Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Ботанико-фармакогностическое и товароведческое изучение трех видов горошка рода Vicia L. (V. cracca L., V. sepium L., V. sylvatica L.) в онтогенезе, произрастающих на территории Московской области

На правах рукописи

ООЗОВТТ'44

БОЙКОВ Андрей Адольфович

БОТАНИКО - ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ И ТОВАРОВЕДЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРЕХ ВИДОВ ГОРОШКА

РОДА VICIA L. (V. cracca L., V. sepium L., V. sylvatica L.) В ОНТОГЕНЕЗЕ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

15. 00. 02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

Научные руководители: - доктор фармацевтических наук

Людмила Ивановна Бабаскина;

- кандидат биологических наук, профессор Евгений Иванович Барабанов

Официальные оппоненты: - доктор фармацевтических наук, профессор

Эма Максимовна Казьмина;

- доктор биологических наук, профессор Александр Павлович Меликян

Ведущая организация: Всероссийский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН (ВИЛАР).

¡0 7 Ш6*

Защита состоится « 1 ) » 200^т. в часов на заседании

диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова ( 121019, Москва, Никитский бульвар, д. 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «

» к! гооб-

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

'¿Сф

Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время стоит острая проблема реализации национального проекта в области здравоохранения, предусматривающего улучшение медицинской и фармацевтической помощи населению. В рамках данного проекта актуальным является более широкое использование лекарственных препаратов на основе растительного сырья с целью улучшения качества лечения. Поэтому ведется систематический направленный поиск новых видов перспективных лекарственных растений. В условиях рыночных отношений важную роль в данном поиске играет способность новых лекарственных растительных средств удовлетворять конкретные потребности людей и степень их полезности, т.е. их потребительные свойства, потребительные стоимости и качество, являющиеся категориями товароведческого анализа.

Горошки издавна используются в народной медицине как противовоспалительное, гемостатическое, ранозаживляющее и диуретическое средство при разнообразных заболеваниях. Содержание комплекса незаменимых аминокислот и витаминов, богатый флавоноидный состав определили их широкую фармакотерапевтическую активность.

В научной медицине горошки до настоящего времени не применялись. Данные по их химическому составу недостаточны и противоречивы; практически не исследован спектр фармакологического действия. Поэтому научное обоснование возможности расширения сырьевой базы лекарственных растений для производства лекарственных растительных средств за счет видов горошка в настоящее время является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось ботанико-фармакогностическое и товароведческое обоснование возможности эффективного использования трех видов горошка: мышиного, заборного и лесного, произрастающих на территории Московской области, в качестве лекарственного растительного сырья с учетом их онтогенеза.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) изучить особенности онтогенеза и ритма сезонного развития трех видов горошка и установить морфолого-анатомические характеристики каждого этапа развития растений;

2) провести фармакогностический и товароведческий анализ потребительных свойств и качества нового лекарственного растительного сырья травы трех видов горошка и жидких экстрактов на их основе:

а) исследовать флавоноидный, аминокислотный и минеральный составы в ходе онтогенеза для рациональной заготовки сырья в определенных возрастных состояниях;

б) изучить специфическую фармакологическую активность и токсичность;

в) решить вопросы стандартизации, упаковки и маркировки; исследовать стабильность в процессе хранения;

3) разработать технологические регламенты производства и нормативную документацию на перспективное сырьё травы горошка и экстракт.

Научная новизна. Проведено ботанико-фармакогностическое и товароведческое изучение новых лекарственных растительных средств: травы горошков мышиного, заборного и лесного. Установлены особенности онтогенеза и ритма сезонного развития. Впервые проведено комплексное исследование потребительных свойств горошков (химического состава и фармакологической активности) с учетом их онтогенеза. Изучены флавоноидный, минеральный и аминокислотный составы лекарственного растительного сырья трех видов горошка и жидких экстрактов на их основе. Получены новые данные, характеризующие динамику содержания флавоноидов в ходе онтогенеза. Исследована иммуномодулирующая и противоопухолевая активность экстрактов горошков. Разработаны характеристики подлинности, показатели качества и их нормы для сырья и жидких экстрактов. Изучена стабильность сырья травы горошков и

экстрактов в процессе хранения. Проведен анализ упаковки и маркировки новых товаров.

Научно - практическая значимость работы. Проведенные исследования показали, что трава горошков (мышиного, заборного, лесного) является ценным лекарственным растительным сырьем и может служить источником флавоноидов, минеральных веществ и аминокислот. Результаты исследования могут быть использованы при разработке лекарственных форм с использованием дешевого и широко распространенного растительного сырья травы трех видов горошка.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены:

1) технические условия (ТУ): «Трава горошка мышиного», «Экстракт горошка»;

2) опытно - промышленные регламенты (ОПР): на производство сырья (трава) горошка мышиного, на производство экстракта горошка;

3) инструкция по сбору и сушке травы горошка мышиного.

Разработан проект ФС «Экстракт горошка мышиного».

