Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Сравнительное фармакогностическое изучение грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной



МАЗЕПИНА ЛАРИСА СЕРГЕЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГРУШАНКИ КРУГЛОЛИСТНОЙ, ЗИМОЛЮБКИ ЗОНТИЧНОЙ И ТОЛОКНЯНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 7 ЯНЭ 2011

Москва - 2010

4843387

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Фурса Николай Сергеевич

Яковлев Геннадий Павлович

доктор фармацевтических наук,

профессор Сорокина Алла Анатольевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « ¿Л-» фё&СиЩ 2011 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития РФ» по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан «с&2> » 201 $.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09,

доктор фармацевтических наук, ( ^ ^ Наталья Петровна Садчикова профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В условиях современной жизни не избежать развития различных заболеваний, в том числе урологических, доля которых составляет 10 - 12 % в общей структуре заболеваемости населения России (Урология, 2009). Неосложнснные инфекции мочевыводящих путей - одни из самых частых заболеваний женщин репродуктивного возраста. По статистике в нашей стране регистрируется 26 - 36 млн. случаев острого цистита в год. Такая высокая заболеваемость свидетельствует об актуальности и необходимости поиска безопасных, эффективных, не оказывающих побочных эффектов лекарств, к которым, прежде всего, относятся фитотерапевтические средства.

В этом аспекте заслуживает внимания изучение отдельных представителей семейства вересковые (Ericaceae Juss.), в частности грушанки круглолистной (Pyrola rotundifolia L.) и зимолюбки зонтичной (Chimaphila umbellata (L.) W. Barton), сходных с таким классическим лекарственным растением, издавна применяемым для лечения урологических заболеваний, как толокнянка обыкновенная (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.), относящаяся к тому же семейству. В сравнении с ней они обладают определенными преимуществами. Так, установлено, что грушанка обладает более выраженным противовоспалительным действием и проявляет терапевтическую эффективность при экспериментальном гломерулонеф-рите (Т.Н. Пензина, 1999). Для зимолюбки характерна противогрибковая активность (J.J. Galvan et al., 2007). В то же время в сравнении с толокнянкой в химическом отношении грушанка и зимолюбка исследованы недостаточно.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось сравнительное фармакогностическое изучение грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной для обоснования возможности использования дополнительных источников растительного сырья в медицинской практике.

Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи: - изучить данные литературы по современному состоянию морфолого-анатомических, фитохимических и фармакологических исследований объектов диссертационной работы;

-4- предпринять сравнительное изучение химического состава листьев исследуемых растений, в частности различных элементов, аминокислот, веществ вторичного метаболизма, главным образом фенольных соединений (простых фенолов, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, дубильных веществ);

- подобрать и адаптировать методики количественного определения отдельных групп фенольных соединений в сырье каждого изучаемого растения после предварительного выявления оптимальных условий их проведения;

- определить содержание отдельных групп фенольных соединений в образцах сырья, заготовленных в различных регионах РФ и реализуемых в аптеках;

- проанализировать сезонную динамику накопления действующих веществ в листьях грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной для выявления оптимальных сроков их заготовки;

- провести сравнительный хромато-масс-спектрометрический и морфоло-го-анатомический анализ листьев изучаемых растений;

- определить числовые показатели листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и разработать проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП) «Листья зимолюбки зонтичной», «Листья грушанки круглолистной» и проект изменения к фармакопейной статье (ФС) ГФ XI «Листья толокнянки».

Научная новизна работы. С использованием современных физико-химических методов анализа (хромато-масс-спектрометрия, ВЭЖХ, масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, спектрофотометрия и др.) предпринято сравнительное фитохимическое изучение листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной.

Методом масс-спектрометрии определено содержание 5 макро-, 53 микро- и ультрамикроэлемента в листьях изучаемых растений.

При анализе аминокислотного состава листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки выявлены 8 незаменимых и 11 заменимых аминокислот.

Подобраны и адаптированы методики количественного определения арбутина, флавоноидов и гидроксикоричных кислот в листьях каждого исследуемого растения.

Проведсн сравнительный хромато-масс-спектрометрический и морфолого-анатомический анализ листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной.

Результаты исследований нашли отражение в проектах ФСП «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной», а также в проекте изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки» в разделе «Количественное определение».

Прастическая значимость работы. Предложены методики стандартизации листьев изучаемых растений по отдельным показателям, позволяющие объективно оценивать их доброкачественность.

На основании проведенных исследований составлены и внедрены:

- спектрофотометрические методики количественного определения отдельных групп фармакологически активных веществ (суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот, арбутина) в листьях грушанки круглолистной (акт о внедрении от 21.10.2009 г. в учебный процесс кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Минздравсоцразвития РФ»);

- спектрофотометрическая методика количественного определения арбутина в листьях грушанки круглолистной (акт о внедрении от 17.06.2009 г. в учебный процесс кафедры управления и экономики фармации с курсами фармакогнозии и ботаники, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ»),

Особенности исследований отражены в проектах ФСП «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной» и в проекте изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки».

Положения, выносимые на защиту:

- результаты определения элементного и аминокислотного состава сырья грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной;

- данные сравнительного фитохимического изучения сырья исследуемых

растений,

- особенности сравнительного хромато-масс-спектрометрического и мор-фолого-анатомического анализа листьев объектов исследования,

- итоги разработки проектов нормативной документации (НД).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обобщены на конгрессе «Традиционная медицина-2007» (Москва, 2007); научно-практических конференциях: «Фармация и здоровье» (ПГФА, Пермь, 2005), «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования» (Уфа, 2006), «Лекарства - человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств» (НФаУ, Харьков, 2006), «Современные вопросы теории и практики лекарствоведения» (ЯГМА, Ярославль, 2007), «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (БГУ, Белгород, 2008), «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (ПГФА, Пермь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (ЯГМА, Ярославль, 2009); на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых ЯГМА (Ярославль, 2006-2010); на межкафедральной научной конференции кафедр фармакогнозии и ботаники, фармацевтической и токсикологической химии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, фармакологии ЯГМА (Ярославль, 2010 г.).

Апробация работы проведена на межкафедральной научной конференции фармацевтического факультета Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова (12 октября 2010 г.).

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликована 30 работ, из них 7 в журналах, в том числе 2 статьи в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных BÁK», и 3 статьи в зарубежных журналах.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-

исследовательских работ ГОУ ВПО -ЯГМА Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (номер государственной регистрации 01.20.0600898). Тема утверждена на заседании Учёного совета ЯГМА (протокол №2 от 19.10.2005).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. Она иллюстрирована 27 рисунками и 44 таблицами. Список литературы включает 262 источника, из них 56 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования для сравнительного фармакогностического анализа служили листья грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной, заготовленные в местах естественного произрастания в различных регионах европейской и азиатской частей РФ, а также образцы, реализуемые в аптеках. В процессе изучения использовали как классические, так и современные методы исследований, в частности хроматографию на бумаге (БХ), спектрофото-метрию (СФ-56), хромато-масс-спектрометрию (газовый хроматограф 6850 с масс-селективным детектором 5973 Agilent Technologies), ВЭЖХ с фотометриче-кой детекцией (аминокислотный анализатор Hitachi 835), ВЭЖХ с УФ-детекцией (хроматограф фирмы «Gilson», модель 305), масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (масс-спектрометр ELAN-DRC-e). Морфолого-анатомический анализ проводили в соответствии с требованиями ГФ XI с использованием цифровой камеры для микроскопа Webbers MYscope 310 М. Определение числовых показателей осуществляли, руководствуясь методиками, описанными в ГФ XI издания (ГФ XI, вып.1, 1987, вып. 2, 1989), а разработку проектов нормативной документации - в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 «Отраслевой стандарт. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» (2000).

