Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и стандартизация лекарственных растительных иммуномодулирующих средств

г-ч — г. - На правах рукописи оозовэзоэ

НАГАСЛАЕВА Ольга Васильевна

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СРЕДСТВ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ - 2007

003069309

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель доктор фармацевтических наук

Николаева Галина Григорьевна

Официальные оппоненты доктор фармацевтических наук,

профессор

Маняк Виктор Андреевич

кандидат фармацевтических наук Югдурова Елизавета Долгоровна

Ведущая организация Всероссийский институт лекарственных

и ароматических растений

Защита состоится « » 2007 г в /¿7 часов на заседании

диссертационного совета К 003 028 01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу 670047, г Улан-Удэ, ул Сахьяновой, 6

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан « » 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Хобракова Валентина Бимбаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы наблюдается значительное снижение показателей здоровья и рост заболеваемости населения вследствие ряда объективных причин, среди которых важное значение имеют ухудшение экологической обстановки, интенсификация ритма жизни, снижение социальной защищенности широких слоев населения Вследствие все возрастающего эколого-социального прессинга отмечается существенное снижение резистентности организма, связанное с ослаблением иммунных, детоксикационных и других адаптационно-приспособительных механизмов

В этих условиях, проблема разработки новых иммуномодулирующих средств приобретает особую актуальность, в особенности, для профилактики заболеваний лицам с ослабленным здоровьем и перенесшим тяжелые заболевания, пожилым и престарелым, населению, проживающему в регионах с неблагоприятными климато-географическими условиями, а также широким слоям населения с целью повышения сопротивляемости организма, предупреждения утомления при физических и умственных нагрузках и повышения работоспособности

В последнее время во всем мире значительно повысился интерес к лекарственным растениям По своей химической природе растительные средства близки человеческому организму Они не воспринимаются как чужеродные и, в отличие от синтетических препаратов, не отторгаются защитными системами организма В ходе длительной эволюции человек' приспособился к их усвоению, они легче включаются в биохимические процессы, обладают хорошей переносимостью, отсутствием отрицательных реакций при длительном использовании Растительные препараты, содержащие комплекс биологически активных веществ (БАВ), оказывают фармакотерапевтическое действие на обменные процессы в организме, функции сердечно-сосудистой, центральной нервной системы и желудочно-кишечный тракт и другие органы

Практический интерес представляют сборы, наиболее популярные и доступные для населения России Весьма перспективными являются исследования по переводу многокомпонентных смесей лекарственных растений, используемых в виде настоев и отваров, в суммарные препараты - экстракты При получении экстрактов-концентратов обеспечивается максимальный выход биологически активных веществ, что повышает фармакотерапевтический эффект К преимуществам сухих экстрактов и лекарственных форм на его основе относятся удобство для применения и стойкость при хранении Кроме того, стандартизация по действующим веществам позволяет осуществлять контроль на стадиях производства и точность дозирования готового продукта, поэтому ,нЬ >

менее важной задачей является разработка стандарта качества на сухой полиэкстракт и лекарственную форму

Исходя из вышеизложенного можно заключить, что создание иммуномодулирующих средств из растительного сырья своевременно и является актуальной

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка и стандартизация новых лекарственных средств на основе растительной композиции в виде полиэкстракта сухого и гранул, обладающих иммуномодулирующей активностью

Для этого необходимо было решить следующие основные задачи

- обосновать и разработать состав многокомпонентной растительной композиции для получения полиэкстракта сухого,

- подтвердить наличие основных групп биологически активных веществ, разработать методики их количественного содержания в исходной растительной композиции,

- разработать способ получения полиэкстракта сухого и на его основе гранул,

- провести фотохимическое изучение полиэкстракта сухого и гранул, разработать показатели качества с целью их стандартизации,

- разработать методы сквозной стандартизации исходной композиции, полиэкстракта сухого и гранул;

- разработать нормативную документацию в виде проектов Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на полиэкстракт «Иммунополифит» сухой, гранулы «Иммунополифит», лабораторный регламент на производство полиэкстракта сухого и на гранулы

Научная новизна. Разработана оптимальная композиция, включающая восемь видов лекарственного растительного сырья, обладающая иммуномодулирующей активностью

В ходе исследования хлмического состава растительной композиции, учитывая закономерности выхода биологически активных веществ, зависящие от типа экстрагента, диаметра частиц сырья, кратности и продолжительности экстрагирования, разработаны оптимальные условия экстракции, обеспечивающие максимальный выход суммы экстрактивных веществ, которые легли в основу технологических схем получения полиэкстракта сухого, условно названного «Иммунополифит», и гранул на его основе

Избирательной экстракцией в сочетании с методами хроматографии в тонком слое и на бумаге, ВЭЖХ, ГЖХ установлено наличие веществ фенольной природы (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, фенилпропаноидов, дубильных веществ), полисахаридов, сапонинов,

аминокислот, каротиноидов, аскорбиновой и органических кислот в исходной композиции, полиэкстракте сухом и гранулах

Разработаны методики сквозной стандартизации лекарственных растительных средств, заключающиеся в использовании принципа унификации в ряду растительное сырье - субстанция - лекарственная форма по фенольным соединениям (сумме флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт и сумме фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту), установлены показатели качества, которые включены в нормативную документацию

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены

- Способ получения и технологическая схема производства полиэкстракта «Иммунополифит» сухого (Лабораторный технологический регламент),

- Состав и технология получения гранул «Иммунополифит» (Лабораторный технологический регламент),

- Разработаны методики стандартизации лекарственного средства (проект ФСП - полиэкстракт «Иммунополифит» сухой),

- Установлены показатели качества для гранул (проект ФСП -гранулы «Иммунополифит») Нормативные документы утверждены Ученым советом ИОЭБ СО РАН, протокол № 4 от 15 03 07 г

