Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование рода Equisetum L.флоры Сибири как источника лекарственных средств

004609914

На правах рукописи

КОЛОМИЕЦ НАТАЛЬЯ ЭДУАРДОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

РОДА ЕСШ18ЕТиМ Ь. ФЛОРЫ СИБИРИ КАК ИСТОЧНИКА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

2 3 СЕН 2010

Москва - 2010

004609914

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению (ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава), г. Томск

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор Калинкииа Галина Ильинична

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению (ГОУ ВПО ЯрГМА Росздрава), г. Ярославль

Защита состоится «8» ноября 2010г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « » семт^е** 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор фармацевтических наук, профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор Ермакова Валентина Алексеевна

доктор химических наук, профессор Звонкова Елена Николаевна

Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

А.И. Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фармацевтическая практика постоянно требует увеличения ассортимента и количества лекарственного растительного сырья (JIPC) для получения новых эффективных лекарственных препаратов. Расширение ассортимента JIPC возможно за счет внедрения в медицинскую практику растений народной медицины и, прежде всего, видов, систематически близких к официнальным. С этой точки зрения значительный интерес представляют растения рода хвощ.

Род хвощ Equisetum L. по оценкам современных систематиков насчитывает до 35-38 видов травянистых растений. На территории Российской Федерации, по разным данным, род Equisetum L. представлен 1215 видами, 10 из них произрастают в Сибири. Многие вопросы систематики рода являются спорными и в настоящее время трактуются различными ботаническими школами по-разному. Кроме того, до настоящего исследования химический состав значительного количества видов флоры Сибири оставался неизученным, а из всего рода хвощ только 1 вид является официнальным лекарственным растением - хвощ полевой Equisetum arvense L. В то же время большинство хвощей на протяжении длительного времени успешно используются коренными народами для лечения различных заболеваний. Несмотря на это, виды хвоща, близкие официнальному по систематическому положению и морфологическим признакам, до сих пор не используются в медицинской практике.

Информация о качественном составе биологически активных веществ (БАВ) рода хвощ носит фрагментарный характер. Химическая характеристика большинства видов неполная, а у некоторых представителей рода отсутствует. Наиболее изучен фенольный комплекс хвоща полевого, произрастающего в Европейской части России, Польше и Японии; значительное число видов флоры Сибири не изучены.

С точки зрения химического состава род хвощ представляет особый интерес. Фенольные соединения некоторых видов этого рода представлены редкой группой флавоноидоа - 5-оксифлавонами. Большой интерес заслуживает и минеральный комплекс данных растений, основным элементом которого являются соединения кремния.

Исследование химического состава хвощей необходимо для оценки качества сырья, а также для установления возможной взаимосвязи между биологической активностью и компонентным составом различных видов хвоща, что позволит предложить методологию дальнейшего исследования и практического использования перспективных видов.

Актуальной остается проблема анатомо-морфологической диагностики видов рода хвощ. Современные требования по внедрению в медицинскую практику новых видов лекарственного растительного сырья включают в себя не только исследование фармакологических свойств и химического состава, но и детальное исследование морфологических и анатомических признаков сырья для определения его подлинности.

Данные анатомо-морфологического исследования могут быть использованы для решения теоретических вопросов систематики рода хвощ с целью объективной оценки различий между систематически близкими, но морфологически трудно различимыми видами различного ранга. Кроме того, при разработке оптимальных режимов сбора, сушки, хранения сырья, а также условий извлечения биологически активного комплекса (БАК) необходимо учитывать особенности морфологической и анатомической структуры растений.

Таким образом, широкое распространение большинства видов хвоща, длительная история их успешного применения в народной медицине, фрагментарная изученность подчеркивают обоснованность нашего интереса и выбора в качестве объекта исследования представителей этого древнего рода.

Цель работы. На основании комплексного химико-фармакологического исследования разработать научно-методическое обоснование использования перспективных видов рода хвощ флоры Сибири как источников новых лекарственных средств.

Задачи исследования:

1. На основании данных литературы по систематическому положению, распространенности, сырьевым ресурсам выделить наиболее перспективные для дальнейшего исследования виды хвоща.

2. На основании сравнительного анатомо-морфологического исследования получить достоверную информацию о сходстве и различиях видов рода хвощ для выявления диагностических признаков.

3. Оценить фармакологическую эффективность биологически активных комплексов видов рода хвощ по различным фармакологическим тестам.

4. Провести сравнительное исследование основных групп БАВ видов рода хвощ; выделить и идентифицировать фенольные соединения. Полученные данные использовать для анализа связи химического состава с фармакологическими свойствами хвощей.

5. Разработать нормативную документацию (проекты ФС, инструкции по сбору и сушке ЛРС и др.) на предлагаемое ЛРС перспективных видов хвоща.

Научная новизна. Впервые на основании данных по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам видов рода Equisetum L. флоры Сибири установлено, что наиболее перспективными для химико-фармакологического изучения являются: хвощ полевой, х.речной (приречный), х.зимующий, х.болотный, хлуговой, хлесной, х.береговой (прибрежный).

Установлены морфологические различия видов хвоща по характеру обрыва стебля, ветвлению, форме и длине влагалищ стебля; направлению и количеству граней ветвей 1-го и 2-го порядка; структуре зубцов влагалищ стебля; наличию или отсутствию спороносных колосков; характеру поперечных срезов стебля и ветвей, наличию и строению выростов на верхушках ребер.

Впервые проведено сравнительное изучение анатомических особенностей 10 видов рода Equisetum L Выявлены признаки, характерные для рода хвощ, а также отличия для видов, относящихся к различным подродам.

Впервые проведено определение устьичного индекса для 10 видов рода хвощ флоры Сибири. Показано, что устьичный индекс, как стоматографический признак, с определенной степенью достоверности можно использовать только для идентификации видов подродa Hippochaete Milde.

Впервые проведена оценка фармакологической активности хвощей флоры Сибири по различным тестам. Установлено, что виды подрода Hippochaete Milde, содержащие преимущественно соединения кремния в сочетании с небольшим количеством фенольных соединений, проявляют выраженную диуретическую, противогрибковую и противовоспалительную активность. Виды данной группы нецелесообразно рассматривать в качестве источников препаратов антибактериального и гепатопротекторного действия. Виды подрода Equisetum Sad., накапливающие в значительных количествах фенольные соединения, ПСК и небольшое количество кремния, перспективны в качестве источников диуретических, антимикробных, противовоспалительных и гепатопротекторных средств.

Из 10 видов хвоща выделены и идентифицированы 30 веществ фенольной природы, из них впервые кемпферол 3,7-ди-0-а-Ь-рамнопиранозид. Впервые методом ВЭЖХ-МС обнаружены дихлорпроизводные фенольных соединений (дихлорапигенин, дихлоркемпферол), эллаговая кислота.

В зависимости от состава флавоноидов виды рода хвощ разделены на три группы: виды, накапливающие только гликозиды кемпферола (E.palustre,

E.hiemale, E.scirpoides, E.variegatum, E.ramossisimum); виды, накапливающие гликозиды кемпферола и кверцетина (E.pratense; E.sylvaticum); виды, накапливающие гликозиды кверцетина, кемпферола, апигенина, генкванина и лютеолина (E.fluviatile; E.arvense, Е.1 litorale).

В 10 видах хвоща флоры Сибири установлено наличие более 30 макро-и микроэлементов. Различия в компонентном составе отсутствуют и связаны с удельным содержанием элементов. В видах, систематически близких, отмечено сходное накопление элементного состава. Установлено, что виды подрода Hippochaete Milde превосходят виды подрода Equisetum Sad. по содержанию кремния в 2-3 раза.

Научная новизна полученных результатов защищена 2 патентами Российской Федерации.

Научно-практическая значимость работы. На основании результатов анатомо-морфологических и химических исследований разработаны методики, позволяющие объективно оценивать подлинность и качество сырья хвощей, которые включены в проекты новой нормативной документации.

Разработаны показатели качества сырья хвоща полевого и методики их оценки, которые включены в проект новой Фармакопейной статьи «Хвоща полевого трава».

По результатам диссертационной работы внедрены:

- нормативная документация: ФС 42-0209-07 «Хвоща полевого трава»;

- «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща полевого», утверждена комиссией по стандартизации ВИЛАР (г.Москва), протокол №2 от 03.02.2006

Разработаны:

- проект ФС «Хвоща зимующего трава»;

- проекты ФСП: «Урологический сбор»; «Климактерический сбор».

Предложенный состав урологического сбора и методики его

стандартизации использованы ООО «Биолит» для разработки гранулированной БАД к пище «Уролизин» (Акты внедрения от 02.02.2005).

Результаты исследований включены в монографию Коломиец Н.Э., Калинкиной Г.И. «Растения рода Хвощ (EQUISETUM L.). Систематика, химический состав, перспективы использования в медицине», а также учебно-методические пособия, используемые в учебном процессе студентами, преподавателями и практическими работниками: «Проблема урологических заболеваний и основные направления их решения с помощью фитотерапии», «Лекарственные препараты и биологически активные добавки на основе биологически активных веществ хвоща», «Анализ лекарственного растительного сырья по внешним и микроскопическим признакам»,

«Диагностические признаки хвоща полевого и близких к нему видов», «Методы фармакогностического анализа лекарственного растительного сырья. Химический анализ».

Получены патенты на изобретения:

- «Лекарственное средство, обладающее комплексным диуретическим, противомикробным и противовоспалительным действием» № 2314116 от

10.01.2008 г;

- «Лекарственное средство для профилактики и лечения патологический проявлений климактерического синдрома» № 2376026 от

20.12.2009 г.

На защиту выносятся

1. Результаты обоснования выделения наиболее перспективных видов рода хвощ Флоры Сибири по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам;

2. Результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования видов рода хвощ флоры Сибири;

3. Результаты изучения химического состава фенольных соединений и минерального комплекса хвощей;

4. Результаты оценки фармакологической эффективности биологически активных комплексов видов рода хвощ по различным фармакологическим тестам;

5. Результаты исследований по разработке нормативной документации на перспективные виды хвоща.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на научно-практической конференции, посвященной 80-летию фармацевтической службы Самарской области, Самарского государственного медицинского университета и Самарского аптечного склада «Современные тенденции развития фармации» (Самара, 1999); Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); первой Международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию со дня открытия проф.К.Н.Виноградовым сибирской двуустки у человека «Актуальные проблемы инфектологии и паразитологии» (Томск, 2001); Международной конференции молодых ученых «Леса Евразии в III тысячелетии» (Москва, 2001); Всероссийской научно-технической конференции «Лекарственные средства и пищевые добавки на основе растительного сырья» (Бийск, 2001); Международной конференции молодых врачей «Yong doctors on the third millennium» (Ереван, Армения, 2001); Первом съезде микологов

«Современная микология в России» (Москва, 2002); научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004); постоянно действующей научно-технической школе-семинаре студентов, аспирантов и молодых ученых «Информационные системы мониторинга окружающей среды» (Томск, 2004); III Международной научной конференции, посвященной 120-летию Гербария им.П.Н.Крылова «Проблемы изучения рационального покрова Сибири» (Томск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профЛ.Н.Березнеговской «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной памяти А.С.Саратикова (Томск, 2006); Международной научно-практической конференции «Научные исследования и практическое применение. Современное состояние и пути развития 2007» (Одесса, Украина, 2007); 63 Всероссийской научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); IX международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского Государственного медицинского университета и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 16 статей в журналах из перечня, рекомендуемого ВАК; получены 2 патента на изобретение; издана 1 монография и 5 учебно-методических пособий для студентов, преподавателей и работников практической фармации.

Работа представляет итог исследований, выполненных автором в творческом содружестве с сотрудниками кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ, кафедры фармацевтической технологии СибГМУ, микробиологии с курсом вирусологии СибГМУ; кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета (г. Барнаул); Института органической химии СО РАН (г. Новосибирск); кафедры химии и технологии материалов современной энергетики Северского государственного технологического института Национального

Исследовательского Ядерного Университета «МИФИ» (г.Северск); The Herbarium, Royal Botanic Garden (Edinburgh, Great Britain); Pharmazeutisches Institut der Universität (Bonn, Germany).

Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 326 страницах машинописного текста. В тексте приведено 47 таблиц и 58 рисунков. Библиографический указатель включает 385 источников литературы, из них зарубежной - 209.

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе приведена историческая справка происхождения рода хвощ, обозначены методологические подходы к поиску перспективных видов рода хвощ на основе данных по ресурсам, распространению, применению в народной медицине, степени изученности химического состава и фармакологических свойств. Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, охарактеризованы методы и методики, использованные в работе. Третья глава посвящена исследованию анатомо-морфологических признаков 10 видов рода хвощ. В четвертой главе приведены результаты оценки фармакологической эффективности биологически активных комплексов видов рода хвощ по различным фармакологическим тестам. В пятой главе представлены результаты сравнительного исследования видов рода хвощ на содержание основных групп БАВ: фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот), полисахаридного комплекса, макро- и микроэлементного состава, в том числе соединений кремния. Приведены результаты выделения и идентификации фенольных соединений. Шестая глава посвящена решению вопросов практического использования видов рода хвощ: разработке проектов нормативной документации на сырье хвоща полевого, х.зимующего и новых лекарственных растительных сборов. В разделе «Заключение» обсуждены полученные результаты и перспективы их практического применения; изложено научно-методическое обоснование использования перспективных видов рода хвощ Флоры Сибири как источников новых лекарственных средств.

