Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация сбора противодиабетического. Фармакогностическое изучение побегов голубики

На правах рукописи

ЦИМБАЛИСТ НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СБОРА ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКОГО. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОБЕГОВ ГОЛУБИКИ

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание >ченой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь, 2008

003169819

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель

доктор фармацевтических наук, профессор Татьяна Алексеевна Степанова Официальные оппоненты

доктор фармацевтических наук, профессор Василий Михайлович Петриченко доктор фармацевтических наук, профессор Валентина Николаевна Бубенчикова

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита диссертации состоится «17» июня 2008г В КЗ часов на заседании Диссертационного совета Д 208 068 01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 614990, г Пермь, ул Ленина, 48, тел (342) 212-90-06, 123-445, факс (342)212-94-76

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «ПГФА Росздрава» по адресу 614070, г Пермь ул Крупской, 46

Автореферат разослан « мая 2008 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208 068 01 кандидат фармацевтических наук, доцент

Е В Метелева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения многих стран Ежегодно почти на 5 % увеличивается общее количество больных СД На сегодняшний день в Российской Федерации на официальном учете состоит свыше 3 млн больных Из них доля больных инсулиннезависимым СД составляет 85-90%

При СД нарушается большинство видов метаболизма и в разной степени поражаются многие ткани и органы Развитие СД приводит к появлению серьезных осложнений, являющихся причиной инвалидности и высокой смертности

Применение соответствующих лекарственных растительных препаратов позволяет снизить дозу противодиабетических средств и предупредить развитие осложнений диабета

Номенклатура лекарственных средств растительного происхождения для лечения СД немногочисленна, поэтому расширение ассортимента фитопрепаратов, регулирующих нарушения углеводного обмена и предупреждающих развитие осложнений, является актуальным направлением исследований В этой связи интерес представляют сборы из нескольких лекарственных растений, реализующих основные направления терапии СД

Учитывая богатство дальневосточной флоры и актуальность разработки противодиабетических средств растительного происхождения, на кафедре фармакогнозии и ботаники ДВГМУ был разработан состав сбора противодиабети-ческого

Сбор состоит из побегов черники, листьев крапивы, листьев брусники, побегов леспедецы, плодов шиповника, плодов калины К основным компонентам сбора относятся побеги черники

Систематически близким видом черники обыкновенной (Уасстшт туг^Пив Ь) является голубика (V Ы^тоБит Ь ) Литературные данные и оригинальные исследования показали, что побеги голубики обладают гипогликемическим дей-

ствием В связи с этим сырье голубики можно рассматривать как перспективное для изучения с целью введения в официальную практику и как возможную замену побегов черники в сборах Кроме того, изучение неофицинальных лекарственных растений с целью введения в научную медицину является приоритетным направлением фармакогностических исследований

Введение в фармацевтическую практику новых видов лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов требует тщательного изучения вопросов их стандартизации

Наиболее объективна стандартизация по содержанию биологически активных веществ (БАВ), обеспечивающих фармакологическую активность Согласно литературным данным, сырьевые источники сбора содержат флавоноиды, которые, как известно, обладают широким спектром биологической активности Это обстоятельство делает обоснованным определение содержания флаво-ноидов в сборе и, согласно принципу сквозной стандартизации, в основном компоненте препарата - побегах черники (Уасашшп тугИПив Ь)

Таким образом, разработка методов стандартизации сбора противодиабе-тического и фармакогностическое изучение побегов голубики представляет актуальное направление исследований

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является разработка методик стандартизации сбора противодиабетического и обоснование возможности использования побегов голубики как перспективного сырья ги-погликемического действия

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- изучить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в сборе,

- разработать методики количественного определения флавоноидов и арбутина в сборе,

- установить показатели подлинности и доброкачественности сбора,

- изучить выход биологически активных веществ из сбора в настои,

- провести сравнительное исследование биологически активных веществ побегов голубики и черники обыкновенной,

- изучить динамику накопления биологически активных веществ по фазам вегетации в побегах голубики,

- разработать методику количественного определения флавоноидов в побегах черники и голубики

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Дальневосточного государственного медицинского университета Тема работы утверждена на заседании научно-плановой комиссии ДВГМУ (Протокол № 1 от 31 01 03 г)

Научная новизна. Впервые проведено фармакогностическое исследование оригинального сбора противодиабетического, определены макро-, микродиагностические признаки и числовые показатели С использованием современных методов анализа изучено качественное и количественное содержание БАВ сбора Установлен элементный состав сбора и водного извлечения из него Разработаны методики количественного определения флавоноидов и арбутина в сборе

Изучено влияние размеров частиц сырья и способов настаивания сбора на выход БАВ в настои

Проведено фармакогностическое изучение побегов голубики, впервые определена вариабельность содержания БАВ в побегах голубики по дальневосточному ареалу и фазам вегетации

Практическая значимость работы Разработаны показатели подлинности и доброкачественности сбора противодиабетического, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП)

Выбраны оптимальные способы приготовления водного извлечения из сбора для обоснования Инструкции по применению

Разработанную методику количественного определения и норматив содержания флавоноидов в побегах черники предлагается включить в соответст-

вующую Фармакопейную статью

Обоснована перспективность дальнейшего исследования побегов голубики с целью введения в фармацевтическую практику

Материалы диссертации использованы при подготовке Правил пользования лесным фондом на территории Хабаровского края Проект ФСП на сбор противодиабетический передан ООО «Компания «Хабаровская фармация» Данные диссертационной работы используются в учебном процессе Получены акты внедрения

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на IV международной научной конференции "Азиатско-тихоокеанский регион в глобальной политике, экономике и культуре XXI века" (Хабаровск, 22-23 октября 2002 г), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию Хабаровского края "Природные ресурсы Хабаровского края проблемы науки и образования" (Хабаровск, 11-12 ноября 2003 г), И международной конференции «Лесные биологически активные ресурсы (березовый сок, живица, эфирные мала, пищевые, технические и лекарственные растения)» (Хабаровск, 21-23 сентября 2004г), 61-й 62-й и 63-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004, 2005, 2006 гг)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований

