Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Эвкалимин-новый растительный препарат антибактериального действия

ЦЕНТР ПО ХИМИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

КРУТИКОВА НАТАЛИЯ МАКАРЬЕВНА

ЭВКАЛИМИН - НОВЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ

14.00.25 - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Р Г О ОД 0 2 ИЮН 1997

УДК

Москва -1997

Работа выполнена в Научно-производственном объединении "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" РАСХН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор С.А.Вичканова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Ю.А.Ревазова

доктор биологических наук М.Ф. Минеева

Ведущее учреждение:

Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится " ¿(0" ¡/С((7и\_. 1997 года

в_часов на заседании специализированного Совета

при ЦХЛС Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦХЛС ВНИХФИ

Автореферат разослан "'/?" ц/с/а-гил 997

Ученый секретарь специализированного Совета Д.074.53.01.,

кандидат биологических наук В.Б.Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Современный уровень накопленных знаний в области применения антибактериальных препаратов позволяет сегодня делать прогнозы в отношении химиотерапии будущего. Более нем 50-летний опыт применения антибиотиков и синтетических химиотера-певтичесих препаратов показал, что они всегда будут сохраняться в арсенале средств лечения бактериальных инфекций, а номенклатура их расширяться. Но как известно, постоянное внедрение в клиническую практику все новых групп антибактериальных препаратов не решает проблему лекарственной устойчивости или ослабляет ее лишь на короткое время, поскольку этот процесс каждый раз сопровождается селекцией резистентных штаммов к новым группам антибиотиков, возникновением и выявлением новых механизмов устойчивости как ответной реакции микроорганизмов на неблагоприятные воздействия среды их обитания (ЕШ.Покровский, Н.А.Семина, И.П.Фомина и соавт., 1991; В.П.Яковлев, 1992).

Среди лечебных средств, обладающих антимикробной активностью, особую группу представляют ингибиторы микроорганизмов среди веществ растительного происхождения, для которых быстрое развитие к ним лекарственной резистентности у микроорганизмов не характерно. Эти препараты отличаются, как правило, наличием противовоспалительных или других дополнительных благоприятных биологических свойств, а также хорошей переносимостью в терапевтических дозах (С.А.Вичканова, 1981). Их применение отвечает, на наш взгляд, "тенденции развития современной науки, создающей предпосылки для открытия новых направлений фармакотерапии и профилактики, создания более "физиологичных", безвредных лекарств" (М.Д.Машковский, 1992).

Многолетние медико-биологические исследования, проводимые во ВНИИ лекарственных и ароматических растений, связанные с изучением свойств растения Eucalyptus viminalis Labill., показали перспективность как применения самого эвкалипта прутовидного в медицине, так и разра-

ботки препаратов на его основе (С.А.Вичканова, С.Б.Изосимова, Н.М.Джанашия, 1970; Н.М.Джанашия, В.И.Глызин, 1970; С.А.Вичканова, Э.Е.Алешинская и др., 1971; С.Б.Изосимова, С.А.Вичканова, Н.М.Джанашия, 1973; С.А.Вичканова, Н.М.Джанашия, Л.В.Горюнова, 1973; С.А.Вичканова, 1981; С.А.Вичканова, В.В.Адгина и соавт., 1988, 1990, 1992). Создание на основе этого растения нового оригинального отечественного препарата антибактериального и противовоспалительного действия эвкалимина и перспектива использования его в практической медицине свидетельствует об актуальности медико-биологических исследований данного препарата.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Настоящее исследование посвящено медико-биологическому изучению эвкалимина - нового лечебного средства антибактериального действия из эвкалипта прутовидного с целью экспериментального обоснования его применения в медицинской практике и обеспечения контроля качества препарата.

Для достижения этой цели предстояло выполнить следующий ряд задач:

- изучить эффективность эвкалимина в отношении современных патогенных возбудителей различных инфекционных гнойно-воспалительных заболеваний;

- изучить вероятность возникновения резистентности патогенных микроорганизмов к эвкалимину;

- изучить химиотерапевтическую эффективность эвкалимина на экспериментальных моделях бактериальных инфекций;

- разработать биологический метод стандартизации эвкалимина.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ВНИИ лекарственных и ароматических растений (НПО "ВИЛАР" РАСХН) по проблеме 1300100860 (номер государственной регистрации 01860074455).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. Впервые систематически изучена антимикробная активность эвкалимина, представляющего собой сумму терпеноидных фенолоальдегидов флороглюцинового ряда (эуглобали), в отношении клинических штаммов патогенных микроорганизмов, обладающих моно- и полирезистентностью к применяемым в настоящее время антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам. При этом выявлена высокая эффективность его бактериостатиче-ского действия на стафилококки, стрептококки, пневмококки, энтерококки и токсигенные штаммы возбудителя дифтерии.