Изучение элементного и аминокислотного состава

Содержание макро-, микро- и ультрамикроэлементов в листьях грушан-ки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной определяли с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе ELAN-DRC-e с использованием метода добавок для контроля точности определений. Всего в листьях анализируемых видов определено содержание 5 макро-, 53 микро- и ультрамикроэлемента (табл. 1). Ряды убывания содержания химических элементов свидетельствуют об индивидуальных особенностях их накопления в каждом из анализируемых растений. Обнаружено, что листья грушанки, зимолюбки и толокнянки являются марганофиллами. Образцы оказались экологически безопасными по содержанию свинца, кадмия, ртути и мышьяка.

Аминокислотный состав листьев изучаемых растений определяли на аминокислотном анализаторе «Hitachi» модели 835 на колонке 0,26x15 см в стандартных условиях после гидролиза (табл. 2). Хроматограммы аминокислотного состава исследуемых листьев приведены на рисунках 1-3. Всего нами определено содержание 19 аминокислот, из которых 8 являлись незаменимыми (Val, Ile, Leu, Met, Lys, OH-Lys, Thr, Phe) и 11 заменимыми (Ala, Gly, Ser, Туг, Cys, Asp, Glu, Arg, His, Pro и OH-Pro). Наибольшее суммарное содержание аминокислот отмечено в листьях грушанки.

Вещества вторичного обмена

Качественное обнаружение веществ вторичного метаболизма, из которых одними из наиболее важных являются фенольные соединения, первоначально мы проводили с использованием одно- и двумерной восходящей хроматографии на бумаге Filtrak FN-4 и FN-6. При двумерном хроматографировании в листьях грушанки нами обнаружено 12 флавоноидных соединений, в листьях зимолюбки и толокнянки - по 15. При хроматографическом изучении нами отмечено по 5 гид-роксикоричных кислот в извлечении из листьев каждого растения.

Уточнение данных анализа фенольных соединений методом БХ осуществляли с помощью ВЭЖХ. Исследование проводили на приборе фирмы «Gilson», модель 305 (Франция), инжектор ручной, модель Rheodyne 7125 (USA) с

Таблица 1

Элементный состав листьев толокнянки обыкновенной, зимолюбкн зонтичной и

Элемент Содержание, мкг/г Элемент Содержание, мкг/г

Грушанка Зимолюбка Толокнянка Грушанка Зимолюбка Толокнянка

Макг юэлементы Марганец (Мп) 87,6000 240,0000 29,0000

Кальций (Са) 16475,0000 12486,0000 10859,0000 Медь (Си) 7,5400 8,6600 1,7248

Кремний (ЭО 1535,0000 1220,0000 671,0000 Молибден (Мо) 0,0674 0,2159 0,0250

Магний (Мй) 2516,0000 2585,0000 1390,0000 Мышьяк (Лч) 0,2130 0,2223 0,1203

Натрий (№) 49,0000 84,0000 13,0000 Неодим (N<1) 0,1020 0,0887 0,0527

Фосфор (Р) 1642,0000 1656,0000 1347,0000 Никель (N1) 0,1100 1,4500 4,3800

Микро- и ультрамикроэлементы Ниобий (N1)) 0,0301 0,0228 0,0073

Барий(Ва) 80,0000 83,1000 85,0000 Олово (Бп) 0,0764 0,1541 0,0131

Бор (В) 35,7000 15,0000 17,0000 Празеодим (Рг) 0,0269 0,0252 0,0162

Бром (Вг) 4,6452 4,0678 4,7000 Ртуть (Не) 0,0068 0,0522 0,0034

Ванадий(V) 0,5100 0,6400 0,4800 Рубидий (ЯЬ) 8,8228 19,9000 2,8000

Висмут (В1) 0,0106 0,0304 0,0016 Самарий (Эш) 0,0185 0,0245 0,0164

Вольфрам (\У) 0,0379 0,0848 0,0013 Свинец (РЬ) 1,5615 2,5969 0,2472

Гадолиний (Ос1) 0,0268 0,0194 0,0150 Селен (Бе) 0,4580 0,6042 0,5712

Галлий (ва) 0,1092 0,1305 0,0593 Серебро (Ag) 0,0447 0,1186 0,0020

Гафний (НО 0,0078 0,0097 0,0026 Стронций (Бг) 32,6000 31,5000 52,0000

Германий (Ое) 0,0052 0,0097 0,0061 Сурьма (БЬ) 0,0144 0,0327 0,0281

Гольмий (Но) 0,0026 0,0023 0,0017 Талий (Т1) 0,0476 0,0350 0,0027

Диспрозий (Пу) 0,0173 0,0127 0,0083 Тантал (Та) 0,0014 0,0020 0,0004

Европий (Еп) 0,0253 0,0505 0,0064 Теллур (Те) 0,0053 0,0098 0,0013

Эрбий (Ег) 0,0058 0,0048 0,0034 Тербий (ТЬ) 0,0034 0,0027 0,0017

Железо (Ие) 447,1000 350,0000 235,0000 Титан (ТО 8,3600 8,9000 3,0400

Итербий (УЪ) 0,0057 0,0045 0,0012 Торий (ТЬ) 0,0663 0.0596 0,0152

Итрий (У) 0,0744 0,0760 0,0582 Тулий (Ти, Тт) 0,0014 0,0011 0,0007

Йод (I) 0,0653 0,1491 0,0403 Уран (и) 0,0086 0,0096 0,0025

Кадмий (Сф 0,3428 0,1770 0,0060 Хром (Сг) 8,6600 9,7700 9,4000

Кобальт (Со) 2,8500 2,1800 1,8973 Цезий (Ск) 0,0779 0,1090 0,0081

Лантан (Ьо) 0,1154 0,1228 0,1076 Церий (Се) 0,2406 0,2429 0,1637

Литий (1л) 0,0202 0,2150 0,0050 Цинк (гп) 27,7000 33,0090 30,9000

Лютеций (Ьи) 0,0009 0,0008 0,0002 Цирконий (Zт) 0,4394 0,4297 0,1106

Содержание, мг в 100 мг Содержание, мгв 100 мг

Аминокислота Гру- Зимо- Толок- Аминокислота Гру- Зимо- Толок-

шанка любка нянка ша нка любка нянка

Моноаминомонокарбоновые кислоты Диамшомонокарбоновые кислоты

Алании 0,58 0,49 0,30 Аргинин 0,65 0,42 0,28

Валин* 0,49 0,39 0,25 Лизин* 0,51 0,46 0,24

Глицин 0,79 0,45 0,27 Оксилизин* 0,07 0,04 0,01

Изолейцин* 0,41 0,30 0,19 Гетероциклические

Лейцин* 0,85 0,63 0,42 Пролин 0,52 0,35 0,17

Метионин* 0,12 0,11 0,06 Оксипролин 0,01 0,01 следы

Серии 0,49 0,41 0,24 Гистидин 0,22 0,13 0,09

Тирозин 0,47 0,27 0,19 Сумма незаме-

Треонин* 0,41 0,33 0,20 нимых амино- 3,41 2,64 1,63

Фенилаланин* 0,55 0,38 0,26 кислот*

Цистеин 0,02 0,03 0,03 Сумма замени-

Моноаминодикарбоновые кислоты мых аминокислот 5,61 4,23 2,48

Аспарагиновая 0,80 0,70 0,38 Общая сумма 9,02 6,87 4,11

Глютаминовая 1,04 0,98 0,53

Примечание. Звездочкой обозначены незаменимые аминокислоты.

последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для Windows (рис. 4 и табл. 3). Так, в листьях грушанки идентифицировали 14 веществ фенольной природы, в листьях зимолюбки - 9. В листьях обоих растений доминировал арбутин. В листьях грушанки выявлены такие флавоноиды, как гиперозид, рутин, кверцетин, лютеолин, дигидрокверцетин, лютеолин-7-гликозид, в листьях зимолюбки - гиперозид и эпикатехин. Среди фенольных и гидроксикоричных кислот грушанки идентифицированы галловая, хлорогеновая, цикориевая, феруловая, неохлорогеновая, коричная, зимолюбки -галловая, цикориевая, кофейная, неохлорогеновая. Кроме того, в зимолюбке обнаружены кумарины (кумарин и о-метоксикумарин).

Количественное определение фенольных соединений. Для анализа арбутина применяли хроматоспектрофотометрическую методику с использованием при расчетах концентраций удельного показателя поглощения (£¡2) арбутина-стандарта (Sigma, США), имеющего максимум поглощения при длине волны 285нм, равный 72,23, и коэффициента неполного элюирования, равного 1,14025. Максимумы поглощения в УФ-области очищенных спиртовых извлечений из

- И -

Рис. 1. Хроматограмма аминокислот листьев грушанки круглолистной

аГ!

I 13 Й

¡Ш

§ ЩШ

ШШПЖ:

¡аММ^Ц

3 !\

*1\ *

!\ М

! V г1

( г г : е 7 д | |щ !] ч к и ц и >) г: гг п я 35 к :т я п м з; V м г: к г) и 14

Рис. 2. Хроматограмма аминокислот листьев зимолюбки зонтичной

толокнянки обыкновенной

110П-1»Ю>-41«)-

.4X1-

Рис. 4. Хроматограмма метанольного извлечения листьев 1рушанки круглолистной, полученная при ВЭЖХ-анализе Условные обозначения идентифицированных соединений: 1 - арбутин, 2 - галловая кислота, 3 - хлорогеновая кислота, 4 - цикориевая кислота, 5 - феруловая кислота, 6 - неохлорогеновая кислота, 7 - лютеолин-7-гликозид, 8 - гинерозид, 9 - рутин, 10 - дигидрокверцетин, 11 - коричная кислота, 12 - кемпферол, 13 - лютеолин, 14 - кверцетин.

№ п/п Вещество Время удерживания, мин. Содержание, %

1 Арбутин 3,539 20,34

2 Галловая кислота 4,455 2,85

3 Хлорогеновая кислота 5,624 1,08

4 Цикориевая кислота 6,364 1,77

5 Феруловая кислота 7,950 1,37

6 Неохлорогеновая кислота 10,050 1,39

7 Лютеолин- 7-гликозид 14,290 1,29

8 Гиперозид 16,600 3,40

9 Рутин 19,840 2,07

10 Дигидрокверцетин 28,890 5,52

11 Коричная кислота 47,800 2,83

12 Кемпферол 54,300 2,66

13 Лютеолин 73,240 0,17

14 Кверцетин 77,900 0,03

листьев анализируемых растений и раствора стандартного образца арбутина (Х.=285 нм) полностью совпадали (рис. 5).

Для количественного анализа суммы флавоноидов нами выбрана дифференциальная спектрофотометрия. Их содержание рассчитывали с использованием удельного показателя поглощения (Е,'*) комплекса гиперозида-стандарта (ГНЦЛС, г. Харьков, Украина) с алюминия хлоридом, равного 291,09.

0,4

□ Спиртовой раствор арбутина-стандарта

0,35

0,3

и Спиртовое извлечение из листьев грушанки

0,25 ■

0,2

—*—Спиртовое извлечение из листьев зимолюбки

0,15

0,1

Спиртовое извлечение из листьев толокнянки

0,05

0

270 275 280 285 290 295 300 305 310 315

Длина волны, нм

Рис. 5. УФ-спсктры поглощения спиртовых извлечений из листьев грушанки, зимолюбки, толокнянки и спиртового раствора арбутина-стандарта

Сумму гидроксикоричных кислот определяли прямой спектрофотометри-ей спиртового извлечения. Расчет концентраций проводили с использованием удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты ("Р1ика", Германия).

Количественное определение дубильных веществ проводили по методике ГФ XI, т.е. перманганатомстрическим титрованием.

В процессе адаптации методик нами определены оптимальные условия количественного определения арбутина, суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в листьях каждого растения (тип экстрагента, степень измельчения сырья, продолжительность и количество экстракций, соотношение сырья и экстрагента). Кроме того, нами проведена метрологическая характеристика методик и определены их относительные ошибки, которые представлены в таблицах 4-7.

По адаптированным методикам количественного определения арбутина, флавоноидов, гидроксикоричных кислот и дубильных веществ нами проанализированы 19 образцов грушанки, 16 - зимолюбки и 17 - толокнянки. Полученные результаты отражены в таблицах 8-10.

При обобщении полученных данных выявлено, что среднее содержание арбутина в сырье грушанки составило 6,98%, зимолюбки - 11,46%, толокнянки -10,57%. При этом содержание арбутина колебалось от 2,755% до 12,691% в гру-шанке, от 6,741% до 16,916% в зимолюбке и от 3,148% до 20,499% в толокнянке.

Исследуемое растение п { X Эх Р,% ПрЛ ДХ Е,%

Грушанка 10 9 7,521 0,0039 0,0624 0,0197 95 2,26 0,045 0,60

Зимолюбка 10 9 10,511 0,0091 0,0953 0,0301 95 2,26 0,068 0,65

Толокнянка 10 9 11,283 0,0239 0,1546 0,0489 95 2,26 0,110 0,97

Таблица 5 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов

Исследуемое растение п { X Б Эх Р,% ((р,0 ДХ е,%

Грушанка 10 9 1,231 0,0009 0,03 0,0095 95 2,26 0,021 1,71

Зимолюбка 10 9 1,029 0,00049 0,0221 0,007 95 2,26 0,016 1,55

Толокнянка 10 9 1,827 0,0015 0,0387 0,0122 95 2,26 0,028 1,53

определения гидроксикоричных кислот

Исследуемое растение п £ X 5 Р,% ДХ £,%

Грушанка 10 9 1,985 0,0019 0,0436 0,0138 95 2,26 0,031 1,56

Зимолюбка 10 9 2,029 0,0017 0,0412 0,013 95 2,26 0,029 1,27

Толокнянка 10 9 3,511 0,0059 0,0768 0,243 95 2,26 0,055 1,57

Таблица 7 - Метрологические характеристики количественного определения

Исследуемое растение п Г X Б Б Б, Р,% Кр,0 ДХ с,%

Грушанка 10 9 15,451 0,119 0,345 0,109 95 2,26 0,247 1,60

Зимолюбка 10 9 15,091 0,121 0,348 0,110 95 2,26 0,249 1,65

Толокнянка 10 9 32,103 0,953 0,972 0,307 95 2,26 0,695 2,16

Среднее содержание суммы флавоноидов равнялось 1,48%, 1,08% и 1,46% в сырье грушанки, зимолюбки и толокнянки соответственно. Значения содержания флавоноидов находились в пределах от 0,605% до 2,290 % в грушанке, от 0,536 % до 1,144 % в зимолюбке, от 0,728% до 1,851% в толокнянке.

Среднее содержание суммы гидроксикоричных кислот составило в листьях грушанки - 2,01 %, зимолюбки - 2,46 %, толокнянки - 2,85 %. При этом, их содержание находилось в пределах от 1,524 % до 2,557 % в грушанке, от 1,925 % до 3,616 % в зимолюбке и от 1,186 % до 4,074 % в толокнянке.

