Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) Koso-Pol. и Phlojodicarpus turczaninovii Sipl.

На правах рукописи

ТАРАСКИН ВАСИЛИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

Фармакогностическое исследование РМо}о(Исагрт 81Ьтси$ ^ерИ. ех 8ргеп§.) Ково-Ро!. и РкЩойкагриъ ¡игсгаптоуи 81р1.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

- 8 ДЕК 2011

Улан-Удэ-2011

005005098

Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации и в учреждении Российской академии наук Байкальском институте природопользования Сибирского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор Раднаева Лариса Доржиевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Федосеева Галина Михайловна

кандидат фармацевтических

наук Шелухеева Марина Геннадьевна

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» Министерства образования и науки Российской Федерации

Защита состоится «23» декабря 2011 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан «22» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Хобракова В.Б.

Общая характеристика работы Актуальность темы. Среди биологически активных веществ растительного происхождения важное место занимает класс а-пиронов. Представители этого класса являются соединениями, обладающими широким спектром фармакологических свойств, и поэтому постоянно находятся в сфере внимания исследователей. Флора Сибири богата растениями, представляющими ценность в качестве источников биологически активных веществ, в частности кумаринов. К числу таких растений, безусловно, относятся растения семейства зонтичные (Umbelliferae), такие как вздутоплодник сибирский Phlojodicarpus Sibiriern (Steph. ex Spreng.) Koso-Pol. и вздутоплодник Турчанинова Phlojodicarpus turezaninovii Sipl. Корни вздутоплодников применяются в народной медицине как противоопухолевое, коронарорасширяющее, антикоагулирующее, желчегонное, спазмолитическое, бактерио-статическое средство (Блинова, 1965; Варлаков, 1963; Аркадьева и др., 1966; Шарова,1972; Цетлин и др., 1965; Мулевич, 1988). Вздутоплодник сибирский является фармакопейным растением (ФС 42-2667-89) и используется как сырьё для получения препарата «Фловерин» (ФС 422532-88), который представляет собой природную смесь дигидросамидина и виснадина. Основные запасы вздутоплодника сибирского находятся в Забайкальском крае. Химический состав вздутоплодников изучен недостаточно и ограничен лишь сведениями о содержании кумаринов.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что фармакогностическое изучение корней и корневищ вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus и в. Турчанинова Ph. turezaninovii позволит дополнить сведения о содержании в них биологически активных соединений, расширить сырьевую базу растений, а так же создать на их основе новые лекарственные средства.

Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение вздутоплодника сибирского и в. Турчанинова

Для достижения указанной цели решались следующие основные задачи:

1. Определить анатомо-диагностические признаки корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова и определить показатели качества сырья.

2. Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ (БАВ) исследуемых растений.

3. Разработать способ получения рабочего стандартного образца (PCO) пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова.

4. Разработать методики количественного определения суммы а-пироновых соединений в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова.

5. Разработать нормативную документацию на лекарственное сырьё в. Турчанинова и PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова.

Научная новизна работы.

На основании макро- и микроскопических исследований установлены основные диагностические признаки корней и корневищ в. Турчанинова и в. сибирского. Их основное различие в размерах секреторного аппарата, представленного густой сетью каналов, разнообразных по форме и диаметру. Наиболее узкие каналы в прикамбиальной зоне коры - более характерные для в. Турчанинова, дающие возможность проводить диагностику сырья.

Изучен химический состав корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова. Впервые изучен состав эфирного масла корней и корневищ в. Турчанинова. Основными составляющими эфирного масла являются: а-пинен, а-феландрен, и-цимол, гермакрен D, терпинолен. Эфирное масло в. сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Методом ВЭЖХ/МС проведена идентификация состава флавоноидов в корнях и корневищах в. Турчанинова, количественное содержание которых не превышает 0,003мкг/г. Впервые изучен состав высших жирных кислот корней и корневищ двух видов вздутоплодников, который представлен насыщенными (миристиновой, пальмитиновой, стеариновой) и ненасыщенными (олеиновой, линолевой, линоленовой) кислотами. Изучен состав а - пироновых соединений в. сибирского и в. Турчанинова. В корнях и корневищах в. сибирского идентифицировано 6 производных кумарина: дигидросамидин, цис- и т/;сшс-келлактоны, метилкеллактон, а также дигидроломатин и пеуценидин, которые в данном виде обнаружены впервые. Из корней и корневищ в. Турчанинова выделены - пеуценидин и либанорин. Для пеуценидина впервые по данным рентгеноструктурного анализа (РСА) установлено пространственное строение молекулы в кристалле. Изучен микроэлементный состав корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова. Разработан способ получения PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова, составлен проект ФС на PCO пеуценидина.

Практическая значимость работы.

На основании проведённых исследований разработаны показатели качества сырья, определены диагностические признаки и товароведческие

показатели. Разработаны методики количественного определения содержания суммы а-пироновых соединений в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова. Разработана нормативная документация -проект ФС «Корни и корневища вздутоплодника Турчанинова-Phlojodicarpus turczaninovii Sipl». Показано, что корни и корневища двух видов вздутоплодников сходны по составу БАВ, что позволяет рекомендовать их в качестве новых сырьевых источников фурокумаринов, а также для получения лекарственных препаратов, обладающих спазмолитической активностью. Материалы диссертационной работы включены в разработку методических пособий для студентов фармацевтического отделения ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (акт внедрения от 6.09.2011 г). По результатам исследований разработаны:

1. проект ФС на сырье «Корни и корневища вздутоплодника Турчанинова- Phlojodicarpus turczaninovii Sipl».

2. проект ФС на PCO - «(85,9Я)-9-Ацетокси-8-(2-сенециоилоксипропан-2-ил)-8,9-дигидро-2#-фуро(2,3-й)хромен-2-она» - пеуценидина.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы представлены и обсуждены на:

• международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых rio фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, 2008);

• всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009);

• международной конференции «International Studies on the Essential Oils and Bioactive Constituents of Aromatic and Medicinal Plants from the Mongolia» (Ulanbaator, 2009);

• IV Международной научно-практической конференции «Приоритеты Байкальского региона в Азиатской геополитике России» (Улан-Удэ, 2010);

• 4-th International conference «Green chemistry & advanced technology» (Ulaanbaatar, 2010);

• региональной молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2010);

• всероссийской молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2011);

• ежегодных конференциях преподавателей и сотрудников Бурятского государственного университета (Улан-Удэ, 2008, 2009, 2010).

По результатам исследований опубликовано 9 работ, из них 2 статьи -в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Работа выполнена в рамках исследований по проектам: Междисциплинарный интеграционный проект № 93 «Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов»; РФФИ 08-04-90202-Монг_а «Исследование биогенетических закономерностей биосинтеза биологически активных соединений эндемичных растений Центральной Азии» (2008-2009 гг.); РФФИ 08-04-98037-р_сибирь_а «Химический состав растений как индикатор состояния экосистем Байкальского региона» (2008-2010 гг.); грант Бурятского государственного университета для аспирантов и молодых учёных «Кумарины растений Umbelliferae флоры Бурятии и Монголии: выделение, определение качественного и количественного состава» (2010 г.).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, общих выводов и приложения. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 28 таблицами. Список цитируемой литературы включает 190 источников, из них 60 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании данных литературы рассматривается ботаническая характеристика видов вздутоплодников, анализ сырьевой базы растений в. сибирского и в. Турчанинова. Проведен обзор литературы по природным ангулярным фурокумаринам, рассмотрена их биологическая активность. Обобщены сведения по химическому составу растений в. сибирского и в. Турчанинова и применению их в народной и традиционной медицине.

Во второй главе приведены сведения об объектах исследований, приводится аргументация использованных методов и приборов, а также другие данные методического характера.