Впервые показано в условиях эксперимента отсутствие снижения чувствительности к эвкалимину патогенных микроорганизмов (на примере двух штаммов бактерий рода STAPHYLOCOCCUS).

Впервые доказана высокая химиотерапевтическая эффективность эвкалимина, превышающая активность хлорофиллипта, на экспериментальных моделях локализованных инфекций лабораторных животных, вызванных разными штаммами золотистого стафилококка, в том числе устойчивыми к широко применяемым в настоящее время антибиотикам.

Впервые разработан метод биологической стандартизации эвкалимина, доказывающий ответственность терпеноидных фенолоальдегидов (эуглобалей) за антибактериальную активность препарата и способствующий обеспечению высокого качества данного лекарственного средства уже на первых этапах его промышленного производства.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании доклинических исследований лекарственного препарата в виде суппозиториев для детей с содержанием эвкалимина 0,03 г (Suppositoria cum Eucalymino 0,03 pro infantibus) Фармакологическим Государственным Комитетом МЗ РФ разрешены клинические испытания данной лекарственной формы эвкалимина в 5 специализированных детских учреждениях (протокол №17 от 10.11.94 г). На основании проведенных экспериментальных исследований и последующей клинической апробации эвкалимин разрешен для приме-

нения в медицинской практике у детей и взрослых в виде 0,25% и 1% спиртовых растворов (Per. уд. 90/249/1 и 90/249/2), а также у взрослых в виде вагинальных и ректальных суппозиториев с содержанием эвкалими-на 0,05 г (Per. уд. 91/194/12 и 91/194/13). Инструкция по применению эв-калимина в указанных лекарственных формах утверждена Фармакологическим Государственным Комитетом МЗ РФ (23.07.91 г).

Разработанный метод биологической стандартизации эвкалимина вошел в стандарт предприятия (СТП) на рабочий стандарт (PCO) эвкалимина для биологического контроля субстанции эвкалимина (приказ № 238 от 05.12.89 по НПО "ВИЛАР"). Использование при проведении НИР метода биологической стандартизации эвкалимина способствовало выделению биологически активных веществ, ответственных за его антибактериальное действие, разработке химического метода стандартизации данного препарата и разработке субстанции эвкалимина-стандарта. Показатели качества и стабильности образцов препарата "Эвкалимин", разработанные с использованием метода биологической стандартизации, включены в ВФС на препарат "Эвкалимин" и утверждены Фармакопейным Комитетом МЗ РФ (ВФС-42-1949-89).

Получен Патент №1438042 на изобретение "Способ получения вещества "Эвкалимин", обладающего антимикробной и противовирусной активностью" с приоритетом от 18.04.86 г.

Получен Патент №2032414 на изобретение "Способ получения препарата эвкалимин" с приоритетом от 21.07.92 г.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на Секции Ученого Совета НПО "ВИЛАР" по поискам БАВ и созданию новых лечебных препаратов (1980, 1993); на VII конференции молодых ученых ВНИИ лекарственных и ароматических растений (1985); на 1-ом Международном научном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты" (Москва, 1992); на 2-ом Международном научном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практи-

ческие аспекты" (Чебоксары, 1996); на расширенном межлабораторном заседании коллоквиума отдела медицины ВНИИ лекарственных и ароматических растений (1996).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертационной работы опубликовано 9 работ, получено 2 патента и утверждена 1 ВФС.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на стр. машинописного текста. Работа включает введение и 2 части: I часть - "Обзор литературы" (главы 1 и 2) и II часть - "Экспериментальные исследования" (главы 1, 2, 3, 4 и 5), обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложения. В тексте имеется 18 таблиц,

I рисунок. Список цитируемой литературы содержит ^¡сточника (/^отечественных и 43 зарубежных авторов).

