Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение восковницы обыкновенной Myrica gale L.

На правах рукописи

Кашина Анастасия Алексеевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВОСКОВНИЦЫ ОБЫКНОВЕННОЙ МУЫСА вА1-Е I.

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 о ДЕК 2009

Санкт-Петербург - 2009

003488705

Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии на кафедре фармакогнозии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Яковлев Геннадий Павлович Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Гравель Ирина Валерьевна доктор фармацевтических наук, профессор Николаева Любовь Алексеевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия

Защита состоится « 22 » декабря 2009 г. в 14.30 на заседании Диссертационного Совета Д 208,088.01 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14. Тел. +7 (812) 234-57-29; факс +7 (812) 234-60-44; e-mail: rector@spcpa.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14.

Автореферат разослан « 20 » ноября 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208.088.01,

кандидат фармацевтических наук

Марченко Н. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственные растения до настоящего времени занимают особое место в фармацевтической практике, оставаясь одним из важных источников для получения лекарственных средств. По сравнению с синтетическими, растительные препараты обладают рядом преимуществ, в числе которых - широкий спектр фармакологического действия, как правило, низкая токсичность, меньшая1 выраженность и частота побочных эффектов и значительно меньшее количество противопоказаний. Исходя из этого, изучение новых перспективных видов растительного сырья и их внедрение в научную медицину является одной из задач современной фармакогнозии.

При поиске новых лекарственных растений следует принимать во внимание опыт народной медицины. В частности, в народной медицине стран Европы, Северной Америки, и у коренного населения Дальнего Востока России находили применение виды рода восковница Myrica L. семейства восковниковые - Myricaceae: восковница обыкновенная Myrica gale L. и восковница войлочная Myrica tomentosa (С. DC.) Aschers, et Graebn. Оба растения - двудомные кустарники высотой до 1,5 м, цветущие до распускания листьев. Первый вид произрастает в России на территории Северо-Западного региона, а также в странах Прибалтики, Северной и Западной Европы и Северной Америки, второй - достаточно обилен на Дальнем Востоке России.

Многие растения семейства Myricaceae обладают широким спектром биологической активности. Один из видов семейства - восковница восконосная Myrica cerífera — включен в Британскую Фармакопею в качестве вяжущего средства. Представители семейства, встречающиеся на территории России: восковница обыкновенная применялась как антимикробное, противовоспалительное, вяжущее средства, восковница войлочная использовалась для заживления ран. В последние годы за рубежом обнаружился заметный интерес к исследованию антиоксидантных, антигрибковых свойств М. gale и противоопухолевого действия её эфирного масла.

По данным литературы известно, что для представителей семейства характерно наличие различных групп биологически активных веществ, таких как моно- и сесквитерпеновые компоненты эфирных масел, тритерпеноиды, флавоноиды, фенольные кислоты, диарилгептаноиды, дубильные вещества

(Дикорастущие полезные растения России, 2001; Растительные ресурсы, 2006).

Однако в России систематического изучения этих видов до настоящего момента не проводилось. Поэтому изучение М. gale, произрастающего на северо-западе Европейской части России, с целью введения данного вида в научную медицину является актуальным.

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер государственной регистрации 01200852355). Исследования с использованием приборных хроматографических методов выполнены в аналитическом центре академии (руководитель центра - Стрелкова JI. Ф.). Фармакологический раздел исследований проводили на базе лаборатории лекарственной токсикологии Института токсикологии (Санкт-Петербург), определение антимикробной активности - на кафедре микробиологии СПХФА. Изготовление анатомических препаратов в ходе микроскопического изучения М. gale и М. tomentosa проводили на базе Ботанического института им. B.JI. Комарова РАН.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования было проведение фармакогностического изучения и стандартизации побегов восковницы обыкновенной как перспективного лекарственного растительного сырья для введения в медицинскую практику.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Провести сравнительный фитохимический анализ надземной части М. gale и близкого вида М. tomentosa.

• Изучить качественный состав основных групп биологически активных веществ; провести исследование динамики накопления действующих веществ в побегах М. gale, разработать методики количественного определения маркерных групп соединений для установления доброкачественности сырья.

• Установить острую токсичность и некоторые виды биологаческой активности извлечений из сырья М. gale.

• Установить макро- и микроскопические признаки для диагностики сырья М. gale и основные отличия от М. tomentosa.

• Провести товароведческий анализ для установления числовых показателей, позволяющих нормировать качество лекарственного растительного сырья М. gale\ на основе полученных данных разработать проект нормативной документации на побеги М. gale.

Научная новизна. Впервые исследована динамика накопления эфирного масла в побегах М. gale российских популяций и получены данные о его компонентном составе.

Идентифицировано 11 производных бензойной и коричной кислот, из которых впервые для данного вида обнаружены: феруловая, сиреневая, салициловая, ванилиновая, кофейная, вератровая, гентизиновая и коричная. Проведена сравнительная оценка содержания флавоноидов, дубильных веществ и состава фенольных кислот в сырье М. gale и образце М. tomentosa, полученном от растений, культивируемых в Ботаническом саду БИН им. Комарова РАН.

Выявлено распределение флавоноидов по частям побегов М. gale, а также их содержание в зависимости от фазы развития растения. Из надземной части М. gale выделены свободные моносахара и водорастворимые полисахариды (ВРПС), изучен состав их мономерный состав, а также динамика накопления в разные фазы вегетации растения.

В ходе общего фитохимического анализа показано, что М. gale и М. tomentosa близки по составу основных групп биологически активных веществ.