Полиэкстракт «Иммунополифит» сухой обладает иммуномодулирующей активностью (Заключение лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН от 19 04 06 г)

Апробация работы и публикации. Результаты исследований доложены и обсуждены на

- научно-практической конференции, посвященной 70 - летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии (Улан-Удэ, 2003), - VI симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004), -научно-практической конференции посвященной Фармацевтической службе Республики Бурятия - 80 лет (Улан-Удэ, 2004), - IV региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2005), -VIII Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2005), - II Международном симпозиуме по химии лекарственных растений (Улан-Батор, 2006), - Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006) По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ

Связь задач исследования с проблемным планом Научного совета по фармакологии и фармации. Настоящая работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ

Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины Фундаментальные основы и реализация» на 2003-2006 гг, утвержденной президиумом СО РАН На защиту выносятся:

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию возможности создания лекарственных средств на основе восьмикомпонентной растительной композиции,

разработанный способ получения лекарственных средств, обладающих иммуномодулирующей активностью,

- результаты исследований по разработке методик стандартизации и контроля качества полиэкстракта «Иммунополифит» сухого и гранул «Иммунополифит»

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, 3 глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения Работа иллюстрирована 36 таблицами, 31 рисунками Библиографический указатель включает 162 литературных источников, в том числе 18 на иностранных языках

Глава первая (обзор литературы) посвящена общим сведениям об иммунной системе, обсуждается проблема использования лекарственных растений в качестве иммуномодуляторов, отражены особенности разработки спектрофотометрической методики анализа БАВ в лекарственном растительном сырье

Глава вторая посвящена обоснованию подбора состава смеси лекарственных растений, выбора оптимального варианта соотношения компонентов композиции, разработке показателей контроля качества исходной композиции

В главе третьей изложены результаты разработки способа получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, его фотохимического изучения с использованием методов БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ и разработки методик стандартизации по фенольным соединениям

Глава четвертая включает исследования по разработке технологии получения гранул «Иммунополифит», методик стандартизации по фенольным соединениям, данные о показателях качества гранул и результаты по установлению срока годности

В приложении материалы нормативной документации, заключение о фармакологической активности средства и спектры компонентов липидной фракции полиэкстракта сухого

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выбор оптимального варианта композиции лекарственного растительного сырья и ее анализ

Обоснование подбора растительной композиции

Композиция лекарственных растений, включающая корни солодки голой и вздутоплодника сибирского, плоды шиповника и лимонника китайского, траву горца птичьего и пустырника сердечного, семена льна обыкновенного и цветков календулы лекарственной составлена на основе сведений о применении этих растений в народной, традиционной и научной медицине с учетом фармакологических свойств, химического состава, официнальности и состояния сырьевой базы ингредиентов

Выбор оптимального вариантараститечьной композиции Для определения оптимального соотношения компонентов, было изучено несколько вариантов композиции следующего состава (табл 1)

Таблица 1

Композиция из 8 видов Соотношение компонентов

сырья (8-КРК) композиции, г

I II III

Корень солодки 20 15 25

Семена льна 6 8 5

Плоды лимонника 11 12 10

Плоды шиповника 15 10 15

Трава горца птичьего 10 15 10

Цветки календулы 15 20 10

Корневище вздутоплодника 8 10 10

Трава пустырника 15 10 15

Содержание экстрактивных веществ определяли по методике ГФ XI, сумме флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт и сумме фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту по разработанными нами методикам (табл 2)

Таблица 2

Результаты анализа трех вариантов композиции

Объект исследования 8-КРК Содержание экстрактивных веществ в 100 г сбора, г Содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид-ст,% Содержание фенилпропаноидов в пересчете на кофейную к-ту, %

I вариант 25,05 0,48 0,76

II вариант 24,17 0,39 0,53

III вариант 26,78 0,63 0,93

Данные результатов анализа и фармакологический скрининг показал, что сухой экстракт III варианта 8-КРК, обладает наиболее выраженной иммуномодулирующей активностью Таким образом, для дальнейшего исследования был выбран III вариант 8-КРК

Проведен товароведческий анализ на трех сериях исходной композиции Определены числовые показатели экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 25 % (26,12±1,10), суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид не менее 0,5 % (0,69±0,03), суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту не менее 0,5 % (0,89±0,02), влажность - не более 10 % (6,94±0,11), золы общей не более 7 % (6,12±0,11), золы нерастворимой в 10 % HCl - не более 2 % (1,34±0,03), органической примеси - не более 1,5 % (1,10±0,031), минеральной примеси - не более 1 % (0,60±0,01)

Наличие в составе композиции соединений фенольной природы (флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот), полисахаридов, аминокислот, сапонинов установлено общепринятыми качественными реакциями с водными и спирто-водными извлечениями из 8-КРК. Используя метод двухмерной хроматографии на бумаге марки FN-12, FN-16 в системах растворителей 1. 15 % СН3СООН и 2 БУВ (4 1 2) флавоноидные соединения обнаруживали по их собственной флуоресценции в УФ-свете (зоны адсорбции от бледно- желтого до коричневого цвета) После проявления 3 % спиртовым раствором хлорида алюминия флуоресценция зон усиливалась и приобретала ярко-желтый и желтовато-зеленый цвета В УФ-свете зоны адсорбции фенолкарбоновых кислот имеют голубую и фиолетовую флуоресценцию После обработки парами аммиака окраска зоны адсорбции кофейной -ярко-голубая, галловой - темновато-фиолетовая При этом обнаружено 26 зон, из них 15 отнесено к веществам флавоноидного характера, 5 - к фенолкарбоновым кислотам,' еще 6 - к сапонинам и кумаринам По значениям Rf и окраске пятен на хроматограмме со свидетелями идентифицированы гиперозид Rf~0,34 (система 1), Rf~0,59 система (2), рутин Rf~0,48 (1), Rf~0,51 (2), лютеолин Rf~0,08 (1), Rf~0,81 (2), мирицетин Rf~0,05 (1), Rf~0,65 (2), галловая Rf~0,44 (1), Rf~0,79 (2) и кофейная Rf~0,27 (1), Rf~0,75 (2) кислоты