Средние значения содержания дубильных веществ составили 13,47%, 22,16% и 24,42 % для грушанки, зимолюбки и толокнянки соответственно. Их содержание колебалось от 7,130 % до 24,878% в листьях грушанки, от 14,062% до 30,964 % в листьях зимолюбки и от 18,415 % до 33,547 % в листьях толокнянки.

Динамика накопления фенольных соединений в течение вегетационного периода. Для выявления оптимальных сроков заготовки сырья грушанки и

№ образца Содержание, %

Арбутин Флавоноиды Гидроксикоричные кислоты Дубильные вещества

1 7,563±0,076 1,067±0,017 2,087*0,031 14,029±0,435

2 3,292*0,020 1,100±0,019 1,695*0,026 8,390±0,134

3 10,205±0,102 1,239±0,020 1,907*0,029 16,233±0,503

4 5,367±0,054 1,692±0,027 1,909*0,029 18,712±0,580

5 12,195*0,122 2,104±0,034 1,874±0,028 15,451 ±0,479

6 5.202*0,052 1,689±0,027 2,464*0,037 17,477±0,542

7 6,788*0,068 0,83340,013 1,702*0,026 24,878*0,771

8 2,755±0,017 0,900±0,015 2,039±0,032 10,439±0,167

9 7,656*0,046 0,822±0,014 2,048±0,032 7,130±0,114

10 3,789±0,038 1,088*0,017 2,281*0,034 13,451*0,417

11 3,874*0,039 0,513*0,008 1,524±0,023 12,183*0,378

12 4,260*0,043 1,123*0,018 2,059±0,031 15,243*0,473

13 12,691*0,076 0,859*0,015 2,304*0,036 10,420*0,167

14 11,959±0,072 0,950±0,016 1,821 ±0,028 9,572*0,153

15 4,731 ±0,028 1,390*0,024 2,378±0,037 10,024*0,160

16 6,004*0,036 2,290*0,039 2,132*0,033 14,910*0,239

17 8,051*0,081 0,791±0,013 1,725±0,026 14,872*0,461

18 9,494*0,095 0,605±0,010 2,557*0,038 14,869*0,461

19 6,780*0,041 0,964*0,016 1,665±0,026 7,567*0,121

Примечание. Условные обозначения мест сбора образцов листьев: 1 - Белгородская обл., Белгородский р-н, окр. с. Сосновка, авг. 2005 г.; 2 - сев.-вост. побережье оз. Байкал, июль 2006 г.; 3 - Белгородская обл., окр. с. Сосновка, авг. 2006 г.; 4 - Ярославская обл., Ярославский р-н, окр. пос. Шевелюха, авг. 2006 г.; 5 - Ярославская обл., Ярославский р-н, окр. пос. Прусово, авг.

2006 г.; 6 - окр. г. Ярославля, авг. 2006 г.; 7 - окр. г. Ярославля, сент. 2006 г.; 8 - Ярославская обл., Пошехонский р-н, окр. с. Окулово, июль 2007 г.; 9 - окр. г. Томска, июль 2007 г.; 10 - Ярославская обл., Ярославский р-н, окр. пос. Лесные поляны, июль 2007 г.; 11 - окр. г. Ярославля, июль 2007 г.; 12 - Ярославская обл., окр. пос. Лесные поляны, авг. 2007 г.; 13 - Белгородская обл., окр. с. Сосновка, май 2008 г.; 14 - Ярославская обл., Ярославский р-н, окр. пос. Лесные поляны, май 2008 г.; 15 - Ярославская обл., окр. с. Тощиха, июль 2008 г; 16 - окр. г. Ярославля, авг. 2008 г.; образцы аптечного сырья: 17 - ИП Чугунов, сент. 2007 г.; 18 - ИП Чугунов, июль

2007 г.; 19 - ИП Чугунов, авг. 2008 г.

зимолюбки в центральном регионе России нами изучена сезонная динамика накопления их основных фармакологически активных веществ, какими представляются фенольные соединения. Для количественного определения арбутина, флаво-ноидов, гидроксикоричных кислот использовали адаптированные нами методики, для анализа дубильных веществ - фармакопейную. На основании полученных данных видно, что максимальное содержание в листьях грушанки и зимолюбки арбутина и дубильных веществ наблюдалось в сентябре, а флавоноидов и гидроксикоричных кислот - в августе. Отмечено также высокое содержание арбутина

№ образца Содержание, %

Арбутин Флавоноиды Гидроксикоричные кислоты Дубильные вещества

1 6,771+0,044 0,855±0,012 1,925±0,029 20,140+0,624

2 10,326+0,103 1,009+0,014 2,567+0,039 28,243+0,876

3 8,391+0,839 0,536±0,008 2,501+0,038 16,674+0,517

4 16,916±0,169 1,029±0,014 2,898±0,043 14,062+0,436

5 14,173±0,092 0,951±0,015 2,118±0,027 21,441+0,354

6 8,012+0,052 1,104+0,017 2,412±0,031 14,851+0,245

7 7,956+0,796 1,107±0,015 2,675+0,040 15,385+0,477

8 15,407+0,154 0,978+0,014 2,436+0,037 23,540+0,729

9 12,183*0,079 0,901±0,014 2,060±0,026 22,511+0,371

10 10,272+0,066 1,014+0,016 1,963+0,025 19,034+0,314

11 14,701+0,147 1,060+0,015 3,616+0,054 29,716+0,921

12 13,826±0,138 1,123+0,016 2,227+0,033 30,964+0,959

13 13,807±0,138 1,144+0,016 2,170+0,033 24,828+0,410

14 6,741±0,674 1,076±0,015 2,893+0,043 22,558+0,372

15 12,53 3±0,081 1,091±0,017 2,315+0,029 26,183+0,432

16 11,341±0,073 1,122+0,017 2,553+0,032 24,376+0,402

Примечание. Условные обозначения мест сбора образцов листьев: 1 - Белгородская область, Белгородский район, окр. с. Сосновка, август 2005 г.; 2 - Ярославская область, Ярославский район, окр. пос. Прусово, июнь 2006 г.; 3 - Белгородская область, Белгородский район, окр. с. Сосновка, август 2006 г.; 4 - Ярославская область, Ярославский район, окр. пос. Прусово, август 2006 г.; 5 - Алтайский край, окр. г. Белокудриха, сентябрь 2006 г.; 6 - Ярославская область, Ярославский район, окр. с. Тощиха, июнь 2007 г,; 7 - Ярославская область, Ярославский район, окр. пос. Прусово, июнь 2007 г.; 8 - Белгородская область, Белгородский район, окр. с. Сосновка, август 2007 г.; 9 - Ярославская область, Ярославский район, окр, пос. Лесные поляны, август 2007 г; 10 - Ярославская область, Ярославский район, окр. пос. Лесные поляны, июнь 2008 г; образцы аптечного сырья: 11 - ЗАО «Эвалар», серия 19.02.04, партия 3; 12 - ИП Чугу-нов, июль 2007 г.; 13 - ЗАО «Эвалар», серия 03.03.05., партия 5; 14 - ЗАО «Эвалар», серия 03.04.06, партия 10; 15 -ИП Чугунов, сентябрь 2007 г.; 16 - ИП Чугунов, апрель 2008 г.

в мае, которое летом уменьшалось и вновь увеличивалось к осени.

Из полученных результатов следует, что необходимо проводить заготовку листьев грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной в августе - сентябре.