В 1 главе обзора литературы приводятся сведения об особенностях основных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний на современном этапе. Во 2 главе I части представлены данные о применении эвкалиптов и препаратов из них в медицине, в том числе галеновых форм из разных видов эвкалиптов, эфирного масла и хлорофиллипта. В 1 главе

II части "Экспериментальные исследования" дана характеристика и антимикробный спектр препарата "Эвкалимин", разработанного во ВНИИ лекарственных и ароматических растений. Во 2 главе представлены результаты изучения эффективности эвкалимина в отношении ряда современных возбудителей различных инфекционных гнойно-воспалительных заболеваний. В 3 главе приведены результаты изучения возможности формирования лекарственной резистентности патогенных микроорганизмов к эвка-лимину. В 4 главе содержатся данные по изучению химиотерапевтической эффективности эвкалимина на экспериментальных моделях локализованных бактериальных инфекций (инфицированная рана, гнойная язва, стафилококковый вагинит). В 5 главе описан разработанный метод биологической стандартизации эвкалимина и его научное и практическое значе-

ние. Экспериментальные данные статистически обработаны и обобщены в таблицах.

Работа завершается обсуждением полученных результатов исследования и выводами. В приложения вынесены документы: Регистрационные удостоверения на эвкалимин и его лекарственные формы 90/249/1, 90/249/2, 91/194/12 и 91/194/13, инструкция по применению в медицинской практике препарата "Эвкалимин" антибактериального и противовоспалительного действия, решения Фармакологического Государственного Комитета МЗ РФ по препарату "Эвкалимин", копии патентов, ВФС 421949-89 на "Эвкалимин" и СТП 64-10-39-45-89 "Эвкалимин-стандартный образец для биологического контроля".

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ следующие положения:

- эвкалимин обладает ингибирующим действием в отношении современных клинических штаммов патогенных микроорганизмов, являющихся моно- и полирезистентностными к широко применяемым в настоящее время антибиотикам и синтетическим антибактериальным препаратам;

- эвкалимин не приводит к развитию лекарственной резистентности патогенных микроорганизмов;

- эвкалимин оказывает значительный химиотерапевтический эффект на экспериментальных моделях локализованных бактериальных инфекций;

- разработанный метод биологической стандартизации эвкалимина доказывает ответственность терпеноидных фенолоальдегидов (эуглобалей) за антимикробную активность препарата и способствует обеспечению высокого качества данного лекарственного средства уже на первых этапах его промышленного производства.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Обобщение данных литературы по проблемам антибиотикотерапии на современном этапе показало, что широкое, но, к сожалению, не всегда рациональное применение в практике антибиотиков и синтетических антибактериальных препаратов сопровождается

распространением лекарственноустойчивых бактерий, снижением эффективности антибиотикотерапии, возникновением вспышек инфекций, в том числе внутрибольничных. Расширение номенклатуры антибиотиков и внедрение в медицину все новых групп синтетических антибактериальных препаратов не решают всех проблем, связанных с возникновением анти-биотикорезистентности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся основными возбудителями инфекционных гнойно-воспалительных заболеваний. В связи с вышесказанным, в тактике антибактериальной терапии на сегодняшнем этапе важную роль могут сыграть антибактериальные препараты растительного происхождения.

Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА СОЗДАНИЯ ЭВКАЛИМИНА И ЕГО АНТИМИКРОБНЫЙ СПЕКТР Исследования, проведенные во ВНИИ лекарственных и ароматических растений в лаборатории антимикробных и противовирусных средств под руководством С.А.Вичкановой в 1970-1975 гг. показали, что эвкали-мин, выделенный из эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.) и охарактеризованный на том этапе как сумма фенольных соединений (Н.М.Джанашия, 1972), обладает широким спектром антимикробной и противовирусной активности (С.А.Вичканова, С.Б.Изосимова, Н.М.Джанашия, 1970; С.Б.Изосимова, С.А. Вичканова, Н.М.Джанашия, 1973; С.А. Вичканова, Н.М.Джанашия, JI.B. Горюнова, 1973). При клиническом испытании данного препарата (в лекарственных формах - спиртовые растворы, линимент и вагинальные шарики) был выявлен ряд преимуществ эвкалимина перед используемыми в то время лечебными средствами, особенно при лечении заболеваний верхних дыхательных путей (лечебный эффект в 91,3% случаев), как по эффективности, так и по возможности его применения при заболеваниях смешанной этиологии (С.А.Вичканова, 1981).