Фрагменты работы использованы в учебном процессе на кафедре ботаники ММА им.И.М.Сеченова.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва (2004); на конференции «Лекарственные растения в фармакологии и фармации», Барнаул (2004); на заседаниях кафедры ботаники фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова (2003-2005).

Связь выполненной работы с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках темы НИР кафедры ботаники ММА им. И.М. Сеченова «Онтогенез, ритм сезонного развития и динамика накопления биологически активных веществ лекарственных растений различных ботанико-географических зон РФ».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Особенности онтогенеза и ритма сезонного развития трех видов горошка.

2. Результаты фармакогностического и товароведческого изучения сырья травы трех видов горошка и экстрактов на их основе.

3.Результаты исследования фармакологической активности (иммуномодулирующей) и токсичности экстрактов горошка.

4. Данные по стандартизации сырья травы горошков и их экстрактов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 184 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), 3 глав собственных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 80 рисунками. Библиографический указатель включает 312 источников, из них 36 на иностранных языках.

В первой главе (обзоре литературы) представлены результаты сравнительного анализа возрастной периодизации онтогенеза растений, динамики сезонного развития горошков; приведены данные о географическом распространении, химическом составе и биологической активности представителей рода горошек; рассмотрены вопросы товароведческого анализа сырья бобовых.

Во второй главе дана подробная характеристика объектов и методов исследования.

В третьей главе приведены результаты ботанико-фармакогностического изучения особенностей онтогенеза и ритма сезонного развития трех видов горошка, произрастающих на территории Московской области.

Четвертая глава посвящена фармакогностическому и товароведческому анализу потребительных свойств и качества сырья трех видов горошка и экстрактов на их основе. Приведены результаты химического анализа флавоноидного, аминокислотного, минерального составов. Рассмотрено влияние этапа онтогенеза и фазы вегетации на содержание биологически активных веществ. Представлены данные по фармакологической активности и токсичности экстрактов трех видов

горошка. Рассмотрены вопросы стандартизации и разработки нормативной документации на сырье травы горошков и экстракты.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Основными объектами изучения были 3 многолетних вида растений рода горошек (Vicia L.): горошек мышиный (V. cracca L), горошек лесной (V. sylvatica L), горошек заборный (V. sepium L).

Стационарные наблюдения за ходом онтогенеза, сбор материала (гербарного и фиксированного в 70% этаноле), заготовка сырья проводились в Звенигородском, Пушкинском, Рузском, Сергиево-Посадском районах Московской области с 2001 по 2005 годы. Для уточнения биоморфологических характеристик растений видов горошка были просмотрены коллекции гербариев МГУ им. М.В.Ломоносова (MW), Главного ботанического сада РАН им. Н.В.Цицина (МНА), Ботанического института РАН им. В.Л.Комарова (LE). В работе использована общепринятая терминология при описании вегетативных и генеративных органов. Наблюдения за интродуцентами проводились по общепринятой методике. Описание подземной части растений проводилось по методике М.С.Шалыги (1960). Понятия «жизненная форма» и «классификация биоморф» приняты по И.Г.Серебрякову (1962). Типы сезонного развития ассимилирующей поверхности выделены согласно И.Г.Серебрякова (1964) и И.В.Борисовой (1965). Периодизация большого жизненного цикла проведена по методике Т.А.Работнова (1950) с дополнениями A.A. Уранова (1960, 1975). Анатомические исследования проводились по общепринятой методике. Морфолого-анатомическое описание всех видов горошка проведено по единому плану. При изучении элементного состава частей растений использовались методики микроанализа. Фотографирование объектов проводили цифровой камерой Casio с насадкой МНФ-10.

В работе использованы современные физико-химические методы анализа. Изучение флавоноидов проводили с использованием хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) на пластинках «Sigma Aldrich» в системе

растворителей БУВ (6:1:2); спектрофотометр™ в ультрафиолетовой области на Spectronic «Genesys» 5 (USA). При выделение флавоноидов сырье обрабатывали 70% этанолом троекратно в соотношении 1:1 при нагревании, объединенные экстракты упаривали, водный остаток очищали хлороформом, затем фенольные соединения извлекали из водного раствора этилацегатом (5 раз в соотношении 2:3), последний отгоняли.

Определение белка по содержанию общего азота проводили по методу Кьельдаля и колориметрическим методом в автоанализаторе «Техникон» (Ирландия). Аминокислотный состав белка определяли на аминокислотном анализаторе Biotronic LC 5001 (Германия) с использованием внутреннего стандарта.

Анализ минерального состава проводили методом пламенной атомно -абсорбционной спектрометрии на спектрофотометре AAS - 3 (Германия) после озоления образцов в муфельной печи при температуре 450 - 500°С. Содержание общей золы и золы, нерастворимой в HCl, определяли по ГФ-Х1.

При проведении исследований руководствовались требованиями общих статей ГФ XI «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа», «Трава». Разработку числовых показателей анализируемых видов сырья горошка, микроскопические исследования по установлению диагностических признаков проводили в соответствии с требованиями ГФ XI. При получении экстрактов, изучении их физико-химических показателей руководствовались требованиями общей статьи ГФ XI «Экстракты».