В приложении представлены проекты нормативной документации, акты внедрения, патенты, УФ-, MC-спектры некоторых соединений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы я методы исследования

Объектами исследования являлись надземные части дикорастущих растений 10 видов растений рода Equisetum L.(Equisetum arvense L., Equisetum sylvaticum L., Equisetum pratense Ehrh., Equisetum palustre L„ Equisetum hyemale L., Equisetum fluviatile L., Equisetum scirpoides Michx., Equisetum ramossisimum Desf, Equisetum variegatum Schleicher ex F. Weber & D.Mohr, Equisetum * litorale Kuehlew.), собранные в различных районах сибирского региона в пределах их естественного ареала. Сбор материала осуществляли в течение всего вегетационного периода, а также в начале осени (сентябрь, начало октября) 1998-2007 гг. Кроме того, с целью выявления внутривидовых различий в зависимости от географического фактора были проанализированы образцы, собранные лично автором диссертации в окрестностях г.Монреаля провинции Квебек (Канада), окрестностях г.Варна (Болгария), Ленинградской, Тверской и Московской областях. В идентификации некоторых образцов автору была оказана помощь Dr. Cristoper Nigel Page (Великобритания), за что приношу ему искреннюю благодарность.

Исследование внешних и анатомических признаков хвощей проводили в соответствии со статьями «Методы анализа лекарственного растительного сырья», «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI. Для получения ультратонких поперечных срезов стеблей и ветвей толщиной 20 нм использовали микротом «Микротом МЗ-2». Всего было изготовлено около 650 препаратов. Готовые препараты изучали под микроскопом Carl Ziess (увеличения 7x1,5x4,5; 7x1,5x8; 7x1,5x20; 7x1,5x40), цифрового фотоаппарата «Sony» Cyber Short 5.1. Полученные снимки, обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop CS».

Размер и количество устьиц определяли по методике Европейской Фармакопеи. Подсчет количества клеток и устьиц, размеров устьиц проводили в 30-кратной повторности с подсчетом средней величины.

Для обнаружения, разделения, идентификации, выделения и количественного определения БАВ в исследуемых объектах использовали качественные реакции, спектральные, хроматографические и другие общепринятые методы анализа.

Для хроматографического анализа, идентификации, количественного определения использовали хроматографически чистые вещества, стандартные образцы и известные вещества производства Fluka, Sigma, Aldrich, Merck.

Спектральные исследования проводили на приборах СФ-46; СФ-2000; Specord UR-20; ЯМР-спектры снимали на спектрометре BS-567A (Tesla); Bruker-AM 500.

ВЭЖ-хромато-масс-спектрометрия. Хроматофафический анализ был проведен в НИИ органической химии (г.Новосибирск) под руководством проф.Ткачева A.B. Метод химической ионизации был осуществлен на жидкостном хроматографе с диодно-матричным УФ - и масс-селективным детекторами (Agilent Technologies 1100 Series LS/MSD). Диодно-матричный детектор (модель G 1315В) позволил провести детектирование и запись спектров поглощения в УФ диапазоне 230-500 нм, а масс-селективный детектор - определить молекулярную массу компонентов с точностью 0,1 а.е. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой Zorbax XDB-C8 Rx-С18 (4,6x150мм), наполнитель с диаметром частиц 5мкм и размером пор 80 А, 2,3% НСООН-МеОН (градиент от 40 до 90% метанола с 5 до 10 минуты), 1 мл/мин. Колонку термостатировали при 30°С. Диодно-матричным детектором вели одновременное детектирование на длинах волн 280 и 340 нм при ширине полос 40 нм и контрольной длине волны 560 нм, ширина 100 нм. Масс-селективный детектор (модель G1946C) был использован в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), сканирование проводилось для отрицательных и положительных ионов в диапазоне m/z от 100 до 1000. Сочетание масс-селективного детектора в двух режимах (APCI, Pos. Scan, и APCI Neg. Scan.) с УФ-детектором дает наиболее полную информацию о компонентах в исследуемых растениях. Напряжение на фрагментаторе для положительных ионов 40 вольт, для отрицательных - 70 вольт. Поток газа - осушителя (азота) - 7 л/мин, его температура - 340°С, давление на распылителе 60 psi (фунтов на квадратный дюйм), температура испарителя 400°С.

Расшифровка масс-спектров проведена под руководством профессора кафедры химии СибГМУ д-ра хим. наук Юсубова М.С.

Изучение элементного состава образцов проводили методом нейтронно-активационного анализа (работу проводили в Научно-исследовательском институте ядерной физики при НИ «Томский политехнический университет») и рентгенофлуоресцентного анализа (исследование проведено на кафедре химии и технологии материалов современной энергетики СГТА НИЯУ «МИФИ»).

Для оценки перспективности выбранных объектов исследования были проведены фармакологические испытания диуретической, антимикробной, противовоспалительной, антирадикальной и гепатопротекторной активности.

Фармакологические исследования по вышеуказанным тестам проводили с использованием принятых для этих целей методик и моделей. В экспериментах использовали 300 беспородных мышей-самцов массой 18-22г и 200 белых крыс-самцов массой 150-200г. Животных содержали в пластмассовых клетках, на подстилке из древесных опилок, на стандартном лабораторном рационе, в условиях свободного доступа к пище и воде, при естественном режиме освещения. Все манипуляции с животными проводили в дневное время суток. Эксперименты выполнены в осенне-зимний период.

Исследование диуретической активности проводили на беспородных белых крысах-самцах. Животные находились в индивидуальных обменных клетках в условиях свободного доступа к воде и пище. Ежесуточно измеряли количество объем выделенной мочи. В моче определяли концентрацию креатинина, ионов натрия и калия. Данный фрагмент работы выполнен на кафедре фармакологии Алтайского государственного медицинского университета (г. Барнаул) под руководством проф. Зверева Я.Ф., за что выражаем ему искреннюю благодарность.

Противовоспалительную активность определяли на модели острого агарового отека задней конечности крыс-самцов.

Противогрибковые свойства исследовали методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро.

Антибактериальную активность экстрактов исследовали методом серийных разведений на мясопептонном бульоне.

Антитоксические свойства исследуемых экстрактов оценивали по их влиянию на выживаемость белых беспородных мышей-самцов при воздействии токсических доз тетрахлорметана.

Гепатопротекторное действие оценивали по влиянию на антитоксическую функцию печени и ее метаболические показатели в условиях острого гепатита у белых беспородных крыс-самцов, вызванного введением тетрахлорметана, в сравнении с эффективностью эталонного гепатопротектора.

Для оценки антирадикальной активности использовали скрининговый тест, основанный на изучении взаимодействия исследуемых образцов со стабильным радикалом - а-дифенил-а-пикрилгидразилом (ДФПГ).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрического критерия Стъюдента и критерия инверсий Мана-Уитни, определяли среднюю арифметическую (М) и ее стандартную ошибку (т). Расчеты проводили с помощью программы «Statistica for Windows 7.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Морфолого-анатомическое исследование видов рода хвощ

Результаты проведенного морфолого-анатомического исследования 10 видов хвоща флоры Сибири, в сравнении с европейскими и канадскими образцами позволили выявить, уточнить, расширить и впервые обобщить морфологические, микроморфологические и анатомические признаки стеблей и ветвей 10 видов рода Equisetum L.

Внешний вид поверхности ветвей и стеблей разных видов хвоща отличается по наличию и строению выростов на верхушках ребер (гребнях), строению поперечных срезов стебля и ветвей (наличию и расположению полостей, расположению колленхимы, эндодермы и др.), характеру клеток эпидермиса, наличию и форме эпидермальных выростов, количеству рядов устьиц, хорошо различимых при рассмотрении в стереомикроскоп или лупу.

К числу важных анатомических особенностей хвощей относятся строение устьичного аппарата, расположение устьиц в бороздках, форма выступов на верхушках ребер стеблей и ветвей (рис. 1). Так для подрода Equisetum Sad. характерным является наличие непогруженных или слегка погруженных устьиц, расположенных в бороздках узкими и широкими полосами без четко выраженных продольных рядов, а также многообразие выростов клеток эпидермиса на верхушках ребер стеблей и ветвей. Видам подрода Hyppochatae Milde свойственно наличие погруженных устьиц, расположенных в бороздках узкими полосами в 1-3 четко выраженных продольных ряда и однообразие выростов клеток эпидермиса.

Другой важной особенностью хвощей является строение поперечных срезов стебля и веточек: расположение механической ткани, ее развитие, расположение эндодермы, наличие или отсутствие колленхимы в бороздках и ребрах стеблей, наличие или отсутствие центральной полости в ветвях.

Equisetum arvense

Подрод Hyppochatae Milde

Equisetum hyemale

Подрод Equisetum Sad.

lisetum fluviatile

lisetum palustre

Equisetum pratense Equisetum E. x litorale Equisetum variegatura

Equisetum ramossisimum

Equisetum pratense E.fluviatile Equisetum scirpoides

Рис. 1. Анатомическое строение видов рода Equisetum L.

Впервые проведено определение устьичного индекса для 10 видов рода хвощ флоры Сибири по методике Европейской Фармакопеи (табл.1). Показатель «устьичный индекс» используется в систематике растений для решения спорных вопросов, связанных, в первую очередь, с наличием гибридов. Кроме того, этот показатель можно использовать для идентификации видов, так как устьичный индекс является видоспецифичным. Нами показано, что устьичный индекс, как стоматографический признак, можно использовать только для идентификации видов подрода Hippochaete Milde. Варьирование устьичного индекса в пределах 1% в хвоще прибрежном, вероятно, является одним из доказательств его гибридогенного происхождения.

Таблица 1

Устьичный индекс видов рода Equisetum L.

Виды n Устьичный индекс,%

Подрод Equisetum Sad.

Equisetum * litorale Kuehlew. 6 13-20

Equisetum arvense L. 44 11-12

Equisetum sylvaticum L. 20 20-22

Equisetum pratense Ehrh. 20 17

Equisetum fluviatile L. 20 15-17

Equisetum palustre L. 20 24-25

Подрод Hippohaete Milde

Equisetum hyemale L. 40 13

Equisetum scirpoides Michx. 10 19

Equisetum ramosissimum Desf 10 12

Equisetum variegatum Schleicher ex F. Weber &D.Mohr 10 16

Результаты анатомо-морфологического исследования видов рода хвощ использованы нами при разработке нового проекта Фармакопейной статьи «Хвоща полевого трава», «Инструкции по сбору и сушке травы хвоща полевого», проекта ФС «Хвоща зимующего трава», проектов ФСП «Урологический сбор» и «Климактерический сбор».

Исследование химического состава видов рода хвощ

Общепринятыми химическими методами нами исследован качественный состав 6 видов подрода Equisetum Sad. и 4 видов подрода Hippohaete Milde. Данные таблицы 2 показывают, что в надземной части всех хвощей присутствуют флавоноиды, фенолокислоты, аминокислоты,

алифатические кислоты, сапонины, алкалоиды, витамины, соединения кремния. Впервые для многих представителей рода хвощ было установлено, что в качестве запасных питательных веществ накапливаются полисахариды. Отсутствие кумаринов, по нашим данным, согласуется с данными литературы.

Таблица 2

Содержание основных групп БАВ в видах рода Едтваит I*

(% на абс.-сухое сырье)

Виды Флавоноиды Фенолкарбоновые кислоты Тритерпеновые | соединения Полисахариды Аминокислоты Витамин К Каротиноиды, мг% Соединения кремния

Подрод Едшзегит БЫ.

