Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование и стандартизация корней щавеля конского (Rumex confertus Willd)

На правах рукописи

Зайцева Надежда Вячеславовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОРНЕЙ ЩАВЕЛЯ КОНСКОГО сШМЕХ СОМРЁЯТШ \VILLD.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

17 ДПР 2014

Самара-2014 ,

005547124

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, доцент Авдеева Елена Владимировна Официальные оппоненты:

Пупыкина Кира Александровна, доктор фармацевтических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, профессор кафедры

Гармонов Сергей Юрьевич, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет», кафедра аналитической химии, сертификации и менеджмента качества, профессор кафедры

Ведущая организация:

Пятигорский медико-фармацевтический институт, филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального учреждения «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «05» июня 2014 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171) и на сайте ГБОУ ВПО СамГМУ (http://www.samsmu.ru/science/referats/2014/zaiceva2')

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственное растительное сырье, содержащее антраценпроизводные, было и остается в центре внимания исследователей, занимающихся разработкой слабительных лекарственных средств. В этом ряду традиционно рассматриваются сенна остролистная (Senna acutifolia, семейство Бобовые - Fabaceae), крушина слабительная (Rhamnus cathartica, семейство Крушиновые - Rhanmaceae) и, в меньшей мере, - ревень пальчатый (Rheum palmatum, семейство Гречишные - Polygonaceae) и щавель конский (Rumex confertus, семейство Гречишные - Polygonaceae).

Популярность лекарственных растительных препаратов объясняется целым рядом преимуществ, характерных для фитопрепаратов, особенно при лечении хронических заболеваний, в том числе при терапии желудочно-кишечных патологий (Киселева T.JL и др., 2008; Куркин В.А., 2007; СамылинаИ.А. и др., 2003; 2010). Одним из лекарственных растений, потенциал которого с позиций современной медицины и фармации раскрыт далеко не в полой мере, является щавель конский. Так, накопился ряд вопросов относительно полноты и доказательности сведений по химическому составу и решения проблемы стандартизации сырья данного растения. Кроме того, сдерживающим фактором для применения щавеля конского в научной фармации и медицине является недостаточная изученность химического состава, отсутствие обоснованных подходов к оценке качества лекарственного растительного сырья (JIPC), а также ряд других нерешенных вопросов. Поэтому, на наш взгляд, перспективными и первоочередными направлениями исследований являются углубленное изучение данного растения как сырьевого источника биологических активных соединений (БАС), решение вопросов стандартизации, обоснование рационального использования JIPC «Щавеля конского корни» для получения лекарственных средств.

Актуально в этой связи и совершенствование нормативной документации (НД), особенно в части отражения в ней фитохимических параметров качества корней щавеля конского. В частности, в ВФС 42-1077-81 и других видах утвержденной НД отсутствуют разделы качественной и количественной оценки содержания БАС в обсуждаемом JIPC, а описанные в литературе методики

являются громоздкими и имеют ряд недостатков (анализ не нативной гаммы антрагликозидов, а продуктов их гидролиза, потери анализируемых веществ в ходе пробоподготовки, неточность, не оптимальный выбор вещества-стандарта и другие проблемы).

Таким образом, данные изучения химического состава и решение указанных аналитических проблем для изучаемого сырья и разрабатываемых лекарственных препаратов на его основе позволит с позиций современных требований к фармакопейному анализу (объективность, унификация методик, использование веществ-стандартов) гарантировать качество ЛРС «Щавеля конского корни» и соответствующих фитопрепаратов, а также сделает более рациональным использование растения в научной медицине и фармации.

Цель и задачи исследования. Фармакогностическое исследование и совершенствование методов стандартизации корней щавеля конского (Яйтех соп/ёгШ \VilId., сем. Гречишные - Ро^опасеае).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение химического состава корней щавеля конского.

2. Анатомо-гистологическое исследование корней щавеля конского для выявления диагностических признаков данного вида ЛРС.

3. Разработка новых подходов к стандартизации корней щавеля конского с позиции определения ведущей группы БАС.

4. Разработка методик качественного анализа корней щавеля конского (на наличие антраценпроизводных).

5. Разработка методики количественного определения суммы антраценпроизводных в корнях щавеля конского.

6. Изучение слабительных свойств и токсичности водных и водно-спиртовых извлечений корней щавеля конского и обоснование получения экстракционного препарата «Щавеля экстракт густой»; изучение его параметров качества.