Изучение острой токсичности экстрактов проводили в соответствии со статьей ГФ XI «Испытание на токсичность». Цитотоксическая активность экстрактов оценивалась по цитотоксическому тесту, основанному на избирательной способности живых клеток восстанавливать МТТ (3- [4,5- диметклтриазола-2-ш1]-2,5-дифенилтетразолия бромид) в формазанах в митохондриях.

Онтогенез и ритм сезонного развития

В онтогенезе горошков было выделено 4 возрастных периода: латентный; предгенеративный или виргинильный; генеративный; постгенеративный или

сенильный и 11 возрастных состояний: семена (sm); проростки (pli), всходы (pb), ювенильные (j), имматурные (im), взрослые вегетативные (v); молодые генеративные (gi), средневозрастные генеративные fe), старые генеративные (g3); субсенильные (ss), сенильные (s). Основными критериями выделения возрастных этапов онтогенеза горошков выступали качественные и количественные морфолого-анатомические признаки.

В онтогенезе горошка мышиного латентный период продолжался 6-7 месяцев. Твердосемянность составляла 90 %. Запасные вещества использовались на доразвитие зародыша.

Виргинильный период - 1-3 года. Проростки появлялись в конце апреля, начале мая. Всхожесть семян составляла 40-60 %. Зародыш семени часто поражался долгоносиками ситоном и брухусом. Нами установлено, что предпосевная обработка семян горошка 20% серной кислотой в течение 30-40 минут с последующим промыванием в проточной воде повышает всхожесть семян до 80%. Проростки имели тонкий удлиненный вегетативный побег диаметром около 1 мм с 6-7 междоузлиями, причем 1-3 междоузлия имели чешуйчатые листья, а с 4 узла -формировались первые листья. Корневая система состояла из главного корня и нескольких боковых корней. Ювенильные растения были представлены удлиненными вегетативными однолетними побегами высотой 10-20 см с зелеными настоящими листьями и развитым усиком; в подземной части - главный корень и боковые корни с бактериальными клубеньками. Имматурные растения имели главный побег и побеги второго-третьего порядков длиной 20-27 см, возникающие симподиально из пазушных почек первого и второго узлов побега первого порядка. В подземной части наблюдалось появление боковых корней третьего порядка. У семядольного узла побегов первого порядка формировались придаточные корни толщиной 0,5 мм. Корневая система смешанная. К концу первого вегетационного периода начали появляться плагиотропные гипогеогенные корневища. Взрослые вегетативные растения формировались двумя путями: семенным и вегетативным. У семенных растений появлялся куст с длиннокорневищной системой и придаточными корнями. У вегетативных растений

корневая система была мочковатого типа, состоящая только из придаточных корней. Весной из верхушечных почек корневищ интенсивно формировались 4-6 вегетативных побега, длиной до 50 см.

Генеративный период - 5-10 лет. Молодые генеративные растения морфологически были сходны со взрослыми вегетативными растениями, но количество вегетативных побегов увеличивалось до 10-12 и появлялись 2-4 генеративных побега. Средневозрастные генеративные растения характеризовались массовым цветением и образованием пышных зарослей. Горошек мышиный - поздноцветущий вид. Позднее цветение обусловлено тем, что в почках возобновления осенью не формируются генеративные органы: соцветия, цветки. Количество вегетативных побегов составляло 18-25, высотой до 180 см. Число вегетативных побегов преобладало над количеством генеративных побегов (10-15), последние формировались из почек возобновления корневищ. Соцветия располагались на концах побегов 1-3 порядков. Корневища нарастали симподиально. Заложение придаточных корней происходило при отмирании боковых корней у основания каудекса. Старые генеративные растения характеризовались ослаблением генеративной функции, замедлением корне- и побегообразования. Вегетативные (6-8) и генеративные (3-4) побеги имели высоту до 50-70 см, ветвились до третьего порядка. Количество побегов было меньше, чем у растений средневозрастного состояния. Наблюдалось отмирание низовых листьев, уменьшение количества соцветий, разрушение корневища, хотя каудекс был еще способен образовывать короткие корневища.

Сенильный период - 2-4 года. Субсенилъные растения характеризовались прекращением генеративной функции. Наблюдалось постепенное отмирание органов растений. Количество побегов - 4-6 высотой - до 40 см. Уменьшалось число и размер листьев, наблюдалось ослабление и прекращение корнеобразования. Растения данного возрастного состояния были схожи с ювенильными растениями. Сенильные растения характеризовались отмиранием корневищ. Придаточные корни не образовывались, корневая система была представлена 1-3 крупными и несколькими тонкими придаточными корнями.

Количество надземных неветвящихся побегов составляло 3-5 длиной - не более 30 см. Было установлено, что стареющие растения очень чувствительны к изменениям условий среды.