Основные положения, выносимые на защиту результаты изучения комплекса БАВ сбора противодиабетического и голубики, предложения по стандартизации сбора, обоснование методики количественного определения флавоноидов и норматива их содержания в сборе противодиабетическом и побегах черники, данные по выходу основных групп БАВ в настои из сбора, результаты сравнительного анализа качественного и количественного содержания действующих веществ в сырье черники и голубики, данные по изменчивости

количественного содержания основных БАВ в побегах голубики по фазам вегетации

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 177 страницах машинописного текста, иллюстрирована 58 рисунками и 43 таблицами Результаты экспериментов обработаны статистически

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальной работы, общих выводов, списка литературы и приложений Список литературы включает 220 источников

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы В главе I (литературный обзор) приводятся сведения по изучению лекарственных растений для лечения и профилактики сахарного диабета и его осложнений, дано обоснование состава сбора с позиции химического состава и фармакологического действия сырьевых компонентов Глава II посвящена описанию материалов и методов использованных в работе В главе III приведены материалы по фармакогностическому и химическому изучению сбора и разработке методик количественного определения суммы флавоноидов и арбутина в сборе Глава IV посвящена изучению влияния размеров частиц сырья и способов настаивания на выход БАВ из сбора в настои Фармакогностическое исследование побегов голубики и изучение изменчивости химического состава по фазам вегетации описаны в главе V. В главе VI описаны исследования по разработке методики количественного определения флавоноидов в побегах черники и голубики Проект ФСП на сбор приведен в приложении 1 В приложение 2 включены акты внедрения

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Объектами исследования являлись 9 серий сбора противодиабетического, 34 образца побегов голубики и 17 образцов побегов черники, собранных преимущественно на Дальнем Востоке Макро- и микроанализ сбора проводился

по общепринятым методикам Микропризнаки сбора исследовали под микроскопом Micros МС400А Полученные цифровые фотографии микропрепаратов обрабатывали с помощью анализатора изображений в программе Mecos Качественный состав БАВ в объектах исследовали современными методами фито-химического анализа ВЭТСХ - с помощью системы для тонкослойной хроматографии «Денситометр Сорбфил» и денситометра «Camag», ВЭЖХ - с использованием хроматографа «Agilent Technologies 1100 Series» Элементный состав сбора и побегов голубики изучали с помощью масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой ISP-MS Elan DRC II PerkinElmer Спектрофото-метрические исследования выполняли с использованием регистрирующего спектрофотометра Shimadzu UV-1700 и СФ-46

Количественное определение основных групп БАВ в объектах проводили, используя титриметрические, гравиметрические, спектрофотометрические и хроматографические методы (ВЭЖХ)

Фармакогностическое изучение и разработка вопросов стандартизации сбора противодиабетического

Для выбора оптимальных методов стандартизации оригинального сбора, состоящего из 6 компонентов - побегов черники и леспедецы, листьев крапивы и брусники, плодов шиповника и калины, было проведено его комплексное фармакогностическое изучение В частности, проведен макро- и микроанализ опытных серий сбора

В результате анализов определены диагностические макро- и микропризнаки, по которым устанавливается присутствие каждого из сырьевых компонентов сбора

В ходе фармакогностического изучения сбора анализу был подвергнут УФ спектр извлечения из сбора на спирте этиловом 70 % В спектрах были определены соответствующие экстремумы Статистическая обработка спектральных данных шести серий сбора показала, что для определения подлинности целесообразно использовать такие характеристики спектра, как наличие максимума поглощения при 282± 1 нм и плеча при 319±3 нм

Присутствие БАВ в сборе было установлено качественными реакциями и хроматографическими методами Проведенные исследования позволили выявить различные группы веществ антоцианы, дубильные вещества, флавонои-ды, органические кислоты, полисахариды, сапонины Методами хроматографи-ческого анализа с образцами-свидетелями идентифицированы кофейная и хло-рогеновая кислоты, арбутин, рутин, кверцетин, гиперозид, кемпферол и дополнительно в гидролизате - лютеолин

В сборе и его настое обнаружены 27 элементов, в том числе оказывающие положительное влияние в терапии сахарного диабета - Мп, Сг, Хп, Си, Бе, V Показано, что марганец содержится в настое в количестве, соответствующем среднесуточной потребности Установлено, что в водные извлечения переходит до 50 % содержания большинства выявленных элементов

Для решения задач следующего этапа проводилась количественная оценка содержания БАВ в сборе количество дубильных веществ, полисахаридов, аскорбиновой и фенолкарбоновых кислот определялось по известным методикам, количество флавоноидов и арбутина - по оригинальным Большее внимание к последним группам БАВ объясняется рядом обстоятельств, в том числе фармакологическими свойствами сбора, химическим составом его сырьевых компонентов и относительно высокой вариабельностью содержания флавоноидов и арбутина в сырье

Для определения содержания флавоноидов в сборе при его фармакогно-стическом изучении и в дальнейшем для оценки качества серийной продукции была разработана спектрофотометрическая методика, основанная на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом В ходе разработки методики было изучено влияние условий экстрагирования сбора (концентрация спирта этилового, размер частиц сырья, соотношение сырья и экстрагента, продолжительность и кратность экстракции) на выход флавоноидов, определены спектральные характеристики и условия комплексообразования (количество алюминия хлорида, влияние подкислителя, продолжительность реакции комплексообразования и устойчивость комплекса) Данные эксперимента были

оценены по критериям Стьюдента и Фишера методами попарных сравнений и дисперсионного анализа