Практическая значимость. Предложена методика количественного определения содержания эфирного масла в сырье. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в надземной части восковницы обыкновенной, которая введена в практику научных исследований растительных объектов >и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Определена оптимальная фаза вегетации растения для сбора сырья и установлены оптимальные сроки его заготовки. Выявлены критерии, позволяющие оценить подлинность и доброкачественность сырья. Результаты работы использованы при разработке проекта ФС на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Восковницы обыкновенной побеги». Экспериментально установлено, что деалкоголизированные 70% спиртовые вытяжки из побегов М. gale и эфирное масло растения обладают низкой токсичностью; для 70% спиртовой вытяжки показана противовоспалительная и антиоксидантная

активность; для водного и деалкоголизированного спиртовых извлечений и эфирного масла М. gale - антимикробная активность. Данные о компонентном составе и элементы фармакологических исследований могут быть использованы при целенаправленном создании фитопрепаратов из надземной части восковницы обыкновенной.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: XI Международном съезде «Фитофарм» (Лейден, 2007); научной конференции студентов и аспирантов «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); III Международном форуме «Интегративная медицина» (Москва, 2008); IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 8 научных работах, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК».

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты общего фитохимического изучения надземной части М. gale в сравнении с близким видом М. tomentosa;

• Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп биологически активных веществ из надземной части М. gale (эфирного масла, флавоноидов, фенольных кислот, дубильных веществ, углеводов);

• Данные микроскопического изучения М. gale в сравнении с М. tomentosa;

• Результаты изучения некоторых видов биологической активности извлечений из надземной части М. gale\

• Данные товароведческого анализа сырья «Восковницы обыкновенной побеги» и его стандартизация.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 161 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 40 таблицами. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы, и 3 главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), выводов, списка литературы, включающего 133 источника, из них 75 на иностранных языках и 4 приложений.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна, практическая значимость работы. В первой главе представлен обзор литературы, в котором рассмотрены ботанико-географическая характеристика, химический состав и биологическая активность представителей рода Myrica - М. gale и М. tomentosa. Вторая глава содержит описание объектов исследования и используемых методов фотохимического, фармакологического, микробиологического, микроскопического и товароведческого анализа. В третьей главе приведет результаты фитохимического анализа надземной части М. gale в сравнении с М. tomentosa, изучения компонентного состава основных групп биологически активных веществ, содержащихся в надземной части восковницы обыкновенной: эфирного масла, соединений фенольной природы, тритерпеноидов, стероидов, полисахаридов. В четвертой главе отражены результаты определения острой токсичности, антигипоксической, противовоспалительной, антиоксидантной, противомикробной активности извлечений и эфирного масла М. gale. В пятой главе приведены результаты изучения анатомического строения листа, стебля, плода М. gale в сравнении с близким видом М. tomentosa. В шестой главе отражены результаты разработки показателей подлинности и качества восковницы обыкновенной побегов. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные выводы по проделанной работе. Приложение 1 - Список исследованных образцов, Приложение 2 -Проект ФС на сырье «Восковницы обыкновенной побеги», Приложение 3 -Инструкция по заготовке сырья, Приложение 4 - Акты о внедрении результатов работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования

Основными объектами исследований служили образцы надземной части восковницы обыкновеной, собранные от дикорастущих растений в разные фазы вегетации в Ленинградской области в апреле-октябре 2006-2008 гг. Кроме того, при проведении фотохимических исследований в качестве объекта для сравнения использовали листья восковницы войлочной и восковницы обыкновенной, заготовленные от культивируемых растений в парке Ботанического института им. Комарова РАН (2008 г.).

При качественном и количественном анализе основных групп биологически активных веществ использовали общепринятые химические и физико-химические методы (хромато-масс-спектрометрию, ГЖХ, ВЭЖХ, ТСХ, БХ, УФ-спектрофотометрию). Для определения некоторых аспектов биологической активности (острой токсичности, антигипоксического, противовоспалительного, действия, антимикробной активности) использовали извлечения из побегов М. gale, в случае установления острой токсичности и антимикробного действия - также эфирное масло М. gale.

Отбор проб и товароведческий анализ сырья проводили в соответствии с требованиями ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» (2003), ГФ ХЗ, вып. 1, 2 (1987, 1989) и ГФ XII (2008). Составление проекта нормативной документации -фармакопейной статьи на сырье осуществляли в соответствии с ОСТ 91.500.05.001-00. «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» (2000).

2. Фитохимическое изучение восковницы обыкновенной

Предварительная фотохимическая оценка надземной части восковницы обыкновенной показала, что основными группами биологически активных веществ изучаемого вида являются терпеноиды эфирного масла, флавоноиды, фенольные кислоты, дубильные вещества, тритерпеновые сапонины, полисахариды. М. tomentosa содержит те же основные группы соединений. Кроме того, в отдельных образцах М. gale присутствуют незначительное количество кумаринов и'азотсодержащих оснований. Не обнаружены в обоих видах кардиотонические гликозиды и антраценпроизводные.

• Для изучения эфирного масла М. gale его получали методом гидродистилляции, его количественное содержание оценивали по методу 2 (ГФ XI, вып. 1) отдельно в мужских и женских побегах, а также в листьях и плодах растения (табл. 1). Содержание эфирного масла в побегах растения сильно варьирует: от следовых количеств (<0,05%) до свыше 1,5%.

В мужских побегах наблюдалось увеличение содержания эфирного масла к фазе начала цветения (0,42±0,02%). С развитием молодых вегетативных побегов, оно снижалось (0,17±0,01%), оставаясь примерно на том же уровне до конца вегетации (0,18±0,01%).

В женских побегах количество эфирного масла заметно возрастало с момента начала формирования плодов (0,50±0,02%) до массового плодоношения (1,65±0,07%) (табл. 1). Подобная динамика связана, очевидно, с увеличением массы плодов в сырье. В зрелых плодах наблюдалось наибольшее содержание эфирного масла, оно достигало 2,85±0,14%.