В третьей главе представлены экспериментальные данные товароведческого и качественного химического анализа корней и корневищ вздутоплодников в. сибирского и в. Турчанинова.

Глава четвёртая посвящена фитохимическому изучению в. сибирского и в. Турчанинова. Приведены методики выделения

индивидуальных соединений из корней и корневищ растений, результаты идентификации и оценки их количественного содержания.

В пятой главе изложены результаты разработки способа получения PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова. Установлены его физико-химические свойства и разработаны показатели качества по стандарту.

В шестой главе представлены сведения о разработанной методике спектрофотометрического количественного определения суммы а -пироновых соединений в пересчёте на PCO пеуценидина в корнях и корневищах вздутоплодников и отражены результаты, полученные на основе данного метода.

Основное содержание работы

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили корни и корневища многолетних растений семейства зонтичные (Umbelliferae) - в. сибирского и в. Турчанинова, произрастающие на территории Забайкальского края, Бурятии и Монголии, собранные в ходе экспедиционных работ в 2008-2010 гг.

Микроскопические исследования проводили согласно ОФС «Методы анализа лекарственного растительного сырья», раздел «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы» и «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI, вып. 1, с. 263-266, с. 277-279.

Товароведческие показатели устанавливали в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1; ГФ XII, ч. 1; ГОСТ 24027.2-80 «Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирного масла».

На этапе предварительной оценки извлечений, при разделении веществ на колонках и контроле чистоты полученных соединений применяли метод ВЭЖХ/УФ и тонкослойную хроматографию на пластинках Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ (Имид, Россия) с использованием систем: хлороформ - этанол, 10:1; петролейный эфир - эфир, 4:1. Индивидуальные соединения выделяли колоночной хроматографией на силикагеле 0.035-0.070 мм (Acros, США) (элюент - хлороформ-этанол).

Фракции после колоночной хроматографии исследовали на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ детектором (Эконова, Россия). Качественное и количественное определение флавоноидов проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent Technologies 1200 Series, с масс-спектрометрическим детектором -ионной ловушкой типа Ion Trap LS/MS 6330. Спектры ЯМР соединений в растворах с CDC13 или CD3OD получали на спектрометрах AV-300 (Bruker, Германия; рабочие частоты 300.13 ('Н) и 75.47 МГц (13С)) и AV-

600 (600.30 ('H) и 150.96 МГц (ПС)). Для соотнесения сигналов в спектрах ЯМР использовали различные типы протон-протонной и углерод-протонной сдвиговой корреляционной спектроскопии (COSY, ^СОХН, COLOC, NOES Y). Мультиплетностъ сигналов в спектрах 1 С-ЯМР определяли при записи спектров в режиме J модуляции.

Для записи масс-спектров, определения молекулярных масс и элементного состава использовали масс-спектрометр высокого разрешения DFS Thermo Scientific (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, температура испарителя 230-280°С). Диапазон сканирования 20 - 1100 а.е'.м. Температуру плавления определяли на столике Stuart SMF-38. Величины удельного вращения [а]™ измеряли на поляриметре PolAAr

3005.

Рентгеноструктурное изучение пеуценидина выполнили ш-ср сканированием (ширина фреймов 0.5°) на дифрактометре KAPPA APEX II (Bruker) с двухкоординатным CCD детектором с использованием МоКа радиации (X. = 0.71073 Â).

Метиловые эфиры жирных кислот идентифицировали методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Agilent Packard HP 6890 с квадрупольным масс-спектрометром (HP MSD 5973N) в качестве детектора. Использовали колонку DBWax с внутренним диаметром 0,25 мкм. Газ - носитель - гелий (постоянный поток 1,0 мл/мин.).

Температура колонки: 90°С (изотерма 4 мин.), 90-165°С (30°С/мин.), 165-225°С (3°С/мин., изотерма 5 мин.), температура испарителя - 250°С. Объём пробы - 1 мкл раствора с разделением потока 60:1. Ионизация:

электронный удар (70 эВ).

Процентный состав смеси вычисляли по площадям газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания и полных масс-спектров соответствующих чистых соединений.

Эфирное масло исследовали методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Agilent Packard HP 6890 с квадрупольным масс-спектрометром (HP MSD 5973N) в качестве детектора. Использовалась 30-метровая кварцевая колонка HP-5ms с внутренним диаметром 0,25 мм. Газ - носитель - гелий (постоянный поток 1,0 мл/мин).

Температура колонки: 50°С (изотерма 2 мин.), 50-200°С (4°С/мин.), 200-280°С (20°С/мин.), 280°С (изотерма 5 мин.), температура испарителя -250°С. Объём пробы - 1мкл раствора с разделением потока 20:1. Ионизация: электронный удар (70 эВ). Диапазон сканирования 50-550 а.е.м.

Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания, полных масс-спектров, библиотеки хромато-масс-спектрометрических данных летучих веществ растительного происхождения (Ткачев). Процентный состав эфирных масел вычисляли по площадям газохром атографических пиков с помощью программы MSD Сеш Analize, без учёта корректирующих коэфициентов.

Определение микроэлементного состава проводили с использованием атомно-абсорбционного спектрофотометра VARIAN АА240 с пламенной атомизацией.

Валидацию аналитических методик проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений.

Результаты исследования

Фармакогностическая характеристика в. сибирского и в. Турчанинова.

Описание внешнего вида: сырье - подземные органы вздутоплодников сибирского и Турчанинова представляют собой отдельные куски корневищ и корней, реже цельные корневища и корни дайной от 3 до 10 см, диаметром от 1 до 3 см. Поверхность их покрыта морщинистой, отслаивающейся пробкой светло-серого у вздутоплодника сибирского, или тёмно-коричневого у в. Турчанинова цвета. Излом белый или жслтовато-белый. Запах приятный, вкус водного извлечения сладковатый, затем горьковато-пряный.

Для внедрения нового вида сырья в фармацевтическую практику необходима разработка нормативной документации, проекта ФС на сырье, одним из разделов которой является микроскопия. В связи с этим нами проведено микроскопическое изучение двух выше перечисленных растений (табл. 1).

Таблица 1

Основные анатомо-диагностические признаки корней и корневищ в. сибирского и

в. Турчанинова

Сырье/диагн. Секреторные каналы Секреторные каналы Сердце- Секретор-

признаки корней, 0 ми коры корня, мкм винные ный

лучи аппарат

Ph. sibiricus 2-3 Каналы 150-210 образуют 3-4- наличие 2-

Ph. 1-2 разного от 30-50 многочислен- рядные, в 3-рядного

íurczaninovii диаметра до 70- ные перифери- (местами

выстланы 2-4- 100 ответвления и ческой до 4 рядов)

рядным анастомозы части коры слоя

желтоватым извилис- выдели-

эпителием и тые. тельных

заполнены клеток.

прозрачным

вязким

секретом

Установлены следующие товароведческие показатели лекарственного сырья (табл. 2).

Таблица 2

Показатель Рк ¡¡ЫИсю Рк ШгсгатпочИ

Потеря в массе при высушивании Не более 6 % Не более 6

Экстрактивные вещества Не менее 22 % Не менее 30 %

Органическая примесь Не более 3 % Не более 3,5 %

Минеральная примесь Не более 0,35 % Не более 0,4 %

Общая зола Не более 7 % Не более 10 %

Зола не раств. в 10% НС1 Не более 3% Не более 4,5 %

Выделение и изучение биологически активных веществ корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова.

Углеводы. Методом ТСХ в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова была обнаружена сахароза. В кристаллическом виде дисахарид был выделен на заключительных этапах градиентной экстракции из спиртового экстракта. Общее содержание сахарозы в корнях и корневищах вздутоплодников, определенное антронсерным методом, составило 5,00 % от массы сырья.