Хромато-масс-спектрометрический анализ. В метанольных извлечениях анализируемых листьев нами идентифицировано 44 вещества, из них 8 феноль-ных соединений (орцин, галловая кислота, гидрохинон, арбутин, гваякол-глюкопиранозид, 2-метилрезорцин, цианиданол, 4-гидроксибензойная кислота), 3 тритерпеноида ф-амирин, а-амирин, З-оксо-урс-12-ен), 1 - стероид (ситостерол), 7 органических кислот (бензойная, треоновая, 3-гидроксинропановая, янтарная, яблочная, лимонная и терефталевая кислоты), 11 жирных кислот (пеларгоновая,

Ks образца Содержание, %

Арбутин Флавоноиды Гидроксикоричныс кислоты Дубильные вещества

1 9,634±0,093 1,212*0,018 2,793*0,044 31,512±0,680

2 15,383*0,149 1,843±0,028 3,715±0,058 18,415±0,398

3 11,494±0,111 1,851*0,028 3,603±0,056 33,547*0,725

4 10,224*0,099 1,715*0,026 3,914±0,061 27,416*0,592

5 12,104*0,117 1,503±0,023 4,074±0,064 32,744±0,707

6 12,082±0,117 1,233±0,019 2,688±0,042 31,220*0,674

7 10,257*0,099 1,833±0,028 3,151 ±0,049 29,711*0,642

8 6,540*0,063 0,975*0,015 1,186*0,019 18,600±0,402

9 3,148±0,031 0,785±0,012 2,832±0,044 24,681*0,533

10 8,241*0,080 0,728±0,011 2,392±0,038 23,108*0,499

11 9,512±0,092 1,206±0,018 2,915±0,046 23,182*0,501

12 10,634±0,103 1,315±0,020 2,854±0,045 21,415*0,463

13 13,491±0,131 1,460*0,022 2,435±0,038 19,468*0,421

14 12,144±0,118 1,515*0,023 2,911 ±0,046 20,378*0,441

15 20,499±0,199 1,273±0,019 1,981±0,031 19,348*0,418

16 3,998*0,039 1,081 ±0,017 2,446±0,038 20,192*0,436

17 10,214*0,099 1,324±0,021 2,629±0,041 20,235*0,437

Примечание. Условные обозначения мест сбора образцов листьев: 1 - Ярославская обл., окр. пос. Вакарево, авг. 2005 г.; 2 - Ярославская обл., окр. пос. Прусово, июнь 2006 г.; 3 - окр. г. Ярославля, авг. 2006 г.; 4 - Ярославская обл., окр. пос. Прусово, авг. 2006 г.; 5 - Ярославская обл., окр. пос. Вакарево, сент. 2006 г.; 6 - респ. Коми, июнь 2007 г.; 7 - Ярославская обл., окр. пос. Вакарево, авг. 2007 г.; 8 - Алтайский край, окр. г. Барнаул, авг. 2007 г.; 9 - Ярославская обл., окр. пос. Вакарево, июнь 2008 г.; 10 - Ярославская обл., окр. пос. Прусово, авг. 2008 г.; образцы аптечного сырья: 11 - ООО «ФАРОС», серия 12072003; 12 - ОАО «Красногорсклексред-ства», серия 10104; 13 - ЗАО «Здоровье», серия 041005; АО «Адонис», серия 50203; 15 - ОАО «Красиогорсклексредства», серия 20407; 16 - ЗАО «Авентин-Экохелп», серия 010404; 17 - ЗАО «Иван-чай», серия 010805.

каприновая, лауриновая, маргариновая, миристиновая, пальмитиновая, линолевая, арахиновая, докозановая, линоленовая и стеариновая кислоты), 10 - углеводов (арабинофураноза, арабинопираноза, арабиновая кислота, метиларабиноза, ме-тилглюкофураноза, ксилофураноза, рибоза, глюкофураноза, ксилоза, сахароза), 1 - аминокислота (пролин), 4 - другие первичные метаболита. Идентифицированные вещества приведены в таблице 11 в порядке увеличения их масс. Общими для всех трех анализируемых растений являлись 19 веществ, представленных 2 фе-нольными соединениями (галловая кислота, арбутин), 7 углеводами (арабинофураноза, арабинопираноза, арабиновая кислота, рибоза, глюкофураноза, ксилоза, сахароза), 4 органическими (янтарная, яблочная, лимонная и терефталевая) и 5 жирными кислотами (миристиновая, пальмитиновая, линолевая, линоленовая и

стеариновая), 1 аминокислотой (пролин). Вместе с тем, в листьях грушанки и зи-молюбки обнаружены 6 общих соединений (орцин, треоновая кислота, метилара-биноза, метилглюкофураноза, ксилофураноза, гваякол-глюкопиранозид), грушанки и толокнянки - 2 (арахиновая кислота и ситостерол), зимолюбки и толокнянки - 4 (бензойная кислота, 3-гидроксипропановая кислота, а-амирин и Р-амирин). Только в грушанке выявлены 3 компонента (эйкозан, 2-метирезорцин, цианида-нол), в зимолюбке - 3 (1-гидрокси-2-пропанон, глицерин и пеларгоновая кислота), в толокнянке - 7 (гидрохинон, капроновая, 4-идроксибензойная, лауриновая, маргариновая, докозановая кислоты, З-оксо-урс-12-ен).

Морфолого-анатомический анализ. Определение числовых показателей. Разработка проектов НД Морфолого-анатомический анализ. При сравнительном микроскопическом анализе выявляются как определенные сходства, так и различия исследуемых растений. Общими анатомическими признаками для грушанки, зимолюбки и толокнянки являются тип устьичного аппарата (аномоцитный), расположение устьиц только на нижней стороне листа, наличие кутикулы. Однако, количество околоустьичных клеток у толокнянки (6 - 8) больше, чем у грушанки и зимолюбки (4 - 6) и клетки эпидермиса мельче. Отличительной особенностью листа зимолюбки являются наличие хорошо различимого губчатого мезофилла, имеющего характер аэренхимы. Включения оксалата кальция у зимолюбки встречаются часто в форме друз, у грушанки друзы редкие, как правило, одиночные, а у толокнянки оксалат кальция откладывается главным образом в виде кристаллов вдоль жилок. Отличительным признаком микроскопии листа толокнянки является наличие простых волосков, тогда как у грушанки и зимолюбки волоски нами не обнаружены. Результаты морфолого-анатомического анализа сырья грушанки и зимолюбки использованы при составлении проектов ФСП.

Определение числовых показателей. Руководствуясь методиками, приведенными в ГФ XI издания, нами определены такие числовые показатели для сырья грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной, как влажность, содержание золы общей и нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной,

нольных извлечений из листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки

Анализируемое растеиие

Грушанка Зимолюбка Толокнянка

№ Вещество Время Содер- Время Содер- Время Содер-

п/п удерживания, мин. жание, % удерживания, мин. жание, % удерживания, мин. жание, %

1 2 3 4 5 6 7 8

1 1 -Гидрокси-2-пропаиои - - 5,423 0,519 - -

2 Бензойная кислота - - 5,635 0,071 5.624 0,113

3 Глицерин - - 5,836 1,734 - -

4 Янтарная кислота 6,079 0,979 6,079 0,197 6,068 0,244

5 З-Гидроксипропановая кислота - - 6.227 0,078 6,222 0,081

6 Гидрохинон - - - - 6,666 3,307

7 Пелартоновая кислота - - 6,370 0,114 - -

8 Калриновая кислсгта - - - - 6,957 0,087

9 Орцин (5-мегилрезорцин) 7,026 11,799 7,026 5,981 - -

10 Яблочная кислота 7,179 0,786 7,179 0,241 7,179 0,471

11 Пролин 7,396 0,326 7,396 0,136 7,396 0,133

12 Треоновая кислота (2,3,4-тригидроксибутановая кислота) 7,586 0,416 7,586 0,088 - -