В связи с проведением в НПО "ВИЛАР" дальнейших НИР по усовершенствованию технологии эвкалимина была получена более очищенная

субстанция (далее "Эвкалимин"). Настоящая работа посвящена исследованию медико-биологических свойств эвкалимина (исследование ингиби-рующего действия в отношении современных патогенных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний, исследование вероятности возникновения устойчивости бактерий к эвкалимину, изучение химиотерапевти-ческой эффективности), разработке метода контроля качества препарата (биологическая стандартизация) с использованием его при изучении связи биологической активности и его химического состава.

Эвкалимин получают из листьев или побегов эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.) семейства миртовых (Myrtaceae). Эвкалимин является оригинальным препаратом и представляет собой очищенную сумму терпеноидных фенолоальдегидов флороглюцинового ряда (эуглобалей) и тритерпеноидов. За биологическую активность препарата ответственны фенолоальдегиды флороглюцинового ряда (эуглобали) формулы С23Н30О5 или С28Н38О5, имеющие общий фрагмент:

Эвкалимин - аморфный порошок серовато-кремового или серовато-кремового с зеленоватым оттенком цвета, со специфическим запахом, электризуется. Трудно и медленно растворим в 95% спирте, мало растворим в хлороформе, практически не растворим в воде.

Эвкалимин обладает (табл.1) широким спектром антимикробной активности и оказывает высокое бактериостатическое действие в отношении ряда лабораторных штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, ингибируя рост грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Bacillus

н-с=о

R = H, C4H,

anthracoides, Corynebacterium diphtheriae, Myc.tuberculosis (МИК: 0,24 -62,5 мкг/мл).

Таблица 1

Антимикробный спектр эвкалимина

№№ Активность,

пп Наименование штаммов мкг/мл

1 Staphylococcus aureus "Жаев" 0,98

2 Staphylococcus aureus "Typi" 15,6

3 Staphylococcus aureus 209-P 0,98-7,8

4 Staphylococcus aureus 69-P 31,2

5 Staphylococcus aureus 20-P 1,95

6 Staphylococcus aureus 18-P 62,5

7 Streptococcus haemolyticus 295 0,98

8 Streptococcus pyogenes 1512 группы A 0,98-1,95

9 Bacillus subtilis 6633 3,9-7,8

10 Bacillus anthracoides 96 0,49

11 Corynebacterium diphteriae gravis 75 7,8

12 Mycobacterium tuberculosis H-37 Rv 62,5

13 Mycobacterium tuberculosis "Academia" 7,8-31,2

14 Escherichia coli M-17 н/а 500

15 Proteus vulgaris OX2 26-27 н/а 500

16 Pseudomonas aeruginosa 165 и/а 500

17 Pseudomonas aeruginosa 25292 н/а 500

18 Microsporum lanosum 125-250

19 Trichophyton mentagrophytes

granulosum (gypseum)** 500

20 Trichophyton mentagrophytes

granulosum 3/4 *** 1000

21 Trichophyton mentagrophytes

interdigitale 41/2922 *** 1000

22 Trichophyton rubrum ** 1000

23 Candida albicans 250

Примечание: *) - резистентные к пенициллину (в концентрации 500 мкг/мл), полученные из ВНИИА; **) - штаммы, полученные из ЦКВИ; ***) - штаммы, полученные из ВНИИА

Эвкалимин слабо активен в отношении мицелиальных грибов (рода Microsporum и Trichophyton) и дрожжеподобных грибов (рода Candida), и в дозе 500 мкг/мл и ниже не проявил активности в отношении грамотрица-тельных микроорганизмов рода ESCHERICHIA и PSEUDOMONAS.

При сравнительном изучении в опытах in vitro антимикробной активности эвкалимина и хлорофиллипта (препарат из Eucalyptus globulus Labill.) в отношении штаммов стафилококка с разной степенью лекарственной резистентности (S. aureus 209-Р, S.aureus «Жаев» и S.aureus 291) установлено, что эвкалимин по бактериостатическому действию в 4-16 раз превышает активность хлорофиллипта.