7. Разработка проекта ФС «Щавеля конского корни» для включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания.

Научная новизна. В результате изучения химического состава корней щавеля конского (Яитех соп/ёгШ >УШс1.) выделены и идентифицированы с использованием УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также

результатов химических превращений 8 индивидуальных соединений: 8-0-Р-Э-глюкозид эмодина, эмодин, хризофанеин, хризофанол, фисцион

(антрахиноны), 8-0-р-0-глюкопиранозид неподина (непозид), неподин, 8-0-р-Б-глюкопиранозид торахризона (производные нафталина). Установлено, что доминирующими компонентами сырья данного растения являются эмодин и 8-О-р-О-глюкопиранозид эмодина. Для неподина и непозида, выделенных ранее из корней щавеля конского, впервые приведены данные 'Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а 8-0-Р-Б-глюкопиранозид торахризона впервые описан для корней щавеля конского.

Показана целесообразность проведения стандартизации сырья по антраценпроизводным (ведущая группа БАС) с использованием 8-О-р-О-глюкозида эмодина в качестве вещества-стандарта. Обоснованы аналитические подходы, заключающиеся в обнаружении диагностически значимого (из числа доминирующих) антраценпроизводного 8-0-р-0-глгокозида эмодина в корнях щавеля конского с использованием ТСХ-анализа и спектроскопии (качественный анализ), и оценки содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на указанное вещество-стандарт методом дифференциальной спектрометрии (количественное определение).

При изучении диагностических анатомо-гистологических признаков ЛРС впервые описаны склереиды, находящиеся на продольном срезе коровой части корня щавеля конского, которые важно отличать от лубяных волокон. С использованием гистохимической реакции с щелочными реагентами выявлены особенности локализации антраценпроизводных: в основной паренхиме вторичной коры и паренхиме сердцевинных лучей.

На основании результатов морфолого-анатомических, фитохимических, аналитических исследований и данных изучения нормируемых параметров качества ЛРС разработан проект ФС «Щавеля конского корни», который принят ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» МЗ РФ для включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания.

Практическая значимость. Разработаны методики качественного анализа корней щавеля конского с использованием ТСХ и спектроскопии. В основе методики ТСХ-анализа лежит обнаружение в предложенных условиях

диагностически значимого антрахинона - 8-0-Р-0-глюкозида эмодина. Кроме того, в целях дополнительной идентификации и оценки доброкачественности JIPC предложен анализ электронного спектра в области от 190 до 700 нм щелочно-аммиачного раствора спирто-водного извлечения из корней щавеля конского, для которого характерен основной максимум поглощения при 520 нм ± 2 нм (антраценпроизводные). В плане совершенствования подходов к стандартизации также разработана методика количественного определения суммы антраценпроизводных в корнях щавеля конского с использованием дифференциальной спектрометрии (аналитическая длина волны — 520 нм) и 8-О-Р-О-глюкозида эмодина в качестве вещества-стандарта, что исключило стадии пробоподготовки и последующих превращений (с потерями) анализируемых веществ в ранее используемых методиках. В результате в проект ФС «Щавеля конского корни» введены новые разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» и предложена соответствующая формулировка в разделе «Числовые показатели»: содержание суммы антраценпроизводных не менее 4,0%.

В результате технологических исследований получен ряд фитосубстанций с использованием в качестве экстрагента спирта этилового в различных концентрациях и воды; для них изучена слабительная активность с позиций установления дозозависимого эффекта (в т.ч. в сравнительном аспекте с некоторыми другими официнальными растениями, содержащими антрагликозиды) и безопасности. В результате выбор сделан в пользу использования в качестве экстрагента спирта этилового 40%, найдена эффективная минимальная доза (25 мг/кг) для развития статистически значимого слабительного эффекта в эксперименте; итогом данного фрагмента работы явилась разработка лекарственного препарата «Щавеля экстракт густой» (который может представлять в дальнейшем интерес в плане создания на его основе таблетированных и капсулированных лекарственных форм); для него предложен состав, способ получения и изучены параметры качества. Оформлено рационализаторское предложение «Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в лекарственном растительном сырье - корнях щавеля конского» (2012 г.), а также получено положительное решение от 18.02.214 г. о выдаче патента на изобретение «Способ

количественного определения суммы антраценпроизводных веществ в корнях щавеля конского» (заявка № 2012136082, опубликована в бюл. № б от 27.02.2014 г.).