Разработка методик количественного содержания биологически активных веществ в композиции Стандартизацию 8-КРК по содержанию действующих веществ проводили по сумме флавоноидов в пересчете на гиперозид и сумме фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту В основу разработанной методики определения флавоноидов положен метод дифференциальной спектрофотометрии после реакции

комплексообразования со спиртовым раствором алюминия хлорида (рис 1) Среди производных гидроксикоричных кислот

(фенилпропаноиды) в растительной композиции доминирующим компонентом является кофейная кислота При разработке методики нами изучены оптимальные условия экстракции и возможность использования прямой спектрофотометрии без предварительной очистки суммы фенилпропаноидов, максимумы поглощения растворов кофейной кислоты и суммы фенилпропаноидов 8-КРК совпадают (рис 2) Дифференциальные спектры поглощения 8-КРК и ГСО гиперозида

# Name Peaks(nm) Abs(AU)

1 giperozid +A1C13 415 0 0 67455

2 8-КРК +A1C13 412 0 0 28992

Рис 1

УФ-спектры растворов 8-КРК и кофейной кислоты

0 7- N ,

_358_355_4Ш___И8_эддеиыЫш

# Name Peaks(nm) Abs(AU)

1 kofeinst 323 0 0 63073

2 8-КРК 323 0 0 53259

Рис 2

Для проверки воспроизводимости методик проведено 7 определений содержания суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в одной серии растительной композиции (табл 3)

Таблица 3

Метрологические характеристики методик определения суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в 8-КРК (f=6, Р=95%, t(P,f)=2,45)

Содержание X S2 S Дх Е, %

Флавоноиды 0,69 1,60 10"4 1,26 10"2 3,10 10"2 ±4,49

Фенилпроп-ды 0,89 1,16 Ю-4 1,08 10'2 2,63 10'2 ±2,96

Относительная ошибка единичного определения не превышает ± 4,49 % и ± 2,96 % соответственно

Количественное содержание свободных аминокислот в 8-КРК рассчитано по стандартному образцу аланина, оптическую плотность раствора которого измеряли параллельно с раствором исследуемого образца (рис 3, табл 4) Выбор аминокислоты в качестве стандартного образца обусловлен тем, что по данным ТСХ и (ВЭЖХ-полиэкстракта), аланин содержится в виде свободной формы в большем количестве Спектры поглощения продуктов реакции взаимодействия растворов аланина-стандарта и 8-КРК с нингидрином

04-

э 0 350 3- /

8 0 25 / -

■е 1 02 0 15

1- " г

-

500 520 540 560 5В0 600 _ 620 'бДО 660 Wavelength ¡м,

# Name Peaks(nm) Abs(AU)

1 alanin-st 569 0 0 44240

2 8-КРК , 566 0 0 33829

Рис 3

Таблица 4

Метрологические характеристики методики определения аминокислот в 8-КРК в пересчете на аланин-стандарт

f X SJ S P t(P,f) Дх E, %

6 1,87 5,96 10"4 2,44 10"2 95 2,45 5,98 10"2 ±3,20

Относительная ошибка определения свободных аминокислот составляет ± 3,20 % с 95 % вероятностью

Количественную оценку содержания аскорбиновой кислоты в водном извлечении проводили спетрофотометрическим методом после

проведения реакции с натриевой солью фосфорномолибдата (рис 4, табл 5)

Спектры поглощения продуктов реакции взаимодействия растворов кислоты аскорбиновой и 8-КРК с фосфорномолибденовым

комплексом

# Мате РеаКэСпт) АЬз(Аи)

1 авсогЬ Ыа 825 0 0 43883

2 8-КРК 820 0 0 35194

Рис 4

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного определения аскорбиновой кислоты в композиции

Г X Б Б Р «Р,0 Дх Е,%

6 1,04 1,02 10"4 1,01 10"3 95 2,45 2,47 10"2 ±2,38

Относительная ошибка методики составляет не более ± 2,38 %

Для количественного определения дубильных веществ использовали комплексометрический метод титрования, основанный на осаждении дубильных веществ аммиачным раствором окиси цинка, выделении осадка центрифугированием, разрушении комплекса цинк-дубильные вещества уксусной кислотой и титровании катионов цинка раствором трилона Б в присутствии индикатора ксиленолового оранжевого

Для количественного определения полисахаридов (ПС) использовали комбинированный метод спектрофотометрии, основанный на измерении оптической плотности продуктов взаимодействия моносахаридов, образовавшихся после гидролиза ПС, с кислотой пикриновой в щелочной среде В качестве стандартного образца использовали субстанцию глюкозы

Определение содержания свободных органических кислот проводили по методике ГФ XI, ст 38 Нами использован метод алкалиметрического титрования, индикатором служила смесь метиленового синего и фенолфталеина Для улучшения перехода окраски в растворе, количества обоих индикаторов уменьшены в 10 раз

Количественное содержание сапонинов определяли методом спектрофотометрии по удельному показателю поглощения кислоты глицирризиновой при длине волны 258 нм, который равен 133,8. Полученные данные отражены в таблице 6

Таблица 6

Дубильные вещества Полисахариды (восст моносах) Сапонины Органические кислоты

2,52 ± 0,07 4,11 ±0,16 2,52± 0,05 5,34 ± 0,28

Разработка способа получения и методик стандартизации лекарственного средства «Иммунополифит» В результате изучения факторов, влияющих на процесс экстрагирования, предложена ресурсосберегающая технология, обеспечивающая максимальный выход БАВ из сырья Метод заключается в комплексной технологии переработки и состоит в том, что растительную композицию экстрагируют последовательно спиртом 80 % и спиртом 60 % двухкратно по часу каждой экстракции, затем шрот экстрагируют водой очищенной однократно, тем самым обеспечивая полное истощение сырья На основании оптимального режима экстрагирования разработана технологическая схема, которая положена в основу лабораторного регламента на получение полиэкстракта сухого (рис 5)