В листьях содержание эфирного масла не отличалось у женских и мужских особей. В развитых листьях обнаруживались лишь следовые количества эфирного масла (<0,05), однако в молодых листьях на отрастающих побегах его содержание достигало 0,19±0,01%.

Таблица 1 - Содержание эфирного масла в побегах М. gale в разные фазы вегетации (содержание в % в пересчете на абсолютно-сухое сырье) (п=3)

Объект исследования Содержание эфирного масла, %

НП Б ц ОП ЗП МП KB

Мужские побеги 0,18± 0,01 0,28± 0,01 0,42± 0,02 0,17± 0,01 - - 0,18± 0,01

Женские побеги - - - 0,17± 0,01 0,50± 0,02 1,65± 0,07 0,07± 0,01

Листья - - - 0,19± 0,01 - <0,05 <0,05

Примечание. НП - набухание цветочных почек, Б - бутонизация, Ц - цветение, ОП -отрастание молодых побегов, ЗП - завязывание плодов, МП - массовое плодоношение, КВ -конец вегетации. Прочерк означает, что количественное определение не проводилось.

Анализ эфирного масла по фазам вегетации проводили методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС) с помощью масс-спектрометра «Agilent 6890N 5975С» на капиллярной колонке АР 5 MS размером 30 м - 0,25 мм с толщиной фазы 0,25 мкм. Идентификацию соединений осуществляли по времени удерживания пиков и сравнением масс-спектров компонентов с данными библиотек масс-спектров. Расчет количественного содержания отдельных соединений проводили на основании определения площади пиков. Фрагмент газо-хроматографического разделения компонентов эфирного масла представлен на рис. 1, компонентный состав проанализированных образцов эфирного масла приведен в таблице 2.

Преобладающими терпеноидами в фазу плодоношения, которая предлагается в качестве оптимальной при заготовке сырья, являются а-пинен, цинеол и Д-кадинен. В целом же состав эфирного масла в зависимости от места сбора и фазы развития растений варьирует и включает порядка 40 компонентов.

Abundance eOOOGOQ

6.55

sb

2.^8 \

n

11°

я

s.|b

laijijVi

Time-> 2.50 3.0C Э.50

...........* %

AiUlU . . ,

4 00 4.60 5.00 5.50 P.OO 6-53 700 7 50

7.77

8.00

Рис. 1 - Фрагмент газо-хроматографического разделения компонентов образца эфирного масла из побегов М. gale, собранных в фазу плодоношения.

Таблица 2 - Компонентный состав эфирного масла побегов Myrica gale

Компонент Время удерживания, мин Содержание в % в эфирном масле по фазам вегетации

Буто низа-ция Цвете ние Отрас тание побегов Пло-доно-ше-ние Конец Вегетации Цвете ние Пло-доно-ше-ние

В образцах из пос. Лахта В образцах ш окрестностей г.Сесгрорецка

1 ' "'2 3 4 5 6 7 8 9

а-Пинен 2,69 3,43 8,59 11,25 11,59 4,04 7,21 6,91

р-Пинен 2,90 1,00 - 4,02 2,19 - 0,88 1,91

а-Фелландрен 3,04 - 5,05 5,37 3,70 4,20 4,23 5,67

Лимонен 3,14 - 4,24 - - - - -

Цинеол 3,17 - 4,32 - 15,19 2,56 6,94 7,35

p-Терпенил ацетат 3,18 - - 6,46 - 1,03 3,46 3,77

у-Терпинен 3,31 - 0,70 — — - - -

v-Терпинен 3,34 - — - — - 2,75 2,84

Карен 3,52 - - - - - - 0,60

Борнеол 4,08 0,17 — - - — - -

г/г/с-Р-Терпинеол 4,11 0,50 - - - - -

4-Терпинеол 4,13 0,70 - - 1,65 0,68 0,89 -

а-Терпинеол 4,20 1,09 0,30 - - 0,81 0,80 0,47

г/мс-Карвеол 4,71 — 0,49 — - - - ' - '

а-Борнилацетат 4,81 1,07 1,07 - 1,02 0,59 - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Изоборнилацетат 4,83 - - - - 1,15 1,05 1,35

б-Камфенол 4,87 - - - - 1,72 - -

а-Терпенилацетат 5,21 3,28 1,89 0,40 3,01 2,88 2,32 2,53

а-Кубебен 5,27 - — 0,29 - - - 0,65

Копаен 5,47 2,47 - 1,05 1,89 2,90 0,68 3,96

а-Гурьюнен 5,68 0,67 0,80 0,27 0,47 - - 1,22

(З-Кариофиллен • 5,76 4,10 3,00 - - 1,62 - -

у-Элемен 5,77 , - 0,30 0,66 2,50 - 2,68 6,09

v-Элемен 5,80 - - 14,28 - 2,34 - 1,11

(З-Кадинен 6,07 4,24 4,07 1,72 2,91 - 1,02 4,82

V- Мууролен 6,09 - — - - 1,44 - -

а-Мууролен 6,23 — - - - 1,02 - 3,39

v-Гурыонен 6,25 4,80 - 1,36 - - - -

А-Кадинен 6,37 4,87 12,73 5,21 6,28 1,87 2,81 5,79

Каламенен 6,39 - - - - 6,58 - -

Р-Панасинсен 6,50 6,89 - 5,73 10,16 - — -

Эремофиллен 6,52 - - — - 6,14 6,26 4,76

Эудесма-3,7(11)-диен 6,56 - - - - 4,20 5,69 -

Р-Гуайен 6,66 - - - - 2,02 1,37 1,32

Р-Кариофиллеп эпоксид 6,83 - - - - 3,23 - -

Каларен эпоксид 6,97 - - - - 3,96 - -

Кубенол 7,02 3,92 2,84 1,04 1,93 3,29 - 3,57

Гермакрон 7,46 4,96 3,43 - 2,19 2,11 9,79 -

Эудесм-7(11)-ен-4-ол (Juniper camphor) 7,50 2,64 - 0,64 0,75 1,32 2,39 0,66

Бензилбензоат 7,78 0,72 1,68 0,63 0,14 1,55 - 0,53

Фитол 9,40 0,05 - 0,36 - - - 0,09

Примечание. Прочерк означает, что компонент не обнаружен.