Разработанные методики качественного и количественного анализа корней щавеля конского внедрены в учебный и научный процесс кафедр фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии и химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России. Результаты диссертационных исследований включены в методические материалы практических занятий и лекций для студентов, интернов и аспирантов в ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, а также используются в работе ГБУ здравоохранения «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области» и ЗАО «Самаралектравы» (акты внедрения от 12.02.2014 г. и 19.12.2013 г. соответственно).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты анатомо-гистологического исследования корней щавеля конского.

2. Результаты изучения химического состава корней щавеля конского и разработка способа получения 8-0-Р-Б-глюкозида эмодина (доминирующего антрагликозида, предложенного в качестве вещества-стандарта).

3. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации ЛРС «Щавеля конского корни».

4. Методики качественного анализа ЛРС «Щавеля конского корни» с использованием ТСХ и спектроскопии.

5. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в пересчете на 8-0-Р-Б-глюкозид эмодина в ЛРС «Щавеля конского корни» с использованием дифференциальной спектрометрии.

6. Данные изучения специфической фармакологической активности и токсичности различных экстракционных препаратов корней щавеля конского (отличные по используемому экстрагенту и способам получения) и обоснование перспектив разработки нового слабительного средства «Щавеля экстракт густой».

7. Данные по разработке нормативной документации (НД) на сырье - ФС «Щавеля конского корни» для включения в XII издание Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по теме: «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ Государственной регистрации 01200900658), а также соответствует тематике Проблемной комиссии по химико-фармацевтическим наукам Университета.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на II Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2011 г.), на Всероссийских конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2011, 2012, 2013 гг.), на научно-практической конференции «Аспирантские чтения» (Самара, 2012, 2013 гг.), III Международной виртуальной Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (2014 г.).

Основное содержание диссертации опубликовано в 16 научных работах, из них 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 121 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований, их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 145 источников, из которых 37 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту. Глава 1

содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований щавеля конского, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике и другим вопросам. В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья и индивидуальных веществ, а также технологические способы получения экстракционных препаратов на основе изучаемого вида ЛРС и методики фармакологического исследования. В главе 3 обсуждаются результаты анатомо-морфологического исследования корней щавеля конского и обоснование специфических анатомо-гистологических признаков корней разных анатомических зон и стадий развития. В главе 4 приведены результаты исследования химического состава корней щавеля конского (выделение, очистка и установление структуры индивидуальных веществ) и способ получения диагностически значимого 8-0-р-О-глюкозида эмодина, предложенного в качестве вещества-стаНдарта. В главе 5 рассматриваются результаты исследований по совершенствованию методов стандартизации корней щавеля конского. В главе б дано обоснование целесообразности расширения номенклатуры отечественных (эффективных и безопасных) лекарственных средств растительного происхождения путем разработки густого экстракта корней щавеля и рассмотрения его с позиций как самостоятельного слабительного фитопрепарата (по результатам фармакологических исследований), так и в качестве лекарственной субстанции для создания на последующих этапах твердых лекарственных форм. В приложение вынесены материалы по разработке НД на сырье - проекта ФС «Щавеля конского корни» и акты внедрения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Анатомо-морфологическое исследование корней щавеля конского

Исследования морфолого-анатомического строения корней щавеля конского (рис. 1-3) различных стадий развития (отличаются диаметром) проводили с использованием цифрового микроскопа Мо^с БМ111 (с кратностью увеличения 4x10; 10><10; 40x10; 100x10) и стереоскопического цифрового микроскопа Мо^с ОМ-39С-Ы9СО-А (с увеличением * 20 и х 40). Анализ корней диаметром 3-5 мм позволил выявить ряд диагностических признаков. Так, покровная ткань корней вторичного строения представлена пробкой (рис. 1). Пробковый слой состоит не только из старых слущивающихся слоев, но также имеет новые слои, состоящие из ровных 3-5 рядов клеток, правильной прямоугольной формы.

На продольном срезе коровой части хорошо видны элементы механической ткани - склереиды. Они представлены клетками округлой формы, желтого цвета со щелевидным просветом посередине. В клеточных стенках склереид отсутствуют или изредка видны поровые каналы (рис. 2).