Фитохимическое исследование полиэкстракта сухого При фотохимическом исследовании полиэкстракта сухого было установлено наличие основных групп биологически активных веществ, содержащихся в исходной композиции флавоноиды, фенолкарбоновые и гидроксикоричные кислоты, дубильные вещества, полисахариды, аминокислоты, высшие жирные кислоты, сапонины, аскорбиновая и органические кислоты Методом ВЭЖХ подтверждено наличие флавоноидов гиперозида, рутина, лютеолина, мирицетина (табл 7), фенолкарбоновых кислот галловой, коричной, кофейной в полиэкстракте сухом (табл 8)

Таблица 7

Время удерживания и спектральные отношения флавоноидных гликозидов и их агликонов на хроматограмме полиэкстракта

№ п/п Соединение 1к, мин К — §ззо/8зчо

1 Гиперозид 9,30±0,09 1,63±0,09

2 Рутин 9,52±0,10 0,82±0,05

3 Мирицетин 11,34±0,11 0,98±0,05

4 Лютеолин 15,22±0,15 0,85±0,05

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ПОЛИЭКСТРАКТА СУХОГО

Спирт 1

Вода 1

ТП 2 1 1риготовление спирта 80 % и экстрагирование измельченной 8-КРК

|ТП 2 2 * Слив и фильтрация 1 и 2 экстракта

1 I ТП (Приготовление спирта 60 % 1 2 3| и экстрагирование шрота —

ТП 24 Г Слив и фильтрация 3 и 4 экстракта

|ТП 25 Экстрагирование шрота водой очищенной

i ТП |Слив и фильтрация 2 6 5-экстракта (водного)

ТП 3 1 Г Концентрирование спирто-водных экстрактов

ТП 32 1 Объединение кубовых остатков с 5 экстрактом

ТП 33 Концентрирование объединенных водных экстрактов

1 ТП (Очистка водного 3 4 .экстракта Сепарированием

ТП 3 1 Доупарка очищенного водного экстракта --

1 1 ТП|Сушка | 3 б| очищенного экстракта

ГП 1 Измельчение

1 растительного

сырья

потери

■ Ы 2

потери I

Экстрагирование восьмикомпонентной растительной композиции (8-КРК)

1------

Шрот в отвал

Отгон спирта на ТП 2 1

А.

-чПз! Получение I готового _^продукта

Осадок б в — в отвал

|УМО 1

I

Фасовка и упаковка полиэкстракта сухого

на склад

потери

Рис 5

Таблица 8

Время удерживания и спектральные отношения фенолкарбоновых кислот на хроматограмме стандартной смеси и полиэкстракта

Кислота Время удерживания, Спектральные отношения

мин А272/А300

галловая 2,25, 2,25* 0,38, 0,34*

кофейная 7,82, 7,90* 3,16, 2,93*

коричная 18,15, 18,20* 0,46, 0,51*

- значения, соответствующие пикам в образце полиэкстракта Содержание галловой, кофейной, коричной кислот установлено их наличие в полиэкстракте в количестве 18,5, 13,8, и 3,6 мкг/мл, соответственно

Исследованный методом ГЖХ образец полиэкстракта сухого содержит широкий набор жирных кислот, включающий кислоты с длиной цепью от С14 до СЗО (табл 9)

Таблица 9

Времена удерживания и соотношения жирных кислот

Время удерживания, мин Длина цепи, (количество двойных связей) Доля

6,83 С14 (0) 1,9%

9,01 С15 (0) 0,5 %

11,11 С16(1) 1,0%

11,74 С16 (0) 25,8 %

14,82 С17 (0) 0,5 %

16,54 1-С18 (2) 0,7 %

17,12 С18 (2) 25,7 %

17,35 С18 (1) 24,8 %

17,50 1-CI8 (1) 1,2 %

18,24 С18 (0) 5,7 %

21,83 С19 (0) 0,1 %

24,48 С20 (1) 0,4 %

25,52 С20 (0) 1,0%

29,23 С21 (0) 0,2 %

32,90 С22 (0) 1,1 %

36,50 С23 (0) 0,4 %

40,03 С24 (0) 0,9 %

43,44 С25 (0) 0,1 %

46,78 С26 (0) 0,3 %

53,16 С28 (0) 0,1 %

59,18 СЗО (0) 0,1 %

Характерное для высших растений распределение жирных кислот с преобладанием четноцепочных соединений Пальмитиновая, олеиновая, линолевая кислоты составляют 77 % всех кислот образца Моно- и диеновые кислоты представлены главным образом кислотами с С18 В то время как все остальные кислоты в подавляющем большинстве присутствуют в виде насыщенных структур

При анализе аминокислотного состава полиэкстракта сухого выявлено наличие большого набора свободных и связанных аминокислот, идентифицировано 21 аминокислот, среди которых обнаружено 10 незаменимых аминокислот (табл. 10, 11)

Таблица 10

№ Аминокислота нМ/мг № Аминокислота нМ/мг

1 2 3 1 2 3

1 Треонин' 0,88 12 Метионин" 2,82

2 Серин 5,20 13 Изолейцин" 2,04

3 Аспаргин 42,93 14 Лейцин" 0,81

4 Глютаминовая к-та 5,15 15 Фенилаланин * 2,23

5 Глютамин 3,66 16 у-аминомаслянная 3,19

6 Пролин 84,33 17 Этаноламин 0,78

7 Глицин 2,41 18 Орнитин 0,15

8 Алании 6,39 19 Лизин" 0,73

9 Цитруллин 0,09 20 Гистидин * 1,06

10 а-аминомаслянцая 3,38 21 Аргинин" 7,33

11 В алии * 3,43 22 Фосфоэтаноламин 10,93

* - не заменимые аминоки Связанные а слоты миноки 23 слоть Аспарагиновая к-та 1 полиэкстракта сух 0,82 'аблица ого