Таблица 2

Сравнительное изучение эвкалимина и хлорофиллипта

Препарат Задержка роста, мкг/мл

S.aureus "Жаев" S.aureus 209-Р S.aureus №291

Эвкалимин 1,95 3,9 7,8

Хлорофиллипт 15,6 62,5 31,2

Глава 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЭВКАЛИМИНА В ОТНОШЕНИИ СОВРЕМЕННЫХ ПАТОГЕННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Анализ данных литературы показал (С.М.Навашин и соавт, 1988; 1990; В.П.Яковлсв, 1992), что за последнее 10-летие этиологическая структура возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний претерпела существенные изменения и среди основного ряда патогенных микроорганизмов появились возбудители, относящиеся ранее к условно-патогенной микрофлоре. При этом значительно увеличилось число штаммов микроорганизмов, обладающих множественной резистентностью к современным антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам.

В работе было изучено ингибирующее действие эвкалимина в отношении 160 клинических штаммов патогенных микроорганизмов, выделенных из органов и тканей больных различных клинических учреждений

г.Москвы в 1991-1995 гг. (ВНИИТ и ИО РАМН, НИИАГП РАМН, Институт хирургии им. А.В.Вишневского, ЦКИБ №1, кафедра инфекционных болезней РМАПО). Идентификация микроорганизмов и определение ан-тибиотикограммы возбудителя проведены в соответствующих подразделениях этих учреждений. Для проведения исследований использовали субстанцию эвкалимина, соответствующую СТП64-1039-45-89 на РСО эвкалимина, наработанную в отделе фитохимии НПО «ВИДАР» (руководитель - профессор В.И.Глызин). Бактериостатическую активность эвкалимина определяли методом двукратных серийных разведений в соответствующих каждому микроорганизму жидких питательных средах. Для этого готовили ряд убывающих концентраций эвкалимина, а в качестве контроля служили пробирки с чистой средой без препарата. Суточную культуру каждого микроорганизма, выращенную на скошенном агаре, смывали изотоническим раствором натрия хлорида, разводили по бактериологическому стандарту мутности. В каждую пробирку (опытные и контрольные) вносили 0,2 мл бактериальной взвеси, содержащей соответствующее количество микробных тел/мл. Засеянные пробирки выдерживали в термостате при 37°С в течение 24 или 48 часов. Результаты фиксировали по минимальной ингибирующей концентрации (МИК) эвкалимина в мкг/мл, при проведении опытов в 2-5 повторностях, в зависимости от штамма.

2.1. Изучение бактериостатической активности эвкалимина в отношении клинических штаммов стафилококков В работе использованы 42 штамма патогенных микроорганизмов рода STAPHYLOCOCCUS (S.aureus, S.albus, Sepidermidis), выделенных из различных органов и тканей (носоглотка, кровь, шейка матки, гнойные раны, в том числе ожоговые) больных. 90% взятых в исследование штаммов стафилококков являлись полирезистентными и были устойчивы к таким широко используемым в настоящее время антибиотикам, как ампициллин, карбенициллин, тетрациклин, гентамицин, эритромицин,

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ MOHO - И ПОЛИРЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ К ЭВКАЛИМИНУ

(сводные данные)

Название Число

микроорганизма изученных МИК, мкг/мл

штаммов

Грамположительные 100

микроорганизмы:

STAPHYLOCOCCUS

S. au reus 27 3,9-31,2

S.epidermidis 11 1,95-7,8

S.albus 4 7,8 -15,6

STREPTOCOCCUS

S.pneumoniae 23 1.95 - 31.2 (МИК= 3.9 - 87% )

S.viridans 8 3.9 - 7.8

ENTEROCOCCUS

Str.faeealis 14 0,49-1,95

CORYNEBACTER

Cor. Dphtheriae 13 3,9-62,5

(МИК=15,6-31,2-77%)

Грамотрицательные . 60

микроорганизмы:

SERRATIA

S. marcescens II 31,2-500

S. rubidae 2 1000

ACINETOBACTER

A. anitratus 3 15,6-125 (1штамм-2000)

A. icoeffi t 15,6

ENTEROBACTER

E. cloaceae 2 8000

E.aerogenes 2 62,5; 2500

ESCHERICHIA

E. coli 10 500 - 4000 (7 штаммов - н/а

8000)