Для эфирного масла российских популяций М. gale характерно присутствие таких основных компонентов как а-пинен, а-терпенилацетат, Л-кадинен, кубенол и гермакрон, тогда как, согласно литературным данным, для северо-американских популяций М. gale характерно преобладание мирцена и лимонена, для европейских - а-пинена и цинеола.

• Испытание на наличие сапонинов осуществляли с помощью реакции пенообразования в кислой и щелочной средах. Методом ТСХ спиртовых извлечений из сырья М. gale после проявления кислотой серной было обнаружено около 9 компонентов тритерпеновой и стероидной природы, один

из которых по характерной окраске и значениям Rf в сравнении с веществами-свидетелями оказался идентичным с урсоловой кислотой. Методом денситометрии установлено, что максимальное количество урсоловой кислоты накапливается в стеблях растения, а минимальное - в цветочных почках (табл. 3). В извлечениях, полученных после экстракции сырья неполярными органическими растворителями, обнаружили вещество стероидной природы, которое методом ТСХ идентифицировали как Р-ситостерол. Присутствие этого компонента в растении было установлено впервые. Результаты денситометрического анализа показали, что данный компонент распределяется по различным частям побегов М. gale примерно в одинаковых количествах (табл. 3).

Таблица 3 - Содержание урсоловой кислоты и Р-ситостерола в различных частях побегов Myrica gale

Орган растения Содержание, %

Урсоловая кислота /?-Ситостсрол

Листья 0,050±0,002 0,032±0,001

Стебли 0,244±0,008 0,020±0,001

Цветочные почки 0,030±0,001 0,021±0,001

Плоды 0,058±0,002 0,03 0±0,001

• Исследование фенольных кислот М. gale проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (рис. 2).

(Шблгг

и

л 3 4 5 < Т в 9 J0 11 12 13 14 15 lfi "l?"

Рис. 2 - Хроматограмма, полученная при ВЭЖХ-исследовании спиртового извлечения из мужских побегов М. gale в фазу цветения.

Идентифицированные компоненты: 2 - галловая, 3 - гентизиновая, 5 - хлорогеновая, 6 - кофейная, 7 - ванилиновая, 9 - сиреневая, 11 - л-кумаровая, 12 - феруловая, 14 -вератровая, 19 - коричная кислоты. Соединения 1,4, 8,10,13,15,18 - неидентифицированы.

Установлено, что в мужских и женских побегах М. gale и в различных их частях, собранных в разные фазы вегетации, содержится около 20 производных бензойной и коричной кислот, из которых 11 было идентифицировано в присутствии метчиков. Основными компонентами являются феруловая, сиреневая и салициловая кислоты. Наличие 8 кислот (феруловая, сиреневая, салициловая, кофейная, ванилиновая, вератровая, гентизиновая, коричная) было обнаружено в растении впервые. При изучении динамики накопления отдельных кислот в побегах'"М gale отмечено увеличение содержания большинства кислот в фазу цветения и их снижение к концу вегетации, за исключением салициловой и галловой кислот. Последние преимущественно накапливались в побегах к концу вегетации (табл. 4).

Таблица 4 - Качественный состав и содержание идентифицированных производных бензойной и коричной кислот в побегах Myrica gale в различные

фенологические фазы (% в пересчете на абсолютно-сухое сырье)

Наименование компонента

Место сбора Вид сырья Фенофаза Галловая Гентизиновая Хлорогеновая 1 Кофейная 1 Ванилиновая Сиреневая 1 3 m 0 а. са S W 1 к | Феруловая I Вератровая Салициловая j Коричная

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Е НП 0,07 0,02 0,17 0,05 0,01 0,38 0,01 0,80 - - <0,01

о VO

с

о м Ц 0,06 0,03 0,30 0,15 0,06 0,39 0,35 0,97 0,07 - <0,01

о к

Лахта 1 KB 0,08 0,02 0,28 - 0,03 0,34 - 0,83 0,01 0,79 <0,01

й и и ю

Ц 0,04 0,06 0,15 0,28 0,13 0,38 0,31 0,88 0,02 - <0,01

с 1)

К W

И о * KB 0,10 0,04 0,08 0,16 0,08 0,16 0,02 0,28 - 0,10 <0,01

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Е о ю о с о к м о НП 0,06 0,01 0,14 - 0,04 0,46 0,21 0,88 0,01 - -

У D щ g <D О ц 0,04 0,02 0,26 0,26 0,18 0,47 0,29 1,27 0,01 - <0,01

£

KB 0,07 0,02 0,10 - 0,05 0,31 0,01 0,81 - 0,28 <0,01

Примечание. НП - набухание цветочных почек, Ц - цветение, КВ - конец вегетации. Прочерк обозначает отсутствие компонента.

Суммарное содержание идентифицированных кислот в разных частях побегов растения уменьшалось в ряду: листья - соцветия - стебли (табл. 5).