С точки зрения диагностики корней щавеля конского, важно отличать склереиды от лубяных волокон, которые локализуются во флоэме корня (рис. 3). Лубяные волокна в поперечном сечении напоминают склереиды, однако они имеют продолговатую, прозенхимную форму, что хорошо заметно на продольном срезе. Волокна исходно желтого цвета с утолщенными клеточными стенками располагаются как одиночно, так и группами (рис. 3).

Таким образом, выявлены дополнительные диагностически значимые признаки: склереиды, находящиеся на продольном срезе коровой части корня щавеля конского, и особенности локализации антраценпроизводных - в основной паренхиме вторичной коры и паренхиме сердцевинных лучей (устанавливается гистохимической реакцией со щелочью).

Рис. 1. Корень щавеля конского диаметром 3-5 мм. Поперечный срез

А - общий вид (х20); Б - фрагмент коры (х 100). Окраска раствором щелочи. Обозначения: 1 - пробка; 2 - паренхима коры; 3 - камбий; 4 -сосуды ксилемы; 5 - первичная ксилема; 6 - каменистые клетки; 7 - друзы

Рис. 2 Склереиды корня щавеля конского. Продольный срез (х 400)

Обозначения: 1 - паренхима коровой части; 2 - склереиды; 3 - пробка.

м 1'

Рис. 3. Коровая часть корня щавеля конского. Продольный срез

А - общий вид (х 100); Б - паренхима коровой части (х 400) Обозначения: 1 - паренхима коровой части; 2 - пробка; 3 - склереиды; 4 - лубяные волокна.

2. Исследование химического состава корней щавеля конского

С учетом сложного химического состава корней щавеля конского для выделения индивидуальных соединений, их разделения и очистки потребовалось сочетание различных хроматографических и экстракционных методов.

Препаративное разделение суммарных спирто-водных извлечений осуществлялось с использованием невысоких слоев сорбента (в основном полиамид и силикагель). При этом для элюирования веществ использовались хлороформно-спиртовые и водно-спиртовые системы в различных соотношениях. Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялась с помощью гексана, хлороформа, спирта этилового, спирта метилового и воды. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировалась методами ТСХ и ВЭЖХ.

Спектры ЯМР- 'Н получали на приборах «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

В результате изучения компонентного состава корней щавеля конского выделены и охарактеризованы антраценпроизводные — S-O-ß-D-глюкозид эмодина, эмодин, хризофанеин, хризофанол, фисцион (1-5), а также производные нафталина - S-O-ß-D-глюкопиранозид неподина (непозид), неподин, S-O-ß-D-глюкопиранозид торахризона (6-8).

Определено, что доминирующими компонентами сырья данного растения являются эмодин и S-O-ß-D-глюкопиранозид эмодина, строение которых установлено с использованием масс-спектрометрии, УФ- и 'Н-ЯМР-спектроскопии( рис. 4 и 5). Для неподина и непозида, выделенных ранее из корней щавеля конского, впервые приведены данные 1 Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а B-O-ß-D-глюкопиранозид торахризона (8) впервые описан для корней щавеля конского.

Эмодин (I): Я = ОН; Хризофанол (3): И. = Н; Фисцион (5): Я = ОСН3

8-0-р-0-Глюкопиранозид эмодина (2): Я = ОН;

Хризофанеин (4): Я = Н

Непозид (7): Я = Н; Неподин (6) 8-0-Р-0-глюкопиранозид торахризона (8):

Я = ОСН3

Причем соединение 8 было выделено ранее из корней ревеня обыкновенного (Polygonaceae) и листьев некоторых видов кассии (РаЬасеае). На наш взгляд, это подтверждает мнение ученых относительно того, что гидроксипроизводные нафталина, к которым относятся также неподин (6) и непозида (7), участвуют в биосинтезе антраценпроизводных.

libiYFÍ " ' 'ш#<¥ ' ' УтгШН Ж

Рис. 4. 'Н-ЯМР спектр эмодина в дейтерированном ДМСО

пнвуяиаядяаетсюаз шигтетиояяиытитиияияткамимло п-ч'чк utiiw Ü U ■>.....>. : i—. л: ¡ NMR/5054614) ! [ Г w Г 1 г

ж х нш vr^rrwr-rif

Рис. 5. 'Н-ЯМР спектр S-O-ß-D-глюкопиранозид эмодина в дейтерированном ДМСО

3. Исследования по совершенствованию методов стандартизации

корней щавеля конского и лекарственных препаратов на их основе

С использованием полученных данных по химическому составу корней щавеля конского, а также с учетом разработанного способа выделения одного из доминирующих и диагностически значимых соединений - антрахинона 8-0-р-О-глюкозида эмодина, рассматриваемого нами в контексте решения проблемы стандартизации в качестве вещества-стандарта, были предложены новые подходы к оценке качества сырья.