Эфирные масла. Исследование качественного и количественного состава эфирных масел с применением метода ГХ/МС позволило выявить некоторые закономерности его накопления в зависимости от места произрастания.

Выход эфирного масла из корней и корневищ в. Турчанинова составил до 1.4 % от массы воздушно-сухого сырья. Цвет масел от прозрачного до светло-жёлтого с приятным ароматом. В масле, выделенном из корней и корневищ, идентифицировано около 65 компонентов. Основными составляющими эфирного масла являются: а-пинен, а-феландрен, п-цимол, гермакрен, терпинолен. Терпинолен в эфирном масле содержится от 17.42 до 32.24 %. Количество а-пинена составляет от 8.04 до 15.86 % от объема эфирного масла. Эфирные масла из исследованных популяций (монгольской и бурятской) имеют близкий набор компонентов, но отличаются по их количественному содержанию. Выход эфирного масла из корней и корневищ в. сибирского составил от 0,5 до 1,2 % от массы воздушно-сухого сырья. В масле идентифицировано около 30 компонентов, что составило 97-99% от общего числа соединений. Нами впервые установлено наличие в растениях, в качестве основных компонентов, лимонена, у-терпинена, терпинолена, спатуленола, гермакрена Б, виридифлорола, р-барбатена, 5-кадинена и р-акорадиена. Эфирные масла, выделенные из подземной части растений, собранных в

2008 и 2009 гг., схожи по набору компонентов. Эфирное масло из корней и корневищ в. сибирского, собранных в Забайкальском крае, характеризуется высоким содержанием лимонена (до 62 %), 3-карена (до 6 %), яг-куркумена (до 4.0 %); в Бурятии - у-терпинена (до 37.86 %), п-цимола (до 9.35%), ионола (до 10.99%). Состав эфирных масел из растений, произрастающих в разных районах, имеет значительные отличия по количественному содержанию компонентов, хотя набор основных составляющих масла близок (табл. 3).

Таблица 3

Основные компоненты эфирных масел в. сибирского и в. Турчанинова

(% от цельного масла)

Компонент РИ. 5/Ыпсш РЪ. шгсгаптот

Забайкальский край Бурятия Бурятия Монголия

2008-2009 2008-2009 2008-2009 2008-2009

1 2 3 4 5

а-Пинен 1.17' 0.78 15.86 8.04

Р-Мирцен 0.68 1.01 3.15 4.18

а-Фелландрен 0.93 1.41 14.99 8.22

З-Карен 5.55 5.11 0.17 0.28

л-Цимол 1.68 9.35 4.40 3.25

Лимонен 61.07 6.82 13.63 9.46

цис-р-Оцимен - - 0.66 3.24

7-Терпинен 0.55 37.86 0.01 0,28

Терпинолен 5.40 30.1 32.24 17.42

Борнилацетат 1.00. 2.02 1.40 3.33

Кариофиллен 0.01 3.34 1.10 0.04

Диметиловый эфир тимогидрохнноиа 2.94 10.45 2.02 0.96

Р-Барбатем + 5.80 - -

(З-Акорадиен 0.95 5.67 + 0.07

Гермакрен О - 3.45 0.11 3.04

бициклогермакрен - 1.02 1.22 3.97

¿р-Куркумен 4.0 1.71 - -

Р-Бизаболен 1.69 4.60 - -

Ионол + 10.99 - -

5-Кадинеь 0.98 7.53 0.01 0.30

Виридифлорол - 6.30 + +

Гермакрен В - - 1.15 3.55

Спатуленол 0.99 1.07 0.18 3.35

Примечание: «-» - компонент не обнаружен, «+» - содержание компонента меньше 0.01%; "-среднее из 6 определений.

Флавоиоиды. Качественный анализ спиртовых извлечений из корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова показал наличие флавоноидов. Для подтверждения присутствия флавоноидов, а также для установления их химической природы и количественного содержания проведён анализ с помощью метода ВЭЖХ/МС/МС с использованием в качестве стандартов

соответствующих чистых соединений. Впервые в корнях и корневищах в. Турчанинова обнаружены рутин (2 - Знг/г), байкалин (1-1.2 нг/г) и кверцетин (1—1.5нг/г). В корнях и корневищах в. сибирского обнаружен рутин, количественное содержание которого варьируется в зависимости от места произрастания от (2-3.2 нг/г).

Жирные кислоты. Методом ГХ/МС определён жирнокислотный состав (ЖК) корней и корневищ вздутоплодников, в каждом из видов идентифицирована 21 высокомолекулярная жирная кислота, что составило 97-99% от суммы веществ. Основные компоненты жирных масел (С18:0, С18:1п9, С18:2пб, 18:ЗпЗ, 20:2п11) в. сибирского и в. Турчанинова совпадают (рис. 1).

3

t,min

Рис. 1. Хроматограмма жирных кислот корней и корневищ в. Турчанинова. 1 -16:0,2 — 18:1п9, 3 - 18:2п6, 4 - 18:3п6

Имеются незначительные различия в количественном содержании доминирующих кислот жирных масел из образцов в. сибирского в зависимости от места и года сбора (табл. 4).

Кумарины. С целью препаративного выделения кумариновых соединений нами использовалось воздушно-сухое сырье, собранное в 2009 г. (по 500 г каждого вида). Измельчение проводили до размера частиц, проходящих сквозь сито размером 2 мм. Измельченные корни и корневища в. сибирского и в. Турчанинова последовательно экстрагировали растворителями в порядке возрастания полярности. Экстракцию проводили растворителями трехкратно при комнатной температуре в течение 24 часов, периодически встряхивая. Полноту экстракции отслеживали, используя метод ТСХ. Выход экстрактивных веществ представлен в таблице 5.

Таблица 4

Относительное содержание основных жирных кислот в корнях и корневищах _вздутоплодников (% от суммы компонентов)_

Наименование компонента РЬ. эйтсм РИ. Шгс:аптоуИ

1 2 3 4 5 6 7

16:0 7.43 ±0.20 10.82 ±0.22 6.83 ±0.18 9.95 ±0.41 7.09 ±0.33 5.55 ±0.30 6.38 ±0.27

16:1п9 1.66 ±0.01 4.16 ±0.30 1.65 ±0.09 1.19 ±0.04 2.24 ±0.20 2.22 ±0.19 2.81 ±0.24

18:1п9 18.88 ±0.28 19.00 ±0.31 16.20 ±0.21 19.01 ±0.23 18.17 ±0.22 17.60 ±0.30 18.68 ±0.33

18:2п7 9.05 ±0.31 6.46 ±0.22 9.26 ±0.30 7.23 ±0.27 7.13 ±0.35 9.45 ±0.39 9.08 ±0.21

18:2пб 55.48 ±1.75 49.10 ±0.20 57.15 ±0.21 54.36 ±1.11 55.85 ±1.17 53.05 ±0.57 51.9 ±0.74

18:3пб 2.15 ±0.12 2.87 ±0.10 2.32 ±0.01 1.86 ±0.02 2.69 ±0.03 2.67 ±0.14 3.71 ±0.01

ЕНЖК 9,27 13.72 8.05 11.68 9.23 8.13 8.44

Е МНЖК 21,37 23.88 19.21 21.03 21.22 2132 22.45

£ ПНЖК 68,37 60.50 71.38 65.87 68.41 68.54 68.12

Таблица 5

Выход экстрактивных веществ__

№ п/и Растворитель для экстракции Выход экстрактивных веществ, %'

РИ. зШпсиз, Забайкальский край" РЬ. иЫпыи, Бурятия РК Шгсгаптот, Монголия РЬ. 1игсгатпо\'п, Бурятия

1 Петролейный эфир 13.18"' 11.67 16.20 14.72

2 Диэтиловый эфир 4.04 4.39 6.00 3.5

3 трет- Бутилметиловый эфир 1.00 0.20 1.30 0.31

4 Этилацетат 0.90 0.80 1.16 0.27

5 Этиловый спирт 96% 10.82 11.50 10.36 11.02

* % от массы воздушно-сухого сырья; ** все образцы 2009 года; ***среднее из трёх определений.