Таблица 5 - Качественный состав и содержание идентифицированных производных бензойной и коричной кислот в различных частях побегов Myrica gale (% в пересчете на абсолютно-сухое сырье)

Наименование компонента ^ I i 1 11 81

Часть растения Галловая Гентизиновая 3 я о а 2 о а О Я Кофейная | Ванилиновая Сиреневая и-Кумаровая Í Феруловая Вератровая Салициловая Коричная

Листья 0,09 0,01 0,07 0,11 0,19 0,34 0,27 0,91 0,02 0,58 < 0,01 2,59

Стебли 0,04 0,08 0,01 0,01 0,06 0,45 0,18 0,05 0,01 - < 0,01 0,89

Соцветия 0,06 0,02 0,07 0,11 0,04 0,30 0,01 1,04 0,01 0,49 < 0,01 2,15

Примечание. Прочерк обозначает отсутствие компонента. Исследовали части мужских побегов, собранных в конце вегетации (листья, стебли) и в фазу цветения (соцветия) в окрестностях пос. Лахта в 2007 г.

Сравнение состава производных бензойной и коричной кислот в листьях М. gale (пос. Лахта) и М. tomentosa (парк БИНа) 2008 г. заготовки показало практически идентичный их качественный состав, но накопление отдельных кислот и общее их количество было выше у М. gale (табл. 6).

Таблица 6 - Сравнительное содержание производных бензойной и коричной кислот в листьях Myrica gale и М. tomentosa

Наименование компонента Содержание фенолкарбоновых кислот, %

Myrica gale Myrica tomentosa

Хлорогеновая 0,062 0,010

Кофейная 0,192 0,139

Сиреневая 0,975 0,235

Ванилиновая - 0,003

н-Кумаровая . 0,169 0,142

Феруловая 1,060 0,571

Вератровая 0,012 0,004

Салициловая 0,526 0,447

Коричная - 0,002

Итого: 3,00 1,55

Примечание. Исследовали образцы 2008 г. заготовки, собранные в фазу конца вегетации, М. gale - в окрестностях пос. Лахта, М. tomentosa - в парке БИНа.

• В составе полифенольного комплекса побегов М. gale с помощью специфических реакций установили присутствие дубильных веществ преимущественно конденсированной группы. При определении количественного содержания таннидов методом перманганатометрии в образцах сырья М. gale, собранных от разобщенных популяций, обнаружили, что их содержание практически не зависит от места произрастания растений и колеблется от 6% в начале вегетации до 10% к концу вегетации (табл. 7).

Таблица 7 - Содержание дубильных веществ в пересчете на таннин в побегах

M. gale по фазам вегетации (п=3)

Место сбора Содержание дубильных веществ, %

Цветение Отрастание молодых побегов Плодоношение Конец вегетации

Окрестности пос. Лахта 5,8±0,1 7,3±0,2 8,0±0,2 10,3±0,3

Окрестности г. Сестрорецка 6,0±0,1 7,4±0,1 8,1±0,2 10,5±0,3

При параллельном сравнительном анализе содержания таннидов в двух видах восковницы установлено, что содержание дубильных веществ в листьях растений, собранных в местах с одинаковыми условиями произрастания в парке БИНа, у М. gale несколько выше (8,2±0,2%), чем у М. tomentosa (6,7±0,2%).

• Методами БХ и ТСХ установлено наличие в побегах восковницы обыкновенной около 9 компонентов флавоноидной природы. Один из доминирующих компонентов полифенольного комплекса был выделен с помощью препаративной бумажной хроматографии и идентифицирован по физико-химическим показателям как гиперозид. После проведения кислотного гидролиза суммы флавоноидов в составе гидролизата было определено наличие трех основных агликонов - кверцетина, кемпферола и мирицетина.

Для оценки количественного содержания флавоноидов в сырье была разработана дифференциальная спектрофотометрическая методика. Методика основана на кислотном гидролизе флавоноидов и последующем проведении реакции комплексообразования с 1% спиртовым раствором алюминия хлорида. В качестве вещества для пересчета содержания флавоноидов выбран доступный стандартный образец - кверцетин. Аналитическая длина волны составила 425 нм, т. к. этот максимум практически совпадает с максимумом поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом (рис. 3).

WAVELENGTH [тт.]

Рис. 3 - УФ-спекгры поглощения окрашенных комплексов с алюминия хлоридом: 1 - шдролизат суммы флавоноидов из побегов Myrica gale, 2 - раствор ГСО кверцетна.

Подобраны оптимальные условия экстракции сырья: экстрагент - 70% спирт, измельченность сырья до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:100 и время экстракции 90 минут. Методика хорошо воспроизводима, относительная ошибка определения не превышала 1,7%. С использованием разработанной методики было определено содержание суммы флавоноидов в разные фазы в побегах М. gale, и в их различных частях (табл. 8).

Таблица 8 - Данные по содержанию флавоноидов (%) в надземных частях

Myrica gaje, собранных в различные фазы вегетации (п=4)

Орган растения Фаза вегетации Содержание флавоноидов, % в пересчете на абсолютно-сухое сырье

Побеги Цветение 1,86±0,05

Побеги - Отрастание молодых побегов 2,42±0,02

Побеги Плодоношение-конец вегетации 2,35±0,04

Листья Плодоношение-конец вегетации 2,25±0,05

Стебли Плодоношение-конец вегетации 0,35±0,04

Плоды Массового плодоношения 0,27±0,02

Генеративные почки Конец вегетации 2,10±0,03

Максимальное накопление флавоноидов в побегах М. gale наблюдается в фазу отрастания молодых побегов, в фазу плодоношения оно также сохраняется на высоком уровне. Наибольшее количество флавоноидов содержится в листьях, немного меньшее - в цветочных почках, а минимальное - в стеблях и плодах. Параллельно определено содержание флавоноидов в листьях М. tomentosa и установлено, что их количество было немного выше (2,33±0,02%), чем в листьях М. gale, собранных в том же месте (2,26±0,02%).