* № Аминокислота нМ/мг № Аминокислота нМ/м г

1 2 3 1 2 3

1 Лизин 6,14 9 Глицин 15,97

2 Гистидин' 6,74 10 Алании 16,39

3 Аргинин" 38,64 11 Валин 20,94

4 Аспарагиновая 117,98 12 Метионин" 1,92

5 Треонин" 10,79 13 Изолейцин * 5,96

6 Серин 16,17 14 Лейцин * 5,49

7 Глутаминовая 51,07 15 Тирозин 2,50

8 Пролин 99,25 16 Фенилаланин * 30,90

Определение содержания основных биологически активных веществ в полиэкстракте сухом Методики количественного определения основных групп БАВ, разработанные нами для анализа исходной композиции, были положены в основу разработки методик для БАВ полиэкстракта сухого (рис 6, 7)

При разработке методик анализа БАВ полиэкстакта сухого определяли растворитель, навески, соотношение полиэкстракта к экстрагенту, а также аликвоту для разведения анализируемого полиэкстракта, чтобы оптическая плотность испытуемого раствора находилась при оптимальном значении в пределах 0,2 - 0,6 нм

Спектры поглощения продуктов реакции взаимодействия растворов аланина-стандарта и полиэкстракта сухого с нингидрином

ч

0 4-р>, Ч

0 354 / / \

<с. 034 / \

3 0 25-3 /

■е й < 0 2-] 0 15-1/ 01-3 0 05-3 / N Щ V

500 520 540 560 580 еОО 620 640 660 VAvelena*ti (nf

# Name Peaks(nm) Abs(AU)

1 alanin-std 569 0 0 44240

2 polyextract 560 0 0 44169

Рис 6

Таблица 12

Метрологические характеристики методики количественного определения свободных аминокислот в полиэкстракте сухом

f X S1 S P t(P,f) Дх E, %

6 5,02 4,06 10"J 6,37 10"2 95 2,45 1,56 10' ±3,11

Спектры поглощения продуктов реакции взаимодействия растворов кислоты аскорбиновой и полиэкстракта сухого с фосфорномолибденовым комплексом

# Name Peaks(nm) Abs(AU)

1 ascorb kislota 825 0 0 43883

2 polyextract 820 0 0 44102

Рис 7

Таблица 13

Метрологические характеристики методики количественного определения аскорбиновой кислоты в полиэкстракте сухом

f X S1 S Р t(P,f) Дх Е,%

6 4,55 1,75 103 4,18 10"2 95 2,45 1,03 10"' ±2,25

Таблица 14

Количественное содержание биологически активных веществ в полиэкстракте «Иммунополифит» сухом, %

Дубильные вещества Полисахариды Сапонины Органические Кислоты

9,65 ± 0,35 8,12 ±0,26 8,05 ±0,16 17,11 ±0,88

Относительная ошибка единичного определения разработанных методик с 95 % вероятностью не превышают ± 5 %

Для более полной характеристики химического состава был изучен минеральный комплекс полиэкстракта сухого Дефицит макро- и микроэлементов формирует факторы риска многих хронических заболеваний, снижает функциональную активность иммунной системы Биотические дозы любых микроэлементов, стимулирующе влияя на все функции организма, усиливают и иммунные механизмы защиты

Определение его проводили методом атомно-абсорбционной пламенной спектрометрии с атомизацией пробы в воздушно-ацетиленовом пламени (табл 15)

Таблица 15

Содержание основных макро- и микроэлементов _ в полиэкстракте сухом, %_

Элемент Полнэкстракт Элемент Полиэкстракт

N310'6 257500 Мп 10"6 2003

К 10'" 2531250 Ре 10"6 6493

Са 10"6 172748 Со 10'6 112

Си 10'6 1668 Сг 10"6 187

1п 10"6 3165 N1 10"6 418

са ю-6 1898 Мв 106 641750

РЬ 10"6 92 81 10"6 1003

Стандартизация полиэкстракта «Иммунополифит» сухого Учитывая химический состав и способ получения сухого полиэкстракта стандартизацию проводили по содержанию фенольных соединений Для определения полиэкстракта «Имммунополифит» сухого разработана качественная реакция на флавоноидные соединения и методом ТСХ разработана подлинность пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ-254»), система растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4 12) для флавоноидов, хлороформ-этилацетат-муравьиная кислота (5 4'1) для фенолкарбоновых кислот

В основу разработанной методики определения суммы флавоноидов (в пересчете на гиперозид) положен метод дифференциальной спектрофотометрии (рис 8) Методом прямой спектрофотометр™ разработана методика определения суммы фенилпропаноидов (в пересчете на кофейную кислоту) (рис 9)

Дифференциальные спектры поглощения полиэкстракта сухого и ГСО гиперозида

# Мате

1 glperozld +А1С13

2 ро1уех!гас1 +А1С13

Реак5(пт) АЬз(Аи) 415 0 0 67455 411 0 0 34622

Рис 8

УФ-спектры растворов полиэкстракта сухого и кофейной кислоты

# Name Peaks(nm) Abs(AU)

1 Kofein st 323 0 0 63073

2 polyextract 320 0 0 40868

Рис 9

Таблица 16

Метрологические характеристики методик определения суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в полиэкстракте сухом в пересчете на гиперозид и кофейную кислоту (f=6, Р=95%, t(P,f)=2,45)