13 4-Гидроксибеюойная кислота - - - - 7,904 0,319

14 Лауриновая кислота - - - - 7,983 0,453

15 Арабинофураноза 8,131 0,932 8,131 0,271 8,136 0,362

16 Арабинопираноза 8,358 1,419 8,358 0,626 8,358 0,286

17 Арабиновая кислота 8,485 2,394 8,480 2,163 8,464 0,531

18 Метиларабиноза 8,655 0,433 8,655 0,357 - -

19 Терефталевая кислота 8,676 1,394 8,676 0,341 8,676 1,183

20 Метилглюкофураноза 8,729 1,534 8,729 0,402 - -

21 Ксилофураноза 8,781 0,652 8,781 0,370 - -

22 Миристиновая кислота 8,866 0,689 8,866 0,252 8,866 0,631

23 Рибоза 8,924 0,863 8,924 0,393 8,924 0,261

24 Глюкофураноза 8,956 4,389 8,956 1,503 8,972 1,315

25 Лимонная киаюта 9,067 2,140 9,067 0,587 9,067 0,480

26 Ксилоза 9,205 1,839 9,205 0,484 9,210 0,286

27 Галловая кислота 9,379 7,486 9,379 1,536 9,379 9,089

28 Пальмитиновая кислота 9,659 9,212 9,660 3,930 9,665 4,628

29 Маргариновая кислота - - - - 10,035 0,104

30 Линсшевая кислота 10,299 4,432 10,299 3,685 10,299 3,876

31 Линоленовая кислота 10,331 4,267 10,331 18,601 10,331 3,852

32 Стеариновая кислота 10,389 1,187 10,389 0,588 10,389 0,759

33 Арахиновая кислота 11,061 0,371 - - 11,061 0,142

34 Зйкозан 11,251 4,626 - - - -

35 Арбутин 11,479 5,547 11,415 10,401 11,637 10,743

36 Гваякол-глюкопиранозид 11,727 7,720 11,643 8,949 - -

37 Докозановая кислота - - - - 11,754 0,265

38 Сахароза 11,986 13,659 11,986 18,593 11,986 0,862

39 2-Мегилрезорцин 12,055 3,016 - - - -

40 Цианиданол 12,991 2,633 - - - -

41 Ситостерол 17,048 2,861 - - 17,069 0,873

42 З-Оксо-урс-12-сн - - - - 17,645 2,486

43 р-Амирин - - 17,825 18,312 17,836 38,450

44 а-Амирин - - 17,989 1,803 17,941 13,327

содержание экстрактивных веществ, которые включены в проекты ФСП.

Разработка проектов НД. Результаты проведенных нами исследований использованы при разработке проектов ФСП «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной». Кроме того, нами предложен проект изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки» в разделе «Количественное определение». НД разрабатывали в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 «Отраслевой стандарт. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения».

ВЫВОДЫ

1. С помощью метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в листьях грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной определено содержание 5 макро- (Са, Mg, Na, Р, Si), 53 микро- и ультрамикроэлемента (Ag, As, В, Ва, Bi, Br, Се, Cd, Co, Cs, Cr, Cu, Dy, Er, Eu, Fe, Ga, Gd, Ge, Hf, Hg, Но, I, La, Li, Lu, Mn, Mo, Nb, Nd, Ni, Pb, Pr, Rb, Sb, Se, Sm, Sn, Sr, Ta, Tb, Te, Th, Ti, TI, Tm, U, V, W, Y, Yb, Zn, Zr), среди которых больше всего содержалось Са, Mg, Si, Fe, Mn, Ba, Sr, и выявлено, что проанализированные образцы является экологически безопасными.

2. Проведен сравнительный анализ аминокислотного состава листьев изучаемых растений, в результате которого обнаружено 19 аминокислот, из которых 8 являлись незаменимыми (Val, lie, Leu, Met, Lys, OH-Lys, Thr, Phe) и 11 заменимыми (Ala, Gly, Ser, Туг, Cys, Asp, Glu, Arg, His, Pro и OH-Pro), и отмечено, что их больше всего содержалось в листьях грушанки.

3. Экспериментально подобраны и адаптированы применительно к листьям каждого исследуемого растения спектрофотометрические методики количественного определения отдельных групп фенольных соединений (арбутина, суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот) путем определения оптимальных условий их проведения. Проведена метрологическая характеристика методик.

4. По адаптированным методикам проанализированы различные образцы листьев (более 15 для каждого исследуемого вида) и в них определено содержание арбутина, суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот, дубильных ве-

щсств, в результате чего обнаружено, что больше всего арбутина содержалось в листьях зимолюбки, а дубильных веществ - в толокнянке.

5. При изучении динамики накопления фенольных соединений в течение вегетационного периода в листьях грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной выявлены оптимальные сроки их заготовки в Ярославской области, приходящиеся на конец лета - начало осени (август-сентябрь).

6. При сравнительном хромато-масс-спектрометрическом анализе природных соединений листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки идентифицированы 44 вещества, представленные фенольными соединениями, тритерпеноидами, органическими и жирными кислотами, углеводами и другими соединениями.

7. При морфолого-анатомическом анализе исследуемых листьев отмечено, что по внешним признакам весьма сходны зимолюбка и толокнянка, в то время как по микродиагностическим признакам - грушанка и зимолюбка.

8. Установлены отдельные числовые показатели для листьев грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной (влажность, содержание золы общей и нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание экстрактивных веществ).

9. На основе проведенных исследований разработаны проекты фармакопейных статей предприятия «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной», а также предложен проект изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки» в разделе «Количественное определение».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Белоногова В.Д., Марсов Н.Г., Мазепина Л.С. [и др.] Сравнительный анализ элементного состава листьев толокнянки европейского и азиатского происхождения // Фармация и здоровье: материалы международной научно-практической конференции. - Пермь, 2005. - С. 126.

2. Мазепина Л.С., Лукина А.Ю., Коротаева М.С. [и др.] Фитохимическое изучение некоторых видов семейства вересковых, произрастающих в европейской и азиатской частях России // Фармация и здоровье: материалы международной научно-практической конференции . - Пермь, 2005. - С. 136 - 137.

3. Жаворонкова М.Е., Лукина А.Ю., Мазепина Л.С. [и др.] Химический и фармакологический скрининг некоторых видов семейства вересковых // Лекарства - человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации ле-

карственных средств: мат-лы науч.-практ. конф. с междун. участием - Харьков, 2006.-С. 40-41.

4. Мазепина Л.С., Коротаева М.С., Горохова Т.А. Рентгенофлуоресцентный анализ элементного состава листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА. - Ярославль, 2006. - С. 114-115.

5. Мазепина JI.C., Коротаева М.С., Джурко Ю.А. Фитохимическое изучение листьев грушанки круглолистной // Актуальные проблемы фармации: межрегиональный сборник научных трудов - Рязань, 2006. - С. 157 - 159.

6. Мазепина JI.C., Круглов Д.С., Коротаева М.С., Фурса Н.С. Масс-спектрометрическое определение макро-, микро-, и ультрамикроэлементов в листьях грушанки круглолистной // Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования: сб. науч. трудов юбилейной конф., поев. 25-летию фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2006. - С. 147 - 148.

7. Горохова Т.А., Коротаева М.С., Марсов Н.Г., Мазепина Л.С. [и др.] Изучение элементного состава сырья отдельных лекарственных растений, произрастающих в естественных условиях Ярославской области и выращиваемых в питомнике // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 38 - 39.