Сравнительный анализ онтогенезов трех видов горошка показал, что до имматурного состояния жизненные циклы близки и развитие идет по одной схеме (рис. 1). В имматурном состоянии для каждого вида характерна различная глубина залегания придаточных корней: у горошка мышиного - 3-4 м, у горошка заборного - до 1 м, у горошка лесного - на поверхности почвы. Различно время пребывания растений каждого вида в возрастных состояниях. Например, длительность виргинильного состояния у растений горошков мышиного и заборного составляла 34 года, а у лесного - 4-7 лет. Следует отметить значительную амплитуду колебаний биометрических показателей органов растений у различных видов горошка и количества надземных и подземных органов. Кроме того, горошек мышиный относится к поздноцветущим растениям, а горошек лесной - к раннецветущим; горошки мышиный и заборный зацветают на 3-4 год жизни, а лесной - только на 7 год, за счет длительного виргинильного периода. Ценопопуляции горошков способны занимать большую площадь произрастания за счёт длиннокорневищных побегов, причем растения ценопопуляций, находящихся в лесу или в затенённых местах, имеют более длинные подземные побеги по сравнению с растениями открытых мест обитания. Система корневищ наиболее выражена у горошка лесного.

Фармакогностический и товароведческий анализ потребительных свойств и качества сырья трех видов горошка и экстрактов на их основе

В условиях рыночных отношений усложняется процесс создания новых лекарственных растительных средств из-за необходимости постоянной систематической ориентации проводимых исследований на тенденции развития и поведение целевого рынка. Поэтому нами проводились дробные, поэтапные исследования по комплексу вопросов, включающих изучение химического состава, фармакологической активности, решение вопросов стандартизации и др.

Рис. 1. Обобщенный большой жизненный цикл (онтогенез) горошков:

1 - проростки, 2 - всходы, 3 - ювенильные растения, 4 - имматурные растения, 5- взрослые вегетативные растения, 6 - молодые генеративные растения, 7 - средневозрастные генеративные растения, 8 - старые генеративные растения, 9 - сенильные растения -

Химический состав

По данным предварительного изучения основными биологически активными веществами горошков являются флавоноиды. Их выделение проводили по общепринятой методике. Предварительные исследования с использованием ТСХ показали, что каждый вид горошка имеет характерный флавоноидный состав, сохраняющийся в лекарственных формах: отварах и экстрактах. Было установлено наличие основных флавоноидов: рутина, лютеолина, гиперозида и катехина.

Сравнительную оценку количественного содержания флавоноидов в сырье травы разных видов горошка по этапам онтогенеза проводили по разработанной нами методике с применением спектрофотометрического метода. В основе методики лежит реакция комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия. Определение содержания флавоноидов в сырье травы горошков проводили в пересчете на рутин. Предварительно были изучены оптимальные условия экстракции флавоноидов из сырья травы горошков. Установлено, что наиболее полное извлечение флавоноидов достигается при трехкратном экстрагировании 50-70 % этанолом, при соотношении сырья и экстрагента 1:30 и времени экстракции - по 30 минут каждое экстрагирование, при измельченности сырья - до 1 мм. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 1. Относительная ошибка методики не превышала ± 3%.

Таблица 1. Метрологические характеристики методики количественного

определения флавоноидов в сырье травы горошков

f х, % S2 S Р,% Дх Е>о

сырье травы горошка мышиного

9 | 0,52 | 0,00030 0,0173 95 1 0,012 2,31

сырье травы горошка заборного

9 0,46 0,00025 0,0158 95 0,011 2,39

сырье травы горошка лесного

9 0,38 0,00024 0,0155 95 0,011 2,89

Для определения точности методики был использован метод добавок рутина (R 5143 SIGMA). Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии систематических ошибок.

При использовании разработанной методики было установлено, что наибольшее количество флавоноидов содержат молодые генеративные растения (рис.2) в фазах бутонизации и цветения. Достаточно высокое содержание флавоноидов обнаружено и у взрослых вегетативных и средневозрастных генеративных растений. Поэтому для рационального и эффективного использования ценопопуляций горошков следует заготавливать на сырье молодые

и средневозрастные генеративные растения, характеризующиеся максимальной биомассой, в фазе цветения. Трава является оптимальным сырьем для заготовок, так как в ней содержится достаточно высокое количество флавоноидов, значительно выше только в цветках, но на их долю приходится лишь до 10 % биомассы. Наибольшее количество флавоноидов обнаружено в сырье травы горошка мышиного. В ходе исследований показано влияние условий произрастания растений на содержание флавоноидов.

Возрастное состояние

Рис.2. Содержание флавоноидов в сырье травы трех видов горошка: 1 -мышиного, 2 - заборного, 3 - лесного по этапам онтогенеза

При изучении содержания флавоноидов в различных лекарственных формах (отварах и экстрактах) было установлено, что максимальное количество флавоноидов содержится в экстрактах, следовательно, это наиболее рациональная лекарственная форма. Однако, отвар также может быть использован в медицине как лекарственная форма, не содержащая спирта.