Содержание X S S Дх Е, %

флавоноиды 2,14 1,13 10'3 3,36 10"2 8,24 10"2 ±3,85

фенилпроп-ды 4,16 2,24 103 4,74 10'2 1,16 10'1 ±2,79

Ошибка единичного определения с 95 % вероятностью не превышает ± 4 % и ± 3 % соответственно

Разработанные показатели качества для полиэкстракта сухого описание внешнего вида, подлинность, потеря в массе при высушивании, количественное содержание действующих веществ включены в проект ФСП Установлен предварительный срок годности полиэкстракта сухого - 2 года

Разработка технологии получения гранул «Иммунополифит»

Для улучшения сыпучести, уменьшения гигроскопичности, лучшего дозирования и учитывая фармакологические свойства полиэкстракта сухого, была разработана гранулированная лекарственная форма

Гранулы должны иметь следующий состав в расчете на одну дозу Полиэкстракт «Иммунополифит» сухой (ФСП 42- ) -0,15 г Лактозы (ОСТ 4963-85, Фармакопейный ГФ X, ст 589) - 0,65 г Сахар-рафинад (ГОСТ 22-94, ФС 42-77-72) - 0,45 г

Крахмал картофельный (ГОСТ 7699-78, высший сорт)

Технологическая схема получения гранул состоит из следующих операций просеивание, смешивание компонентов, влажное гранулирование, сушка гранул, сухое гранулирование Выбор вспомогательных веществ при разработке гранул проводили с учетом контроля качества лекарственной формы (точность дозирования, распадаемость), которые позволяют получить гранулы, соответствующие требованиям ГФ XI, вып 2 Выбор наполнителей проводили на основании получения удовлетворительных характеристик гранулятов Введение молочного сахара в состав гранул целесообразно в связи с тем, что лекарственное вещество гигроскопично, крахмал картофельный в виде 3 % раствора, как увлажнитель и разрыхлитель, сахар-рафинад в качестве корригирующего вещества и частично как наполнитель для придания твердости гранулам

В основу стандартизации гранул по содержанию фенольных соединений положена методика определения суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в исходной композиции и сухом полиэкстракте Метод основан на спектрофотометрическом определении суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт и фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту (рис 10,11)

Дифференциальные спектры поглощения гранул и ГСО гиперозида

# Ште

1 Огапи1ае+А1С13

2 вфегог^-вг + А1С13

Реак^пт) АЬз(А11) 411 0 0 42102 415 0 0 67455

Рис 10

УФ-спектры растворов гранул и кофейной кислоты

0 80 7080 50 40 3-

ог^

он о-

__450 Л'ЗУ'^ПЦ'Н :пп

# Ыате

1 §гапи1ае

2 кс&т к

Реакз(пт) АЬз(А11)

322 0 0 60377

323 0 0 63073

Рис 11

Для стандартизации гранул «Иммунополифит» разработаны следующие показатели качества описание внешнего вида, потеря в массе при высушивании, определение распадаемости Эти показатели включены в проект ФСП на гранулы иммунополифита Исследования по установлению срока годности гранул проводились в естественных условиях Установлен первоначальный срок годности 2 года

Выводы

1 На основании данных о применении лекарственных растений в народной, традиционной и научной медицине, обзора литературы о химическом составе, с учетом сырьевой базы, фармакологического скрининга разработан состав композиции лекарственного растительного сырья, состоящий из корня солодки голой, семян льна обыкновенного, плодов лимонника китайского, плодов шиповника, травы горца птичьего, цветков ноготков лекарственных, корня вздутоплодника сибирского, травы пустырника сердечного, являющегося основой для получения иммуномодулирующего средства

2 Проведен товароведческий анализ исходной композиции, установлены числовые показатели С использованием хроматографических методов и химического анализа изучен качественный состав БАВ исходной композиции Установлено наличие флавоноидов, фенилпропаноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, полисахаридов, сапонинов, аминокислот, аскорбиновой и органических кислот

3. Изучены факторы, влияющие на процесс экстрагирования лекарственного растительного сырья, разработана ресурсосберегающая технология, заключающаяся в последовательной экстракции исходной композиции спиртом 80 %, спиртом 60 % - двухкратно и водой очищенной - однократно по 60 мин каждой экстракции, при оптимальном соотношении сырье-экстрагент - 1 10, коэффициента водопоглощения 1 2 Разработан лабораторный регламент на производство иммуномодулирующего средства - полиэкстракта «Иммунополифит» сухого

4 Исследован качественный состав полиэкстракта сухого методом БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ, идентифицированы флавоноиды (лютеолин, гиперозид, рутин, мирицетин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, коричная, кофейная), высшие жирные кислоты, аминокислоты, полисахариды, аскорбиновая и органические кислоты (яблочная, лимонная)

5 На основании экспериментальных данных разработаны методики сквозной стандартизации исходной композиции -полиэкстракта сухого - гранул по фенольным соединениям методами дифференциальной и прямой спектрофотометрии Относительная ошибка методик количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид не превышает ± 5 %, суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту - ± 3 %

6 Разработана схема получения гранул на основе полиэкстракта сухого и составлен лабораторный регламент на производство гранул

7 Разработаны показатели качества для полиэкстракта «Иммунополифит» сухого и гранул «Иммунополифит», которые включены в проекты Фармакопейных статей предприятия (ФСП) и установлен для них срок годности - 2 года

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Нагаслаева О В, Николаева Г Г Лекарственные растения и перспективы получения из них препаратов с иммуномодулирующим действием //Материалы научно-практической конференции посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии - Улан-Удэ, 2003 - С 79-80

2 Нагаслаева О В , Хобракова В Б , Николаева И Г Пути поиска лекарственных растений с иммуномодулирующими свойствами //Вестник Бурятского университета Серия 11 Медицина - Вып 3 - Улан-Удэ Изд-во Бурятского госуниверситета, 2003 - С 179-188