Из данных таблицы 5 видно, что наибольший выход экстрактивных веществ наблюдается при экстракции эфиром петролейным и спиртом этиловым.

Полученные густые экстракты после отделения осадков подвергали хроматографическому разделению на колонках с сияикагелем при соотношении сырьё-сорбент 1:40. Элюирование веществ осуществляли в градиентной системе (99:1, 98:2, 97:3, 9:1, 8:2 и 7:3). Фракции отбирали по

25 мл. Фракции, содержащие одинаковые соединения, по данным ВЭЖХ/УФ и ТСХ, объединяли, упаривали досуха и кристаллизовали. В результате было выделено 7 соединений.

Кумарины в. сибирского.

Из корней и корневищ в. сибирского выделено 6 производных кумарина. При хроматографии ПЭ и ДЭ экстрактов на силикагеле выделили пеуценидин (I) и дигидроломатин (II). Содержание пеуценидина в ПЭ экстракте составило 8.2% от веса экстракта. Основным компонентом МТБЭ и ЭА экстракта явился дигидросамидин (III). При обработке ЭА извлечения серной кислотой и последующей хроматографии выделили продукты омыления кумаринов - смесь цис- и шранс-келлактонов (IV, V). Обработка ЭА извлечения 10% раствором КОН и последующая хроматография позволили выделить метилкеллактон (VI) (рис. 2)

Рис 2. Кумарины из в. сибирского и в. Турчанинова I - пеуценидин, II -дигидроломатин, III - дигидросамидин, IV - цис - келлактон, V - трапе -келлакгон, VI - метилкеллактон VII - либанорин.

Кумарины в. Турчанинова.

Из в. Турчанинова монгольской и бурятской популяций было выделено 2 соединения: пеуценидин и либанорин.

Соединение I. Белые ромбические кристаллы. С21Н22О7. Т.пл. 122-1250С (из EtAc). (ab = -48.2 (с 1.23, СНС13). УФ-спектр (ЕЮН), нм, (Ige): 207 (5.12), 226 (4.12), 298 (3.77), 322 (4.68). ИК-спектр (v, см"): 806, 848, 862, 938, 980, 1005, 1024, 1053, 1075, 1114, 1132, 1320, 1354, 1490, 1576, 1620, 1647, 1727, 1752, 3093. Спектр ^-ЯМР (CDC13, 5, м.д., J/Гц):

1.61, 1.70 (оба с, по ЗН, СН3 при С-4'), 1.86, 2.11 (оба с, по ЗН, СН3 при С-5"), 2.02 (ЗН, с, СН3С=0), 5.15 (1Н, д, /7.0, Н-2*), 5.58 (1Н, уш.с., Н-4"), 6.21 (1Н,д, J9.6, Н-3), 6.82 (1Н, д,/8.5, Н-6), 6.97 (1Н, д,/7.0, Н-3'), 7.40 (Ш, д, / 8.5, Н-5), 7.61 (1Н, д, / 9.6, Н-4). (рис. 5). МС, (m/z, /„„, %): 386 (15), 344(10), 326 (12), 311 (18), 286 (22), 261 (12), 244 (28), 243 (15), 229 (40), 227 (32), 201 (24), 186 (22), 158 (29), 128 (25), 102 (26), 83 (100), 55 (26), 43 (29). Найдено: 386.1364. Вычислено: 386.1360. Найдено, %: С 65.38; H 5.32. Вычислено, %: С 65.28; H 5.74.

Таким образом, на основе приведённых физико-химических данных соединение 1 имеет структуру (85',9Л)-9-Ацетокси-8-(2-сенециоил-оксипролан-2-ил)-8,9-дигидро-2#-фуро(2,3-й)хромен-2-он - пеуценидина.

Впервые по данным рентгеноструктурного анализа (РСА) показано пространственное строение молекулы пеуценидина. Кристаллы ромбические, пространственная группа Р2\2{21 Кумариновый фрагмент практически плоский. Фурановое кольцо находится в конформации кресла. Ангелоильный и ацетатный заместители - плоские. В кристалле молекулы пеуценидина за счёт водородных связей С-Н...О типа связаны между собой в бесконечные ЗО-каркасы. (рис. 3).

Рис. 3. Пространственное строение молекулы пеуценидина в кристалле

Соединение II. С12Н12О4. Данные УФ и ИК спектров идентичны (Ганбаатар, 2010). Спектр 'Н-ЯМР (СОС13, 6, м.д., .Г/Гц): 1.70 (с, 6Н, 2*СН3 при С-2'), 6.35 (1Н, д, /9.8, Н-3), 6.81 (Ш, д,/ 8.0, Н-6), 6.92 (Ш, с, Н-4), 7.31 (1Н, д,/8.5, Н-6), 7.36 (1Н, д,/8.5, Н-5), 7.76 (1Н, д,/9.8, Н-5). Спектр "С-ЯМР (5, м.д.): 28.54 (2*СН3), 69.02 (С-2), 97.70 (С-4'), 108.44 (С-5), 113.33 (С-4а), 113.82 (С-3), 117.44 (С-8а), 123.32 (С-6), 144.37 (С-4),

148.04 (С-8), 156.86 (С-7), 160.73 (С-2), 164.33 (С-3'). На основании приведенных данных - дигидроломатин (З'-гидроксисеселин).

Соединение III. С21Н2404. Т.пл. 113-114°С (из (Et)20). (a)D = +64,5° (с 0.93, диоксан). УФ-спектр (ЕЮН), нм, (lge): 219 (3.9), 245 (3.39), 257 (3.35), 322 (3.89). ИК-спектр (v, см-1): 3105, 3060, 1738, 1615, 1584, 1495, 1238. Спектр 'Н-ЯМР (CDC13, 5, м.д., J/Гц): 6.25 (1Н, д, Л 0.0, Н-3), 7.63 (1Н, д, J10.0, Н-4), 6.81 (1Н, д, J 8.0, Н-6), 7.38 (1Н, д, /8.0, Н-5), 6.55 (1Н, д, /5.4, Н-4'), 5.34 (1Н, д, /5.4, Н-3'), 1.41, 1.44 (с, по ЗН, Н-1', Н-5'), 2.14 (с ЗН, оАс), 2.18 (2Н, д, / 7.5, Н-2"), 0.96 (6Н, д, / 6.9, Н-4", Н-5") -дигид росам идин.

Соединение IV. Белые кристаллы. Q4H14O5. Т.пл. 174-175 (бензол), (a)D= +81.2 (с 2.0, СНС13). УФ-спектр (ЕЮН), Х^, нм, 258, 228. ИК-спектр (v, см"1): 3380, 3080, 3060, 1698, 1607, 1568. Спектр 'Н-ЯМР: (CDCI3, 5, м.д., J/Гц): 1.39 и 1.44 (каждый ЗН, с, гем. - (Ме)2); три АВ системы: 3.84 и 5.19 ( каждый 1Н, д, / 5,2, Н-9 и Н-10 соответственно); 6.23 и 7,64 (каждый 1Н, д, / 9,6 , Н-3 и Н-4 соответственно); 6.77 и 7.30 (каждый 1Н, д, / 8.6, Н-6 и Н-5 соответственно) - (+)-г/мс-Келлактон.