Е.агуепБе Ь. 2,38± 0,57± 7,37± 13,61± 0,53± 0,22+ 4,78± 1,31±

0,08 0,02 0,31 0,19 0,02 0,006 0,72 0,15

Е.рга(еп5е 0,99± 0,53± 7,08± 6,33+ 0,43± 0,32+ 2,63± 1,05±

ЕЬгЬ. 0,018 0,05 0,21 0,20 0,009 0,01 0,11 0,03

Е.вукайсит 0,91± 0,59± 7,0± 5,96± 0,3 8± 0,27+ 3,89± 1,07±

Ь. 0,005 0,07 0,24 0,26 0,02 0,01 0,24 0,05

Е.раИше Ь. 1,11± 0,72± 8,92± 5,98± 0,46± 0,28+ 5,75± 1,23±

0,01 0,01 0,17 0,22 0,01 0,01 0,31 0,10

Е.Пиу1аШе Ь. 1,21± 0,71± 7,86± 6,08+ 0,32± 0,34+ 4,83± 1,19±

0,004 0,02 0,19 0,14 0,01 0,02 0,21 0,16

Е. х 1кога1е 1,201± 0,60± 7,58± 9,12± 0,45± 0,30+ 4,70± 1,36±

КиеЫеш. 0,003 0,02 0,16 0,18 0,02 0,004 0,60 0,09

Подрод Шррокае1е МШе

Е. 11уета1е Ь. 0,18± 0,062± 5,75± 4,19+ 0,26± 0,29+ 0,54+ 4,04±

0,009 0,00 0,25 0,07 0,01 0,01 0,04 0,11

E.variegatum

БсЫешЬег ех И. 0,11± 0,056+ 3,21± 3,49± 0,19± 0,26± 0,48± 3,31±

\Veber & 0,007 0,00 0,20 0,06 0,01 0,01 0,03 0,11

В.МоЬг

Е.гато51Б51ти 0,17± 0,058+ 3,56± 3,55± 0,19± 0,19+ 0,40± 3,53+

ш Ое$1 0,009 0,00 0,23 0,07 0,01 0,01 0,04 0,09

Е.БацкМев 0,12± 0,033+ 3,44± 2,23± 0,09± 0,10+ 0,22± 3,44+

М!сЬх. 0,006 0,00 0,10 0,04 0,01 0,01 0,04 0,10

По содержанию основных групп БАВ виды, представленные в таблице 2 можно условно разделить на 2 группы:

I группа - виды, близкие по составу х.полевому и представляющие интерес с точки зрения расширения его сырьевой базы. Эта группа представлена 6 видами подрода Equisetum Sad.: х.полевой, х.лесной, х.луговой, х.приречный, х.болотный и х.береговой (прибрежный). Виды первой группы преимущественно содержат фенольный комплекс (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты) в количестве 1,5% и выше. Внутри подрода Equisetum Sad. выделяются хвощ полевой и х.береговой, в которых накапливается 1,39% и 1,21% флавоноидов и 0,57% и 0,60% фенолокислот соответственно; х.речной и х.болотный содержат соответственно 0,71% и 0,72% фенолокислот. По-видимому, фенольные соединения играют в этих видах хвоща важную биологическую роль и наряду с сапонинами, полисахаридами, витаминами и каротиноидами, также присутствующими в достаточном количестве, определяют фармакологическую активность данных растений. Фенольные соединения, в частности флавоноиды, можно использовать для стандартизации лекарственного растительного сырья видов 1 группы.

II группа - виды, отличающиеся по химическому составу от хвоща полевого, практически неизученные, для которых необходимо определить направления использования в медицинской практике. Ко второй группе отнесены 4 вида подрода Hippohaete Milde: хвощ зимующий, х.ветвистый, х.камышковый, х.пестрый. Доминирующей группой БАВ в данных видах являются соединения кремния (до 6%), определяющие как морфологические признаки видов (жесткие и трудно ломающиеся стебли и ветви), так и возможно их фармакологические свойства. Соединения кремния также можно рассматривать как ведущую группу БАВ для стандартизации лекарственного сырья видов этой группы. Из других групп БАВ, накапливающихся в достаточном количестве, следует отметить сапонины и полисахариды. Виды подрода Hippohaete Milde относятся к видам, низкопродуцирующим флавоноиды и фенолокислоты, так как содержание флавоноидов не превышает 0,2%, а фенолокислот 0,07% соответственно. Для видов этой группы фенольные соединения следует, вероятно, рассматривать как сопутствующие БАВ, не оказывающие существенного влияния на их фармакологические свойства.

Таким образом, исходя из выше сказанного, для более детального исследования видов рода хвощ нами выбраны фенольные вещества и соединения кремния. Кроме того, учитывая отсутствие данных о полисахаридах этого рода, нами проведено исследование их фракционного

состава. Полисахариды, сопутствующие фенольным соединениям и микроэлементам в суммарных экстрактах лекарственного сырья, дополняют и усиливают их фармакологические свойства.

Выделение и установление структуры фенольных соединений хроматографическими и спектральными методами

Исследование фенольного комплекса хвощей методом колоночной хроматографии позволило выделить 21 вещество флавоноидной природы и 9 фенолкарбоновых кислот, структура которых установлена хроматографическими, физико-химическими и спектральными методами. При этом 1 вещество из хвощей выделено впервые.

С целью подтверждения и уточнения состава фенольного комплекса хвощей нами использован метод высокоэффективной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Анализу подвергли обогащенные фенольными соединениями хлороформные, этилацетатные и бутанольные фракции этанольных экстрактов.

При расшифровке ВЭЖХ-МС и выборе предполагаемой структуры веществ в качестве главных критериев использовали данные о времени удерживания, УФ- и масс-спектрах соответствующих пиков в сравнении со стандартными, аутентичными веществами и данными литературы.

Данным методом в хлороформной, этилацетатной и бутанольной фракциях хвощей подтверждено присутствие 10 веществ, выделенных и идентифицированных хроматографическими и спектральными методами: кемпферол-З-О-р-О-глюкозида, кепферол-софорозида, кемпферол-З-О-7-О-диглюкозида, кверцетин-З-О-Р-О-глюкопиранозида, кверцетин-З-О-рутинозида, гликозида генкванина, кофейной, хлорогеновой, п-кумаровой и феруловой кислот.

Кроме того, необходимо отметить, что методом ВЭЖХ-МС нами получены новые данные о химическом составе хвощей. С максимально возможной для данного метода достоверностью можно говорить о присутствии в хвощах гликозидированного производного госсипетина (рис. 2), эллаговой кислоты (рис. 3,4) и двух дигалогенированных флавоноидов (рис. 5-9). При этом эллаговая кислота описана для хвощей впервые, а дихлорапигенин и дихлоркемпферол описаны впервые не только для хвощей, но и для высших растений вообще.

Max: 46025

MSD1 SPC.tim 6=1.687 ot D:\DATA2OO6\YUSUBOV\Kti6_lP-O.D ÄPCI, Pos. Scar), Frag: 70

CÍ)

HO

HO^

m/z 317,1

OH

^ eg -- rt

v r, к

ffl a

100

... 200

300

400

Рис. 2 Масс-спектр фрагментов молекулярного иона госсипетина (m/z 317,2) и молекулярных ионов m/z 451,2 и m/z 495,3 в режиме ХИ APCI Pos. Scan.

Рис. 3 УФ - спектр вещества со временем удерживания 11.09

IßOl SPC. »n e=a.78í ¿ Í32 «ОС*Т*2ШЛ1 SUBO««7.1 POCO APUPco.&tt.frag 70 •«¿Oí £.799<ÜO^Wtó^WjSwtóWHTJN'ÜÓ'Ü №CÍ.ta$.SÜn'.^»в.ТО

100 i Mi: 7?1í 100 > - 8157

ÍM-HJ 0,

м- ao J-w

60 60 «^yiyOH

«0 40 но

¿ 0

а i m fl [ 20 3 m/z 302.0 Г ?

110 ?flí) ЖП Vi!) 4(10 mí Я0П ' ' 32(T ' ' 3*0 ' Vd ЗЯ0 4íW 4?fl

Рис. 4 Масс-спектр фрагментации молекулярного иона эллаговой кислоты в режиме ХИ APCI, Neg. Scan. ХИ APCI, Pos.Scan.

Рис. 5 а - УФ-спектр пика на ВЭЖ-хроматограмме со временем удерживания 8,196 мин этилацетатной фракции хвоща берегового; б - УФ-спектр пика 11,816 мин этилацетатной фракции хвоща берегового.

IÖÖ- cterCC'MC 1 t»T * Afrd't,!!*}. Sc im. Fra^: "ö

353/355/357

ео-

40 - 1 2

:о - 1 * 3 - P * ? s 0 II II 1 Ii fi i * 1 Ii 1

........ Jfft ¿ttfl ¿«'s * m

Рис. 6 Масс-спектр фрагментов молекулярного иона дихлоркемпферола (m/z 354,0) в режиме ХИ APCI Neg. Scan.

Рис. 7 Масс-спектр фрагментов молекулярного иона дихлоркемпферола (m/z 354,0) в режиме ХИ APCI Pos.Scan.

•MSD1 SPC, lime=l 1.651:11.866 of EACOMP1U>ATA2006\YUSUBOV\KH1_1N-O.D APCI, Noy. Scan, Frag: 70

Max: 19895

Рис. 8 Масс-спектр фрагментов молекулярного иона дихлорапигенина (m/z 338,0) в режиме ХИ APCI Neg. Scan.

338,0) и неидентифицированного молекулярного иона (m/z 248,1) в режиме ХИ APCI Pos. Scan.

Несомненно, наиболее интересным фактом нам представляется обнаружение в этилацетатной фракции хвоща полевого и х.берегового дигалогенсодержащих флавоноидов. Как известно, галогенированные фенольные соединения в природе встречаются очень редко. Практически все известные в настоящее время галогенированные фенольные соединения выделены из микроорганизмов, и низших растений. Поэтому факт обнаружения подобных соединений в хвощах, с одной стороны, подтверждает их древнее происхождение, с другой является своеобразным связующим звеном между низшими и высшими растениями.

Полученные нами данные о составе флавоноидов позволили разделить исследуемые виды рода хвощ на три группы, что соотносится с концепцией классификации хвощей, основанной на морфологических и микроморфологических характеристиках.

Как видно из схемы (рис. 10), к первой группе нами отнесены виды, не отличающиеся разнообразным составом флавоноидов и относящиеся к группе примитивных растений, стоящих в филогенетическом отношении на более низшей ступени развития. Исключение составляет хвощ болотный, относящийся к филогенетически более молодому подроду Equisetum Sad. Нахождение данного вида в одной группе с примитивными видами можно рассматривать как одно из подтверждений в пользу теории о недавнем эволюционном ответвлении подрода Equisetum Sad. от подрода Hippochaete Milde.

Классификация рода Equisetum L. по составу флавоноидов

1. Виды, накапливающие только гликозиды кемпферола:_

• Equisetum palustre (подрод equisetum)

• Equisetum hyemale ¡подрой Hippohaete)

• Equisetum scirpoides (подрод Hippohaete)

• Equisetum variegatum (подрод Hippohaete)

• Equisetum ramosissimum (подрод Hippohaete)

2. Виды, накапливающие гликозиды кемпферола и кверцетина

Equisetum pratense (подрод Equisetum) Equisetum syivaticum (подрод equisetum)

Классификация подрода Equisetum по морфологическим и микроморфологическим характеристикам (по C.N.Page)

Section I: EQUISETUM sect.nov.:

E.fluviatile

E.arvense

Section 2: SUBVERNALIA A.Br.:

E.pratense

E.sylvaticum

3. Виды, накапливающие гликозиды кверцетина, кемпферола и флавонов

Equisetum fluviatile (подрод Equisetum) Equisetum arvense (подрод equisetum) Equisetum * litorale (подрод Equisetum)

Section 3:PALUSTRIA sect.nov.:

E.palustre

E.bogotense

E.diffusum

E.telmateia

Рис.10 Классификация видов рода ЕцшвеЬип Ь.

Вторую и третью группы составили виды более молодые, продвинутые в систематическом отношении, для которых характерен более разнообразный состав флавоноидов.

Также отметим, что к последней группе отнесены виды, 2 из которых: х.полевой и х.речной являются родительскими видами третьего -х.прибрежного. Тем самым подтверждается высказываемое в литературе

мнение о том, что химический состав гибридов близок химическому составу родителей.

Таким образом, в результате детального изучения химического состава фенольного комплекса хвощей, были выделены, идентифицированы 30 компонентов, в том числе 1 вещество впервые - кемпферол-3,7-ди-0-а-Ь-рамнопиранозид (леспедин или кемпферетрин). Кроме того, дополнительно методом ВЭЖХ-МС впервые обнаружены дихлорапигенин, дихлоркемпферол и эллаговая кислота (табл.3).

Индивидуальные отличия в комбинациях содержащихся компонентов указывают на видовую самостоятельность хвощей в рамках единого таксона и дают дополнительную возможность решить вопросы систематики рода Ецшъешт Ь.