8. Мазепина Л.С., Джурко Ю.А., Коротаева М.С. [и др.] Фитохимическое изучение листьев зимолюбки зонтичной, перспективного растения традиционной медицины // Традиционная медицина-2007: сборник научных трудов конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия Центрального НИИ рефлексотерапии.-М., 2007.-С. 70-71.

9. Мазепина Л.С., Коротаева М.С. Определение макро-, микро- и ультрамикроэлементов в листьях грушанки и зимолюбки масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА. - Ярославль, 2007. - С. 113 - 114.

10.Мазепина Л.С., Коротаева М.С., Фурса Н.С. Количественное определение арбутина в листьях зимолюбки зонтичной // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2007. - №2. - С. 260 - 263.

11.Мазепина Л.С., Коротаева М.С., Фурса Н.С. Хроматоспектрофотометри-ческое определение арбутина в листьях грушанки круглолистной // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения: сб. мат-лов науч.-практ. конф. с междун. участием, поев. 25-летию фармацевтического факультета ЯГМА. - Ярославль, 2007. - С. 208 - 211.

12.Фурса М.С., Мазепша Л.С., Круглов Д.С. Масс-спектрометричне визна-чення макро-, MiKpo- та ультрамшроелементсв у Tpaei зимолюбки зонтично!' // Фармацевтичний журнал (Украина). - 2007. - №6. - С. 95 - 97.

13.Фурса Н.С., Шкроботько П.Ю., Парфенов A.A., Мазепина Л.С. [и др.] Некоторые итоги определения экологической чистоты ряда видов лекарственного растительного сырья // Влияние природных и антропогенных факторов на социо-экосистемы: межрегион, сб. науч. тр. - Рязань, 2007. - Вып. IV. - С. 248 - 254.

14.Мазепина Л.С. Определение суммы флавоноидов в листьях зимолюбки зонтичной // Актуальные проблемы образования и общества: мат-лы научно-практ. конф. с междун. участием. - Ярославль, 2008. - Т. 1. - С. 173 - 174.

15.Мазепина Л.С. Подбор оптимальных условий количественного определения суммы флавоноидов в листьях грушанки круглолистной // Сборник научных работ студентов и молодых учёных ЯГМА. - Ярославль, 2008. - С. 145 - 146.

16.Мазепина Л.С., Коротаева М.С., Фурса Н.С. Спектрофотометрическое определение арбутина в листьях толокнянки обыкновенной с использованием колоночной хроматографии // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научых трудов. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. -С. 61-63.

17.Мазепина Л.С., Фурса U.C., Круглое Д.С. Элементный состав листьев толокнянки обыкновенной II Фармация. - 2008. - №2. - С. 17-18.

18.Фурса Н.С., Жаворонкова М.Е, Мазепина Л.С. [и др.] Масс-спектрометрическое определение макро-, микро- и ультрамикроэлементов в листьях 3 видов вересковых и 2 видов грушанковых // Вестник фармации (Беларусь). - 2008. - №2 (40). - С. 66 - 70.

19.Фурса Н.С., Мазепина Л.С., Таланов A.A. Количественное определение отдельных групп фенольных соединений в листьях грушанки круглолистной // Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании: мат-лы междун. науч.-практ. конференции. - Белгород, 2008. - С. 280 - 283.

20.Васильева И.В., Мазепина Л.С. Сезонная динамика накопления фенольных соединений в сырье грушанки круглолистной // Актуальные вопросы медицинской науки: сб. науч. работ студентов и молодых учёных всероссийской конф. с междун. участием. - Ярославль, 2009. - С. 279 - 280.

21.Мазепина Л.С., Бузук Г.Н., Белоногова В.Д., Фурса Н.С. Количественное определение суммы флавоноидов в листьях толокнянки // Вестник фармации (Беларусь). - 2009. - №2 (44). - С. 26 - 30.

22.Мазепина Л.С., Ошмарина В.И., Коротаева М.С. [и др.] Содержание фенольных соединений в листьях зимолюбки зонтичной // Изыскание и создание природных лекарственных средств: межвуз. сб. науч. трудов с междун. участием, поев. 25-летию кафедры фармакогнозии и ботаники ЯГМА. - Ярославль, 2009. -С. 197-2009.

23.Мазепина Л.С., Таланов A.A., Месхи H.H. [и др.] Количественное определение некоторых групп фенольных соединений в листьях толокнянки обыкновенной // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 79 - 81.

24.Мазепина Л.С., Червякова A.B., Шитов Л.Н. [и др.] Хромато-масс-спектрометрический анализ листьев толокнянки // Актуальные вопросы медицинской науки: сб. науч. работ студентов и молодых учёных всеросс. конф. с междун. уч-ем. - Ярославль, 2009. - С. 283.

25.Талашова C.B., Круглов Д.С., Ошмарина В.И., Мазепина Л.С. [и др.] Масс-спектрометрический анализ элементного состава лекарственного растительного сырья различных морфологических групп // Изыскание и создание природных лекарственных средств: межвуз. сб. науч. трудов с междун. участием, поев.

26.Талашова C.B., Шкроботько П.Ю., Соленникова С.Н., Мазепина JI.C. [и др.] Изучение аминокислотного состава различных морфологических групп растительного сырья // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 112-113.

27.Фурса Н.С., Мазепина Л.С., Таланов A.A. [и др.] Определение арбутина в листьях грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа: мат-лы Российской науч.-практ. конф. с междун. уч-ем. - Пермь, 2009. - С. 168 - 171.

28.Мазепина Л.С., Джурко Ю.А., Фурса Н.С. Анализ листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной методом хро-мато-масс-спектрометрии // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научых трудов. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. -С. 85 - 87.

29. Мазепина Л.С., Иванов А.П., Фурса Н.С. Обоснование применения грушанки - традиционного урологического средства // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010. - №7. - С. 224 - 226.

30. Фурса Н.С., Белоусов М.В., Шкроботько П.Ю., Мазепина Л.С. [и др.) Анализ аминокислотного состава отдельных видов семейств бурачниковых, валериановых, вересковых, гвоздичных, грушанковых и яснотковых // Фармация. - 2010. - №4. - С. 22 - 24.

Отпечатано в ООО «Аверс Плюс» 150040, г. Ярославль, пр. Октября, 34/21. Тел. 97-69-22 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5. Заказ № 308.

Актуальность темы. В условиях современной жизни не избежать развития различных заболеваний, в том числе урологических, доля которых составляет 10 — 12 % в общей структуре заболеваемости населения России (Урология, 2009). Неосложненные инфекции мочевыводящих путей - одни из самых частых заболеваний женщин репродуктивного возраста. По статистике в нашей стране регистрируется 26-36 млн. случаев острого цистита в год. Такая высокая заболеваемость свидетельствует об актуальности и необходимости поиска безопасных, эффективных, не оказывающих побочных эффектов лекарств, к которым, прежде всего, относятся фитотерапевтические средства.

В этом аспекте заслуживает внимания изучение отдельных представителей семейства вересковые (Ericaceae Juss.), в частности грушанки круглолистной (Pyrola rotundifolia L.) и зимолюбки зонтичной (Chimaphila umbellata (L.) W. Barton), которые сходны с таким классическим лекарственным растением, издавна применяемым для лечения урологических заболеваний, как толокнянка обыкновенная (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.), относящаяся к тому же семейству, и вместе с тем они обладают определенными преимуществами. Так, ранее установлено, что грушанка обладает более выраженным противовоспалительным действием и проявляет терапевтическую эффективность при экспериментальном гломерулонефрите (Т.Н. Пензина, 1999). Для зимолюбки характерна противогрибковая активность (J.J. Galvan et al.5 2007). В то же время в сравнении с толокнянкой в химическом отношении грушанка и зимолюбка исследованы недостаточно.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования явилось сравнительное фармакогностическое изучение грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной для обоснования возможности использования дополнительных источников растительного сырья в медицинской практике.