Соединение V. Белые кристаллы. С14Н1405. Т.пл. 185-187 (бензол), (a)D= -18.3 (с 2.4, СНС13). Спектр 'Н-ЯМР: (CDC13, 5, м.д., J/Гц): 1.29 и 1.50 (каждый ЗН, с, тем. - (Ме)2); три АВ системы: 3.83 и 4.98 ( каждый 1Н, д, / 6.8, Н-9 и Н-10 соответственно); 6.23 и 7,63 (каждый Ш, д, / 9,6 , Н-3 и Н-4 соответственно); 6.76 и 7.29 (каждый 1Н, д, / 8.6, Н-6 и Н-5 соответственно) - (-)-ягранс-Келлактон.

Соединение VI. Бесцветные кристаллы. CuHi605 Т.пл. 159-160°С (из (Et)20). (ot)D = +13.02 (с 0.96, ЕЮН). УФ-спектр (ЕЮН), нм, (lgs): 220 (4.09), 247 (3.5), 258 (3.45), 327 (4.16). Спектр 'Н-ЯМР: (CDC13, 5, м.д., J/Гц): 6.26 (1Н, д,/9.5, Н-3), 7.63 (1Н, д, J9.5, Н-4), 6.76 (1Н, д, У 8.6, Н-6), 7.32 (1Н, д, /8.4, Н-5), 1.44 (6Н, с, Н-Г и Н-5), 3.88 (1Н, д.д., / 7.0, / 5.0, Н-3'), 4.71 (1Н, д, / 5.0, Н-4'), 2.95 (Ш, д, / 7.0, -ОН), 3.88 (ЗН, с, -ОСН3) - 4'-0-метил-гуиокеллактона.

Соединение VII. Белые кристаллы. Т.пл. 75-77°С (из (Et)20). (a)D = +188.3 (с 0.88, CHClj). УФ-спектр (ЕЮН), \пах, нм, (lgs): 206 (4.11), 237 (3.68), 298 (2.77), 329 (4.13). ИК-спектр, (v, см"1): 806, 832, 930, 980, 1024, 1069, 1263, 1385, 1460, 1506, 1620, 1720, 1736, 3090. Спектр ^-ЯМР: (CDCI3, б, м.д., J/Гц): 1.53,1.61 (оба с, по ЗН, СН3 при С-4'), 1.86,2.10 (оба с, по ЗН, СНз при С-5"), 3.36 (2Н, м, Н-3'), 5.21 (1Н, д.д, / 7.6, 8.2, Н-2'), 5.58 (1Н, уш.с., Н-4"), 6.23 (1Н, д, /9.6, Н-3), 6.80 (1Н, д, / 8.4, Н-6), 7.27 (1Н, д, / 8.4, Н-5), 7.62 (1Н, д, / 9.6, Н-4) (рис 7). МС, (m/z, /отн, %): 328 (10), 303 (10), 286 (5), 244 (16), 243 (11), 229 (42), 227 (15), 201 (8), 187 (16), 83 (100), 43 (25). Найдено: 328.1314. С19Н20О5. Вычислено: 328.1311.

На основании физико-химических данных соединение 2

идентифицировали как {8(5)-(2-сенециоилоксипропан-2-ил)-8,9-дигидро-2#-фуро(2,3-/г)-хромен-2-он} - либанорин.

Таким образом кумарины в. сибирского Прибайкалья представлены фуро- и пиранокумаринами. Пеуценидин и либанорин являются доминирующими кумаринами корней и корневищ в. Турчанинова флоры Бурятии и Монголии.

Элементный состав. Методом атомно-адсорбционного анализа в золе корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова определено количественное содержание микроэлементов (табл. 6).

Таблица 6

Количественное содержание микроэлементов в корнях и корневищах _вздутоплодников_____

№ Ph. sibiricus Ph. turczaninovii

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Си 8.48 2.21 4.79 7.25 5.82 4.45 9.00 4.33 4.93

±0.45 ±0.29 ±0.12 ±0.35 ±0.11 ±0.31 ±0.61 ±0.48 ±0.54

Zn 41.90 26.90 29.97 22.96 24.27 20.30 37.71 33.83 30.33

±0.77 ±0.17 ±0.12 ±0.59 ±0.11 ±0.31 ±0.39 ±0.63 ±0.48

Cd 0.17 0.23 0.29 0.22 0.29 0.25 0.24 0.29 0.28

±0.01 ±0.01 ±0.01 ±0.01 ±0.03 ±0.01 ±0.01 ±0.03 ±0.01

Pb 0.30 1.16 0.94 1.09 1.20 1.25 2.94 1.15 1.08

±0.01 ±0.01 ±0.03 ±0.09 ±0.01 ±0.07 ±0.04 ±0.04 ±0.05

Ni 2.77 4.03 2.61 3.53 5.85 1.52 2.84 1.23 1.85

±0.03 ±0.03 ±0.02 ±0.03 ±0.03 ±0.01 ±0.01 ±0.05 ±0.01

Mn 58.11 33.58 32.73 26.90 43.79 36.04 61.70 65.39 37.93

±0.71 ±0.45 ±0.20 ±0.57 ±0.34 ±0.13 ±0.45 ±0.02 ±0.56

Cr 64.41 59.31 75.32 0.17

±0.41 ±0.56 ±0.34 ±0.01

«-» элемент не обнаружен

Согласно полученным данным, содержание меди в исследованных образцах находилось в пределах от 2.21 мг/кг до 9.00 мг/кг. Содержание цинка для всех образцов варьировалось в пределах от 20.30 до 41.90 мг/кг, кадмия - от 0.17 до 0.29 мг/кг. Наибольшая концентрация свинца выявлена во вздутоплоднике Турчанинова, собранного в Селенгинском районе в 2008 г., его содержание составило до 2.94 мг/кг. Никель, обнаруженный во всех образцах, содержался в пределах от 1.23 до 5.85 мг/кг. Содержание марганца обнаружено в достаточно широких пределах, от 26.90 до 65.39 мг/кг. Хром был обнаружен в 4 образцах в количестве от 0.17 до 75.32 мг/кг. Максимальная концентрация хрома была найдена в образце в. Турчанинова, собранного в Селенгинском районе в 2008 г.

Разработка способа получения PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова. С целью качественной и количественной оценки сырья в пересчёте на доминирующий компонент нами был

разработан способ получения PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова. На рисунке 4 представлена схема получения PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова.

Рис. 4. Схема получения PCO пеуценидина из корней и корневищ в. Турчанинова.

Основные этапы получения PCO пеуценидина заключаются в следующем: измельчённое воздушно-сухое сырьё экстрагировали хлороформом три раза при температуре 80°С в соотношении сырья и растворителя 1:15 в течение 30 мин в ультразвуковой ванне, с частотой излучения 50КГц. Объединенные хлороформные экстракты упаривали и к полученному извлечению добавляли смесь хлороформ-эфир петролейный (1:1). Оставляли при температуре 5°С на 24 часа. Выпавший осадок отделяли, промывали и перекристаллизовывали.

Было получено три серии PCO пеуценидина. Качество полученного готового продукта подтверждено данными Т.пл., удельным показателем

поглощения, ИК, УФ и 'Н-ЯМР-спектроскопии. Указанные показатели качества включены в проект ФС на PCO пеуценидина.

Разработка методики количественного определения суммы а-пироновых соединений в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова.

Учитывая тот факт, что нами разработан способ получения PCO пеуценидина, количественное определение представляется целесообразным проводить по содержанию кумаринов. Количественную разработку методики проводили методом спектрофотометрии, так как спектры спиртовых растворов из корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова совпадают.

При изучении оптимальных условий экстракции установлено, что наиболее полное извлечение кумаринов из сырья достигается при измельчении сырья до размеров, проходящего сквозь сито 2-3 мм, при температуре 80°С в соотношении сырья и растворителя 1:15 в течение 30 мин в ультразвуковой ванне с частотой излучения 50КГц. Экстракцию проводили хлороформом три раза. Объединенные экстракты упаривали до полного удаления растворителя. Оставшийся густой экстракт растворяли в спирте и проводили измерения при длине волны 322 нм.