В качестве стандартного образца выбран рутин, аналитическая длина волны >=409 нм Установлено, что в качестве экстрагента целесообразно использовать спирт этиловый 70 % Наибольший выход флавоноидов достигается при размерах частиц 0,5 мм и трехкратной экстракции (табл 1)

Оптимальное количество 2 % раствора алюминия хлорида составляет 1 мл, реакция комплексообразования развивается в течение 40 мин и сохраняет стабильность последующие 30 мин В области рабочих плотностей 0,2 - 0,8 наблюдается линейная зависимость между содержанием флавоноидов и величи-

ной оптической плотности

Таблица 1

Влияние условий экстракции на полноту извлечения флавоноидов из сбора

Условия экстракции Содержание флавоноидов, % Р=95%

концентрация спирта этилового, % 70 95 1,60±0,06 1,Ю±0,10 Р >Р 1 ЭКСП 1 Кр

размер частиц сбора, мм 0,5 1 2 1,99±0,04 1,91 ±0,06 1,85±0,03 Р >Р 1 ЭКСП 1 кр

продолжительность экстракции, мин 15 30 60 1,86±0,04 1,83+0,09 1,84±0,09 р <р 1 ЭКСП 1 кр

кратность экстракций однократная экстракция двухкратная экстракция трехкратная экстракция 1,73±0,06 1,92±0,05 1,95±0,04 р >р 1 ЭКСП 1 кр

Относительная средняя погрешность методики (£) составляет 2,6 %

(табл 2) Опыт с добавками стандартного образца рутина показал отсутствие систематической ошибки Методика апробирована на 6 образцах сбора, данные по содержанию флавоноидов приведены в табл 3 Статистическая обработка результатов показала, что методика удовлетворяет аналитическим задачам Ва-

лидационная оценка методики, проведенная в соответствии с проектом ОФС «Ва-лидация фармакопейных методов» по показателям сходимость, воспроизводимость, правильность и линейность подтвердила ее пригодность для решения задач стандартизации

Таблица 2

Метрологическая характеристика методики определения суммы флавоноидов в сборе противодиабетическом

п f х,% S2 s ; Р,% Лх: £|,% s ,%

6 5 1,16 0,001 0,012 95 0,03 6,0 2,6

mAU 50004000 30002000 1000

mAU 1600

1200 800 400

2,5

2,5 7,5

12,5 17,5 mm

7,5 12,5 17,5 mm

Рис 1 Хроматограмма спиртового извлечения сбора до очистки на колонке с алюминия оксидом (А) и после очистки (Б)

Для количественного определения арбутина в сборе была разработана методика, в основе которой лежит высокоэффективная жидкостная хроматография Арбутин из сбора извлекали 40 % спиртом этиловым Очистку извлечения от сопутствующих веществ проводили на колонке с алюминия оксидом Полученный элюат использовали для анализа Для хроматографирования были подобраны следующие условия колонка- Zorbax SB С 18, 4,6x250 мм (с размером частиц 5 мкм), подвижная фаза - фосфорная кислота вода метанол (0,5 60 40), скорость потока - 1 мл/мин, рабочая длина волны - 285 нм, объем пробы - 20 мкл, температура колонки - 25 "С, продолжительность хроматографирования - 20 мин Разработанная методика характеризуется высокой избирательностью и удовлетворительной точностью (S2 = 0,01, s = 7,4%) В выбранных условиях время удерживания

ГСО арбутина составляет 2,6 мин (рис 1)

Результаты количественного определения основных БАВ сбора приведены в табл 3 Как видно по представленным данным, все исследованные группы содержатся в сборе в терапевтически значимых количествах, то есть стандартизацию сбора можно проводить по содержанию любых из приведенных веществ Тем не менее, по совокупности критериев мы считаем наиболее оправданным проводить стандартизацию сбора по количественному содержанию флавоноидов и дубильных веществ

Таблица 3

Количественное содержание биологически активных веществ в сборе протнводиабетическом

№ Содержание БАВ, %

серии дубильные фенолкар- флавонои- арб>тии полисаха- аскорбино-

вещества боновые кислоты ды риды вая кислота

01 04 8,5 1,50 1,16 2,20 6,8 0,29

02 04 9,1 1,93 1,99 1,39 5,9 0,31

03 04 8,7 1,77 1,33 1,10 5,8 0,30

04 04 8,5 2,51 1,36 0,81 6,3 0,21

05 04 9,0 1,49 1,28 1,51 7,4 0,20

06 04 6,4 1,70 1,47 1,70 5,6 0,23

X 8,4 1,65 1,43 1,45 6,3 0,26

S2 0,97 0,03 0,09 0,23 0,47 0,002

Ах 0,4 0,19 0,31 0,51 0,3 0,02

V 12 11 20 33 11 19

Данные табл 3 свидетельствуют о том, что минимальное содержание фла-

воноидов в сборе составляет 1,16%, дубильных веществ - 6,42% В качестве фармакопейного норматива содержания действующих веществ в сборе протнводиабетическом можно установить содержание флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,0%, дубильных веществ - не менее 5,5%

Определение доброкачественности сбора проводилось по всем показателям, предусмотренным ОСТ 91500 05 001-00 для данной лекарственной формы Результаты исследований и рекомендуемые для включения в ФСП нормативы приведены в табл 4

Таблица 4

Числовые показатели сбора противодпабетического

Показатели содержания Средние значения, % Рекомендуемый норматив %

влаги 7,9±0,6 не более 14

золы общей 6,8±0,5 не более 10

золы, нерастворимой в 10% растворе НС1 0,88±0,36 не более 2

частиц, не проход сквозь сито с 0 отверстий 3 мм 2,3±1,2 не более 5

частиц, проход сквозь сито с 0 отверстий 0,2 мм 6,7+1,1 не более 10

Таким образом, в результате фармакогиостического изучения сбора определено качественное и количественное содержание БАВ, установлен минеральный состав, выявлены диагностические макро- и микропризнаки сырьевых компонентов сбора Для включения в ФСП предложена качественная реакция и УФ спектр, разработана методика количественного определения флавоноидов в сборе, обоснованы числовые показатели сбора