Таблица 3

Фенольные соединения видов рода ЕцшьеШт Ь. флоры Сибири

Виды

Соединение к о ш о « О X 5Х X н о в о а а> я о к я: о ш е и в 3 г >> в ш о а 3 « 2 о. ь Ж 2 н о 5 а

к; X с; >< о ю о с 5> о. о ю сб а о с а

X X X х X X X X

1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 и

апигенин- 4'-0-глюкозид

апигенин-5-0-Р-0-глюкопиранозид + + +

гликозид госсипетина + + + + + +

лютеолин- 5-0-Р-0-глюкопираиозид + + + + + +

кемпферол- З-О-Р-В-глюкопиранозид + +

кемпферол- З-О-глюкозид-7-О-рамнозид + + + + + +

кемпферол- З-О-рутинозид (никотифлорин) +

кемпферол- З-О-рутинозид-7-О-глкжозид +

кемпферол- З-О-рутинозид-7-О-рамнозид + + + + ■ + +

кемпферол- З-О-софорозид кемпферол-3-0-(6"-0-ацетилглюкозвд)-7-0- + + + + + + + + + + +

глюкозид кемпферол- 3- 0-7- О-диглюкозид + + + + + + + + +

кемпферол- 7-О-глюкозид + + +

кемпферол- 3-0-софорозид-4'-0 глюкозид

кемпферол -3,7-О-дирамнопиранозид

Окончание табл. 3

Соединение Виды

Х.луговой Х.лесной Х.болотный Х.полевой Х.речной X.береговой Х.зимующий Х.камышковый X. пестрый Х.ветвистый

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

генкванин- 5-0-р-0-глюкопиранозид кверцетин-З-О-р-О-глюкопиранозид кверцетин- З-О-Р-О-глюкозид-7- О-а-Ь-рамнозид кверцетин-З-О-рутинозид кверцетин- З-О-рутинозид-7-О-рамнозид кверцетин- 3-0-(3-0-софорозид кверцетин- 3- 0-7- О-диглюкозид кверцетин-3-рамнозид (кверцитрин) хлорогеиовая кислота метиловый эфир кофейной кислоты протокатеховая кислота п-оксибензойная кислота кофейная кислота галловая кислота п-кумаровая кислота феруловая кислота эллаговая кислота дихлорапигенин дихлоркемпферол + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ■.................. + + + + + + +

неидентифицированные соединения флавоноидной природы (1) (2) (3) (4) (5) (6) - + + + + + + - - - +

Примечание: «+»- вещество присутствует; «-»- вещество не обнаружено

Кроме того, проведенное нами исследование позволило определить константные вещества для рода Едшешт К ним отнесены 5 веществ: гликозид госсипетина, кемпферол-З-О-софорозид, кемпферол-3,7-0-диглкжозид, протокатеховая и п-кумаровая кислоты. Также мы посчитали возможным выделить таксономические маркеры для обоих подродов

(Equisetum Sad. - кемпфсрол-З-О-Р-О-глюкозид; Hippochaete Milde -кемпферол-3-0-софорозид-4'-0-глюкозид) и некоторых видов. Так, для хвоща полевого и хвоща берегового - 5-глюкопиранозиды лютеолина, апигенина и генкванина, для х.болотного - кемпферетрин.

Проведенные исследования позволили установить, что сибирские образцы хвоща полевого отличаются от европейских наличием 5-O-ß-D-глюкопиранозида лютеолина, что, вероятно, связано с эколого-географическим фактором, приводящим к образованию хемотипов. Данный факт учтен нами в новой ФС «Хвоща полевого трава» при разработке методики определения подлинности сырья методом хроматографии в тонком слое сорбента.

Исследование элементного состава видов рода Equisetum L.

Исследование элементного состава, помимо теоретических научных задач, в частности, привлечения этих данных в качестве дополнительного хемотаксономического маркера, позволяет оценить лекарственную ценность растительного сырья.

В видах рода хвощ установлено наличие более 30 макро- и микроэлементов (табл.4). Сравнение состава выявленных в хвощах элементов показывает, что оно сходно. Однако по содержанию некоторых элементов отдельные виды хвоща существенно отличаются друг от друга.

Общей тенденцией для всего рода является накопление кальция, натрия, железа, цинка, кремния. Отличия заключаются в преобладании у видов подрода Hippohaete Milde никеля, кобальта, кремния и меди. Для видов подрода Equisetum Sad. характерно накопление цинка и марганца.

Наименьшее удельное содержание элементов отмечено нами в более древних видах подрода Hippohaete Milde, при этом накапливают они в основном соединения кремния (Equisetum hyemale, Equisetum scirpoides, Equisetum variegatum, Equisetum ramosissimum); продвинутые в систематическом отношении виды подрода Equisetum Sad. (Equisetum arvense,

Equisetum pratense, Equisetum sylvaticum, Equisetum ßuviatile, Equisetum palustre, Equisetum * litorale) имеют более высокое удельное содержание элементов: при этом незначительное содержание кремния дополняется цинком и марганцем.

Таким образом, для видов рода хвощ элементный состав, наряду с 5-оксифлавонами, можно рассматривать в качестве дополнительного хемотаксономического маркера. По содержанию, роли для растений, а так же макро- и микроорганизмов самостоятельного исследования заслуживают соединения кремния.

Таблица 4

Элементный состав растений рода хвощ флоры Сибири, % от абс.- сухого сырья_

Элементы Род ЕдшзеШтЬ.

Подрод Equisetum Sad. Подрод Hippokaete Milde

Equisetum arvense Equisetum pratense Equisetum sylvaticum Equisetum fluviatile Equisetum palustre Equisetum x litorale Equisetum hyemale Equisetum scirpoides Equisetum variegatum Equisetum ramosissim um

К 0,44 0,18 0,60 5,00 0,24 5,07 0,45 0,33 0,34 0,31

Na 0,15 0,19 0,17 0,19 0,19 0,15 0,20 0,18 0,20 0,20

Са 4,10 7,30 6,60 9,61 9,00 9,20 10,22 8,61 9,11 10,0

С1 0,12 0,03 0,03 0,07 0,04 0,14 0,01 0,01 0,01 0,01

Вг -10"4 2,90 1,86 1,73 2,36 2,24 1,56 2,49 1,70 1,93 1,87

Fe -К)"4 277,9 44,1 68,65 286,35 294,7 226,5 284 210,90 221,00 270,33

Со -Ю"4 0,50 1,43 1,72 2,15 1,52 1,05 2,78 2,05 2,11 2,67

La -10"4 0,69 0,36 0,64 0,49 0,51 0,40 0,48 0,38 0,29 0,31

Мп -10"4 1,80 4,33 30,1 5,36 3,21 3,77 7,51 7,40 6,00 6,80

Rb -10"4 1,04 2,46 1,63 2,17 2,11 1,11 2,23 2,91 2,52 1,30

Pb -10"4 0, 50 1,15 1,72 2,15 1,52 0,25 2, 78 1,48 0,66 -

Se -lO"4 <0,009 <0,009 < 0,009 < 0,009 <0,009 < 0,009 < 0,009 <0,009 <0,009 < 0,009

Sr -10"4 4,57 4,84 3,91 3,25 3,44 3,01 2,97 1,90 1,00 1,40

Sb -10"4 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006 <0,006

Ta -10"4 <0,01 <0,01 <0,01 0,052 0,072 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

Соединения кремния

Как известно, отличительной особенностью видов рода хвощ является их способность накапливать кремний. Способность хвощей накапливать кремний отражается на морфологических и анатомических особенностях данных растений, имеет хемотаксономическое значение и определяет особенности фармакологического действия видов разных подродов.

Нами проведено определение всех форм кремния в золе спектроскопически на спектрографе ИСП-28 и растворимого минерального кремния спектрофоториметрическим методом.

Полученные нами результаты (табл.5) показывают, что степень накопления кремния в подроде Hippochaete Milde в 2-3 раза выше, чем в подроде Equisetum Sad. Это, несомненно, отражается на морфологических и анатомических особенностях данных растений, имеет хемотаксономическое значение, а также определяет особенности фармакологического действия хвощей, принадлежащих к разным подродам.

Таблица 5

Содержание кремния в видах рода Equisetum L_

Виды Содержание, %

в сырье в пересчете на элементарный кремний в золе в пересчете на Si02

Подрод Equisetum Sad.

Equisetum arvense 1,31±0,15 33,40+0,51

Equisetum pretense 1,05±0,03 26,18+0,33

Equisetum sylvaticum 1,07+0,05 28,52+0,50

Equisetum palustre. 1,23±0,10 39,34+0,39

Equisetum fluviatile 1,19+0,16 24,24+0,29

Equisetum x litorale 1,36±0,09 30,23+0,36

Подрод Hippohaete Milde

Equisetum hyemale 4,04+0,11 65,86+0,27

Equisetum variegatum 3,31+0,11 52,14+0,31

Equisetum ramosissimum 3,53±0,09 54,77+0,34

Equisetum scirpoides 3,44±0,10 50,03±0,29

Исследование фармакологической активности биологически активных комплексов видов рода хвощ

Проведена оценка биологической активности 7 видов рода хвощ флоры Сибири: хвощ полевой, х.речной (приречный), х.зимующий, х.болотный, х.луговой, х.лесной, х.береговой (прибрежный). Изученные виды хвоща имеют широкий спектр биологической активности: диуретической, противомикробной, противовоспалительной, гепатопротекторной.

Диуретические свойства. В эксперименте исследовали влияние однократного и длительного введения хвощей на функцию почек у крыс. Из 7 видов только хвощ зимующий и хвощ болотный существенно увеличили объем суточного диуреза и экскреторную функцию почек у крыс. Эти представители рода хвощ перспективны для дальнейшего углубленного фармакологического исследования в качестве диуретиков. Другие виды хвоща, в том числе и хвоща полевого вызывали незначительное увеличение мочеотделения.

Противовоспалительные свойства. Экспериментально были изучены противовоспалительные (антиэкссудативные) свойства 7 видов хвоща. Показано, что максимальный эффект, близкий к эффекту препарата сравнения, проявляется у хвоща полевого и хвоща зимующего.

Антибактериальная активность. Результаты исследования антибактериальных свойств различных видов хвоща in vitro показали, что более выраженный бактериостатический эффект проявляют виды подрода Equisetum Sad. Наиболее значительно подавляют активность кишечной палочки и клебсиеллы пневмонийной хвощ полевой, х. лесной, х. луговой, х. речной и х.болотный. В менее значимых концентрациях в отношении золотистого стафилококка и пневмонийной клебсиеллы бактериостатическое действие проявили виды подрода Hippochaete Milde:, при этом в отношении синегнойной палочки бактериостатическое действие проявляется только у х.зимующего, и не проявляется у остальных видов этого подрода.

Противогрибковые свойства. Оценка антигрибковых свойств представителей рода хвощ показала, что к числу перспективных фунгистатиков, задерживающих рост поверхностных дерматофитов в концентрациях 7,8-15,6 мкг/мл относятся 2 вида: хвощ полевой и хвощ зимующий.

Антирадикальные свойства. Проведенная оценка антирадикальных свойств хвощей показала, что наиболее выражены они у видов подрода Equisetum Sad. При этом высокая антирадикальная способность хвоща лесного и х.полевого коррелирует с их гепатопротекторным действием.

Гепатопротекторная активность. В качестве объектов исследования использовали хвощ полевой и хлесной, содержащие наибольшее количество фенольных соединений, а также хвощ зимующий, как представитель подрода Hippochatae Milde, отличающийся химическим составом от представителей подрода Equisetum Sad.

Результаты нашего исследования показывают, что хвощ лесной и х.полевой обладают более выраженным антитоксическим и гепатопротекторным действием, механизм которого требует более

детального изучения. При профилактическом введении экстракты данных растений увеличивают выживаемость мышей, которым инъецировали токсические дозы тетрахлорметана. На фоне острого токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном, экстракты хвоща полевого и хвоща лесного способствуют улучшению антитоксической и экскреторной функций печени, препятствует развитию структурно-метаболических нарушений. Хвощ зимующий - представитель подрода Hippohatae Milde, практически не изменял биохимических показателей сыворотки крови и индикаторных ферментов, не влияя, таким образом, на экскреторную и антитоксическую функцию печени.

Решение вопросов практического использования видов рода хвощ

Решение задачи по расширению ассортимента JIPC за счет внедрения в медицинскую практику видов, систематически близких к официнальным и приведение российских стандартов качества к уровню мировых (Европейская фармакопея, Британская фармакопея, Фармакопея США) требует с одной стороны разработки нормативной документации на вновь предлагаемое сырье, с другой - переработки и дополнений действующей НД, с учетом современных требований к оценке качества лекарственного растительного сырья.

Руководствуясь вышеизложенным, а также требованиями ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения», нами на основании исследования анатомо-морфологических признаков и химического состава хвоща полевого и близких к нему видов разработана фармакопейная статья «Хвоща полевого трава». Как видно из таблицы 6, в новый проект ФС внесены существенные изменения и дополнения в разделы «Внешние признаки», «Микроскопия» и «Числовые показатели»; внесены изменения в методику определения подлинности сырья методом ТСХ; введен новый раздел «Количественное определение», в котором описана методики определения содержания флавоноидов спектрофотометрическим методом в расчете на кверцетин, а также экстрактивных веществ. Данный показатель введен в связи с тем, что данное сырье предназначено для приготовления водных и водно-спиртовых извлечений. Кроме того, по новым требованиям в ФС включен раздел «Микробиологическая чистота».

По результатам нашего исследования интерес для углубленного исследования и внедрения в медицинскую практику представляет не только хвощ полевой, но и хвощ лесной, хлуговой, х.речной, х.прибрежный, х.болотный и х.зимующий.