Максимумы поглощения хлороформных экстрактов вздутоплодников и PCO пеуценидина в УФ-спектре (этанол) совпадают (рис. 5).

Рис. 5. УФ-спектры поглощения хлороформных экстрактов. 1-в. Турчанинова, 2 - в. сибирский, 3 - PCO пеуценидина.

Определение метрологических характеристик методики количественного определения суммы а-пироновых соединений было

проведено в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова в пересчете на PCO пеуценидина (табл. 7).

Таблица 7

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы ct-пироновых соединений в растительном сырье в. сибирского(1) и в. Турчанинова (2) в пересчете на пеуценидин-стандарт

f Хер S S, Р t(p,f) Дх Аотн.

1 9 2.66 0.01347 ±0.00426 95 2.26 0.03043 ±1.14

2 9 3.73 0.01653 ±0.00523 95 2.26 0.03736 ±1.00

Для проверки отсутствия систематической ошибки в методике были проведены эксперименты с добавками пеуценидина непосредственно при экстракции сырья. Полученные результаты приведены в таблицах 8,9.

Таблица 8

Результаты опытов с добавками пеуценидина (в. Турчанинова)

№ п/п Содержание производных кумаринов в 1 г сырья, мг Добавлено пеуценидина, мг Должно быть, мг Найдено, мг Относительная ошибка, %

1. 26.60 3.23 29.83 29.60 -0.77

2. 26.60 6.45 33.15 33.46 +0.93

3. 26.60 9.68 36.28 36.65 + 1.02

Таблица 9 Результаты опытов с добавками пеуценидина (в. сибирский)

№ п/ п Содержание производных кумаринов в 1 г сырья, мг Добавлено пеуценидина, мг Должно быть, мг Найдено, мг Относительн ая ошибка, %

1. 38.80 2.56 41.36 41.03 -0.79

2. 38.80 5.12 43.92 44.23 +0.70

3. 38.80 10.18 48.98 49.40 +0.86

Относительная ошибка опытов с добавками находится в пределах величины случайной ошибки, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Методика валидирована - подтверждена специфичность, прецизионность. Таким образом, было установлено, что суммарное содержание а-пироновых соединений в корнях и корневищах в. сибирского составляет от 2.55 до 2.71%, а в корнях и корневищах в. Турчанинова от 3.73 до 3.88%. Полученные данные легли в основу проекта ФС на сырье.

Разработка нормативной документации на сырье в. Турчанннова

Результаты морфологических и фитохимических исследований корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова послужили основой для создания нормативной документации проекта ФС на сырье «Корни и корневища вздутоплодника Турчанинова - РЫсдосИсагриь Шгсгатпоуи

При разработке норм качества проведен анализ образцов сырья из различных мест произрастания (табл.10).

Таблица 10

Количественное содержание а-пироновых соединений в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова (гс=10, Р=95%, ф,/)-2.26)

Сырьё Содержание суммы а-пироновых соединений, % Метрологические характеристики разработанной методики

S S, ±Дл А отн., %

В. сибирский, бухта Безымянная, Бурятия 2009 г. 2.66 0.01347 0.00426 0.03043 ±1.14

В. сибирский, о. Ольхон, Иркутская область, 2010 г. 2.54 0.01200 0.00379 0.02712 ±1.07

В. сибирский, бухта Песчаная, Иркутская область, 2010 г. 2.55 0.01253 0.00396 0.02832 ±1.10

В. сибирский, п-ов Св. Нос, Бурятия, 2010 г. 2.71 0.01040 0.00329 0.02350 ±0.86

В. сибирский, Нерчинский район, Забайкальский край, 2009 г. 2.61 0.01200 0.00379 0.02712 ±1.04

В. Турчанинова, Булганский аймак, Монголия, 2009 г. 3.88 0.01733 0.00548 0.03917 ±1.01

В. Турчанинова, Селенгинский р-он, Бурятия, 2009 г. 3.73 0.016533 0.00523 0.03736 ±1.00

Показатели качества сырья «Корни и корневища вздутоплодника Турчанинова - РЫ0]0<Исагри$ ШгсгатпоуЦ 81р1.» приведены в таблице 11.

Таблица 11

Нормы качества сырья «Корни и корневища вздутоплодника Турчанинова -_РЫо]оЛсагри5 ШгсгатпоуН 5!р1.»._

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки ГФ И сырье - подземные органы вздутоплодников сибирского и Турчанинова представляют собой отдельные куски корневищ и корней, реже цельные корневища и корни длиной от 3 до 7см, диаметром от. 1 до 3 см. Поверхность их покрыта морщинистой, отслаивающейся пробкой тбмно-коричневого цвета. Излом белый или желтовато-белый. Запах приятный, вкус водного извлечения сладковатый, затем горьковато-пряный.

Микроскопия ГФ 11 Секреторные каналы корней 12мм в диаметре выстланы 2-4-рядным желтоватым эпителием и заполнены прозрачным вязким секретом; секреторные каналы коры корня, от 30-50 до 70-100 мкм; образуют многочисленные ответвления и анастомозы; сердцевинные лучи - 3-4-рядные, в периферической части коры извилистые; секреторный аппарат - наличие 2-3-рядного (местами до 4 рядов) слоя выделительных клеток.

Подлинность Щелочная проба Положительная реакция (ярко-жёлтое окрашивание)

Количественное определение Спектрофотометри-ческий содержание пеуценидина не менее 2,73 %

Выход экстрактивных веществ ГФ И Не менее 30 %

Потеря в массе при высушивании Гравиметрический, ГФ 11 Не более 6 %

Золы общей ГФ 11 Не более 10%

Золы нерастворимой в 10 % р-ре кислоты хлористоводородной ГФ И Не более 4,5%

Органической примеси ГФ 11 Не более 3,5 %

Минеральной примеси ГФ 11 Не более 0,4 %

выводы

1. Выявлены основные анатомо-диагностические признаки корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова. Их различие заключается в размерах секреторного аппарата, представленного густой сетью каналов, разнообразных по форме и диаметру. Наиболее узкие каналы в прикамбиальной зоне коры - более характерны для в. Турчанинова, что дает возможность проводить диагностику сырья.

2. Выделены и изучены биологически активные вещества корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова: эфирные масла, жирные кислоты, флавоноиды, кумарины, углеводы, микроэлементы. Основными составляющими эфирного масла в. Турчанинова являются: а-пинен, а-феландрен, и-цимол, гермакрен D, терпинолен. Эфирное масло в. сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, S-кадинен и ß-акорадиен. Жирнокислотный состав корней исследованных видов вздутоплодников совпадает и представлен насыщенными (миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенными (олеиновая, линолевая, линоленовая) кислотами. Флавоноиды (рутин, байкапйн и кверцетин) в корнях и корневищах в. Турчанинова и в. сибирского обнаружены впервые. Углеводы корней и корневищ в. сибирского и в. Турчанинова представлены сахарозой.

3. Изучен состав а-пироновых соединений в. сибирского и в. Турчанинова. В корнях и корневищах в. сибирского идентифицировано 6 производных кумарина: дигидросамидин, цис- и транс-келлактоны, метилкеллактон, а также дигидроломатин и пеуценидин, которые в данном виде растения обнаружены впервые. Из корней и корневищ в. Турчанинова выделены пеуценидин и либанорин.

4. Разработан способ получения рабочего стандартного образца пеуценидина. Разработаны показатели качества, которые легли в основу проекта ФС.

5. Разработана методика спектрофотометрического определения суммы а-пироновых соединений в подземных органах в. сибирского и в, Турчанинова (относительная ошибка определения не превышает ±1.14 %), Установлено, что общее содержание а-пироновых соединений в корнях и корневищах в. сибирского и в. Турчанинова составляет 2.55-2.71% и 3.73-3.88 % соответственно (от массы абсолютно сухого сырья).