Изучение параметров экстракции сбора противодпабетического

Оригинальный сбор состоит из шести компонентов, относящихся к трем морфологическим группам сырья (плоды, листья, побеги) и характеризующихся различной гистологической структурой и химическим составом Этим обусловлен интерес к разработке оптимальной технологии водного извлечения сбора противодпабетического

Предварительно был изучен выход БАВ из сырьевых источников сбора в настои в зависимости от размеров частиц сырья Результат эксперимента показал, что измельченность сырья в выбранных пределах оказывает достоверное влияние на выход экстрактивных веществ - из побегов черники, листьев крапивы и брусники, дубильных веществ - из сырья черники, брусники, шиповника и калины, флавоноидов - из плодов шиповника, органических кислот - из брусники Выход большинства групп БАВ из компонентов сбора находится на высоком уровне - 70-90 % Относительный выход экстрактивных веществ в настои колеблется от 68 до 97 %, дубильных веществ - 57-93 %, флавоноидов - 65-89 %

Наибольший выход в настои сбора отмечается для арбутина (94 %), экстрактивных веществ (83 %) и аскорбиновой кислоты (81 %) Дубильные вещества и флавоноиды извлекаются на 67-68 %

Затем было изучено влияние способа приготовления настоя из сбора на показатели количественного содержания БАВ Мы сравнили способы приготовления извлечения из сбора по фармакопейным методикам приготовления настоев и отваров, настаиванием в термосе, в микроволновой печи и кипячением на плитке Однофакторный дисперсионный анализ полученных данных показал, что способ приготовления настоев оказывает статистически достоверное влияние на содержание дубильных, экстрактивных веществ и арбутина и не влияет на содержание флавоноидов и аскорбиновой кислоты Относительно низкое количество дубильных веществ переходит в настои, приготовленные на плите и в микроволновой печи Арбутин лучше извлекается при приготовлении извлечений фармакопейными способами В целом способы приготовления настоев хотя и оказывают статистически значимое, но не существенное влияние на содержание БАВ в извлечениях Изученные технологические режимы можно считать равноприемлемыми, но для включения в Инструкцию по применению сбора нами выбран как наиболее оптимальный - фармакопейный способ получения отваров

Фармакогностическое изучение побегов голубики

Для обоснования возможности использования побегов голубики в качестве сырья, альтернативного побегам черники в составе сборов, был проведен сравнительный фитохимический анализ сырья двух видов Анализу подвергнуто 14 образцов голубики и 17 образцов черники обыкновенной, собранных в основном по дальневосточным ареалам видов

Качественный анализ подтвердил присутствие в побегах голубики и черники дубильных веществ, флавоноидов, антоцианов, сапонинов, простых фе-нольных соединений, хроматографически идентифицированы хлорогеновая и кофейная кислоты, арбутин, гиперозид, авикулярин, гвайаверин и кверцетин Сравнение хроматографических профилей фенольных комплексов трех образ-

цов черники и трех образцов голубики показало, что различия между видами находятся в границах внутривидовой изменчивости химического состава

Изучение микроэлементного состава побегов голубики проводилось на образцах, собранных в Еврейской автономной области, Республике Саха (Якутия) и Амурской области В исследованных образцах выявлено до 30 элементов, в том числе обнаружены Ре, Ъп, Сг, Си, Мд, Мп, Со, Бе, играющие важную роль в регуляции обменных процессов

Результаты сравнительного анализа побегов голубики и черники по количественному содержанию основных групп БАВ были обработаны статистически, достоверность различий определялась по критерию Стьюдента Полученные данные представлены в сводной таблице (табл 5), из которой следует, что по среднему содержанию флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых и органических кислот голубика превосходит чернику обыкновенную

Таблица 5

Данные статистической обработки содержания БАВ в выборках образцов

сырья голубики и черники обыкновенной

Стат параметры Значения статистических характеристик по выборкам

флавоноиды д>бильные вещества органические М1СТОТЫ фенолкарбоновые кислоты

горбика черника гол>бика черника горбика черника голубика черника

п 14 17 14 17 14 17 14 17

Г 3,75 1,84 12,3 8,3 2,48 0,98 9,1 7,5

Дл 0,34 0,19 1,4 0,7 0,58 0,08 0,8 0,6

^тш 2,58 1,12 8,0 6,3 1,29 0,64 7,0 5,6

4,94 2,53 16,3 11,4 4,17 1,17 11,5 9,1

0,32 0,14 5,85 1,63 1,0 0,02 1,7 1,1

V 15 20 20 15 40 15 15 14

^эксп 11 5,5 5,6 3,5

Примечание Значение thp для всех исследованных гр>пп БАВ составпяет 2,1

Таким образом, в результате фармакогностического изучения побегов голубики показано сходство химического состава этого сырья с биологически активным комплексом побегов черники и определенные преимущества побегов голубики в количественном содержании некоторых БАВ

Для определения динамики накопления основных БАВ были проанализированы 4 серии образцов голубики, собранных в различных районах Дальнего Вое-

тока в Амурской области, в Хабаровском крае, Республике Саха (Якутия) и Камчатской области Во всех образцах определялось содержание дубильных веществ, флавоноидов, арбутина, органических и фенолкарбоновых кислот В качестве примера на рисунках 2 и 3 приведена динамика накопления дубильных веществ и флавоноидов в побегах голубики

Содержание дубильных веществ, %

20 п

15 -

10 -

5 -

фазы вегетации

цветение

плодоношение

конец

вегетации вегетации

Рис 2 Динамика накопления дубильных веществ в побегах голубики по фазам вегетации I - Еврейская автономная область, 2 - Камчатская область, 3 - Амурская область, 4 - Республика Саха (Якутия)