3.1. Качественный анализ корней щавеля конского

С целью определения подлинности ЛРС «Щавеля конского корни» использовали ТСХ-анализ, основанный на обнаружении и идентификации 8-0-Р-О-глюкозида эмодина, а также оценивался характер спектра поглощения спирто-водного извлечения из ЛРС.

3.1.1. ТСХ-анализ

В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющие эффективно разделить основные компоненты сырья и однозначно идентифицировать анализируемое соединение.

В предложенных условиях тонкослойно-хроматографического разделения на пластинках «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» при просмотре в видимом свете обнаруживается доминирующие пятно, имеющее розовую окраску с величиной около 0,7 (хризофанол и реум-эмодин), а также ярко-розовое пятно с величиной около 0,6 (8-0-Р-Б-глюкозид эмодина).

о о ©

О

о

12 3 4

Рис. 6. Хроматографический профиль водно-спиртового извлечения из корней щавеля конского

Обозначения: 1 - водно-спиртовое извлечение; 2 - эмодин; 3 -хризофанол;

4 - 8-0-р-0-глюкозид эмодина

После обработки реактивом диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе карбоната натрия хроматографические и нагрева пластинок при температуре 110 С0 в течение 2 мин. в сушильном шкафу 8-0-р-0-глюкозид эмодина проявляется в виде хорошо заметного пятна оранжево-красного цвета (рис. 6). Также приобретают соответствующие желто-оранжево-красные окраски и другие соединения фенольной природы.

3.1.2. Спектр поглощения корней щавеля конского

Исследование электронных спектров показало, что максимум поглощения щелочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из корней щавеля конского (приготовленного для количественного определения) в длинноволновой области спектра находится при 520 нм ± 2 нм (рис. 7).

АЬимЬапсе

Рис. 7. Электронные спектры водно-спиртового извлечения из корней щавеля конского (разведение 1:2500)

Обозначения: 1 - раствор исходного спирто-водного извлечения из ЛРС;

2 - его щелочно-аммиачный раствор.

В длинноволновой области электронного спектра щелочно-аммиачного раствора 8-О-р-О-глюкозида эмодина также наблюдается четкий максимум поглощения при 520 нм ± 2 нм (рис. 8), что указывает на определяющий вклад данного доминирующего соединения и близких к нему по структуре и спектральным характеристикам в кривую светопоглощения при указанной аналитической длине волны. Обсуждаемые факты послужили основанием для включения в раздел «Качественный анализ» проекта ФС «Щавеля конского корни» не только методики ТСХ-анализа, но и характера спектра поглощения щелочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из ЛРС.

3.2. Количественное определение суммы антраценпроизводных в корнях щавеля конского

С целью разработки методики количественного определения суммы антраценпроизводных (с использованием метода дифференциальной спектрометрии) нами определены оптимальные условия экстракции антраценпроизводных в корнях щавеля конского: экстрагент - спирт этиловый 70%; соотношение сырье: экстрагент - 1:50; время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 90 мин.

Было установлено, что в качестве аналитической длины волны можно принять значение 520 нм, а стандартным образцом может служить доминирующий антрагликозид - 8-0-Р-Б-глюкозид эмодина (рис.8). В случае отсутствия стандарта в расчетной формуле может быть использовано установленное значение удельного показателя поглощения щелочно-аммиачного раствора вещества (Ек1) — 160.

Рис. 8. Электронные спектры щелочно-аммиачных растворов водно-спиртового извлечения из корней щавеля конского (1) и 8-0-Р-Б-глюкозида эмодина (2) (разведение 1:1250)

Метрологические характеристики методики количественного определения антраценпроизводных в корнях щавеля конского методом дифференциальной спектрометрии представлены в таблице 1.

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в корнях щавеля

X 5 Р, % UP.fi АХ Е, %

10 4,731 0,0978 95 2,23 ±0,218 + 3,85

Относительная ошибка опытов с добавками 8-0-р-0-глкжозида эмодина в сырье и спирто-водное извлечение находится в пределах ошибки единичного определения разработанной методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки данной методики.