6. Проведена стандартизация сырья «Корни и корневища вздутоплодника Турчанинова - Phlojodicarpus turczaninovii Sipl». Определены товароведческие показатели, диагностические признаки, показатели подлинности, качества сырья и PCO пеуценидина, которые вошли в проект ФС на PCO пеуценидина и сырье.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тараскин В.В. Сравнительный анализ состава эфирного масла Phlojodicarpus turczanirtovii (Apiaceae), произрастающего в Монголии и Бурятии /

B.В. Тараскин, Л.Д. Раднаева, С.В. Жигжитжапова, О.А. Аненхонов, Жамсаранжав Ганбаатар // Вестник БГУ. Серия Химия-физика. - 2011.- вып. №3,-

C. 111-115.

2. Тараскин В.В. Состав эфирного масла Phlojodicarpus sibiricus{Apiaceae)l

B.В. Тараскин, Л.Д. Раднаева, О.А. Аненхонов, С.В. Жигжитжапова, С.М. Гуляев, Т.Э. Соктоева // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.-2011.- №1(77), 4.2.- С. 177-180.

3. Тараскин В.В. Растения рода Phlojodicarpus Turcz. ex Ledeb. флоры Бурятии - источники кумаринов / В.В. Тараскин, Л.Д. Раднаева, С.В. Жигжитжапова // «Ломоносов-2008»: мат-лы междунар. научн. конф.- М., 2008.-

C. 157-158.

4. Шульц Э.Э. Кумарины в подземных органах Phlojodicarpus sibiricus . из Восточного Прибайкалья / Э.Э. Шульц, В.В. Тараскин, Н.И. Комарова, Т.Н. Петрова, Д.В. Царенко, Л.Д. Раднаева, О.А. Аненхонов, Г.А. Толстиков. II «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»: мат-лы IV Всеросс. научн. конф.- Барнаул, 2009,- С. 57.

5. L.D. Radnaeva. Essential oils and coumarins from plans of the Phlojodicarpus Turcz. Ex Lebed / L.D. Radnaeva, V.V. Taraskin, S.V. Zhigzhitzhapova, J. Ganbator // «International Studies on the Essential Oils and Bioactive Constituents of Aromatic and Medicinal Plants from the Mongolia»: materials of the international scientific conference.-Ulaanbaatar, 2009.- P. 89-91.

6. Тараскин B.B., Раднаева Л.Д. Состав эфирного масла растения рода Вздутоплодник - Phlojodicarpus Turcz. ex Ledeb. (семейство Apiaceae -Сельдерейные) произрастающего в Бурятии и Монголии / В.В. Тараскин, Л.Д. Раднаева // «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы»: мат-лы регион, молод, науч.-практ. конф. с междунар. уч-ем,- Улак-Удэ, 2010,- С. Ш-112.

7. Ganbaatar J. Coumarins of Phlojodicarpus sibiricus and Peucedanum terebinthaceum growing in Byryatia and Mongolia / J. Ganbaatar, E.E. Shults, L.D. Radnaeva, R. Mungunnaran, A. Tuvshintugs, V.V. Taraskin // «Приоритеты Байкальского региона в азиатской геополитике России»: мат-лы IV Междунар. науч. конф,- Улан-Удэ, 2010 г.- С. 151-153

8. Ganbaatar J. Coumarins of Phlojodicarpus sibiricus / J. Ganbaatar, E.E. Shults, L.D. Radnaeva, D. Otgonsuren, V.V. Taraskin, D. Mungunnaran, D. Badamkhand. // «Green chemistry & advanced technology»: Materials of the 4th International conference.- Ulaanbaator, 2010.- P. 77-81.

9. Тараскин В.В. Тяжелые металлы в подземных органах растения рода Вздутоплодник - Phlojodicarpus Turcz. ex Ledeb. (семейство Apiaceae -Сельдерейные) произрастающего в Бурятии и Монголии / В.В. Тараскин, Н.Б Болданова, Л.Д. Раднаева // «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы»: мат-лы Всеросс. молод, научн. конф. с междунар. уч-ем,-Улан-Удэ, 2011.-С. 111-112.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГХ/МС- газовая хроматография/масс-спектрометрия ИК - инфракрасная спектроскопия ТСХ - тонкослойная хроматография УФ - ультрафиолетовый

ЯМР - спектроскопия ядерного магнитного резонанса

ПЭ - петролейный эфир

ДЭ - диэтиловый эфир

МТБЭ - тре от- бути л м ети л о в ы й эфир

ЭА - этилацетат

РСА - рентгеноструктурный анализ

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, д.х.н., профессору Раднаевой Ларисе Доржиевне за руководство диссертационным исследованием и неоценимую моральную поддержку. Отдельную благодарность автор выражает зав. лабораторией медицинской химии НИОХ СО РАН, д.х.н., проф. Шульц Э.Э. за помощь в установлении строения кумариновых соединений и зав. лабораторией флористики и геоботаники, к.б.н. Аненхонову O.A. за помощь в определении и сборе образцов растений.

Подписано в печать 21.11.2011 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,6печ. л. Тираж 100. Заказ № 64.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН. 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.

Актуальность темы. Среди биологически активных веществ растительного происхождения важное место занимает класс а-пиронов. Многие представители этого класса являются соединениями с выраженными фармакологическими свойствами и поэтому постоянно находятся в сфере внимания исследователей [128]. В терапии кожных заболеваний используют препараты, содержащие фурокумарины и обладающие фотосенсибилирующим и фотозащитным действием, такие как псорален, изопсаролен, 8-метоксипсорален, бергаптен и изопимпинеллин [1,139]. Производные 4-гидроксикумарина, и пиранокумарины применяют в качестве антикоагулянтов с коронарорасширяющей и спазмолитической активностью. В ряду растительных кумаринов обнаружены перспективные противовирусные и противораковые агенты [131,140,161,162,164,166,170,176, 190]. Например, дигидросамидин рассматривается в качестве источника келлактонов, на основе которых синтезирован ряд анти-ВИЧ агентов [190], 2'(5)-колумбианетин сульфат обладает антипролиферативной активностью, связанной с индукцией апоптоза опухолевых клеток путем активации экспрессии Вах, р53 и р 21 [152]. Противоопухолевой активностью обладают дигидрофурокумарины вагинидиол [164] и ангелмарин [131, 166].

Флора Сибири богата растениями, представляющими ценность в качестве источников биологически активных веществ [3,1214,38,46,47,64,67,112], в частности кумаринов. К числу таких растений, безусловно, относятся растения семейства зонтичные (Umbelliferae), такие как вздутоплодник сибирский Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) Koso-Pol. и вздутоплодник Турчанинова Phlojodicarpus turczaninovii Sipl. Корни вздутоплодников применяются в народной медицине как противоопухолевое, коронарорасширяющее, антикоагулирующее, желчегонное, спазмолитическое, бактериостатическое средство [4,11,13,19,64,124,127,151]. Вздутоплодник сибирский является фармакопейным растением (ФС 42-2667-89) и используется как сырьё для получения препарата «Фловерин» (ФС 42-2532-88), который представляет собой природную смесь дигидросамидина и виснадина. Основные запасы вздутоплодника сибирского находятся в Забайкальском крае. Химический состав вздутоплодников изучен недостаточно и ограничен лишь сведениями о содержании кумаринов [71,109].

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что фармакогностическое изучение корневищ и корней вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus и в. Турчанинова Ph. turczaninovii позволит дополнить сведения о содержании в них биологически активных соединений, расширить сырьевую базу растений, а так же создать на их основе новые лекарственные средства.

Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение вздутоплодника сибирского и вздутоплодника Турчанинова.