Содержание 8 флавоноидов, % к

2 ■

фазы вегетации

плодоношение

вегетации

конец вегетации

Рис 3 Динамика накопления флавоноидов в побегах голубики по фазам вегетации I - Еврейская автономная область, 2 - Камчатская область, 3 - Амурская область, 4- Респ)бтнка Саха (Якутия)

На основании количественного анализа образцов, собранных в Амурской области, можно сделать вывод, что максимальное содержание изученных групп веществ приходится на период плодоношения В камчатской серии максимум арбутина обнаруживается в фазу плодоношения, остальных БАВ - в начале вегетации В сырье, заготовленном в ЕАО, максимальное содержание большинст-

ва групп БАВ также приходится на начало вегетации, дубильных веществ - на фазу плодоношения В образцах из Якутии максимальное количество дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот обнаружено в период плодоношения, флавоноидов - в период цветения, арбутина - ближе к концу вегетации Анализ полученных данных свидетельствует об отсутствии закономерностей накопления БАВ в побегах голубики по срокам сбора и фазам вегетации В разных сериях образцов наблюдаются различные картины динамики БАВ, что видимо, связано с влиянием климатического, географического и экологического факторов

По совокупности полученных данных можно сделать заключение, что изменения количественного содержания БАВ в динамике не превышают таковые для сырья, собранного в разных географических пунктах Поэтому можно рекомендовать заготовку побегов голубики в дальневосточном регионе с начала цветения до начала побурения листьев, поскольку в эти периоды побеги вполне развиты и содержание БАВ достаточно высокое

Разработка методики количественного определения флавоноидов в побегах черники и голубики

Побеги черники являются основным компонентом сбора и в соответствии с принципом сквозной стандартизации представляется актуальной разработка стандартизации сырья черники по количественному содержанию флавоноидов Как и в предыдущем случае, для разработки методики использовали дифференциальную спектрофотометрию

В процессе отработки условий пробоподготовки были применены 2 варианта исследований традиционная схема последовательных экспериментов и математическое моделирование процесса экстракции флавоноидов в условиях влияния разнородных факторов При этом решались две задачи практическая -по разработке условий пробоподготовки и академическая - по сравнению «традиционного» и «математического» метода оптимизации экстракции действующих веществ По первому варианту экспериментально изучены параметры пробоподготовки концентрация спирта этилового, размер частиц сырья, соотно-

шение сырья и экстрагента, продолжительность и кратность экстракции Дисперсионный анализ показал достоверное влияние концентрации спирта, соотношения сырье экстрагент и кратности экстракции и отсутствие влияния двух других из изученных факторов на результаты анализа

Для реализации второго варианта исследований использовали дробный факторный эксперимент В качестве основных факторов, влияющих на экстракцию флавоноидов, были выбраны продолжительность экстрагирования, соотношение сырья и экстрагента и кратность экстракции

Результаты обрабатывали статистически с использованием программы Stat-graphics plus for Windows Была получена математическая модель процесса извлечения флавоноидов, уравнение регрессии которого имеет следующий вид

F= 1,42667+0,0115667ху-0,0000266667ху2-0,00195 ху xz+0,321667 xz, где F - содержание флавоноидов, у - количество экстрагента, взятого для экстракции 1 г сырья, мл, z - кратность экстракций

С помощью этого уравнения была построена графическая модель экстракции флавоноидов из сырья, характер поверхности которой отражает закономерность извлечения флавоноидов (рис 4)

Рассчитанные значения полученной функции хорошо коррелируют с экспериментальными данными коэффициент корреляции равен 0,96 Рассчитанная средневзвешенная дисперсия а = 0,005, Ах = 0,07 (Р = 90%), е = 2,7 % Рассчитанная по данному уравнению область оптимальных значений содержания флавоноидов в извлечении охватывала большой диапазон вариантов экстракции, поэтому мы провели дисперсионный анализ для отсеивания малозначащих факторов В результате были получены F-отношения, показавшие, что фактор кратности экстракций оказывает более сильное влияние по сравнению с фактором соотношения сырье экстрагент (FKp кра1н01ГЬ(3,5) > FKp соотноше„„е (1,6)) Фактор продолжительности экстрагирования оказался малозначащим (FKp время=0,1) В итоге получили вариант трехкратной экстракции 1 г сырья последовательно порциями по 100, 50 и 50 мл спирта этилового 70 % В выбранных условиях была проведена экстракция сырья и получен результат, находящийся в области

оптимума (2.75±0,09 %), что подтверждает правильность параметров, выбранных в первом варианте.

2 -

I

Г

Кратность 4 экстракций

1:150

Рис. 4 Зависимость перехода флавоноидов в экстракт от соотношения сырье : экстрагент и кратности экстракций при продолжительности мацераций 15 мин.

Необходимо подчеркнуть, что оба варианта экспериментов позволили выбрать одни и те же условия пробоподготовки. но математическое планирование эксперимента дает возможность обнаружить закономерности экстракции флавоноидов из сырья, выявить малозначащие факторы и определить область оптимальных условий экстракции для конкретного объекта.

В качестве стандарта также использован рутин, аналитическая длина волны - 415 нм. Количество комплексообразователя - 1 мл 2 % раствора алюминия хлорида. Реакция комплексообразования развивается в течение 35 мин, комплекс сохраняет стабильность в течение 50 мин. В области рабочих оптических плотностей 0.2 - 0,8 наблюдается линейная зависимость между концентрацией флавоноидов в испытуемом растворе и величиной поглощения.

Таблица 7

Метрологическая характеристика методики определения

суммы флавоноидов в побегах черники

п f х, % Б2 5 ; Р,% А х БЬ% 8, %

6 5 1,34 0,001 0,014 95 0,02 7,5 1,1

Содержание флавоноидов.