Таблица 6

Разделы и показатели качества травы хвоща полевого, включенные в проект новой ФС42-0209-07

Разделы ФС ФС 50 ГФХ1 «Трава хвоща полевого» ФС 42-0209-07 «Хвоща полевого трава»

Внешние признаки 1. Цельное сырье 2. Измельченное сырье 1. Цельное сырье 2. Измельченное сырье 3. Порошок

Микроскопия 1. Цельное сырье 2. Измельченное сырье 1. Цельное сырье 2. Измельченное сырье 3. Порошок 4.Фотографии микропрепаратов хвоща полевого и примесей

Качественные реакции Пластинки «8йиЛ)1254». Идентификация подлинности сырья проводится по наличию 3 пятен с характерной ярко-голубой флюоресценцией Пластинки Идентификация подлинности сырья проводится по наличию не менее 2 зон адсорбции с характерной ярко-голубой флюоресценцией

Количественное определение отсутствует Введено впервые. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин спектрофотометрическим методом

Числовые показатели Цельное и измельченное сырье: влажность; содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты; измельченность и содержание примесей. 1. Цельное сырье. 2. Измельченное сырье. 3. Порошок 4. Содержание суммы флавоноидов не менее 0,1%; экстрактивных веществ, извлекаемых 40% этиловым спиртом, не менее 20%

Микробиологическая чистота отсутствует Введена впервые

В связи с этим нами на данном этапе разработаны показатели определения подлинности и качества сырья хвоща зимующий данного вида, включенные в проект Фармакопейной статьи «Хвоща зимующего трава». Учитывая высокое содержание соединений кремния в надземной части хвоща зимующего и их значимость в проявлении фармакологической активности, стандартизацию сырья данного вида хвоща нами предложено

проводить по содержанию кремния спектрофотометрическим методом. При этом использовали способность кремниевой кислоты давать с ионами молибдена в кислой среде (рН=1,5-1,7) растворимую кремнемолибденовую кислоту, окрашенную в желтый цвет. Кроме того, введен показатель «содержание экстрактивных веществ», так как указанное сырье рекомендуется использовать для получения водного настоя и экстракта на 40% этаноле.

Для других, исследованных нами видов хвоща, в данном разделе обсуждены перспективные направления их дальнейшего исследования и использования в медицине.

Заключение

На основании комплексного изучения нами разработано научно-методическое обоснование использования перспективных видов хвоща флоры Сибири, как источников новых лекарственных средств различного спектра действия. Предложенный научно-методический подход можно использовать для поиска, изучения и обоснования перспективности в медицине филогенетически близких видов других родов (рис. 11,12).

Проведенные нами на первом этапе теоретические исследования по систематическому положению, распространенности, оценке ресурсного потенциала, позволили сузить круг поиска и выделить для дальнейшего исследования наиболее перспективные виды хвоща.

Ареал хвощей на территории России достаточно велик. При этом наиболее изучена ресурсная база официнального вида - хвоща полевого, промышленную заготовку которого осуществляют в основном в Европейской части России. Как отмечают ресурсоведы, несмотря на большой ареал, природные запасы хвоща полевого на территории России не равноценны. Занимая огромные по площади территории хвощ полевой в большинстве районов России встречается рассеянно или в виде небольших куртин, что не позволяет осуществлять заготовительные мероприятия в большом объеме. Известны и районы, где хвощ полевой относится к видам, требующим охраны. При этом по всему ареалу хвощ полевой сочетается с другими видами хвоща (хлуговой, х.приречный, хлесной, х.болотный, х.зимующий), которые имеют еще более широкое распространение и образуют большие по размерам заросли. Отметим и другую проблему, возникающую при осуществлении заготовительных мероприятий. Как известно, хвощи отличаются крайним полиморфизмом, вследствие чего примесные виды, имеющие схожие с хвощом полевым морфологические признаки, ошибочно заготавливаются в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Этап

1

Этап 2,3

Этап 4,5

Рис. 11. Схема научно-методического подхода к исследованию видов рода Equisetuш Ь.

Подтверждением сказанному служат результаты нашего исследования по проблеме фальсификации и качества травы хвоща полевого, реализуемого на фармацевтическом рынке Томской области. Анализ образцов промышленных партий продукции более чем 20 российских производителей показал, что 70% образцов не соответствует требованиям ГФ XI по показателю «подлинность». При этом в 65% образцах вместо хвоща полевого обнаружен хвощ болотный, 5% образцов соответствовали хвощу лесному. На основании вышесказанного один из следующих этапов комплексного изучения хвощей был посвящен исследованию их анатомо-морфологических признаков. Полученные данные могут быть использованы для решения теоретических вопросов систематики с целью объективной оценки различий между систематически близкими, но морфологически трудно различимыми видами хвощей. Кроме того, на основании сравнительного анатомо-морфологического исследования получена достоверная информация о диагностических признаках хвощей,которая включена нами в проекты ФС «Хвоща полевого трава», «Хвоща зимующего трава».

Для определения направления изучения фармакологической активности перспективных видов хвощей был проведен анализ сведений научной и традиционной медицины по использованию исследуемой группы растений. На основании полученных данных проведено экспериментальное исследование экстрактивных комплексов хвощей по выбранным тестам.

Согласно предложенной схемы научно-методического подхода к исследованию видов рода хвощ на следующем этапе проведено исследование химического состава перспективных видов. Определены основные группы БАВ (фенольные соединения, соединения кремния); детально исследован компонентный состав фенольных соединений с установлением структуры веществ.

В составе исследуемых видов хвоща идентифицировано более 30 компонентов фенольной природы. Индивидуальные отличия в комбинациях содержащихся компонентов указывают на видовую самостоятельность хвощей в рамках единого таксона и дают дополнительную возможность решить вопросы систематики рода Едшяешт Ь. Достоверность различий подтверждена выделением и установлением структуры основных компонентов.

В рамках научно-методического подхода важным является вопрос об установлении возможной взаимосвязи между биологической активностью и компонентным составом различных видов хвоща, что позволяет предложить методологию дальнейшего исследования и практического использования перспективных видов (рис.12).

Как показали результаты исследования химического состава, основными БАВ видов рода хвощ являются фенольные соединения и соединения кремния, на основании содержания которых хвощи разделены нами на две секции.

Значимость фенольных соединений и соединений кремния хвощей, подтверждена нами экспериментальным изучением антимикробной, противовоспалительной, диуретической, гепатопротекторной и антирадикальной активности 10 видов рода хвощ флоры Сибири.

Нами показано, что водные извлечения 4 видов подрода Hippohaete Milde , богатые кремнием, в перспективных концентрациях (7,8-31,2 мкг/мл) подавляют активность поверхностных дерматофитий на уровне препаратов сравнения нитрофунгина и сангвиритрина. Для 6 видов подрода Equisetum Sadв которых преобладают флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и полисахаридный комплекс, с точки зрения противогрибковой активности перспективны водно-спиртовые извлечения (7,8-62,5 мкг/мл). Таким образом, можно предположить, что противогрибковые свойства хвощей в равной степени могут быть обусловлены, как соединениями кремния, так и фенольными соединениями.

Подрод Equisetum

Хвощ полевой Xлесной Х.речной Х-бачотный X.прибрежный Хлуговой

Преобладающими группами БАВ являются фенольные соединения до 2,5%; сапонины до 9%; ПСК до 14%; соединения кремния до 1,4%

Диуретическая

Хвощ баютный

Противогрибковая

Все виды

Антибактериальная

Все виды

Протм»овоспАлителм»я

Хвощ полевой

Гепатопротекгорная

Хвощ лесной, хвощ полевой

А нт и рад и кал ьн ая

Все виды

Диуретическая

Хвощ зимующий

Противогрибковая

Хвощ зимующий

Противовоспалительная

Хвощ зимующий

ГепатхвдМКГорная - -

Подрод Hippohaete

Хвощ зимующий X. камышковый

Х.пестрый X. раскидистый

Преобладающим и группами БАВ являются соединения кремния до 6,0%; фенольные соединения до 0,25%;

ПСК до 4,5%

Рис. 12 Взаимосвязь химического состава видов рода хвощ с их фармакологическими свойствами

Кроме противогрибкового действия, представляет интерес способность экстракционных препаратов хвощей подавлять активность некоторых бактерий, вызывающих и отягощающих течение целого ряда заболеваний инфекционно-воспалительного характера.

Исследование диуретической активности 7 видов хвоща показало, что наиболее значительно увеличивают диурез хвощ болотный и хвощ зимующий.

Диуретический эффект хвоща зимующего можно связать с содержанием кремния, в то время, как препараты хвоща болотного, по-видимому, оказывают диуретическое действие за счет суммирования эффекта флавоноидных гликозидов, фенолкарбоновых кислот и соединений кремния.

Известно, что соединения кремния препятствуют образованию мочевых камней, за счет образования защитных коллоидов, препятствующих кристаллизации минеральных солей, и тем, самым, затрудняющих образование из них камней. Заметим, что соли кремниевой кислоты наряду с выведением из организма излишка воды, препятствуют адгезии микроорганизмов, решая проблему выведения токсических веществ эндогенного и экзогенного происхождения, связывая их в кишечнике.

Что касается роли фенольных соединений в диуретическом эффекте, то многочисленными исследованиями различных авторов установлено, что ряд флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, выделенных из растений, обладают выраженной способностью увеличивать диурез и влиять на обмен электролитов в почках. Диуретический эффект выявлен у кверцетина, кемпферола, рутина, лютеолина, некоторых других флавоноидов, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот. Нами установлено, что хвощи содержат более 20 гликозидированных производных кемпферола, кверцетина, апигенинаи лютеолина.

Поскольку хвощи рассматриваются в качестве потенциальных средств для лечения урологических заболеваний, неотъемлемой частью которого является воспаление, была проведена оценка противовоспалительного действия хвощей.

Нами установлено, что хвощ зимующий и х.полевой статистически достоверно снижают прирост массы отека у экспериментальных животных. Высокую антиэкссудативную активность проявили экстракты хвоща болотного, х.речного и х.берегового.

При этом противовоспалительное действие хвоща полевого, х.болотного, х.речного и х.берегового может быть обусловлено флавоноидами, фенолкарбоновыми кислотами и полисахаридами. Большинство перечисленных веществ, по данным литературы, способны

ослаблять воспалительные и аллергические реакции, усиливать процессы регенерации.

Противовоспалительные свойства хвоща зимующего можно связывать с соединениями кремния. Защитная роль соединений кремния в купировании воспалительного процесса связана, прежде всего, с тем, что кремний, сосредоточенный в эластине и коллагене кровеносных сосудов, эпителиальных и соединительных тканях повышает их эластичность, упругость, снижает проницаемость стенок сосудов для «неблагоприятных» факторов. Как следствие, это улучшает местное кровоснабжение и способствует быстрому восстановлению поврежденных сосудов, тканей и органов.

При любом воспалительном процессе, в том числе и при патологии почек увеличивается токсическая нагрузка на печень, которая является основной мишенью для поражения различными ксенобиотиками, и, как правило, по свободнорадикальному механизму. В связи с этим важным элементом профилактических и терапевтических мероприятий является использование средств с антирадикальным действием. Данные литературы говорят о том, что антирадикальная активность растительных препаратов определяется, главным образом, фенольными соединениями (флавоноидами и фенолокислотами) и витаминами. Нами установлено, что антирадикальные свойства наиболее выражены у видов подрода Equisetum Sad. с преимущественным содержанием флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. При этом наиболее выраженную способность подавлять активность свободных радикалов проявил хвощ лесной, который также оказался наиболее перспективным гепатопротектором и корректором мутагенеза.

Исследование антитоксической и экскреторной активности хвощей показывает целесообразность углубленного изучения в данном направлении видов подрода Equisetum Sad., которые отличаются значительно большим набором гликозидов кверцетина, лютеолина, апигенина и фенолкарбоновых кислот. Напротив, нами отмечено, что экстракт хвоща зимующего -представитель подрода Hippohaete Milde практически не изменял биохимических показателей сыворотки крови и индикаторных ферментов, не влияя, таким образом, на экскреторную и антитоксическую функцию печени. Это позволяет сделать заключение о нецелесообразности поиска гепатопротекторов среди видов хвоща подрода Hippohaete Milde.

Таким образом, проведенные исследования показывают перспективность дальнейшего углубленного фармакологического исследования хвоща полевого, хлесного, хлугового, х.болотнош, х.речного, х.зимующего и х.прибрежного.

На проведенных исследований нами разработана нормативная документация на перспективные виды сырья «Хвоща зимующего трава» и «Хвоща полевого трава». Кроме того, разработаны многокомпонентные растительные фитосредства: «Урологический сбор» и «Климактерический сбор». Проведены фармакологические исследования, которые подтвердили их безопасность и специфическую фармакологическую активность; разработаны проекты нормативной документации.

ВЫВОДЫ

1. На основании данных литературы по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам видов рода Equisetum L. флоры Сибири установлено, что наиболее перспективными для химико-фармакологического изучения являются: хвощ полевой - Equisetum arvense L; х.речной (приречный) - E.fluviatile L.; х.зимующий - E.hyemale L; х.болотный - E.palustre L; хлуговой - E.pratense Ehrh.; хлесной -E.sylvaticum L.; х.береговой (прибрежный) - E.1 litorale Kuhlew. ex Rupr.