Для достижения указанной цели решались следующие основные задачи:

• Определить анатомо-диагностические признаки корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова и определить показатели качества сырья.

• Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ (БAB) исследуемых растений.

• Разработать способ получения рабочего стандартного образца (PCO) пеу цени дина из корневищ и корней в. Турчанинова.

• Разработать методики количественного определения суммы а-пироновых соединений в корневищах и корнях в. сибирского и в. Турчанинова.

• Разработать нормативную документацию на лекарственное сырьё в. Турчанинова и PCO пеуценидина из корневищ и корней в. Турчанинова.

Научная новизна работы.

На основании макро- и микроскопических исследований установлены основные диагностические признаки корневищ и корней в. Турчанинова и в. сибирского. Их основное различие в размерах секреторного аппарата, представленного густой сетью каналов, разнообразных по форме и диаметру. Наиболее узкие каналы в прикамбиальной зоне коры - более характерные для в. Турчанинова, дающие возможность проводить диагностику сырья.

Изучен химический состав корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова. Впервые изучен состав эфирного масла корневищ и корней в. Турчанинова. Основными составляющими эфирного масла являются: а-пинен, а-феландрен, и-цимол, гермакрен D, терпинолен. Эфирное масло в. сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Методом ВЭЖХ/МС проведена идентификация состава флавоноидов в корневищах и корнях в. Турчанинова, количественное содержание которых не превышает 0.003мкг/г. Впервые изучен состав высших жирных кислот корневищ и корней двух видов вздутоплодников, который представлен насыщенными (миристиновой, пальмитиновой, стеариновой) и ненасыщенными (олеиновой, линолевой, линоленовой) кислотами. Изучен состав а-пироновых соединений в. сибирского и в. Турчанинова. В корневищах и корнях в. сибирского идентифицировано 6 производных кумарина: дигидросамидин, цис- и трднокеллактоны, метилкеллактон, а также дигидроломатин и пеуценидин, которые в данном виде обнаружены впервые. Из корневищ и корней в. Турчанинова выделены - пеуценидин и либанорин. Для пеуценидина впервые по данным рентгеноструктурного анализа (РСА) установлено пространственное строение молекулы в кристалле. Изучен микроэлементный состав корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова. Разработан способ получения PCO пеуценидина из корневищ и корней в. Турчанинова, составлен проект ФС на PCO пеуценидина. Разработана методика количественного определения суммы а-пироновых соединений в корневищах и корнях в. сибирского и в. Турчанинова в пересчёте на PCO пеуценидина. Разработана нормативная документация - проект ФС «Корневища и корни вздутоплодника Турчанинова Phlojodicarpus turczaninovii Sipl».

Практическая значимость работы.

На основании проведённых исследований разработаны показатели качества сырья, определены диагностические признаки и товароведческие показатели. Разработаны методики количественного определения содержания суммы а-пироновых соединений в корневищах и корнях в. сибирского и в. Турчанинова. Показано, что корневища и корни двух видов вздутоплодников сходны по составу БАВ, что позволяет рекомендовать их в качестве новых сырьевых источников фурокумаринов, а также для получения лекарственных препаратов, обладающих спазмолитической активностью.

Степень внедрения.

Материалы диссертационной работы включены в разработку методических пособий для студентов фармацевтического отделения ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (акт внедрения от 6.09.2011г). По результатам исследований разработаны и подготовлены к рассмотрению:

1. проект ФС на сырье «Корневища и корни вздутоплодника Турчанинова Ph. turczaninovii Sipl».

2. проект ФС на PCO - «(85,9Д)-9-Ацетокси-8-(2-сенециоилоксипропан-2-ил)-8,9-дигидро-2//-фуро(2,3-/г)хромен-2-она» -пеуценидина.

На защиту выносятся.

• результаты изучения анатомического строения, запасов, критериев подлинности в. сибирского и в. Турчанинова;

• результаты фитохимического изучения биологически активных веществ;

• результаты исследований по разработке способа получения рабочего стандартного образца пеуценидина;

• результаты исследований по стандартизации корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы представлены и обсуждены на:

• международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, 2008);

• всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009);

• международной конференции «International Studies on the Essential Oils and Bioactive Constituents of Aromatic and Medicinal Plants from the Mongolia» (Ulaanbaatar, 2009);

• IV Международной научно-практической конференции «Приоритеты Байкальского региона в Азиатской геополитике России» (Улан-Удэ, 2010);

• 4-th International conference «Green chemistry & advanced technology» (Ulaanbaatar, 2010);

• региональной молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2010);

• всероссийской молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2011);

• ежегодных конференциях преподавателей и сотрудников Бурятского государственного университета (Улан-Удэ, 2008, 2009, 2010).

Работа выполнена в рамках исследований по проектам: Междисциплинарный интеграционный проект № 93 «Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов»; РФФИ 08-04-90202-Монга «Исследование биогенетических закономерностей биосинтеза биологически активных соединений эндемичных растений Центральной Азии» (2008-2009 гг.); РФФИ 08-04-98037-рсибирьа «Химический состав растений как индикатор состояния экосистем Байкальского региона» (20082010 гг.); грант Бурятского государственного университета для аспирантов и молодых учёных «Кумарины растений 11тЬеШ/егае флоры Бурятии и Монголии: выделение, определение качественного и количественного состава» (2010 г.).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 9 работ, из них 2 статьи - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, общих выводов и приложения. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 28 таблицами. Список цитируемой литературы включает 190 источников, из них 60 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Выявлены основные анатомо-диагностические признаки корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова. Их различие заключается в размерах секреторного аппарата, представленного густой сетью каналов, разнообразных по форме и диаметру. Наиболее узкие каналы в прикамбиальной зоне коры - более характерны для в. Турчанинова, что дает возможность проводить диагностику сырья.

2. Выделены и изучены биологически активные вещества корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова: эфирные масла, жирные кислоты, флавоноиды, кумарины, углеводы, микроэлементы. Основными составляющими эфирного масла в. Турчанинова являются: а-пинен, а-феландрен, и-цимол, гермакрен О, терпинолен. Эфирное масло в. сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен Б, виридифлорол, Р-барбатен, 8-кадинен и Р-акорадиен. Жирнокислотный состав корней исследованных видов вздутоплодников совпадает и представлен насыщенными (миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенными (олеиновая, линолевая, линоленовая) кислотами. Флавоноиды (рутин, байкалин и кверцетин) в корневищах и корнях в. Турчанинова и в. сибирского обнаружены впервые. Углеводы корневищ и корней в. сибирского и в. Турчанинова представлены сахарозой.

3. Изучен состав а-пироновых соединений в. сибирского и в. Турчанинова. В корневищах и корнях в. сибирского идентифицировано 6 производных кумарина: дигидросамидин, цис- и гарянокеллактоны, метилкеллактон, а также дигидроломатин и пеуценидин, которые в данном виде растения обнаружены впервые. Из корневищ и корней в. Турчанинова выделены пеуценидин и либанорин.

4. Разработан способ получения рабочего стандартного образца пеуценидина. Разработаны показатели качества, которые легли в основу проекта ФС.

5. Разработана методика спектрофотометрического определения суммы а-пироновых соединений в подземных органах в. сибирского и в. Турчанинова (относительная ошибка определения не превышает ±1.14%). Установлено, что общее содержание а-пироновых соединений в корневищах и корнях в. сибирского и в. Турчанинова составляет 2.55-2.71% и 3.73-3.88 % соответственно (от массы абсолютно сухого сырья).

6. Проведена стандартизация сырья «Корневища и корни вздутоплодника Турчанинова - Phlojodicarpus turczaninovii Sipl». Определены товароведческие показатели, диагностические признаки, показатели подлинности, качества сырья и PCO пеуценидина, которые вошли в проект ФС на PCO пеуценидина и сырье.