PSEUDOMONAS

P.aeruginosa 23 500-8000

P. maltophylia 1 2000

KLEBSIELLA

K.osaenae 1 4000

K. pneumoniae 1 2000

CITROBACTER

С. intermedius 1 2000

PROTEUS

P. mirabilis 1 н/а 8000

кефзол, цепорин, цефалексин, полимиксин, фузидин и др., а также к антибактериальному препарату диоксидину. Для проведения исследований использовали МПБ. Культуру вносили в дозе 103 микробных тел/мл. В результате исследований установлено (табл.3 ), что эвкалимин обладает высокой бактериостатической активностью в отношении всех исследованных клинических штаммов микроорганизмов рода STAPHYLOCOCCUS, обладающих моно- и полирезистентностью в отношении современных антибиотиков. МИК эвкалимина для них составила: в отношении S.aureus - 3,9-31,2 мкг/мл; S.albus - 7,8-15,6 мкг/мл; S.epidermidis - 1,95-7,8 мкг/мл.

2.2. Изучение бактериостатической активности эвкалимина в отношении клинических штаммов пневмококков и стрептококков

В качестве объектов исследования взяты 23 штамма Streptococcus pneumoniae и 8 штаммов Streptococcus viridans, выделенных со слизистой дыхательных путей больных (нос, зев, мокрота). Штаммы Str. pneumoniae были устойчивы к ампициллину и бензилпенициллину, а Str. viridans - к ампициллину, бензилпенициллину и неомицину. Для проведения исследований использовали сывороточный бульон или сахарный бульон. Культуру вносили в дозе 5x106 микробных тел/мл. В результате исследований (см.табл.З) установлено, что эвкалимин обладает высокой бактериостатической активностью в отношении всех изученных клинических штаммов: в отношении S.pneumoniae МИК эвкалимина составила 1,95-31,2 мкг/мл (при этом МИК=3,9 мкг/мл получена в 87% случаев); в отношении S.viridans МИК эвкалимина = 3,9-7,8 мкг/мл.

2.3. Изучение бактериостатической активности эвкалимина в отношении клинических штаммов энтерококков

В исследовании использовано 14 клинических штаммов Streptococcus faecalis. Все штаммы энтерококков являлись полирезистентными к таким современным антибиотикам, как карбенициллин, ампициллин, оксацил-лин, тетрациклин, эритромицин, олеандомицин, гентамицин, полимиксин

и др. Для проведения исследований использовали сывороточный или сахарный бульон. Культуру вносили в дозе 5x106 микробных тел/мл. В результате исследований установлено (см.табл.З), что эвкалимин обладает высокой бактериостатической активностью в отношении изученных клинических штаммов Streptococcus faecalis: МИК эвкалимина составляет 0,49-1,95 мкг/мл.

2.4. Изучение бактериостатической активности эвкалимина в отношении клинических штаммов возбудителя дифтерии

Изучено 13 клинических штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных из зева и носоглотки больных и являющихся токсигенными. Для проведения исследований использовали сывороточный бульон. Культуру вносили в дозе 103 микробных тел/мл. В результате исследований установлено (см. табл.3), что эвкалимин обладает бактериостатической активностью в отношении клинических штаммов дифтерии: МИК эвкалимина составляет 3,9 - 62,5 мкг/мл, при этом в 77% случаев МИК=15,6-31,2 мкг/мл.

2.5. Изучение бактериостатической активности эвкалимина в

отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов

Изучено 60 клинических штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных из различных органов и тканей ( рана, кровь, моча, желчь, мокрота, зев, трахея, почка, шейка матки, вагина, клапан, прокладка с клапана, дренаж). Среди них бактерии рода PSEUDOMONAS составляют 41%, бактерии рода SERRATIA - 21%, бактерии рода ACINETOBACTER - 7%, бактерии рода ENTEROBACTER - 7%, бактерии рода ESCHERICHIA -17%, бактерии рода KLEBSIELLA - 3%, бактерии рода CITROBACTER -2%, бактерии рода PROTEUS - 2%.

Исследования проводили с использованием МПБ, культуру вносили в дозе 103 микробных тел/мл. В результате исследований установлено (см. табл.3), что бактериостатическая активность эвкалимина в отношении

клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов в сравнении с грамположительными микроорганизмами сильно варьирует. При этом относительно более чувствительными являются бактерии рода ACINETO-BACTER (3 штамма из 4-х чувствительны к эвкалимину в концентрации 15,6-125 мкг/мл), бактерии рода SERRATIA (50% чувствительны к 31,2125 мкг/мл эвкалимина), 1 из 4-х штаммов бактерий рода Enterobacter чувствителен к 62,5 мкг/мл эвкалимина. Остальные изученные клинические штаммы грамотрицательных микроорганизмов были малочувствительны (МИК эвкалимина составляет 500 мкг/мл и более) или не чувствительны к 8000 мкг/мл эвкалимина.