Средняя относительная погрешность определения (8) составляет 1,1%, единичного определения (е,) - 7,5 % (табл 7) Отсутствие систематической ошибки подтвердили в эксперименте с добавкой стандартного образца рутина

Разработанная методика апробирована на 12 образцах сырья черники обыкновенной Данные по содержанию флавоноидов приведены в таблице 8

Таблица 8

Содержание флавоноидов в образцах побегов черники обыкновенной

п х, % Х|П1П) % ^тах* /0 82 5 х Р, % Д х

12 1,75 1,18 2,43 0,11 0,1 95 0,21

Таким образом, колебание содержания флавоноидов в побегах черники обыкновенной находится в пределах 1,2 - 2,4 % В качестве норматива содержания действующих веществ в побегах черники предлагается установить содержание суммы флавоноидов не менее 1,0 %

Разработанная методика была также апробирована для определения флавоноидов в побегах голубики Модификация методики касается изменения рабочей концентрации пробы для измерения оптической плотности Соответствующие проверки подтвердили выполнение основного закона светопоглощения и отсутствия систематической ошибки при использовании модифицированной методики Средняя относительная погрешность определения £ (п=6) составляет 1,3%, 52=0,002 (Р=95%)

Таким образом, разработана методика дифференциального спектрофото-метрического определения флавоноидов в побегах черники и обоснован норматив содержания этой группы действующих веществ Показана возможность использования модифицированной методики для определения флавоноидов в побегах голубики

Общие выводы

1 Проведено изучение основных БАВ сбора противодиабетического Показано присутствие в сборе флавоноидов, дубильных веществ, антоцианов, полисахаридов, простых фенольных соединений, оксикоричных и органиче-

ских кислот, идентифицированы 7 индивидуальных соединений Установлено наличие в сборе 27 макро- и микроэлементов Количественно оценено содержание дубильных веществ, флавоноидов, арбутина, аскорбиновой кислоты, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов

2 Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения флавоноидов в сборе и обоснован норматив их содержания - не менее 1,0 % в пересчете на рутин Разработана ВЭЖХ методика определения арбутина Среднее содержание арбутина в сборе составляет 1,45 %

3 Установлены показатели подлинности и доброкачественности сбора определены диагностические внешние и микропризнаки сбора, характеристики УФ спектра, числовые показатели Разработан проект ФСП на сбор

4 Изучены параметры экстракции БАВ в настои из сбора и его компонентов Обоснованы размеры частиц сырья и оптимальный способ приготовления водного извлечения из сбора В проект Инструкции по применению сбора предложено включить способ приготовления отвара по ГФ XI

5 Проведено фармакогностическое исследование побегов голубики Показано наличие в сырье флавоноидов, дубильных веществ, антоцианов, простых фенольных соединений, сапонинов, идентифицированы арбутин, ги-перозид, авикулярин, гвайаверин, кверцетин, хлорогеновая и кофейная кислоты Установлен минеральный состав выявлено содержание 30 элементов Определено количественное содержание основных групп БАВ в побегах голубики Показано, что среднее содержание флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых и органических кислот в побегах голубики достоверно выше, чем в побегах черники

6 Изучена динамика накопления БАВ в побегах голубики, произрастающей в дальневосточном регионе, по фазам вегетации Рекомендована заготовка побегов голубики с начала цветения до начала побурения листьев

7 Разработана методика количественного определения флавоноидов в побегах черники обыкновенной Установлено, что содержание флавоноидов в сырье в пересчете на рутин должно быть не менее 1,0 % Разработанная методика модифицирована для определения флавоноидов в побегах голубики

Список опубликованных работ

1 Цимбалист, Н А К разработке вопросов стандартизации сбора сахаросни-жающего /НА Цимбалист, Т А Степанова, А Е Будо // Лесные биологически активные ресурсы (березовый сок, живица, эфирные масла, пищевые, технические и лекарственные растения) материалы II международной конференции - Хабаровск ФГУ ДальНИИЛХ, 2004 - С 325-327

2 Цимбалист, Н А Изучение влияния получения настоев сбора сахаросни-жающего на выход веществ /НА Цимбалист // Актуальные вопросы современной медицины материалы б 1-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых (Хабаровск, апрель 2004 г ) - Хабаровск издательство ДВГМУ, 2004 -С 58-60

3 Цимбалист, Н А Обоснование выбора размеров частиц сырья в составе сбора сахароснижающего /НА Цимбалист, Н А Леоненко // Актуальные вопросы современной медицины материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых - Хабаровск, 2005 -С 127-129

4 Цимбалист, Н А Решение некоторых методических вопросов количественного определения флавоноидов в сборе сахароснижающем /НА Цимбалист // Актуальные вопросы современной медицины материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых - Хабаровск, 2005 - С 129-130

5 Цимбалист, Н А Стандартизация сахаропонижающего сбора / Н А Цимбалист^ А Степанова, А Е Будо//Фармация -2005 -№4 - С 12-14

6 Степанова, Т А Новые фитопрепараты из растений Дальнего Востока /ТА Степанова, С В Степанов, О В Стусенко, А С Степанов, Н В Матющен-ко, Н А Цимбалист // IV международная научная конференция "Азиатско-тихоокеанский регион в глобальной политике, экономике и культуре XXI века" (22-23 октября 2002 г) - Хабаровск, 2002 - С 97-146

7 Мечикова, Г Я Дальневосточные виды черники - перспективные лекарственные растения/ Г Я Мечикова, Н А Цимбалист, Т А Степанова // Сб статей по итогам Всероссийской науч -практ конф Посвященной 65-летию Хабаровского края "Природные ресурсы Хабаровского края проблемы науки и образования" -Хабаровск Изд-во ХБПУ, 2004 - С 42-45