2. Морфологические различия видов хвоща заключаются в характере обрыва стебля, ветвления, форме и длине влагалищ стебля; направлении и количества граней ветвей 1-го и 2-го порядка; структуре зубцов влагалищ стебля; наличии или отсутствии спороносных колосков; характере поперечных срезов стебля и ветвей (наличие, расположение и диаметр полостей), наличии и строению выростов на верхушках ребер (гребнях),

Наиболее важными анатомическими особенностями хвощей являются: для подрода Equisetum Sad.- наличие непогруженных устьиц, расположенных в бороздках узкими и широкими полосами без четко выраженных продольных рядов и многообразие выростов клеток эпидермиса; для подрода Hippochaete Milde - наличие погруженных устьиц, расположенных в бороздках узкой полосой в 1-3 четко выраженных продольных ряда.

3. Впервые проведено определение устьичного индекса для 10 видов рода хвощ флоры Сибири. Показано, что устьичный индекс, как стоматографический признак, с определенной степенью достоверности можно использовать только для идентификации видов подрода Hippochaete Milde.

4. Проведена оценка фармакологической активности хвощей флоры Сибири по различным тестам:

- из 7 видов хвоща только хвощ зимующий и х.болотный достоверно увеличивают объем суточного диуреза и экскреторную функцию почек у крыс;

- наиболее значительно снижают прирост массы отека у экспериментальных животных хвощ полевой и х. зимующий;

- наиболее выраженный антибактериальный эффект проявили виды хвоща подрода Equisetum в отношении штаммов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa.

- к числу перспективных фунгистатиков относятся хвощ полевой и хвощ зимующий. Экстракты этих видов в перспективных концентрациях задерживают рост возбудителей поверхностных дерматофитий;

- наиболее выраженную гепатопротекторную активность, коррелирующую с антирадикальным действием проявили хвощ полевой и хлесной. Антирадикальные свойства наиболее выражены у видов подрода Equisetum.

5. Из 10 видов хвоща выделены и идентифицированы 30 веществ фенольной природы, из них впервые кемпферол 3,7-ди-О-а-Ь-рамнопиранозид. Методом ВЭЖХ-МС с максимально возможной достоверностью обнаружены гликозид госсипетина, эллаговая кислота, дихлорпроизводные фенольных соединений (дихлорапигенин, дихлоркемпферол).

В зависимости от состава флавоноидов виды рода хвощ разделены на три группы: виды, накапливающие только гликозиды кемпферола (E.palustre, E.hiemale, E.scirpoides, E.variegatum, E.ramossisimum); виды, накапливающие гликозиды кемпферола и кверцетина (E.pratense; E.sylvaticum); виды, накапливающие гликозиды кверцетина, кемпферола, апигенина, генкванина и лютеолина (E.fluviatile; E.arvense, Е. х litorale). Данная классификация соотносится с концепцией классификации хвощей, основанной на морфологических и микроморфологических характеристиках.

В 10 видах хвоща флоры Сибири установлено наличие более 30 макро-и микроэлементов. Различия в компонентном составе незначительные и связаны с удельным содержанием элементов. В видах, систематически близких, отмечено сходное накопление элементного состава. Установлено, что виды подрода Hippochaete Milde превосходят виды подрода Equisetum Sad. по содержанию кремния в 2-3 раза.

6. Анализ возможной взаимосвязи химического состава видов рода хвощ с их фармакологическими свойствами показал, что оптимальное сочетание фенольных соединений, ПСК и соединений кремния в видах подрода Equisetum Sad. обеспечивает диуретическое, антимикробное, противовоспалительное и гепатопротекторное свойства; виды подрода Hippohaete Milde, содержащие преимущественно соединения кремния в сочетании с небольшими количествами фенольных соединений и ПСК

перспективны только в качестве источников диуретических и антигрибковых средств.

7. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены новые Фармакопейная статья «Хвоща полевого трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща полевого»; разработаны проекты ФС «Хвоща зимующего трава», ФСП «Урологический сбор» и ФСП «Климактерический сбор».

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ

1. Антигрибковые свойства растений рода Equisetum / Н.Э. Коломиец, O.A. Мальцева, С.Е. Дмитрук // Тез .докл. научно-практической конференции, посвященной 80-летию фармацевтической службы Самарской области, Самарского государственного медицинского университета и Самарского аптечного склада, 1999. - Самара, 1999. -С. 99-100.

2. Поиск новых источников антигрибковых препаратов / Н.Э. Коломиец, O.A. Мальцева, С.Е. Дмитрук, С.Н. Ефимов П Тез. докл. международной научной конференции, 27-29 июня 2000 г. - Томск, 2000 г. - С. 34-35.

3. Изучение элементного состава растений рода Equisetum и Lemna / Н.Э. Коломиец, O.A. Мальцева, С.Е. Дмитрук // Тез. докл. Международной конференции молодых ученых, 26-29 июня 2001 г. -Москва, 2001. - Т. 2. - С. 66-67.

4. Грибковые поражения кожи и перспективы поиска антигрибковых средств на основе суммарных комплексов травы хвоща / Н.Э.Коломиец, С.Е.Дмитрук // Тез.докл. первой Международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию со дня открытия проф. К.Н. Виноградовым сибирской двуустки у человека, 2-6 апреля 2001 г. -Томск, 2001.-С. 95.

5. Дмитрук С.Е. Грибковые заболевания и альтернативные возможности фитотерапии // С.Е. Дмитрук, Н.Э. Коломиец, B.C. Дмитрук, O.A. Мальцева // Бюллетень СО РАМН. - Новосибирск, 2001. - № 3. -С. 9-14.

6. Исследование микроэлементов, тяжелых металлов в сырье растений рода хвощ - перспективном источнике новых фитопрепаратов и биологически активных добавок / Н.Э. Коломиец, Л.Д. Агеева, С.Е. Дмитрук // Тез. докл. Всероссийской научно-технической конференции, 13-14 сентября 2001 г. - Бийск, 2001. - С. 22-26.

7. Possibilities of phytotherapy in treatment of fungal diseases / Kolomiets N, Maltseva O, Dmitruk S // "Yong doctors on the third millennium": Materials of

International Yong Medic's Conference, 17-22 September 2001. - Yerevan, Armenia, 2001. - S. 78.

8. Коломиец Н.Э. Растения рода EquisetumxTeneHb химической изученности, токсичность, применение в медицине // Коломиец Н.Э., Дмитрук С.Е. / Объединенный медицинский журнал. - 2002. - № 1 (2). -С. 86-89.

9. Возможности использования лекарственных растений для профилактики и лечения дерматомикозов / Н.Э. Коломиец, O.A. Мальцева, С.Е. Дмитрук // Тез. докл. Первого съезда микологов Современная микология в России. Москва, 11-13 апреля 2002 г. - С. 229-230.

10. Коломиец Н.Э. Исследование острой токсичности растений рода Equisetum // Н.Э. Коломиец, С.Е. Дмитрук // Объединенный научный журнал. - 2003. - № 32 (90). - С. 78.

11. Разработка ФС «Хвоща полевого трава» / Н.Э. Коломиец, С.Е. Дмитрук, Г.И. Калинкина // Лекарственные растения в фармакологии и фармации: Тез. докл. научн. конф., посвященной 50-летию Алт. гос. мед. ун-та. -Барнаул: АГМУ, 2004. - С. 103-104.

12. Проблема рационального использования экологического чистого JIPC / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, И.А. Туева, A.C. Ангаскиева, Е.А. Лукша, A.A. Марьин, Л.П. Охрименко, E.H. Сальникова, И.М. Смолякова И Труды постоянно действующей научно-технической школы-семинара студентов, аспирантов и молодых ученых «Информационные системы мониторинга окружающей среды». -Выпуск 3. - Томск, 2004. - С. 51-53.

13. Оценка перспективности некоторых видов лекарственного растительного сырья с точки зрения их экологической чистоты / Н.Э. Коломиец, И.А. Туева, O.A. Мальцева, С.Е. Дмитрук, Г.И. Калинкина // Химия растительного сырья. - 2004. - № 4. - С. 25-28.

14. Коломиец Н.Э. Изучение гепатопротекторных свойств хвоща полевого / Н.Э. Коломиец, Л.К. Михалева, В.В. Шейкин // Фармация. - 2005. - № 4. - С. 38-40.

15. Коломиец Н.Э. Антимутагенные свойства растений рода хвощ / Н.Э. Коломиец, С.Н. Ефимов // Фармация № 5,2005. - С. 31-32.

16. Решение проблемы сырьевой базы лекарственных растений за счет систематически близких видов / Н.Э. Коломиец, Л.П. Охрименко, E.H. Сальникова, В.Н. Тихонов // Проблемы изучения рационального покрова Сибири: Материалы III Международной научной конференции, посвященной 120-летию Гербария им. П.Н. Крылова Томского государственного университета (Томск, 16-18 ноября 2005 г.). - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2005. - 198 с.

17. Анатомическое строение растений рода хвощ / Н.Э. Коломиец, H.H. Сапронова Г.И. Калинкина, С.Е. Дмитрук // Фармация. - 2006. -№ 1.-С. 19-21.

18. Проблема фальсификации сырья хвоща полевого / Н.Э.Коломиец, Г.И. Калинкина, С.Е. Дмитрук, A.M. Зиновьева // Фармация. - 2006. -№ 2. - С. 37-42.

19. Коломиец Н.Э. Растения рода хвощ / Н.Э. Коломиец // Фармация. - 2006. -№3,-С. 46-48.

20. Антимикробные свойства компонентов противоклимактерического сбора / Н.Э. Коломиец, Т.В. Полуэктова, Г.И. Калинкина, М.Т. Джумаева // Бюллетень Сибирской медицины. - Томск, 2006. -Т. 5. - Приложение 2. - С. 122-124.

21. Фитотерапия климактерических расстройств / Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калиникина // Науки о человеке: материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2006. - С. 136.

22. Коломиец Н.Э. Вопросы стандартизации травы хвоща полевого / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Фармация. - 2007. - № 1. - С. 11-14.

23. Антигрибковые свойства хвощей флоры Сибири / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, С.Е. Дмитрук// Фармация. - 2007. - № 4. - С. 36-40.

24. Коломиец Н.Э. Антибактериальные свойства хвощей / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Фармация. - 2007. - № 5. - С. 38-39.

25. Проблема урологических заболеваний и основные направления их решения с помощью фитотерапии / Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Т.В. Полуэктова // Аптечное дело. - 2007. - № 1. - С. 36-47.

26. Фармакогностическая оценка биологически активных добавок, реализуемых на российском рынке / С.Е. Дмитрук, Г.И. Калинкина, Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Т.В. Полуэктова // VII Межрегиональная научно-практическая фармацевтическая конференция «Биологически активные соединения в профилактике заболеваний и укреплении здоровья нации», 23мая 2007. - Новосибирск, 2007. - С. 11-13.

27. Разработка состава и изучение характеристик подлинности многокомпонентного урологического сбора / Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Международная научно-практическая конференция «Научные исследования и практическое применение. Современное состояние и пути развития 2007», 1-15октября 2007. - Т. 15. - Химия. Медицина ветеринария и фармацевтика. Биология, сельское хозяйство. -С. 34-43.

28. Количественное определение флавоноидов в многокомпонентных сборах / Т.В. Полуэктова, Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, Л.А. Тихонова // Сборник научных трудов Разработка, исследование и

маркетинг новой фармацевтической продукции. - Пятигорск, 2008. -Вып. 63. - С. 319.

29. Растения рода хвощ (Equisetum Ь.) - перспективные источники новых лекарственных препаратов / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, Р.А. Данильчук // Сборник научных трудов IX м ежду н аро д н о го конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения АЛ. Чижевского. - Москва, 2008. -С. 260-261.

30. Проблема качества лекарственного растительного сырья, реализуемого на фармацевтическом рынке России / Н.Э. Коломиец, Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина, В.В. Шейкин, В.Ю. Андреева, Т.В. Полуэктова // Фармация, 2008. - № 8. - С. 33-38.

31. Коломиец Н.Э. Количественное определение кремния в хвощах / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Фармация. - 2009. - № 3. - С. 13-15.

32. Патент на изобретение «Лекарственное средство, обладающее

комплексным диуретическим, противомикробным и противовоспалительным действием» №2314116 от 10.01.2008 г;

33. Патент на изобретение «Лекарственное средство для профилактики и

лечения патологический проявлений климактерического синдрома» № 2376026 от 20.12.2009г.

34. Исследование химического состава нового урологического сбора /

Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец // Химия растительного сырья, 2009. - № 4. - С. 139-142.

35. Исследование фенольных соединений урологического сбора методом

ВЭЖХ-МС / Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец // Химия растительного сырья, 2009. - № 4. - С. 143-146.

36. Коломиец Н.Э. Растения рода Хвощ (Е(31Л8ЕТиМ Ь.). Систематика,

химический состав, перспективы использования в медицине / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина. - Томск: Печатная мануфактура, 2009. -88 с.