Важным потребительным свойством лекарственного растительного сырья является уровень содержания белка. Опыты показали, что сырье травы трех видов

Таблица 3. Аминокислотный состав сырья травы молодых генеративных растений трех видов горошка (в % на абсолютно сухую массу)

Горошек мышиный Горошек заборный Горошек лесной

Наименование свобод- свобод- свободные свободные свобод- свобод-

аминокислоты ные и ные и амино- ные и ные

связанные амино- связанные кислоты связанные амино-

амино- кислоты амино- амино- кислоты

кислоты кислоты кислоты

Алании 0,52 0,08 0,40 0,07 0,49 0,08

Аргинин 0,24 0,04 0,21 0,04 0,28 0,05

Аспарагиновая кислота 0,98 0,16 0,83 0,14 1,26 0,21

Гистидин 0,36 0,06 0,35 0,06 0,44 0,07

Глицин 0,59 0,10 0,44 0,07 0,72 0,12

Глутаминовая кислота 0,87 0,14 0,95 0,16 1,12 0,19

Метионин* 0,14 0,02 0,16 0,03 0,18 0,03

Лейцин* 0,25 0,04 0,20 0,03 0,32 0,05

Треонин* 0,43 0,07 0,36 0,06 0,48 0,08

Валин* 0,42 0,07 0,43 0,07 0,50 0,08

Изолейцин* 0,51 0,08 0,46 0,08 0,56 0,09

Лизин* 0,53 0,09 0,50 0,08 0,54 0,09

Серин 0,57 0,09 0,53 0,09 0,66 0,11

Тирозин 0,21 0,04 0,18 0,03 0,29 0,05

Фенилаланин* 0,24 0,04 0,22 0,04 0,31 0,05

Сумма всех аминокислот 6,86 1,12 6,22 1,05 8,15 1,35

Сумма незаменимых 2,52 0,41 2,33 0,39 2,89 0,47

аминокислот

* - незаменимые аминокислоты

Анализ минерального состава сырья травы разновозрастных растений трех видов горошка показал, что в ходе онтогенеза количество золы общей и золы, нерастворимой в НС1, увеличивается; возрастает содержание калия, кальция, кремния, фосфора и меди. Поэтому при заготовке травы горошка на сырье следует учитывать ее способность накапливать некоторые минеральные элементы на разных этапах онтогенеза. В таблице 4 представлены результаты определения содержания микро- и макроэлементов в сырье травы молодых генеративных растений горошков.

Приведенные данные допускают перспективность дальнейшего использования сырья травы горошков в качестве дешевого источника важнейших

горошка достаточно богато белком (табл.2) и может служить источником для получения дешевого растительного белка. Сравнительный анализ содержания белка в траве разновозрастных растениях на примере горошка мышиного показал, что в ходе онтогенеза происходит постепенное снижение количества белка в особях. Так как на первых этапах онтогенеза растения еще не имеют достаточно большой биомассы, рациональнее на сырье заготавливать виргинильные, молодые и средневозрастные генеративные растения.

Таблица 2. Содержание белка в сырье травы молодых генеративных растений трех видов горошка и в лекарственных формах (в % на абс. сух. массу)

Вид растений Сырье травы Экстракт Отвар

Горошек мышиный 21,3 ±1,1 2,4 + 0,1 1,6 + 0,1

Горошек заборный 20,4 ±1,6 2,6 + 0,2 1,6±0,1

Горошек лесной 24,2 + 1,3 2,5 + 0,1 1,6 + 0,1

Ценность белка во многом определяется его аминокислотным составом. Исследования проводили как свободных аминокислот, так и связанных после предварительного кислотного гидролиза 6 н. НС1 при температуре 110°С в течение 72 часов (табл. 3). Опыты показали, что все образцы сырья горошков содержат один и тот же набор свободных и связанных аминокислот: 15 аминокислот, среди которых 7 незаменимых. Свободные аминокислоты составили 16-17% от суммы свободных и связанных аминокислот. Суммарное содержание незаменимых аминокислот у горошков составляло 35-37%. Исследования содержания аминокислот в экстракте и отваре (на примере горошка мышиного) показали, что лекарственные формы имеют идентичный состав с соответствующим сырьем. Содержание аминокислот составляло 0,85% в экстракте и 0,52% в отваре. Было обнаружено повышенное содержание метионина, лейцина, гистидина, треонина, лизина в сырье травы горошков, что доказывает перспективность использования данного сырья для получения дешевого растительного белка с высоким содержанием незаменимых биологически активных аминокислот.

макро - и микроэлементов. Анализ содержания минеральных компонентов в различных лекарственных формах показал, что в отвары переходит примерно 4 -6% основных микроэлементов: меди, марганца, цинка; степень извлечения железа несколько ниже: до 3 %. В экстракты переходит менее 4 % элементов, исключения составляют марганец и медь. Таким образом, полученные данные о степени извлечения элементов в различные лекарственные формы позволят в каждом конкретном случае судить о проявлении специфической фармакологической активности данного лекарственного растительного сырья.