• Из надземной части восковницы обыкновенной были выделены свободные моносахариды и водорастворимые полисахариды. Свободные моносахариды извлекали спиртом этиловым 80% из "сырья, предварительно очищенного от липофильных веществ, водорастворимые полисахариды (ВРПС) - водой из шрота, оставшегося после выделения свободных моносахаридов. Методами БХ среди моносахаридов идентифицированы арабиноза, глюкоза и рамноза. Содержание свободных моносахаридов и ВРПС, определенное спектрофотометрически'м методом после реакции с фенолом и кислотой серной концентрированной, составило 2,1-5,7% в пересчете на глюкозу (в зависимости от фазы вегетации и органа растения): максимальное накопление свободных моносахаридов наблюдалось в фазу отрастания побегов М. gale (4,8%), в зависимости от части побегов - в листьях (5,7%). Минимальное количество углеводов установлено в побегах в фазу бутонизации (2,4%), и в плодах (2,1%) (табл. 10). Полученные данные по содержанию свободных моносахаридов коррелируют с накоплением ВРПС в тех же органах и по фазам вегетации, которое составило 0,2-1,5% (табл. 9).

Таблица 9 - Содержание углеводов в надземной части Myrica gale (n=4)

Часть растения Фаза вегетации Содержание, в % в пересчете на абсолютно-сухое сырье

Свободных моносахаридов Водорастворимых полисахаридов

Побеги Бутонизация 2,40±0,10 0,70±0,03

Побеги Цветение 2,71±0,11 0,80±0,04

Побеги Отрастание молодых побегов 4,80±0,22 1,10±0,05

Побеги Плодоношение -конец вегетации 3,93±0,19 1,00±0,04

Листья Плодоношение -конец вегетации 5,70±0,23 1,50±0,07

Стебли Плодоношение -конец вегетации 3,11±0,14 0,71±0,03

Цветочные почки Конец вегетации 3,12±0,14 1,40±0,07

Соцветия Цветение 3,90±0,19 1,41±0,06

Плоды Массовое плодоношение 2,10±0,10 0,20±0,01

Мономерный состав ВРПС определяли после гидролиза раствором кислоты трифторуксусной 2% методами БХ и ГЖХ триметилсилильных производных. Было установлено, что доминирующим компонентом полисахаридов листьев М. gale является арабиноза, содержание которой в несколько раз превышает уровень глюкозы и рамнозы. В составе полисахаридов стеблей, за исключением ксилозы, которая не была обнаружена, содержание идентифицированных моносахаридов, было несколько выше, чем в листьях. Содержание галактуроновой кислоты в исследуемых образцах незначительно (табл. 10).

Таблица 10 - Содержание основных моносахаридов (в % по отношению к их суммарному количеству) в составе водорастворимых полисахаридов М. gale

В одорастворимые полисахариды Содержание мономеров, %

Ara Glc Rha Xyl GalA

Листьев 23,9 9,9 4,6 0,5 0,5

Стеблей 32,6 18,3 5,1 - U

Примечание. Ara - арабиноза, Glc - глюкоза, Rha - рамноза, Ху1 - ксилоза, GalA -галактуроновая кислота, прочерк обозначает отсутствие компонента.

3. Изучение некоторых аспектов биологической активности восковницы обыкновенной

С целью изучения безопасности применения вытяжек и эфирного масла побегов М. gale определяли их острую токсичность. Значения LD5o для деалкоголизированных 70% спиртовых извлечений из побегов М. gale в фазу цветения и плодоношения при внутрибрюшинном введении составили 24,2±1,4 мл/кг и 30,6±1,8 мл/кг, что в пересчете на воздушно-сухое сырье составило 4,8±0,3 г/кг и 6,1 ±0,4 г/кг соответственно. Для эфирного масла значение LDj0 при внутрибрюшинном введении составило 1,9±0,1 г/кг. Таким образом, исследуемые извлечения и эфирное масло побегов М. gale малотоксичны.

70% спирто-водное извлечение из побегов М. gale (фаза плодоношения) в дозах 1/50 - 1/200 LD50 обладало слабой антигипоксической активностью на основных моделях, вызывая прирост времени жизни лабораторных животных на 30-49% по отношению к контролю на модели острой гемической гипоксии, на 13-36% на модели острой гистотоксической гипоксии и на 11-29% на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, уступая препарату сравнения гутимину.

Исследуемое извлечение обладало противовоспалительной активностью: на модели «формалиновый отек» в дозах 1/50 - 1/200 LD50 оно уменьшало образование воспалительного экссудата на 27,5-52,5%; на модели «ватная гранулема» уменьшало массу грануляционной ткани на 29,7-49,1% по сравнению с контрольной группой.

Деалкоголизированное 70% спирто-водное извлечение в концентрации 50100 мкл/мл оказывало антиоксидантное действие in vitro в опытах с кислотой тиобарбитуровой и снижало протекание реакции перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс на 36-65%.

Определение антимикробной активности водного и деалкоголизиро-ванного 70% спирто-водного извлечений М. gale проводили методом серийных разведений. Определение антимикробного действия эфирного масла М. gale -методом дисков, эфирное масло наносили в количестве 5 мкл. Исследуемые извлечения из побегов М. gale были активны в отношении как грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Bacillus cereus, так и грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa (табл. 11) и не эффективны в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli и грибов Candida albicans.

Таблица 11 - Антимикробная активность извлечений из побегов Myrica gale (n = 5)

Препарат Микробная нагрузка, клеток/мл Минимальная ингибирующая концентрация, мг/мл

Staphylococcus aureus Bacillus cereus Pseudomonas aeruginosa

Водное извлечение (1:10) из побегов М. gale 10s - - -

10" 4 2 -

ю4 1 2 4

70% спирто-водное деалкогодизированное извлечение из побегов М. gale ю8 20 - -

106 20 10 20

ю4 20 10 20

Препарат сравнения -водное извлечение (1:10) из листьев шалфея 10s - - -

10" 6 6 -

ю4 3 6 12

Примечание. Минимальная ингибирующая концентрация для водных извлечений приведена в пересчете на сухой остаток; прочерк означает неэффективность препарата в отношении указанной микробной нагрузки.

