrimonia pilosa Ledeb. / М.Г. Ханина, M.A. Ханина, А.П. Родин // Медицина и образование в Сибири. - Новосибирск: Электронное научное издание НГМУ. - 2012. - № 4.

7. Потеряева, О.Н. Изучение гепатопротекторного действия растительных экстрактов при экспериментальном повреждении печени / О.Н. Потеряева, Г.С. Русских, В.В. Иванова, O.P. Грек, В.И. Шарапов, М.Г. Ханина и др. // Медицина и образование в Сибири. - Новосибирск: Электронное научное издание НГМУ. - 2012.- № 3.

8. Ханина, М.Г. Репейничек волосистый - перспективное лекарственное растение / М.Г. Ханина // «Авиценна-2006»: Матер, ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых- Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ. - 2006. - С. 499-500.

9. Ханина, М.Г. Фармакогностическое исследование Agrimonia pilosa Ledeb. / М.Г. Ханина // Вестник Пермской Государственной Фармацевтической Академии. - Пермь: ПГФА. - 2008. - С. 267 - 270.

10. Ханина, М.Г., Фармакогностическое исследование репейничка волосистого / М.Г. Ханина, М.А. Ханина // «Актуальные проблемы современной науки, естественные науки, часть 11 Биологические науки»: Тр. 3-го Международного форума (8-й Международной конференции), Самара. - 2007. - С. 90-94.

11. Ханина, M.Г. Исследование фенольного комплекса Agrimonia pilosa / M.Г. Ханина // «Хыст» (Дарование), Всеукрайнекий медицинский журнал молодых ученых. Украина: Черновцы, 2008. - Вып. 10. - С. 235.

12. Ханина, М.Г. Товароведческий анализ сырьевой части Agrimonia pilosa / M.Г. Ханина // «Хыст» (Дарование), Всеукраинский медицинский журнал молодых ученых. Украина: Черновцы, 2008. - Вып. 10. - С. 235.

13 Потеряева, О.H Активность сывороточных матриксных металлопротеаз у крыс на фоне токсического гепатита, вызванного парацетамолом / О.Н. Потеряева, Г.С Русских, М.Г. Ханина, В.В. Иванова, O.P. Грек, В.И. Шарапов // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - № 12. - С. 153.

14. Потеряева, О.Н. Сравнительная характеристика гепатопротекторного действия карсила и растительных экстрактов на повреждение печени вызванного парацетамолом / О.Н. Потеряева, Г.С. Русских, М.Г. Ханина, В.В. Иванова, O.P. Грек, В.И. Шарапов, Т.В. Хазарук, М.М. Геворгян // XIX Российский национальный конгресс «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО»- Сб матер М.-2012.-С. 416-417.

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 1,75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 573. Подписано в печать 28.01.2013 г.