С применением разработанной методики проанализирован ряд образцов сырья, и, в частности, заготовленных в мае - в срок, по результатам наших исследований (табл. 2), наиболее предпочтительный для сбора ЛРС, когда наблюдается пик содержания антраценпроизводных (в диапазоне 4,25 % ± 0,015 % - 5,56 % ± 0,017 %). Аналогично получены данные для образцов сырья, заготовленных в сентябре-начале октября (этот срок рекомендуется, причем в большинстве источников как более предпочтительный); наблюдается второй по величине максимум накопления антрагликозидов - на уровне 4,15 % -5,27 %. В этой связи нами предлагается в качестве нижнего предела показатель содержания суммы антраценпроизводных: не менее 4,0%, что нашло отражение в предложенной нами редакции проекта ФС «Щавеля конского корни».

Кроме того, в сравнительном плане нами было проведено исследование динамики накопления флавоноидов и дубильных веществ (по стандартным методикам) в корнях растения в течение вегетационного периода (табл. 2).

Данные результаты подтверждают целесообразность заготовки ЛРС прежде всего в весенний, а также возможность получения качественного сырья и в осенний период.

Таблица 2

Результаты сравнительного изучения динамики накопления основных БАС в корнях щавеля конского

Время заготовки сырья Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на 8-0-0-0-глюкозид эмодин, % Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, % Содержание дубильных веществ, %

05.05.12 г. 4,25 ± 0,03 - 4,55 ± 0,05

12.05.12 г. 5,56 ± 0,06 - 5,62 ± 0,08

22.05.12 г. 4,95 ± 0,05 - 2,96 ± 0,06

13.06.12 г. 3,70 ± 0,04 - 3,76 ±0,07

25.06.12 г. 4,05 ± 0,05 3,50 ± 0,06

02.07.12 г. 5,08 ± 0,05 0,08 ± 0,001 3,32 ± 0,04

11.07.12 г. 4,06 ± 0,04 0,05 ± 0,001 3,77 ± 0,06

03.08.12 г. 3,56 ±0,03 - 16,30 ± 0,07

14.08.12 г. 3,30 ± 0,03 - 15,50 ± 0,09

12.09.12 г. 4,15 ± 0,04 10,85 ±0,09

22.09.12 г. 5,27 ± 0,05 - 12,90 ± 0,08

02.10.12 г. 5,05 ± 0,05 - 9,02 ± 0,07

19.10.12 г. 4,67 ± 0,04 - 5,50 ± 0,09

4. Обоснование перспективности разработки новых лекарственных препаратов на основе сырья щавеля конского

С учетом полученных данных по химическому составу корней щавеля конского, потенциалу фармакологических свойств, а также с учетом целесообразности расширения номенклатуры отечественных лекарственных средств растительного происхождения на современном фармацевтическом рынке, нами предпринята попытка разработки экстракционного лекарственного препарата на основе изучаемого растения, основными действующими веществами которого являлась бы нативная гамма антрахинонов.

4.1. Стандартизация лекарственного препарата «Щавеля конского экстракт густого»

Исследовали лекарственный препарат «Щавеля конского экстракт густого» с использованием спирта этилового 40 % методом реперколяции с последующим сгущением. Полученный густой экстракт представляет собой вязкую темно-коричневую массу со специфическим запахом и вкусом.

С целью унификации методик анализа в ряду сырье - лекарственный препарат (Самылина И.А. и др., 1994; 2003; 2010), нами использовались подходы, разработанные для сырья корней щавеля конского. Для определения подлинности применяли метод ТСХ и УФ-спектроскопию. Хроматографический профиль, а также спектральные характеристики лекарственного препарата «Щавеля конского экстракт густого» сопоставимы с таковыми извлечения из корней щавеля конского.

4.1.1. Методика количественного определения суммы антраценнроизводных в густом экстракте щавеля конского

Около 0,2 г (точная навеска) густого экстракта щавеля конского растворяют при нагревании в 30 мл 40 % спирта этилового в колбе емкостью 100 мл. Полученный раствор переносят количественно в мерную колбу на 50 мл, доводят объем до метки 40 % спиртом этиловым и перемешивают (раствор А). Далее методику осуществляют в соответствии с подходами, разработанными для корней щавеля конского.

Содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на 8-О-р-О-глюкозид эмодина варьирует в пределах от 20,5 % ± 0,17 % до 24,8 % ± 0,19 %.