Таблица 4. Содержание основных минеральных компонентов в сырье травы молодых генеративных растений трех видов горошка

( в мг/кг абсолютно сухой массы)

Наименование элемента Горошек мышиный Горошек заборный Горошек лесной

Калий 10000,00 8000,00 9000,00

Магний 2600,00 2700,00 2900,00

Кальций 7000,00 8000,00 7500,00

Сера 2600,00 2850,00 2900,00

Фосфор 1500,00 1550,00 1600,00

Хлор 4500,00 4600,00 4700,00

Железо 130,00 140,00 150,00

Алюминий 160,00 180,00 200,00

Кремний 530,00 470,00 600,00

Марганец 36,00 37,00 38,00

Медь 8,00 8,50 9,00

Цинк 39,00 40,00 41,00

Титан 4,00 4,00 4,00

Никель 5,50 7,80 9,00

Свинец 0,40 0,60 0,80

Кобальт 0,02 0,02 0,02

Кадмий 0,05 0,06 0,08

Всего 29112,97 28587,98 29651,90

Широкое использование горошков в народной медицине, богатый химический состав предопределили возможность использования их в научной медицине. Первым шагом в этом направлении явилось исследование токсичности горошков.

Испытание на токсичность проводили по ГФ XI на здоровых белых мышах обоего пола и на беспородных белых крысах. Тестируемые растворы готовили из жидких экстрактов после удаления этанола и растворения сухого остатка в физиологическом растворе. Каждую серию растворов испытывали на 6-8 животных путем внутривенного введения в дозах 10, 25, 50, 100, 300, 500 мг/кг. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор. Полученные данные свидетельствовали о том, что горошки относятся по токсичности к 4 классу малотоксичных веществ.

Цитотоксическая активность

Для исследования цитотоксической активности был использован цитотоксический тест. Количественное определение формазана проводили спектрофотометрическим методом. На основании данных оптической плотности рассчитывали количество погибших клеток-мишеней, т.е. цитотоксическую активность. В качестве клеток-мишеней использовали клетки эритробластного лейкоза человека (К-562), полученные из лаборатории генетики опухолевых клеток Онкологического центра (РОНЦ РАМН). В опытных сериях к клеткам-мишеням добавляли исследуемые растворы, содержащие экстракты трех видов горошка. Конечные концентрации представлены в таблице 5. В контрольной серии к клеткам-мишеням добавляли физиологический раствор. Клетки - мишени и эффекторы инкубировали в углекислородном инкубаторе при температуре 37°С в течение 18 часов. По окончании опыта добавляли стерильный раствор красителя МТТ. Планшеты помещали в темное место при температуре 37 °С на 4 часа, затем центрифугировали. Кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Titertek Multiscan MCC 340, Labsystems, Finland) при длине волны 540 нм. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Опыты показали, что добавление к клеткам-мишеням исследуемых растворов горошков мышиного и заборного в концентрации 5 мг/мл приводило к почти полной гибели опухолевых клеток (79-83 %). Несколько ниже была цитологическая активность горошка лесного - 65 %. Уменьшение действующей концентрации в 2 раза (2,5 мг/мл) вызывало лизис 20-26 % клеток К-562. В более низких концентрациях (от 0,5 до 0,005 мг/мл) цитотоксичность составляла 6-12 %, что достоверно не отличалось от данных контрольной серии. Учитывая выше изложенное, для дальнейших исследований моделирующего влияния экстрактов горошков на киллерную активность мононуклеаров крови (МНК) были использованы концентрации, не оказывающие прямого цитотоксического действия на клетки К-562 (табл. 5). МНК выделяли из лимфомассы донорской крови, полученной из отделения переливания крови РОНЦ РАМН. В экспериментах в качестве клеток-мишеней использовали клетки К-562. Соотношение клеток мишеней и эффекторов составляло 1:5. Было установлено, что добавление исследуемых растворов в концентрации 0,05 мг/мл оказывало достоверное стимулирующее влияние на противоопухолевую цитотоксическую активность МНК. Повышение концентрации до 0,5 мг/мл не приводило к усилению спонтанной активности МНК, а дальнейшее увеличение дозы оказывало прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки. Полученные данные соответствовали действию других известных иммуномодуляторов, таких как интерлейкин 1 и интерлейюш 2, хотя для последних не характерен дозозависимый эффект.

Проведенные исследования показали, что экстракты травы горошков содержат комплекс биологически активных веществ, способный достоверно усиливать противоопухолевое цитотоксическое действие Т-лимфоцитов. Представляло интерес изучение вовлечения тромбоцитов в противоопухолевый иммунитет, как один из возможных факторов иммунологического надзора, предотвращающего развитие неоплазм. Исследования влияния экстрактов горошков на цитотоксическую активность тромбоцитов мышей с перевиваемыми

опухолевыми клетками: EI-4 (лейкоза), тиомы, В-16 (меланомы), Rag (рака почек), Т-20 (эмбриональной тератокаоциомы) проводили в опытах in vivo на линейных мышах обоего пола, полученных из питомника «Столбовая» и вивария РОНЦ РАМН. Для сравнения цитотоксической активности тромбоцитов здоровых мышей и животных с перевитыми опухолями, тромбоциты выделяли из крови интактных и опухолевых мышей и тестировали как против аутологических, так и аллогенных опухолевых клеток. Опыты показали, что в контрольной группе цитотоксическая активность тромбоцитов здоровых мышей колебалась в пределах 5-40 % (табл. 5). Было установлено, что тромбоциты мышей обладают выраженной спонтанной цитотоксической активностью по отношению к аутологическим опухолевым клеткам. При этом наиболее чувствительными к действию тромбоцитов оказались клетки меланомы В-16 и лейкоза Е1-4. Инкубация тромбоцитов мышей с экстрактами горошков (с максимально нецитотоксической концентрацией 2,5 мг/мл) в некоторых случаях приводила к достоверному увеличению киллерных свойств тромбоцитов (табл.5).