3 Нагаслаева О В, Николаева Г Г Разработка методики количественного определения флавоноидов в многокомпонентном сборе //Тез докл VI Симпозиум по фенольным соединениям - Москва, 2004 - С 124

4 Нагаслаева OB Фитохимическое изучение сухого полиэкстракта //Материалы четвертой региональной межвузовской конференции - Чита, 2005 - С 152-153

5 Нагаслаева О В, Николаева Г Г Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в иммуномодулирующем сборе //Байкальские Чтения - 2 Разгрузочно-диетическая терапия и традиционная медицина - Санкт-Петербург, 2005 - С 154-158

6 Нагаслаева О В, Николаева Г Г Обоснование выбора вспомогательных веществ при разработке лекарственной формы иммуномодулирующего действия //Monos - 15 Integrated system of traditional and modern medicines - Улан-Батор, 2005 - С 70-71

7 Нагаслаева О В , Ширеторова В Г, Николаева Г Г Элементный состав полиэкстракта сухого на основе сбора иммуномодулирующего //Экология и жизнь сборник статей VIII Международной научно-практической конференции -Пенза, 2005 - С 95-97

8 Нагаслаева О В,, Николаева Г Г Химическое изучение иммуномодулирующего сбора //Сборник научных трудов Серия Химия и биологическая эффективность природных соединений - Улан-Удэ Изд-во ВСГТУ, 2006-Вып 10-С 50-53

9 Нагаслаева О В , Хобракова В Б Иммуномодулирующие свойства 8-компонентной растительной композиции //Сборник научных трудов Серия Химия и биологическая эффективность природных соединений - Улан-Удэ Изд-во ВСГТУ, 2006 - Вып 10 - С 62-65

10 Nagaslaeva О V, Hobrakova V В , Nikolaeva G G Development of New Medical Products on a Basis of Biologically Active Substances of Gathering Immunomodylating //The second International Symposium of chemistry of herbal medicine and mongolian drugs - Ulaanbaatar, Mongolia, 2006 - P 98

11 Хобракова В Б , Нагаслаева О В Иммуномодулирующие свойства сухого экстракта «Иммунополифит» //Сибирский медицинский журнал № 5 - Т 63 - Иркутск, 2006 - С 72-74

12 Нагаслаева ОВ, Николаева ГГ, Нагаслаева Л А Иммуномодулирующее средство природного происхождения //Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии Тезисы Всероссийской конференции с международным участием - Улан-Удэ, 2006 - Т 2 - С 100-101

Подписано в печать 19 04 2007 г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Объем 1,5 печ л Тираж 100 Заказ №24

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г Улан-Удэ, ул Сахьяновой, 6

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В последние годы наблюдается значительное снижение показателей здоровья и рост заболеваемости населения вследствие ряда объективных причин, среди которых важное значение имеют ухудшение экологической обстановки, огромная информационная и нервно-эмоциональная нагрузка, снижение социальной защищенности широких слоев населения и многие другие факторы. Люди с пониженной активностью иммунной системы входят в группу риска по состоянию здоровья, отмечается снижение естественной резистентности и иммунологической реактивности организма, связанное с ослаблением иммунных, детоксикационных и других адаптационно-приспособительных механизмов [54,77].

В настоящее время нет никаких сомнений в том, что нарушения иммунной системы играют важную роль в хронизации заболеваний, развитии осложнений. В связи с продолжающимися в последние десятилетия ростом распространенности и тяжести иммунодефицитных состояний проблема заболеваний, обусловленных нарушениями в системе иммунитета переросла в медико-социальную проблему. В этих условиях поиск и разработка новых иммуномодулирующих средств приобретает особую актуальность, в особенности, для профилактики заболеваний лицам с ослабленным здоровьем и перенесшим тяжелые заболевания, пожилым и престарелым, населению, проживающему в регионах с неблагоприятными климато-географическими условиями, а также широким слоям населения с целью повышения сопротивляемости организма, предупреждения утомления при физических и умственных нагрузках и для повышения работоспособности.

В последнее время во всем мире значительно повысился интерес к лекарственным растениям [93,112]. По своей химической природе растительные средства близки организму человека. Они не воспринимаются как чужеродные и, в отличие от синтетических препаратов, не отторгаются защитными системами организма. В ходе длительной эволюции человек приспособился к их усвоению, они легче включаются в биохимические процессы, обладают хорошей переносимостью, отсутствием отрицательных реакций при длительном использовании. Растительные препараты, содержащие комплекс биологически активных веществ (БАВ), оказывают фармакотерапевтическое действие на обменные процессы в организме, функции сердечно-сосудистой, центральной нервной системы, желудочно-кишечный тракт и другие органы.

Практический интерес представляют сборы более популярные и доступные для населения России [81].

В настоящее время исследования по переводу многокомпонентных смесей лекарственных растений, которые используются в виде настоев и отваров, в суммарные препараты - экстракты [140] являются актуальным. При получении экстрактов-концентратов обеспечивается максимальный выход биологически активных веществ, что повышает фармакотерапевтический эффект. К преимуществам сухих экстрактов и лекарственных форм на его основе относятся удобство для применения и стойкость при хранении [4]. Кроме того, стандартизация по действующим веществам позволяет осуществлять контроль на стадиях производства и точность дозирования готового продукта, поэтому стандартизация сухих экстрактов и лекарственной формы является не менее важной задачей [6,39,117].

Исходя из вышеизложенного можно заключить, что разработка иммуномодулирующих средств из растительного сырья является своевременной и актуальной.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящих исследований является разработка и стандартизация новых лекарственных средств на основе многокомпонентной растительной композиции в виде полиэкстракта сухого и гранул, обладающих иммуномодулирующей активностью.