Эфирное масло М, gale оказывало бактериостатическое действие преимущественно в отношении грамположительных микроорганизмов -Staphylococcus aureus и Bacillus cereus и проявляло меньшую антимикробную активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов - Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa и грибов Candida albicans (табл. 12). В отношении тест-штамма Staphylococcus aureus эфирное масло М gale имело преимущество над препаратом сравнения - эфирным маслом эвкалипта.

Таблица 12 - Антимикробная активность эфирного масла Myrica gale (n = 8)

Препарат Микроб, нагрузка, клеток/мл Диаметр зон задержки роста, мм

Staphylococcus aureus Bacillus cereus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Candida albicans

Эфирное масло М. gale 108 20,7±1,5 13,4±1,4 8,0±1,3 11,6±1,5 13,5±0,9

10б 22,8±1,5 16,7±1,4 10,3±1,4 18,0±1,7 -

Эфирное масло эвкалипта (препарат сравнения) 10s 19,1±1,4 18,4±3,6 14,9±1,8 15,5±2,9 29,0±3,3

106 21,2±2,0 26,0±2,5 20,0±1,7 24,0±2,5 -

Примечание. Прочерк означает, что рост тест-культуры отсутствовал.

В целом, исследуемые извлечения и эфирное масло М. gale обладали выраженным антистафилококковым действием.

4. Стандартизация и разработка характеристик подлинности и

показателей качества сырья «Восковницы обыкновенной побеги»

При изучении анатомических признаков сырья было выявлено, что диагностическое значение имеет строение листьев, стеблей и плодов М. gale. Для микроскопии листьев характерны прямостенные клетки эпидермы; устьица, окруженные кольцом из 4-10 побочных клеток, расположенные только с нижней стороны листа (энциклоцитный тип); одноклеточные волоски с гладкой кутикулой, основания которых окружены розетками из 6-8 клеток; железки с крупными многоклеточными головками (из радиально расположенных клеток) на коротких одно- или многоклеточных ножках; мелкие железки с одно-, реже многоклеточной головкой на коротких 1-3-клеточных ножках; крупные друзы кальция оксалата в субэпидермальном слое вблизи жилок, часто в виде цепочек. На поверхности стебля побега первого года жизни имеются простые одноклеточные волоски с бородавчатой кутикулой, мелкие, реже крупные, железки, по своему строению схожие с железками листа; для поперечного среза стебля характерно непучковое строение, наличие друз в паренхиме коры и участков склеренхимы, представленной лубяными волокнами. Поверхность плодов М. gale покрыта железками с крупными многоклеточными головками (из неупорядоченно расположенных клеток) на коротких ножках; на продольном срезе плода заметны 2 одиночных проводящих пучка в области крыловидных выростов, образованных сросшимися прицветниками, редкие друзы в клетках мезокарпия, склерифицированный 6-10-слойный эндокарпий, плотно примыкающая к нему однослойная семенная кожура, однослойный эндосперм и зародыш. М. tomentosa отличается главным образом большей плотностью опушения и качественным строением трихом - отсутствием мелких железок на поверхности листьев.

Для определения подлинности побегов восковницы обыкновенной предложены качественные реакции: на флавоноиды (с алюминия хлоридом и ТСХ), на терпеноиды эфирного масла (ТСХ) и на дубильные вещества (с раствором желатина 1%).

Для оценки количественного содержания эфирного масла в сырье использовали метод перегонки с водяным паром на аппарате Клевенджера с

21

последующим измерением его объема (метод 2 ГФ XI), были подобраны условия проведения гидродистилляции, включающие ее длительность - 3 часа, измельченность сырья - до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Для заготовки побегов рекомендуется фаза массового плодоношения, поскольку в этот период накопление эфирного масла в них максимально. Для мужских особей это соответствует фазе конца вегетации. Исходя из минимального накопления эфирного масла в побегах, в случае отсутствия плодоносящих экземпляров или их незначительного количества, для включения в проект нормативной документации предлагается показатель «содержание эфирного масла не менее 0,1%».

Для оценки содержания флавоноидов в сырье предложен метод дифференциальной спектрофотометрии. Содержание суммы флавоноидов определяли после гидролиза в пересчете на кверцетин в 10 независимых повторностях. Относительная ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет 1,7%, что свидетельствует о достоверности результатов (табл. 13). Для оценки доброкачественности сырья рекомендуется показатель: «содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин не менее 2%».

Таблица 13 - Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в надземной части восковницы

обыкновенной

/ X 2 S s P,% t(P,/) Дх E, %

10 2,35 0,0032 0,056 95 2,23 0,04 1,70

В результате товароведческого анализа шести партий сырья М. gale установлены следующие числовые показатели, которые были включены в проект ФС (табл. 14).

Таблица 14 - Числовые показатели сырья - побегов Myrica gale (n=6).

Наименование показателя Среднее значение, % Рекомендуемое значение показателя, %

Цельное сырье Измельченное сырье

Содержание эфирного масла 0,18±0,02 Не менее 0,1 Не менее ОД

Суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин 2,31±0,08 Не менее 2 Не менее 2

Влажность 8,50±0,40 Не более 10 Не более 10

Золы общей 5,61±0,14 Не более 6 Не более 6

Золы, нерастворимой в 10% растворе кислота хлористоводородной 0,30±0,01 Не более 0,5 Не более 0,5

Стеблей, в том числе отделенных при анализе 32,9±2,0 Не более 35 -

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм 5,б±0,1 Не более 6 -

Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм 5,9±0,2 - Не более 7

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм 4,1±0,2 - Не более 5

Частей или частиц сырья, изменивших окраску и поврежденных вредителями 3,5±0,8 Не более 5 Не более 5

Органической примеси 0,8±0,1 Не более 1 Не более 1

Минеральной примеси 0,3±0,1 Не более 0,5 Не более 0,5

Примечание. Прочерк означает, что для данного сырья определение показателя не предусмотрено. Все партии сырья заготовлены в фазу плодоношения - конца вегетации.