Исследования противоопухолевого действия экстракта горошка заборного в условиях целостного организма на линейных мышах с привитой опухолью меланомы В-16 показали, что экстракт не оказывал прямого противоопухолевого действия, но отмечалась тенденция к увеличению длительности жизни животных, подвергшихся воздействию экстракта горошка.

Стандартизация

С целью стандартизации сырья травы горошков были установлены их диагностические морфологические и анатомические признаки. Диагностическое значение имели: форма прилистников, форма соцветия, размер боба, форма стебля, размер листа и листочка. Характерными отличительными особенностями анатомического строения являлись: особенности расположения устьиц в эпидермисе (количество и место), наличие простых и железистых волосков, тип жилкования, строение стеблей, прилистников и усиков.

Таблица 5. Цитотоксическая и иммуномодулирующая активность экстрактов горошков

Концентрация

исслсдусчыч

растворов. содержащих экстракт горошка.

мг/мл

Цитотоксичность, %

горошек мышиный

горошек заборный

горошек лесной

К-562 (¡п \ itro)

Контроль 0,005 0,050 0,500 2,500 5,000

6 + 2 7 + 4 12 + 5 12+3 23 + 3* 79 + 5*

6 + 2 7 + 3 10 + 3 12 + 4 26 ±3* 83+4*

6 + 2 8 + 4 7 + 3 12 + 3 20 ±4* 65 + 5*

Б.

Г---МНК-

К-562 (шуИГО)

Контроль 0,001 0,050 0,500

30 + 5

31 ±4 52 + 4* 26 ±4

30 + 5 33 ±4 57 + 3* 32 + 3

30 + 5 25 ±4 49 + 5* 36 + 3

В.

Rag -*». В-16

Е1-4 (¡п V1 \ г)) Т-20 —•»• Тиоиа

Контроль

Кае 16 + 3 19 + 2 21 ±4 18 + 3

В-16 36+11 54 + 12 56 ± 14* 43 + 11*

Е1-4 39+ 12 52 ± 14* 53 ± 13* 42+11*

Т-20 13 + 8 29 + 9* 32 ±7* 25 ±8

Тиома 5 ± 1 19 ± 2* 21 ± 4* 18 + 3

* - достоверные различия по сравнению с контролем при р< 0,05 или со спонтанной активностью при р< 0,05

Разработаны показатели качества сырья травы трех видов горошка с учетом результатов товароведческого анализа проб тестируемых партий сырья, заготовленных с разных мест произрастания. Для цельного и измельченного сырья установлены следующие показатели: влажность - не более 13,0%; золы общей -не более 5,0%; золы, нерастворимой в 10% растворе НС1 - не более 1,0%. Предложены нормы содержания органической примеси - не более 1,0%; минеральной примеси - не более 0,5%. Проведенные исследования позволили установить норму содержания флавоноидов для горошка мышиного - не менее 0,5%, для горошка заборного - не менее 0,4%, для горошка лесного - не менее 0,3%. С целью установления сроков годности лекарственного растительного сырья были проведены исследования стабильности потребительных свойств и качества травы горошков в процессе хранения. Результаты, показали, что содержание флавоноидов незначительно изменяется в течение 2-2,5 лет. Это дало возможность рекомендовать срок хранения сырья - 2 года. Выбрана рациональная упаковка и определена маркировка на фасованную продукцию сырья травы горошков. На основании полученных результатов были разработаны и утверждены технические условия (ТУ) на траву горошка мышиного, «Опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство сырья травы горошка мышиного», инструкция по сбору и сушке травы горошка мышиного.

Для стандартизации жидких экстрактов горошков были изучены их потребительные свойства, разработаны показатели качества и их нормы: содержание спирта - не менее 55%; содержание сухого остатка - не менее 12,0%; содержание тяжелых металлов - не более 0,01%; содержание флавоноидов: для горошка мышиного - не менее 0,1%, для горошков заборного и лесного - не менее 0,07%. Исследована стабильность экстрактов горошков в процессе хранения. Рекомендован срок хранения - 2 года. Выбрана рациональная упаковка и определена маркировка на экстракт горошка. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены технические условия (ТУ) на экстракт горошка, «Опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство экстракта горошка», разработан проект ФС «Экстракт горошка».

23

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований дано ботанико-фармакогностическое и

товароведческое обоснование возможности расширения сырьевой базы лекарственных растений за счет использования трех видов горошка: мышиного, заборного, лесного, произрастающих в Московской области.

2. Изучены особенности онтогенеза и ритма сезонного развития трех видов горошка.