37. Коломиец Н.Э. Сравнительное исследование химического состава видов рода хвощ флоры Сибири / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Химия растительного сырья. - 2010. - № 1. - С. 149-154.

Тираж 100. Заказ № 804. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел.: 53-30-18.

Актуальность темы. Фармацевтическая практика постоянно требует увеличения ассортимента лекарственного растительного сырья (JIPC) для получения новых эффективных лекарственных препаратов. Расширение ассортимента JTPC возможно за счет внедрения в медицинскую практику растений народной медицины и, прежде всего, видов, систематически близких к официнальным. С этой точки зрения значительный интерес представляют растения рода хвощ.

Род хвощ Equisetum L. - единственный ныне живущий представитель древнейшего многочисленного и разнообразного отдела хвощевидные (членистые), который достиг расцвета в каменноугольном периоде и был видным компонентом Палеозойской эпохи.

В настоящее время хвощи довольно широко распространены на Земле, произрастая в разных растительных зонах и сообществах. Они встречаются практически повсеместно в Северном и Южном полушарии.

По оценкам современных систематиков род хвощ немногочисленен и насчитывает до 35-38 видов травянистых растений. На территории Российской Федерации род Equisetum L. представлен 12-15 видами, 10 из которых произрастают в Сибири.

Отдельные вопросы систематики рода Equisetum L. до сих пор являются спорными и трактуются ботаническими школами по-разному. Этому способствует ряд факторов: высокая степень морфологической пластичности хвощей, частое межвидовое скрещивание в местах совместного произрастания, наследуемые уродства, трудности в интерпретации диагностических признаков и недостаток изученности.

Химический состав большинства хвощей флоры Сибири практически не изучен, а из всего рода хвощ только 1 вид хвощ полевой {Equisetum awense L.) является официнальным лекарственным растением. Перечень показаний к применению препаратов из этого растения ограничен использованием в урологической практике. В то же время большинство хвощей на протяжении длительного времени успешно используются коренными народами для лечения различных заболеваний. Несмотря на это, в настоящее время виды хвоща, близкие официнальному, по систематическому положению и морфологическим признакам до сих пор не используются в медицинской практике.

Таким образом, широкое распространение большинства видов хвоща, длительная история их успешного применения в народной медицине, фрагментарная изученность подчеркивают обоснованность нашего интереса и выбора в качестве объекта исследования представителей этого древнего рода.

Цель работы. На основании комплексного химико-фармакологического исследования разработать научно-методическое обоснование использования перспективных видов рода хвощ Флоры Сибири как источников новых лекарственных средств.

Задачи исследования.

1. На основании данных литературы по систематическому положению, распространенности, сырьевым ресурсам выделить наиболее перспективные для дальнейшего исследования виды хвоща.

2. На основании сравнительного анатомо-морфологического исследования получить достоверную информацию о сходстве и различиях видов рода хвощ для выявления диагностических признаков.

3. Оценить фармакологическую эффективность биологически активных комплексов видов рода хвощ по различным фармакологическим тестам.

4. Провести сравнительное исследование основных групп БАВ видов рода хвощ; выделить и идентифицировать фенольные соединения. Полученные данные использовать для анализа связи химического состава с фармакологическими свойствами хвощей.

5. Разработать нормативную документацию (проекты ФС, инструкции по сбору и сушке JIPC и др.) на предлагаемое J1PC перспективных видов хвоща.

Научная новизна.

Впервые на основании данных по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам видов рода Equisetum L. флоры Сибири установлено, что наиболее перспективными для химико-фармакологического изучения являются: хвощ полевой, х.речной (приречный), х.зимующий, х.болотный, х.луговой, х.лесной, х.береговой (прибрежный).

Установлены морфологические различия видов хвоща по характеру обрыва стебля, ветвлению, форме и длине влагалищ стебля; направлению и количеству граней ветвей 1-го и 2-го порядка; структуре зубцов влагалищ стебля; наличию или отсутствию спороносных колосков; характеру поперечных срезов стебля и ветвей, наличию и строению выростов на верхушках ребер.

Впервые проведено сравнительное изучение анатомических особенностей 10 видов рода Equisetum L. Выявлены признаки, характерные для рода хвощ, а также отличия для видов, относящихся к различным подродам.

Впервые проведено определение устьичного индекса для 10 видов рода хвощ флоры Сибири. Показано, что устьичный индекс, как стоматографический признак, с определенной степенью достоверности можно использовать только для идентификации видов подрода Hippochaete Milde:

Впервые проведена оценка фармакологической активности хвощей флоры Сибири по различным тестам. Установлено, что виды подрода Hippochaete Milde, содержащие преимущественно соединения кремния в сочетании с небольшим количеством фенольных соединений, проявляют выраженную диуретическую, противогрибковую и противовоспалительную активность. Виды данной группы нецелесообразно рассматривать в качестве источников препаратов антибактериального и гепатопротекторного действия. Виды подрода Equisetum Sad., накапливающие в значительных количествах фенольные соединения, ПСК и небольшое количество кремния, перспективны в качестве источников диуретических, антимикробных, противовоспалительных и гепатопротекторных средств.

Из 10 видов хвоща выделены и идентифицированы 30 веществ фенольной природы, из них впервые кемпферол 3,7-ди-0-а-Ь-рамнопиранозид. Впервые методом ВЭЖХ-МС обнаружены дихлорпроизводные фенольных соединений (дихлорапигенин, дихлоркемпферол), эллаговая кислота.

В зависимости от состава флавоноидов виды рода хвощ разделены на три группы: виды, накапливающие только гликозиды кемпферола (E.palustre, Е.hiemale, E.scirpoides, E.variegatum, E.ramossisimum)\ виды, накапливающие гликозиды кемпферола и кверцетина (E.pratense; E.sylvaticum); виды, накапливающие гликозиды кверцетина, кемпферола, апигенина, генкванина и лютеолина (E.flaviatile; E.arvense, Е. х litoralé).

В 10 видах хвоща флоры Сибири установлено наличие более 30 макро-и микроэлементов. Различия в компонентном составе отсутствуют и связаны с удельным содержанием элементов. В видах, систематически близких, отмечено сходное накопление элементного состава. Установлено, что виды подрода Hippochaete Milde превосходят виды подрода Equisetum Sad. по содержанию кремния в 2-3 раза.

Научная новизна полученных результатов защищена 2 патентами Российской Федерации.

Практическая значимость работы.

На основании результатов анатомо-морфологических и химических исследований разработаны методики, позволяющие объективно оценивать подлинность и качество сырья хвощей, которые включены в проекты новой нормативной документации.

Разработаны показатели качества сырья хвоща полевого и методики их оценки, которые включены в проект новой Фармакопейной статьи «Хвоща полевого трава».

По результатам диссертационной работы внедрены:

- нормативная документация: ФС 42-0209-07 «Хвоща полевого трава»;

- «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща полевого», утверждена комиссией по стандартизации ВИЛАР (г.Москва), протокол №2 от 03.02.2006

Разработаны:

- проект ФС «Хвоща зимующего трава»;

- проекты ФСП «Урологический сбор»; ФС «Климактерический сбор».

Предложенный состав урологического сбора и методики его стандартизации использованы ООО «Биолит» для разработки гранулированной БАД к пище «Уролизин» (Акты внедрения от 02.02.2005).

Результаты исследований включены в монографию Коломиец Н.Э., Калинкиной Г.И. «Растения рода Хвощ (ЕС^ШБЕТиМ Ь.). Систематика, химический состав, перспективы использования в медицине», а также учебно-методические пособия, используемые в учебном процессе студентами, преподавателями и практическими работниками: «Проблема урологических заболеваний и основные направления их решения с помощью фитотерапии», «Лекарственные препараты и биологически активные добавки на основе биологически активных веществ хвоща», «Анализ лекарственного растительного сырья по внешним и микроскопическим признакам», «Диагностические признаки хвоща полевого и близких к нему видов»; «Методы фармакогностического анализа лекарственного растительного сырья. Химический анализ».

Получены патенты на изобретения: и

- «Лекарственное средство, обладающее комплексным диуретическим, противомикробным и противовоспалительным действием» № 2314116 от

10.01.2008 г;

Лекарственное средство для профилактики и лечения патологический проявлений климактерического синдрома» № 2376026 от

20.12.2009 г.

На защиту выносится.

1. Результаты обоснования выделения наиболее перспективных видов рода хвощ Флоры Сибири по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам;

2. результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования видов рода хвощ флоры Сибири;

3. результаты изучения химического состава фенольных соединений и минерального комплекса хвощей;

4. результаты оценки фармакологической эффективности биологически активных комплексов видов рода хвощ по различным фармакологическим тестам;

5. результаты исследований по разработке нормативной документации на перспективные виды хвоща.

Апробация работы.

Основные положения диссертации обсуждались на: научно-практической конференции, посвященной 80-летию фармацевтической службы Самарской области, Самарского государственного медицинского университета и Самарского аптечного склада «Современные тенденции развития фармации» (Самара, 1999); Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); первой Международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию со дня открытия проф. К.Н.Виноградовым сибирской двуустки у человека «Актуальные проблемы инфектологии и паразитологии» (Томск, 2001);

Международной конференции молодых ученых «Леса Евразии в III тысячелетии» (Москва, 2001); Всероссийской научно-технической конференции «Лекарственные средства и пищевые добавки на основе растительного сырья» (Бийск, 2001); Международной конференции молодых врачей «Yong doctors on the third millennium» (Ереван, Армения, 2001); Первом съезде микологов «Современная микология в России» (Москва, 2002); научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004); постоянно действующей научно-технической школе-семинаре студентов, аспирантов и молодых ученых «Информационные системы мониторинга окружающей среды» (Томск, 2004); III Международной научной конференции, посвященной 120-летию Гербария им.П.Н.Крылова «Проблемы изучения рационального покрова Сибири» (Томск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф.Л.Н.Березнеговской «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной памяти А.С.Саратикова (Томск, 2006); Международной научно-практической конференции «Научные исследования и практическое применение. Современное состояние и пути развития 2007» (Одесса, Украина, 2007); 63 Всероссийской научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); IX международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 16 статей в журналах из перечня, рекомендуемого ВАК; получены 2 патента на изобретение; издана 1 монография и 5 учебно-методических пособий для студентов, преподавателей и работников практической фармации.

Работа представляет итог исследований, выполненных автором в творческом содружестве с сотрудниками кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ, кафедры фармацевтической технологии СибГМУ, микробиологии с курсом вирусологии СибГМУ; кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета (г. Барнаул); Института органической химии СО РАН (г. Новосибирск); кафедры химии и технологии материалов современной энергетики Северского государственного технологического института Национального Исследовательского Ядерного Университета «МИФИ» (г.Северск); The Herbarium, Royal Botanic Garden (Edinburgh, Great Britain); Pharmazeutisches Institut der Universität (Bonn, Germany).

Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 326страницах машинописного текста. В тексте приведено 47 таблиц и 58 рисунков. Библиографический указатель включает 385 источников литературы, из них зарубежной - 209.

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка использованной литературы и приложения.

285 ВЫВОДЫ

1. На основании данных литературы по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам видов рода Equisetum L. флоры Сибири установлено, что наиболее перспективными для химико-фармакологического изучения являются: хвощ полевой - Equisetum arvense L.; х.речной ("приречный) - E.fluviatile L.; х.зимующий - E.hyemale L.; х.болотный -E.palustre L.; х.луговой - E.pratense Ehrh.; х.лесной - E.sylvaticum L; х.береговой (прибрежный) - E.x litorale Kuhlew. ex Rupr.

2. Морфологические различия видов хвоща заключаются в характере обрыва стебля, ветвления, форме и длине влагалищ стебля; направлении и количества граней ветвей 1-го и 2-го порядка; структуре зубцов влагалищ стебля; наличии или отсутствии спороносных колосков; характере поперечных срезов стебля и ветвей (наличие, расположение и диаметр полостей), наличии и строению выростов на верхушках ребер (гребнях),

Наиболее важными анатомическими особенностями хвощей являются: для подрода Equisetum Sad.- наличие непогруженных устьиц, расположенных в бороздках узкими и широкими полосами без четко выраженных продольных рядов и многообразие выростов клеток эпидермиса; для подрода Hippochaete Milde - наличие погруженных устьиц, расположенных в бороздках узкой полосой в 1-3 четко выраженных продольных ряда.

3. Впервые проведено определение устьичного индекса для 10 видов рода хвощ флоры Сибири. Показано, что устьичный индекс, как стоматографический признак, с определенной степенью достоверности можно использовать только для идентификации видов подрода Hippochaete Milde.

4. Проведена оценка фармакологической активности хвощей флоры Сибири по различным тестам:

- из 7 видов хвоща только хвощ зимующий и х.болотный достоверно увеличивают объем суточного диуреза и экскреторную функцию почек у крыс; наиболее значительно снижают прирост массы отека у экспериментальных животных хвощ полевой и х. зимующий;

- наиболее выраженный антибактериальный эффект проявили виды хвоща подрода Equisetum в отношении штаммов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa.