Результаты анализа содержания основных групп действующих веществ - эфирного масла и флавоноидов и других числовых показателей в образцах сырья, собранных в 2006-2008 гг. показали, что срок годности побегов восковницы обыкновенной составляет 2 года.

Основные результаты и выводы

1. В надземной части М. gale установлено наличие эфирного масла, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, тритерпеновых сапонинов, полисахаридов, а также следов кумаринов и азотсодержащих оснований. Образцы сырья, собранные в пределах Ленинградской области, были близки по составу и количественному содержанию основных групп биологически активных веществ.

2. Впервые изучен компонентный состав и динамика накопления эфирного масла М. gale в разные фазы вегетации для растений, произрастающих на северо-западе России. Содержание эфирного масла варьирует от 0,17% (фаза отрастания побегов) до 1,65% (фаза массового плодоношения).

Преобладающими компонентами эфирного масла побегов М. gale российских популяций являются а-пинен, а-фелландрен, цинеол, а-терпенилацетат, А-кадинен, кубенол и гермакрон.

3. В составе фенольного комплекса из надземной части М. gale хроматографически и спектрофотометрически подтверждено наличие гштерозида, производных кверцетина, кемпферола и мирицетина. Наибольшее содержание флавоноидов в побегах М. gale, определенное по разработанной нами методике, наблюдается с фазы отрастания молодых побегов до фазы плодоношения. Методом ВЭЖХ идентифицировано 11 фенольных кислот, преобладающими из которых являются феруловая, сиреневая, салициловая. Содержание дубильных веществ в сырье максимально к концу вегетации (10%).

4. Наибольшее содержание свободных моносахаров и водорастворимых полисахаридов наблюдается в фазу отрастания молодых побегов, в листьях. Основными мономерным звеном водорастворимых полисахаридов М. gale и является арабиноза, содержание которой в несколько раз превышает уровень глюкозы и рамнозы.

5. Данные по определению острой токсичности вытяжек и эфирного масла М. gale свидетельствуют об их низкой токсичности. 70% деалкоголизированное извлечение из побегов М. gale проявляет антигипоксическую, противовоспалительную, антиоксидантную активность. Наиболее выраженное антимикробное действие извлечений и эфирного масла М. gale при испытании на тест-штаммы микроорганизмов, - рекомендуемые ГФ XI, отмечено в отношении Staphylococcus aureus.

6. Установлены основные анатомические диагностические признаки сырья М. gale, позволяющие отличить два близких вида М. gale и М. tomentosa.

7. Разработаны критерии подлинности и нормативы доброкачественности, включенные в проект фармакопейной статьи на сырье «Восковницы обыкновенной побеги».

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Кашина, А. А. Фенолкарбоновые кислоты надземной части восковницы обыкновенной Myrica gale (Myricaceae) / А. А. Кашина, А. И. Тулайкин, Г. П. Яковлев // Растительные ресурсы. - СПб., 2008. - Т. 44. - Вып. 1. - С. 95-98.

2. Кашина, А. А. Компонентный состав и биологическая активность видов рода Myrica (Myricaceae,;) флоры России / А. А. Кашина, Г. П. Яковлев // Растительные ресурсы. - СПб., 2008. - Т. 44. - Вып. 3. - С. 136-149.

3. Кашина, А. А. Углеводы надземной части восковницы обыкновенной -Myrica gale L. / А. А. Кашина // Фармация из века в век: сборник научных трудов. Часть III. Анализ и стандартизация лекарственных средств. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2008. - С. 50-53.

4. Кашина, А. А. Оценка содержания эфирного масла в побегах Myrica gale / А. А. Кашина, Г. П. Яковлев // Материалы Международного форума «Интегративная медицина 2008». Часть III. Лекарственные растительные средства, фитотерапия. - М., 2008. - С. 110-112.

5. Кашина, А. А. Количественное определение флавоноидов в побегах восковницы обыкновенной Myrica gale L. / А. А. Кашина // Материалы IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». - Барнаул: Изд-во Алтайского университета, 2009.-Кн. 2.-С. 225-227.

6. Кашина, А. А. Антимикробная активность эфирного масла и извлечений надземной части восковницы обыкновенной Myrica gale (.Myricaceae) / А. А. Кашина, С. В. Турина, Г. П. Яковлев // Растительные ресурсы. - СПб., 2009. - Т. 49.-Вып. 2.-С. 127-133.

7. Кашина, А. А. Диагностика видов Myrica gale и М. tomentosa (.Myricaceae) на основе анатомических признаков / А. А. Кашина, А. А. Оскольский // Ботанический журнал. - 2009. - Т. 94. - № 9. - С. 1294-1303.

8. Kashina, A. A. Analysis of esseníial oil of Myrica gale I A. A. Kashina, G. P. Yakovlev // llth International Congress Phytopharm 2007. - Leiden, The Netherlands, 2007. -P. 153.

На правах рукописи

Кашина Анастасия Алексеевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВОСКОВНИЦЫ ОБЫКНОВЕННОЙ МУШСА вЛЬЕ!..

Специальность 15.00.02—ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. ФАРМАКОГНОЗИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Н. В. Андриановой

Подписано к печати 18.1 1.2009. Формат 60 х 90/16, Бумага тип. Печать ризограф. Гарнитура «Тайме». Печ. л.3,0. Тираж 100 экз. Заказ 820 Санкт-Петербург 2009