Жизненный цикл горошков дифференцирован на четыре возрастных периода и одиннадцать возрастных состояний. В ходе онтогенеза выявлены изменения морфологических (морфогенез) и анатомических признаков.

3. Выделены основные критерии, характеризующие возрастные этапы онтогенеза

горошков: качественные и количественные морфологические и анатомические признаки. Показано, что длительность жизни дикорастущих горошков зависит от условий их произрастания (абиотических и биотических факторов внешней среды). Установлено, что взрослые вегетативные и генеративные растения характеризуются максимальными размерами и наибольшей биомассой, что следует учитывать при заготовке особей на сырьё.

4. Изучен флавоноидный состав сырья травы трех видов горошка и лекарственных

форм: отваров и экстрактов. Выделены и идентифицированы четыре основных флавоноида: рутин, гиперозид, лютеолин и катехин. Проведен сравнительный анализ содержания флавоноидов в трех видах горошка; показано влияние возрастного состояния, фазы вегетации и условий произрастания на количество флавоноидов. Установлено, что для рационального и эффективного использования дикорастущих ценопопуляций горошков следует заготавливать на сырьё молодые и средневозрастные генеративные растения в фазе цветения. Показано, что трава является оптимальным сырьем для заготовки.

5. Разработаны методики количественного определения флавоноидов в траве трех

видов горошка и жидком экстракте. Относительные ошибки методик не превышали ± 3 %.

6. Исследована динамика содержания белка в сырье травы горошков в онтогенезе,

показана перспективность заготовки на сырье молодых и средневозрастных генеративных растений. Определен состав свободных и связанных аминокислот сырья травы трех видов горошка и лекарственных форм (отваров и экстрактов). Установлено наличие 15 аминокислот, среди которых 7 - незаменимые. Суммарное содержание аминокислот в траве горошков составило 35 - 37 %.

7. Изучен минеральный состав сырья травы трех видов горошка в онтогенезе.

Показаны и обоснованы закономерности в содержании минеральных компонентов по возрастным состояниям растений. Исследована степень извлечения минеральных компонентов из сырья в лекарственные формы (отвары, экстракты).

8. Установлена цитотоксическая активность экстрактов травы трех видов горошка в

опытах in vitro. Показано их модулирующее действие на киллерную активность мононуклеаров крови. Установлено соответствие полученных результатов действию известных иммуномодуляторов, таких как интерлейкин 1 и интерлейкин 2.

9. Исследовано влияние экстрактов травы горошков на цитотоксическую активность

тромбоцитов мышей с целым рядом перевиваемых опухолевых клеток в опытах in vivo. Установлено достоверное избирательное увеличение киллерных свойств тромбоцитов при добавлении экстрактов горошков. При изучении противоопухолевого действия экстрактов показано, что они не обладают прямой противоопухолевой активностью, но отмечается тенденция к увеличению длительности жизни животных. Установлено, что по токсичности экстракты травы горошков относят к 4 классу малотоксичных веществ.

10. С целью стандартизации сырья травы горошков мышиного, заборного и лесного были установлены их диагностические морфологические и анатомические признаки, предложены показатели качества и их нормы. Для стандартизации жидких экстрактов горошков изучены их потребительные свойства, разработаны показатели качества и их нормы. Изучена стабильность сырья травы горошков и экстрактов в процессе хранения.

11. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены технические условия на траву горошка мышиного и экстракт травы горошка; опытно - промышленные регламенты на производство сырья травы горошка мышиного и экстракта горошка; инструкция по сбору и сушке травы горошка мышиного; разработан проект ФС «Экстракт горошка».

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Бойков A.A., Бабаскина Л.И., Хасаншина А.Р. и др. Изучение аминокислотного состава представителей рода Vicia L.// В сб: Тез. докл. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 2004. - С. 90-91.

2. Бойков A.A., B.C., Бабаскина J1.И., Хасаншина А.Р. и др. Изучение минерального состава представителей рода Vicia L. .// В сб: Тез. докл. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 2004. - С. 760.

3. Бабаскина Л.И., Бойков A.A., Хасаншина А.Р. и др. Выделение и исследование флавоноидов представителей рода Vicia L. .// В сб: Тез. докл. X! Российского национального конгресса «Человек и лекарство». M., 2004. - С. 760.

4. Бойков A.A., Хасаншина А.Р. Изучение химического состава представителей рода Vicia L.// В сб. матер, конф. «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» 8-9 сентября 2004, Барнаул, 2004 С. So-s2..

5. Бойков A.A., Бабаскина Л.И., Барабанов Е.И. и др. Исследование флавоноидного состава сырья и экстракта трех видов горошка // В сб.: Приоритеты фармацевтической науки и практики // Матер, заочной международной конф. М., 2006 - С.300-302.

6. Бойков A.A., Хасаншина А.Р. Медицинское применение трех видов горошка и других бобовых // Медицинская помощь, 2006, №3, С. 46-48.

ПМП АХУ-филнал ОАО «РЖД» v.l. Новая Басманная, д.6 Зак. тнр. экз. 200^ г.