- к числу перспективных фунгистатиков относятся хвощ полевой и хвощ зимующий. Экстракты этих видов в перспективных концентрациях задерживают рост возбудителей поверхностных дерматофитий; наиболее выраженную гепатопротекторную активность, коррелирующую с антирадикальным действием проявили хвощ полевой и х.лесной. Антирадикальные свойства наиболее выражены у видов подрода Equisetum.

5. Из 10 видов хвоща выделены и идентифицированы 30 веществ фенольной природы, из них впервые кемпферол 3,7-ди-0-а-Ь-рамнопиранозид. Методом ВЭЖХ-МС с максимально возможной достоверностью обнаружены гликозид госсипетина, эллаговая кислота, дихлорпроизводные фенольных соединений (дихлорапигенин, дихлоркемпферол).

В зависимости от состава флавоноидов виды рода хвощ разделены на три группы: виды, накапливающие только гликозиды кемпферола (E.palustre, E.hiemale, E.scirpoides, E.variegatum, E.ramossisimum); виды, накапливающие гликозиды кемпферола и кверцетина (E.pratense; E.sylvaticum); виды, накапливающие гликозиды кверцетина, кемпферола, апигенина, генкванина и лютеолина (E.fluviatile; E.arvense, Е. х litorale). Данная классификация соотносится с концепцией классификации хвощей, основанной на морфологических и микроморфологических характеристиках.

В 10 видах хвоща флоры Сибири установлено наличие более 30 макро- и микроэлементов. Различия в компонентном составе незначительные и связаны с удельным содержанием элементов. В видах, систематически близких, отмечено сходное накопление элементного состава. Установлено, что виды подрода Hippochaete Milde превосходят виды подрода Equisetum Sad. по содержанию кремния в 2-3 раза.

6. Анализ возможной взаимосвязи химического состава видов рода хвощ с их фармакологическими свойствами показал, что оптимальное сочетание фенольных соединений, ПСК и соединений кремния в видах подрода Equisetum Sad. обеспечивает диуретическое, антимикробное, противовоспалительное и гепатопротекторное свойства; виды подрода Hippohaete Milde, содержащие преимущественно соединения кремния в сочетании с небольшими количествами фенольных соединений и ПСК перспективны только в качестве источников диуретических и антигрибковых средств.

7. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены новые Фармакопейная статья «Хвоща полевого трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща полевого»; разработаны проекты ФС «Хвоща зимующего трава», ФСП «Урологический сбор» и ФСП «Климактерический сбор».

Заключение

На основании комплексного изучения нами разработано научно-методическое обоснование использования перспективных видов хвоща флоры Сибири, как источников новых лекарственных средств различного спектра действия. Предложенный научно-методический подход можно использовать для поиска, изучения и обоснования перспективности в медицине филогенетически близких видов других родов (рис.57,58).

Проведенные нами на первом этапе теоретические исследования по систематическому положению, распространенности, оценке ресурсного потенциала, позволили сузить круг поиска и выделить для дальнейшего исследования наиболее перспективные виды хвоща.

Ареал хвощей на территории России достаточно велик. При этом наиболее изучена ресурсная база официнального вида — хвоща полевого, промышленную заготовку которого осуществляют в основном в Европейской части России. Как отмечают ресурсоведы, несмотря на большой ареал, природные запасы хвоща полевого на территории России не равноценны. Занимая огромные по площади территории хвощ полевой в большинстве районов России встречается рассеянно или в виде небольших куртин, что не позволяет осуществлять заготовительные мероприятия в большом объеме. Известны и районы, где хвощ полевой относится к видам, требующим охраны. При этом по всему ареалу хвощ полевой сочетается с другими видами хвоща (х.луговой, х.приречный, х.лесной, х.болотный, х.зимующий), которые имеют еще более широкое распространение и образуют большие по размерам заросли. Отметим и другую проблему, возникающую при осуществлении заготовительных мероприятий. Как известно, хвощи отличаются крайним полиморфизмом, вследствие чего примесные виды, имеющие схожие с хвощом полевым морфологические признаки, ошибочно заготавливаются в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС). Подтверждением сказанному служат результаты нашего исследования по проблеме фальсификации и качества травы хвоща полевого, реализуемого на фармацевтическом рынке Томской области. Анализ образцов промышленных партий продукции более чем 20 российских производителей показал, что 70% образцов не соответствует требованиям ГФ XI по показателю «подлинность». При этом в 65% образцах вместо хвоща полевого обнаружен хвощ болотный, 5% образцов соответствовали хвощу лесному. На основании вышесказанного один из следующих этапов комплексного изучения хвощей был посвящен исследованию их анатомо-морфологических признаков. Полученные данные могут быть использованы для решения теоретических вопросов систематики с целью объективной оценки различий между систематически близкими, но морфологически трудно различимыми видами хвощей. Кроме того, на основании сравнительного анатомо-морфологического исследования получена достоверная информация о диагностических признаках хвощей, которая включена нами в проекты ФС «Хвоща полевого трава», «Хвоща зимующего трава».

Для определения направления изучения фармакологической активности перспективных видов хвощей был проведен анализ сведений научной и традиционной медицины по использованию исследуемой группы растений. На основании полученных данных проведено экспериментальное исследование экстрактивных комплексов хвощей по выбранным тестам.

Согласно предложенной схемы научно-методического подхода к исследованию видов рода хвощ на следующем этапе проведено исследование химического состава перспективных видов. Определены основные группы БАВ (фенольные соединения, соединения кремния); детально исследован компонентный состав фенольных соединений с установлением структуры веществ.

Зтш1 1

Этап 2,3

Этап 4,5

Рис. 57. Схема научно-методического подхода к исследованию видов рода Equisetum Ь.

В составе исследуемых видов хвоща идентифицировано более 30 компонентов фенольной природы. Индивидуальные отличия в комбинациях содержащихся компонентов указывают на видовую самостоятельность хвощей в рамках единого таксона и дают дополнительную возможность решить вопросы систематики рода Equisetum L. Достоверность различий подтверждена выделением и установлением структуры основных компонентов.

В рамках научно-методического подхода важным является вопрос об установлении возможной взаимосвязи между биологической активностью и компонентным составом различных видов хвоща, что позволяет предложить методологию дальнейшего исследования и практического использования перспективных видов (рис.12).

Как показали результаты исследования химического состава, основными БАВ видов рода хвощ являются фенольные соединения и соединения кремния, на основании содержания которых хвощи разделены нами на две секции.

Значимость фенольных соединений и соединений кремния хвощей, подтверждена нами экспериментальным изучением антимикробной, противовоспалительной, диуретической, гепатопротекторной и антирадикальной активности 10 видов рода хвощ флоры Сибири.

Нами показано, что водные извлечения 4 видов подрода Hippohaete Milde , богатые кремнием, в перспективных концентрациях (7,8-31,2 мкг/мл) подавляют активность поверхностных дерматофитий на уровне препаратов сравнения нитрофунгина и сангвиритрина. Для 6 видов подрода Equisetum Sad., в которых преобладают флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и полисахаридный комплекс, с точки зрения противогрибковой активности перспективны водно-спиртовые извлечения (7,8-62,5 мкг/мл). Таким образом, можно предположить, что противогрибковые свойства хвощей в равной степени могут быть обусловлены, как соединениями кремния, так и фенольными со единениями.

Подрод ЕцидоШт

Хвощ по ¡свой Х.лесной X.речной X болотный X. прибрежны й Х.луговой

Преобладающими группами БАВ являются фенольные соединения до 2,5%; сапонины до 9%; ПСК до 14%; соединения кремния до 1,4%

Диуретическая

Хвощ болотный

Диуретическая

Хвощ зимующий

Противогрибковая

Все виды

Противогрибковая

Хвощ зимующий

Ан гибактериальная

Все виды

Противовоспалительная

Хвощ полевой

Противовоспалительная

Хвощ зимующий

Гепатопротекторная

Хвощ лесной, хво!ц почевой

Антирадикальная

Все виды

Подрод Hippohaete

Хвощ зимующий X камышковый

X. пестрый X.раскидисты й

Преобладающим и группами БАВ являются соединения кремния до 6,0%; фенольные соединения до 0,25%; ПСК до 4,5%

Рис. 58 Взаимосвязь химического состава видов рода хвощ с их фармакологическими свойствами

Кроме противогрибкового действия, представляет интерес способность экстракционных препаратов хвощей подавлять активность некоторых бактерий, вызывающих и отягощающих течение целого ряда заболеваний инфекционно-воспалительного характера.

Исследование диуретической активности 7 видов хвоща показало, что наиболее значительно увеличивают диурез хвощ болотный и хвощ зимующий.

Диуретический эффект хвоща зимующего можно связать с содержанием кремния, в то время, как препараты хвоща болотного, по-видимому, оказывают диуретическое действие за счет суммирования эффекта флавоноидных гликозидов, фенолкарбоновых кислот и соединений кремния.

Известно, что соединения кремния препятствуют образованию мочевых камней, за счет образования защитных коллоидов, препятствующих кристаллизации минеральных солей, и тем, самым, затрудняющих образование из них камней. Заметим, что соли кремниевой кислоты наряду с выведением из организма излишка воды, препятствуют адгезии микроорганизмов, решая проблему выведения токсических веществ эндогенного и экзогенного происхождения, связывая их в кишечнике.

Что касается роли фенольных соединений в диуретическом эффекте, то многочисленными исследованиями различных авторов установлено, что ряд флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, выделенных из растений, обладают выраженной способностью увеличивать диурез и влиять на обмен электролитов в почках. Диуретический эффект выявлен у кверцетина, кемпферола, рутина, лютеолина, некоторых других флавоноидов, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот. Нами установлено, что хвощи содержат более 20 гликозидированных производных кемпферола, кверцетина, апигенина и лютеолина.

Поскольку хвощи рассматриваются в качестве потенциальных средств для лечения урологических заболеваний, неотъемлемой частью которого является воспаление, была проведена оценка противовоспалительного действия хвощей.

Нами установлено, что хвощ зимующий и х.полевой статистически достоверно снижают прирост массы отека у экспериментальны животных. Высокую антиэкссудативную активность проявили экстракты хвоща болотного, х.речного и х.берегового.

При этом противовоспалительное действие хвоща полевого, х.болотного, х.речного и х.берегового может быть обусловлено флавоноидами, фенолкарбоновыми кислотами и полисахаридами. Большинство перечисленных веществ, по данным литературы, способны ослаблять воспалительные и аллергические реакции, усиливать процессы регенерации.

Противовоспалительные свойства хвоща зимующего можно связывать с соединениями кремния. Защитная роль соединений кремния в купировании воспалительного процесса связана, прежде всего, с тем, что кремний, сосредоточенный в эластине и коллагене кровеносных сосудов, эпителиальных и соединительных тканях повышает их эластичность, упругость, снижает проницаемость стенок сосудов для «неблагоприятных» факторов. Как следствие, это улучшает местное кровоснабжение и способствует быстрому восстановлению поврежденных сосудов, тканей и органов.

При любом воспалительном процессе, в том числе и при патологии почек увеличивается токсическая нагрузка на печень, которая является основной мишенью для поражения различными ксенобиотиками, и, как правило, по свободнорадикальному механизму. В связи с этим важным элементом профилактических и терапевтических мероприятий является использование средств с антирадикальным действием. Данные литературы говорят о том, что антирадикальная активность растительных препаратов определяется, главным образом, фенольными соединениями (флавоноидами и фенолокислотами) и витаминами. Нами установлено, что антирадикальные свойства наиболее выражены у видов подрода Equisetum Sad. с преимущественным содержанием флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. При этом наиболее выраженную способность подавлять активность свободных радикалов проявил хвощ лесной, который также оказался наиболее перспективным гепатопротектором и корректором мутагенеза.

Исследование антитоксической и экскреторной активности хвощей показывает целесообразность углубленного изучения в данном направлении видов подрода Equisetum Sad., которые отличаются значительно большим набором гликозидов кверцетина, лютеолина, апигенина и фенолкарбоновых кислот. Напротив, нами отмечено, что экстракт хвоща зимующего -представитель подрода Hippohaete Milde практически не изменял биохимических показателей сыворотки крови и индикаторных ферментов, не влияя, таким образом, на экскреторную и антитоксическую функцию печени. Это позволяет сделать заключение о нецелесообразности поиска гепатопротекторов среди видов хвоща подрода Hippohaete Milde .

Таким образом, проведенные исследования показывают перспективность дальнейшего углубленного фармакологического исследования хвоща полевого, х.лесного, х.лугового, х.болотного, х.речного, х.зимующего и х.прибрежного.

На проведенных исследований нами разработана нормативная документация на перспективные виды сырья «Хвоща зимующего трава» и «Хвоща полевого трава». Кроме того, разработаны многокомпонентные растительные фитосредства: «Урологический сбор» и «Климактерический сбор». Проведены фармакологические исследования, которые подтвердили их безопасность и специфическую фармакологическую активность; разработаны проекты нормативной документации.