4.2. Изучение фармакологических свойств и токсичности водных и водно-спиртовых извлечений из корней щавеля конского

На базе кафедры фармакологии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России под руководством профессора A.B. Дубищева и доцента E.H. Зайцевой изучалось слабительное действие на белых беспородных крысах (полугодовалого возраста обоих полов, весом 180-220 г, содержащихся на стандартном рационе вивария) водных и водно-спиртовых извлечений на 40% и 70% спирте этиловом из корней щавеля конского в сравнительном аспекте с другими растениями, содержащими антрагликозиды (сенна, крушина обыкновенная).

Анализ полученных данных показал, что эффективны водные извлечения (приготовленные по общим правилам) всех растительных объектов в изучаемом диапазоне доз: 25 - 100 иг/кг в пересчете на антраценпроизводные, при этом для отвара из корней щавеля конского наиболее эффективна доза 50 мг/кг (активность сопоставима с эффектом отвара коры крушины), Извлечения корней щавеля конского на спирте этиловом 40 % оказались наиболее эффективными в плане проявления слабительного эффекта, причем в минимально изучаемой дозе 25 мг/кг, и существенно превосходят препараты сравнения - аналогичные извлечения из листьев сенны и коры крушины), что и было нами учтено в дальнейшем при выполнении технологической части работы по разработке густого экстракта щавеля конского.

Для «Щавеля экстракта густого» при изучении слабительного действия в параллельных экспериментах с экстрагентом (спирт этиловый 40 %) в эквивалентных дозах установлено аналогичное с исходными (неупаренными) водно-спиртовыми извлечениями действие; при этом статистически значимых отличий сравниваемых объектов (исходное извлечение и экстракт) не выявлено. Выраженность эффекта также была наибольшей (в 2,8 раза по сравнению с контролем) в дозировке 25 мг/кг (антраценпроизводные), которую следует считать исходной для последующей выработки рекомендаций по дозировке при использовании экстракта в медицинских целях. Для него также была изучена острая токсичность, показавшая, что даже в максимально возможной для введения животным дозировке (лимитируется емкостью желудка) не наблюдается гибели животных или иных токсических проявлений, что позволяет отнести изучаемый объект к классу малотоксичных веществ.

22

ВЫВОДЫ

1. Анатомо-гистологический анализ корней щавеля конского разных диаметров позволил впервые описать имеющие диагностическое значение склереиды, находящиеся на продольном срезе коровой части корня щавеля конского, и выявить особенности локализации антраценпроизводных, а также подтвердить имеющиеся данные об особенностях анатомического строения сырья.

2. В результате химического изучения корней щавеля конского выделено и охарактеризовано 8 индивидуальных веществ: 8-0-Р-0-глюкозид эмодина, эмодин, хризофанеин, хризофанол, фисцион (антрахиноны), в-О-р-Б-глюкопиранозид неподина (непозид), неподин, 8-0-р-0-глюкопиранозид торахризона (производные нафталина); установлено, что доминирующими компонентами сырья данного растения являются эмодин и в-О-Р-Б-глюкопиранозид эмодина, а в-О-Р-Б-глюкопиранозид торахризона впервые описан для корней щавеля конского.

3. Разработаны методики качественного анализа корней щавеля конского методами ТСХ и спектроскопии с использованием в качестве вещества -стандарта 8-О-Р-О-глюкозида эмодина.

4. Разработана методика количественного определения суммы антраценпроизводных в пересчете на 8-О-Р-О-глюкозид эмодина в корнях щавеля конского с использованием дифференциальной спектрометрии (аналитическая длина волны 520 нм).

5. На основе результатов фармакогностического исследования разработан проект ФС «Щавеля конского корни» с целью его включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания.

6. Разработана технология получения густого экстракта корней щавеля конского методом реперколяции и использованием спирта этилового 40% с содержанием антраценпроизводных не менее 20%; установлены его нормы качества.

7. Установлена статистически значимое слабительное действие густого экстракта корней щавеля конского и установлена его токсичность (класс малотоксичных веществ).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Зайцева, Н.В. Сравнительное исследование химического состава различных органов щавеля конского / Н.В. Зайцева // Аспирантский вестник Поволжья. -2012. - № 5-6. - С. 279-281.

2. Зайцева, Н.В. Перспективы комплексного использования щавеля конского / Н.В. Зайцева, В.А. Куркин, Е.В. Авдеева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2012. — Том 14. - № 1 (9). - С. 2222-2225.