Для этого необходимо было решить следующие основные задачи: - обосновать и разработать состав многокомпонентной растительной композиции для получения полиэкстракта сухого;

- подтвердить наличие основных групп биологически активных веществ, разработать методики их количественного определения в исходной растительной композиции;

- разработать способ получения полиэкстракта сухого и гранул;

- провести фитохимическое изучение полиэкстракта сухого и гранул, разработать показатели качества с целью их стандартизации;

- разработать методики сквозной стандартизации исходной композиции, полиэкстракта сухого и гранул; разработать нормативную документацию в виде проектов Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на полиэкстракт

Иммунополифит» сухой, гранулы «Иммунополифит», лабораторный регламент на производство полиэкстракта сухого и на гранулы. ъ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработан и обоснован оптимальный вариант композиции, включающей восемь видов лекарственного растительного сырья, обеспечивающей иммуномодулирующую активность. w и

С учетом химического состава исходной растительной композиции разработаны параметры экстракции биологически активных веществ из сырья и подобраны оптимальные условия, обеспечивающие максимальный выход суммы экстрактивных и действующих веществ, что положено в основу технологических схем получения полиэкстракта сухого, условно названного «Иммунополифит», и гранул.

Избирательной экстракцией в сочетании с методами хроматографии в тонком слое и на бумаге, ВЭЖХ, ГЖХ установлено наличие веществ фенольной природы (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, фенилпропаноидов, дубильных веществ), полисахаридов, сапонинов, аминокислот, каротиноидов, аскорбиновой и органических кислот в исходной композиии, полиэкстракте сухом и гранулах.

Изучен состав липидной фракции полиэкстракта сухого, в результате идентифицированы более 40 индивидуальных соединений; обнаружено 14 макро- и микроэлементов в полиэкстракте сухом.

Разработаны методики сквозной стандартизации лекарственных растительных средств, заключающиеся в использовании принципа унификации в ряду: растительное сырье - субстанция - лекарственная форма по фенольным соединениям (сумме флавоноидов в пересчете на гиперозид-стандарт и сумме фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту) методами дифференциальной и прямой спектрофотометрии; установлены показатели качества, которые включены в проекты нормативной документации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании проведенных исследований разработаны:

- способ получения и технологическая схема производства полиэкстракта сухого (Лабораторный регламент на производство полиэкстракта «Иммунополифит» сухого. ЛР 64- № 15-53015183-07);

- состав и технология получения гранул (Лабораторный регламент на производство гранул «Иммунополифит». ЛР 64- № 16-53015183-07);

- методики стандартизации лекарственного средства (проект ФСП 42-полиэкстракт «Иммунополифит» сухой);

- показатели качества для гранул (проект ФСП 42- гранулы «Иммунополифит» 0,15 г). Проекты нормативных документов утверждены Ученым советом ИОЭБ СО РАН, протокол № 4 от 15.03.07 г.

- Полиэкстракт «Иммунополифит» сухой обладает иммуномодулирующей активностью (Заключение лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН от 19.04.06 г).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ и ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследований доложены и обсуждены на:

- научно-практической конференции, посвященной 70 - летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии (Улан-Удэ, 2003);

- VI симпозиуме по феиольным соединениям (Москва, 2004); - научно-практической конференции, посвященной Фармацевтической службе Республики Бурятия - 80 лет (Улан-Удэ, 2004); - IV региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2005); - VIII Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2005); - II Международном симпозиуме по химии лекарственных растений (Улан-Батор, 2006); - Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).

По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ с ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ НАУЧНОГО СОВЕТА по ФАРМАКОЛОГИИ и ФАРМАЦИИ. Настоящая работа выполнена в Отделе биологически активных веществ в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме: № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация» на 2003-2006 гг, утвержденной президиумом СО РАН.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию оптимального варианта восьмикомпонентной растительной композиции;

- разработанный способ получения лекарственных средств, обладающих иммуномодулирующей активностью;

- результаты исследований по разработке методик стандартизации и контроля качества полиэкстракта «Иммунополифит» сухого и гранул «Иммунополифит».

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании данных о применении лекарственных растений в народной, традиционной и научной медицине, обзора литературы о химическом составе, с учетом сырьевой базы, фармакологического скрининга обоснована и разработана оптимальная композиция из восьми видов лекарственного растительного сырья, являющаяся основой для получения иммуномодулирующих средств.

2. Разработана ресурсосберегающая технология, заключающаяся в последовательной экстракции исходной композиции: спиртом 80 %, 60 % -двухкратно и водой очищенной - однократно по 60 мин каждой экстракции. Разработан лабораторный регламент на производство полиэкстракта «Иммунополифит» сухого (лекарственное средство).

3. С использованием хроматографических методов БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ и химических реакций, установлено наличие: флавоноидов, фенолкарбоновых и гидроксикоричных кислот, дубильных веществ, полисахаридов, сапонинов, аминокислот, каротиноидов, аскорбиновой и органических кислот в исходной композиции, полиэкстракте сухом и гранулах. Изучен фенольный состав и липидная фракция полиэкстракта сухого, идентифицированы: лютеолин, гиперозид, рутин, мирицетин, галловая, коричная, кофейная, аскорбиновая, лимонная, яблочная кислоты, аланин, (3-каротин.

4. Разработаны методики сквозной стандартизации исходной композиции - полиэкстракта сухого - гранул по фенольным соединениям методами дифференциальной и прямой спектрофотометрии. Относительная ошибка методик определения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид составляет ± 5 %; суммы фенилпропаноидов в пересчете на кофейную кислоту - ± 3 %.

5. Разработана схема получения гранул «Иммунополифит» и составлен лабораторный регламент на производство гранул.

6. Разработаны показатели качества для полиэкстракта «Иммунополифит» сухого и гранул «Иммунополифит», которые включены в проекты Фармакопейных статей предприятия (ФСП) и установлен для них срок годности - 2 года.