8 Степанова, Т А Основные результаты научных исследований кафедры фармакогнозии и ботаники ДВГМУ в направлении стандартизации /ТА Степанова, А С Степанов, Н В Матющенко, Г Я Мечикова, Н А Цимбалист// Дальневосточный медицинский журнал -2005 -№3 - С 81-86

9 Степанова, Т А Практика и перспективы использования викарных видов лекарственных растений Дальнего Востока /ТА Степанова, Г Я Мечикова, С В Степанов, А Е Будо Н В Матющенко, Н А Цимбалист // Наука и природа Дальнего Востока - 2006 - № 2 - С 65-76

10 Фогт, В П Обоснование возможности разработки готовой лекарственной формы на основе прописи сачароснижающего сбора / В П Фогт, Н А Цимбалист, А С Степанов Т А Степанова // Дальневосточный медицинский ж>риал -2006 -№1 -С 88-90

11 Темерханова, Ю Г Изменение содержания биологически активных веществ (БАВ) в побегах голубики по фазам вегетации / 10 Г Темерханова, Н А Цимбалист// Актуальные вопросы современной медицины материалы 63-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых - Хабаровск, 2006 -С 104-105

12 Цимбалист, Н А Исследование элементного состава побегов голубики обыкновенной /НА Цимбалист Т А Степанова Д В Авдеев // Медицинский вестник Башкортостана / Специальный выпуск -2006 -Т 4 №1 -С 180-181

13 Цимбалист Н А Изучение элементного состава сбора противодиабетическо-го / Н А Цимбалист Т А Степанова, В Е Зазулина//Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции со науч тр - Пятигорск, 2007 -Вып 62 - С 407 - 409

14 Степанова, Т А Фитохимическое изучение побегов голубики /' Т А Степанова, И А Цимбалист//Социально ориентированные научные исследования женщин-ученых Хабаровского края материалы первой краевой научной конференции, посвященной 68-й годовщине Хабаровского края, 27 октября 2006 года - Хабаровск РИЦ ХГАЭП, 2007 - С 191-197

Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения многих стран [219]. Распространенность данного заболевания по России на 2001 год составляла для инсулинозависимо-го (ИЗСД) 224,5 на 100 тыс. и инсулиннезависимого (ИНСД) 1595,4 на 100 тыс. человек соответственно [161]. На сегодняшний день в РФ на официальном учете состоит свыше 3 млн. больных, в Хабаровском крае около 16 000 человек, в городе Хабаровске 9 500 больных сахарным диабетом. Из них больных сахарным диабетом 2 типа в Хабаровском крае 15 855 человек, в городе Хабаровске 8 900 человек [159].

Каждые 10-15 лет число больных СД удваивается. Доля ИНСД среди других форм достигает 85-90% [8, 161, 165, 207, 219, 188]. При СД нарушаются большинство видов метаболизма и в разной степени поражаются многие ткани и органы. Развитие СД приводит к появлению серьезных осложнений, являющихся причиной инвалидности и высокой смертности. К наиболее частым (у 30 - 80 % больных СД) длительно протекающим заболеваниям относят: поражения сердечно-сосудистой системы, поражения нервной системы, диабетические нефропатии, поражения кожи, диабетические ретинопатии, поражения костно-мышечной системы и иммунной системы [19, 56, 67, 80, 98, 107, 116, 160].

В связи с этим актуально применение средств растительного происхождения для профилактики и в качестве источника дополнительной терапии СД. В настоящее время зарубежные и отечественные производители предлагают биологически активные добавки к пище (БАД) в качестве вспомогательных средств терапии СД. Федеральный реестр БАД включает 30 препаратов, снижающих риск нарушений углеводного обмена, из них 19 наименований отечественного производства [166].

Среди лекарственных средств растительного происхождения для лечения СД официально зарегистрированы 3 наименования: листья земляники, створки плодов фасоли, сбор "Арфазетин" (пачки, брикеты, фильтр-пакеты) [40].

Таким образом, номенклатура лекарственных средств растительного происхождения для лечения СД немногочисленна, поэтому расширение ассортимента фитопрепаратов, регулирующих нарушения углеводного обмена и предупреждающих развитие осложнений является актуальным направлением исследований. В этой связи интерес представляют сборы из нескольких лекарственных растений, реализующих основные направления терапии СД.

Учитывая богатство дальневосточной флоры и актуальность разработки противодиабетических средств растительного происхождения, на кафедре фармакогнозии и ботаники д.ф.н., профессором Т.А. Степановой был разработан состав сбора противодиабетического. Оригинальный сбор состоит из побегов черники, листьев крапивы, листьев брусники, побегов леспедецы, плодов шиповника, плодов калины.

Основным компонентом сбора являются побеги черники. Ареал черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) на Дальнем Востоке ограничен по сравнению с европейским [7]. Систематически близким видом черники обыкновенной является голубика (V. uliginosum L.) [152]. Ареал голубики охватывает практически все регионы нашей страны [6]. Согласно литературным сведениям листья голубики находят применение при диабете [128, 186, 212]. Проведенные в Пятигорской фармацевтической академии фармакологические исследования побегов дальневосточных образцов голубики показали, что они обладают ги-погликемическим действием [61]. В связи с этим сырье голубики можно рассматривать как перспективное для изучения с целью введения в официальную практику и как возможную замену побегов черники в сборах. Кроме того, изучение химического состава новых лекарственных растений с целью введения в научную медицину является приоритетным направлением фармацевтической практики [106].

Введение в фармацевтическую практику новых видов лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов требуют тщательного изучения вопросов их стандартизации [136].

Наиболее объективна стандартизация по содержанию биологически активных веществ (БАВ), обеспечивающих фармакологическую активность. Согласно литературным данным сырьевые источники сбора содержат флавоноиды, которые обладают антиоксидантной, антигипоксантной, мембраностабилизи-рующей, противоаллергической, противодиабетической, спазмолитической, ги-похолестеринемической, гипотензивной активностью, а также нормализуют нарушенный обмен веществ. Это обстоятельство делает обоснованным определение содержания флавоноидов в сборе и согласно принципу сквозной стандартизации в основном компоненте препарата - побегах черники.