3. Зайцева, Н.В. Научное обоснование целесообразности применения в медицине различных органов щавеля конского (Rumex confertus Willd.) / Н.В. Зайцева, В.А. Куркин, E.B. Авдеева // Традиционная медицина. -

2012,-№5.-С. 244-247.

4. Куркин, В.А. Определение антраценпроизводных в корнях щавеля конского / В.А. Куркин, Н.В. Зайцева, Е.В. Авдеева // Фармация. - 2013. - № 1. — С. 8-10.

5. Куркин, В.А. Антрахиноны и производные нафталина Rumex confertus / В.А. Куркин, Н.В. Зайцева, Е.В. Авдеева, Е.Д. Даева, В.И. Каденцев // Химия природных соединений.-2013. - № 1.-С. 118-119.

6. Куркин, В.А. Анатомо-морфологическое исследование корней щавеля конского (Rumex confertus Willd.) / В.А. Куркин, Н.В. Зайцева, Е.В Авдеева, В.М. Рыжов, JI.B. Тарасенко // Медицинский альманах. —

2013.-№ 1.-С. 196-198.

7. Зайцева, Н.В. Исследование химического состава Rumex confertus / Н.В. Зайцева // Бюллетень Северного государственного медицинского университета (выпуск XXIX). - Архангельск, 2012. - № 2. - С. 68-69.

8. Зайцева, Н.В. Фитохимическое исследование различных сырьевых органов щавеля конского / Н.В. Зайцева // Санкт-Петербургские научные чтения - 2011: тезисы IV Международного молодежного медицинского конгресса. — Санкт-Петергбург, 2011. - С.364.

9. Зайцева, Н.В. Современные подходы к стандартизации корней щавеля конского / Н.В. Зайцева // Молодые ученые — медицине: материалы Всероссийской конференции с международным участием. - Самара, 2012.-С. 211-213.

10. Зайцева, H.B. Изучение диагностических признаков корней щавеля конского / Н.В. Зайцева, H.A. Язрикова, К.Н. Серикова // Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны: тезисы II Международной научно-практической конференции. — Пенза, 2012. — С. 251-255.

11. Зайцева, Н.В. Новые подходы к качественному и количественному анализу антраценпроизводных в корнях щавеля конского / Н.В. Зайцева // Современные проблему медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств: материалы IV Всероссийской научно-практического семинара молодых ученых с международным участием. -Волгоград: Издательство ВолГМУ, 2012 . — С. 31.

12. Зайцева, Н.В. Качественное и количественное определение антраценпроизводных в корнях щавеля конского / Н.В. Зайцева // Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности: тезисы Всероссийской молодежной научной школы. -Самара,2012.-С. 86-87.

13. Зайцева, Н.В. Изучение комплекса биологически активных соединений в корнях Rumex confertus / Н.В. Зайцева // Молодые ученые - медицине: материалы Всероссийской конференции с международным участием. -Самара, 2013. - С. 277-280.

14. Зайцева, Н.В. Сравнительное изучение надземных и подземных органов щавеля конского {Rumex confertus Willd.) / Н.В. Зайцева, B.A. Куркин, E.B. Авдеева, H.A. Язрикова, К.Н. Серикова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов 68-й научной конференции по фармации и фармакологии Пятигорского медико-фармацевтического института — филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ. — Волгоград, 2013. - С. 50 - 51.

15. Зайцева, Н.В. Изучение слабительного действия корней щавеля конского / Н.В. Зайцева // Биотехнология. Взгляд в будущее. [Текст]: III Международная научная Интернет-конференция: материалы конф. (Казань, 25 - 26 марта 2014 г.) / Сервис виртуальных конференций Pax Grid; сост. Синяев Д. Н. - Казань: ИП Синяев Д.Н., 2014. - ISBN том 1 978-5-906217-49-3.

16. Kurkin, V.A . Anthraquinones and naphthalene derivatives of Rumex confertus / V. A. Kurkin, N. V. Zaitseva, E. V. Avdeeva, E. D. Daeva, V. I. Kadentsev // Chemistry of Natural Compounds. - 2013.-№ l.-pp. 135-136.

Подписано в печать 04.04.2014 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,4 усл. печ. л. Тираж 110 экз. Заказ № 520.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П. Тел.: 372-00-56, 372-00-57.