Для реализации поставленной цели следовало решить следующие задачи:

- изучить данные литературы по современному состоянию морфоло-го-анатомических, фитохимических и фармакологических исследований объектов диссертационной работы;

- предпринять сравнительное изучение химического состава листьев исследуемых растений, в частности различных элементов, аминокислот, веществ вторичного метаболизма, главным образом фенольных соединений (простых фенолов, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, дубильных веществ);

- подобрать и адаптировать методики количественного определения отдельных групп фенольных соединений в сырье каждого изучаемого растения после предварительного выявления оптимальных условий их проведения;

- определить содержание отдельных групп фенольных соединений в образцах сырья, заготовленных в различных регионах РФ и реализуемых в аптеках;

- проанализировать сезонную динамику накопления действующих веществ в листьях грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной для выявления оптимальных сроков их заготовки;

- провести сравнительный хромато-масс-спектрометрический и мор-фолого-анатомический анализ листьев изучаемых растений;

- определить числовые показатели листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и разработать проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП) «Листья зимолюбки зонтичной», «Листья грушанки круглолистной» и проект изменения к фармакопейной статье (ФС) ГФ XI «Листья толокнянки».

Научная новизна работы. С использованием современных физико-химических методов анализа (хромато-масс-спектрометрия, ВЭЖХ, масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, спектрофотометрия и др.) предпринято сравнительное фотохимическое изучение листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной.

Методом масс-спектрометрии определено содержание 5 макро-, 53 микро- и ультрамикроэлемента в листьях изучаемых растений.

При анализе аминокислотного состава листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки выявлены 8 незаменимых и 11 заменимых аминокислот.

Подобраны и адаптированы методики количественного определения арбутина, флавоноидов и гидроксикоричных кислот в листьях каждого исследуемого растения.

Проведен сравнительный хромато-масс-спектрометрический и морфо-лого-анатомический анализ листьев грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной.

Результаты исследований нашли отражение в проектах ФСП «Листья зимолюбки зонтичной», «Листья грушанки круглолистной», и в проекте изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки» в разделе «Количественное определение».

Практическая значимость работы. Предложены методики стандартизации листьев изучаемых растений по отдельным показателям, позволяющие объективно оценивать их доброкачественность.

На основании проведенных исследований составлены и внедрены:

- спектрофотометрические методики количественного определения отдельных групп фармакологически активных веществ (суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот, арбутина) в листьях грушанки круглолистной (акт о внедрении от 21.10.2009 г. в учебный процесс кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Минздравсоцразвития РФ»);

- спектрофотометрическая методика количественного определения арбутина в листьях грушанки круглолистной (акт о внедрении от 17.06.2009 г. в учебный процесс кафедры управления и экономики фармации с курсами фармакогнозии и ботаники, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ»).

Особенности исследовании отражены в проектах ФСП «Листья зимо-любки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной» и в проекте изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки».

Положения, выносимые на защиту:

- результаты определения элементного и аминокислотного состава сырья грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной;

- данные сравнительного фитохимического изучения сырья исследуемых растений,

- особенности сравнительного хромато-масс-спектрометрического и морфолого-анатомического анализа листьев объектов исследования,

- итоги разработки проектов нормативной документации (НД).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обобщены на конгрессе «Традиционная медицина-2007» (Москва, 2007); научно-практических конференциях: «Фармация и здоровье» (ПГФА, Пермь, 2005), «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования» (Уфа, 2006), «Лекарства - человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств» (НФаУ, Харьков, 2006), «Современные вопросы теории и практики лекарствоведения» (ЯГМА, Ярославль, 2007), «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (БГУ, Белгород, 2008), «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (ПГФА, Пермь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Акту ( альные вопросы медицинской науки» (ЯГМА, Ярославль, 2009); на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых ЯГМА (Ярославль, 2006-2010); на межкафедральной научной конференции кафедр фармакогнозии и ботаники, фармацевтической и токсикологической химии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, фармакологии ЯГМА (Ярославль, 2010 г.).

Апробация работы проведена на межкафедральной научной конференции фармацевтического факультета Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова (12 октября 2010 г.).

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликована 30 работ, из них 7 в журналах, в том числе 2 статьи в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК», и 3 статьи в зарубежных журналах.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО ЯГМА Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (номер государственной регистрации 01.20.0600898). Тема утверждена на заседании Учёного совета ЯГМА (протокол № 2 от 19.10.2005).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. Она иллюстрирована 27 рисунками и 44 таблицами. Список литературы включает 262 источника, из них 56 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в листьях грушанки круглолистной, зимолюбки зонтичной и толокнянки обыкновенной определено содержание 5 макро- (Са, Mg, Na, Р, Si), 53 микро- и ультрамикроэлемента (Ag, As, В, Ва, Bi, Br, Се, Cd, Со, Cs, Cr, Си, Dy, Er, Ей, Fe, Ga, Gd, Ge, Hf, Hg, Ho, I, La, Li, Lu, Mn, Mo, Nb, Nd, Ni, Pb, Pr, Rb, Sb, Se, Sm, Sn, Sr, Та, Tb, Те, Th, Ti, Tl, Tm, U, V, W, Y, Yb, Zn, Zr), среди которых больше всего содержалось Са, Mg, Si, Fe, Mn, Ba, Sr, и выявлено, что проанализированные образцы является экологически безопасными.

2. Проведен сравнительный анализ аминокислотного состава листьев изучаемых растений, в результате которого обнаружено 19 аминокислот, из которых 8 являлись незаменимыми (Val, lie, Leu, Met, Lys, OH-Lys, Thr, Phe) и 11 заменимыми (Ala, Gly, Ser, Tyr, Cys, Asp, Glu, Arg, His, Pro и OH-Pro), и отмечено, что их больше всего содержалось в листьях грушанки.

3. Экспериментально подобраны и адаптированы применительно к листьям каждого исследуемого растения спектрофотометрические методики количественного определения отдельных групп фенольных соединений (арбутина, суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот) путем определения оптимальных условий их проведения. Проведена метрологическая характеристика методик.

4. С помощью адаптированных методик проанализированы различные образцы листьев (более 15 для каждого исследуемого вида), определены средние значения концентраций арбутина, суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот, дубильных веществ, в результате сравнения которых обнаружено, что больше всего арбутина содержалось в листьях зимолюбки, а дубильных веществ - в толокнянке.

5. При изучении динамики накопления фенольных соединений в течение вегетационного периода в листьях грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной выявлены оптимальные сроки их заготовки в Ярославской области, приходящиеся на конец лета — начало осени (август-сентябрь).

6. При сравнительном хромато-масс-спектрометрическом анализе природных соединений листьев грушанки, зимолюбки и толокнянки идентифицированы 44 вещества, представленные фенольными соединениями, три-терпеноидами, органическими и жирными кислотами, углеводами и другими соединениями.

7. При морфолого-анатомическом анализе исследуемых листьев отмечено, что по внешним признакам весьма сходны зимолюбка и толокнянка, в то время как по микродиагностическим признакам - грушанка и зимолюбка.

8. Установлены отдельные числовые показатели для листьев грушанки круглолистной и зимолюбки зонтичной (влажность, содержание золы общей и нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание экстрактивных веществ).

9. На основе проведенных исследований разработаны проекты фармакопейных статей предприятия «Листья зимолюбки зонтичной» и «Листья грушанки круглолистной», а также предложен проект изменения к ФС ГФ XI «Листья толокнянки» в разделе «Количественное определение».