Таким образом, разработка метода стандартизации сбора противодиабети-ческого и фармакогностическое изучение побегов голубики представляет актуальное направление исследований.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка методик стандартизации сбора противодиабетического и обоснование возможности использования побегов голубики как перспективного сырья ги-погликемического действия.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в сборе; разработать методики количественного определения флавоноидов и арбутина в сборе; установить показатели подлинности и доброкачественности сбора; изучить выход биологически активных веществ из сбора в настои; провести сравнительное исследование биологически активных веществ побегов голубики и черники обыкновенной; изучить динамику накопления биологически активных веществ по фазам вегетации в побегах голубики; разработать методику количественного определения флавоноидов в побегах черники и голубики.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Дальневосточного государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании научно-плановой комиссии ДВГМУ (Протокол № 1 от 31.01.03 г.)

Научная новизна. Впервые проведено фармакогностическое исследование оригинального сбора противодиабетического, определены макро- и микродиагностические признаки и числовые показатели. С использованием современных методов анализа изучен качественный и количественный состав БАВ сбора противодиабетического. Установлен элементный состав сбора и водного извлечения из него. Разработаны методики количественного определения флавонои-дов и арбутина в сборе.

Изучено влияние размеров частиц сырья и способов настаивания сбора на выход БАВ в настои.

Проведено фармакогностическое изучение побегов голубики, впервые определена вариабельность содержания БАВ в побегах голубики по дальневосточному ареалу и фазам вегетации.

Практическая значимость работы. Разработаны показатели подлинности и доброкачественности сбора противодиабетического, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Выбраны оптимальные способы приготовления водного извлечения из сбора для обоснования Инструкции по применению.

Разработанную методику количественного определения и норматив содержания флавоноидов в побегах черники предлагается включить в соответствующую Фармакопейную статью.

Обоснована перспективность дальнейшего исследования побегов голубики с целью внедрения в фармацевтическую практику.

Материалы диссертации использованы при подготовке Правил пользования лесным фондом на территории Хабаровского края. Проект ФСП на сбор противодиабетический передан ООО «Компания «Хабаровская фармация». s

Данные диссертационной работы используются в учебном процессе. Получены акты внедрения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на IV международной научной конференции "Азиатско-тихоокеанский регион в глобальной политике, экономике и культуре XXI века" (Хабаровск, 22-23 октября 2002 г.); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию Хабаровского края "Природные ресурсы Хабаровского края: проблемы науки и образования" (Хабаровск, 11-12 ноября 2003 г.); II международной конференции «Лесные биологически активные ресурсы (березовый сок, живица, эфирные мала, пищевые, технические и лекарственные растения)» (Хабаровск, 21 - 23 сентября 2004г.); 61-й 62-й и 63-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004; 2005; 2006 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту: результаты изучения комплекса БАВ сбора противодиабетического и голубики; предложения по стандартизации сбора; обоснование методики количественного определения флавоноидов и норматива их содержания в сборе противодиабетическом и побегах черники; данные по выходу основных групп БАВ в настои из сбора; результаты сравнительного анализа качественного и количественного содержания действующих веществ в сырье черники и голубики; данные по изменчивости количественного содержания основных БАВ в побегах голубики по фазам вегетации.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 177 страницах машинописного текста, иллюстрирована 58 рисунками и 43 таблицами. Результаты экспериментов обработаны статистически.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальной работы, общих выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 220 источников.

Общие выводы

1. Проведено изучение основных БАВ сбора противодиабетического. Показано присутствие в сборе флавоноидов, дубильных веществ, антоцианов, полисахаридов, простых фенольных соединений, оксикоричных и органических кислот, идентифицированы 7 индивидуальных соединений. Установлено наличие в сборе 27 макро- и микроэлементов. Количественно оценено содержание дубильных веществ, флавоноидов, арбутина, аскорбиновой кислоты, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов.

2. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения флавоноидов в сборе и обоснован норматив их содержания - не менее 1,0 % в пересчете на рутин. Разработана ВЭЖХ методика определения арбутина. Среднее содержание арбутина в сборе составляет 1,45 %.

3. Установлены показатели подлинности и доброкачественности сбора: определены диагностические внешние и микропризнаки сбора, характеристики УФ спектра, числовые показатели. Разработан проект ФСП на сбор.

4. Изучены параметры экстракции БАВ в настои из сбора и его компонентов. Обоснованы размеры частиц сырья и оптимальный способ приготовления водного извлечения из сбора. В проект Инструкции по применению сбора предложено включить способ приготовления отвара по ГФ XI.

5. Проведено фармакогностическое исследование побегов голубики. Показано наличие в сырье флавоноидов, дубильных веществ, антоцианов, простых фенольных соединений, сапонинов; идентифицированы арбутин, ги-перозид, авикулярин, гвайаверин, кверцетин, хлорогеновая и кофейная кислоты. Установлен минеральный состав: выявлено содержание 30 элементов. Определено количественное содержание основных групп БАВ в побегах голубики. Показано, что среднее содержание флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых и органических кислот в побегах голубики достоверно выше, чем в побегах черники.

6. Изучена динамика накопления БАВ в побегах голубики, произрастающей в дальневосточном регионе, по фазам вегетации. Рекомендована заготовка побегов голубики с начала цветения до начала побурения листьев. 7. Разработана методика количественного определения флавоноидов в побегах черники обыкновенной. Установлено, что содержание флавоноидов в сырье в пересчете на рутин должно быть не менее 1,0 %. Разработанная методика модифицирована для определения флавоноидов в побегах голубики.