Таким образом, в результате исследования в опытах in vitro бактерио-статической активности эвкалимина с использованием клинических штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов установлено, что в то время, как ингибирующее действие эвкалимина в отношении грамотрицательных бактерий было менее выражено или отсутствовало, на изученные грамположительные микроорганизмы эвкалимин оказывал значительное бактериостатическое действие.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЕРОЯТНОСТИ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К ЭВКАЛИМИНУ Согласно протоколу ВОЗ среди микроорганизмов - основных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний, подлежащих эпидемиологическому надзору, на первом месте упоминается Staphylococcus aureus (В.И.Покровский и соавт., 1991). Учитывая высокую эффективность эвкалимина в отношении патогенных микроорганизмов рода STAPHYLOCOCCUS , обладающих моно- и полирезистентностью, было целесообразно изучить возможность развития устойчивости к эвкалимину данного вида микроорганизмов. Исследование проводили с использованием метода непрерывных воздействий и метода серийных пассажей (Р.Шнитцер, Э.Грунберг, 1960; Г.Н.Першин, 1972). В качестве тест-микроорганизмов

использовали лабораторный анбиотикочувствительный штамм Staphylococcus aureus 209-Р и клинический полирезистентный штамм Staphylococcus aureus 291.

3.1. Изучение методом непрерывных воздействий При применении метода непрерывного воздействия микроорганизмы остаются в контакте с препаратом более длительное время, чем то, которое необходимо для их полного развития. В 400 мл питательной среды МПБ вносили эвкалимин в количестве равном МИК для данного микроорганизма, затем засевали бульон приготовленной взвесью суточной культуры стафилококка, содержащей 103 микробных тел/мл. Колбу помещали в термостат при температуре 37°С. Наблюдения проводили в течение 60 дней. Через каждые три дня производили высевы на косяк МПА и определяли чувствительность выделенных микроорганизмов к эвкалимину по МИК методом двукратных серийных разведений. Проведенные исследования показали, что в течение всего времени контакта (60 дней) обоих штаммов стафилококка с препаратом чувствительность к эвкалимину практически не изменялась и сохранялась в пределах соседних разведений.

3.2. Изучение методом серийных пассажей Метод многократных воздействий в серийных пассажах основан на применении бактериостатических, постепенно возрастающих концентраций препарата и малого количества посевного материала. В соответствии с методом серийных разведений готовили ряд убывающих концентраций эвкалимина от 1000 мкг/мл до 1,95 мкг/мл в МПБ. Опытные и контрольные пробирки засевали взвесью суточной культуры соответствующего микроорганизма в дозе 103 микробных тел на 1 мл питательной среды. В первом опыте определяли первоначальную МИК эвкалимина в отношении каждого штамма микроорганизмов. Из пробирки, предшествующей МИК, высевали культуру на скошенный мясо-пептонный агар (МПА), содержащий эвкалимин в этой же дозе. Выросшую культуру использовали в каче-

стве нового посевного материала. В каждом последующем опыте (пассаже) техника проведения эксперимента полностью сохранялась. Результаты в каждом пассаже учитывали по МИК эвкалимина в отношении культуры высеваемой на МПА в предыдущем опыте. Исследования проводили в трех параллельных опытах. Колебания в МИК, выявленные при проведении 20 пассажей, находятся в пределах соседних разведений, не носят постоянного характера и обусловлены особенностями метода серийных разведений, при этом конечная чувствительность обоих штаммов стафилококка после проведения 20 пассажей (в течение 3,5 месяцев) не превышала уровня 15,6-31,2 мкг/мл, что свидетельствует об отсутствии снижения чувствительности у изученных тест-микроорганизмов к эвкали-мину.

Таким образом, результаты опытов, проведенных двумя методами с использованием двух штаммов показали отсутствие развития резистентности стафилококка к эвкалимину, что позволяет предположить малую вероятность снижения чувствительности к эвкалимину при его применении в практической медицине.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭВКАЛИМИНА НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ

ЛОКАЛИЗОВАННЫХ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ Химиотерапевтическое изучение эффективности эвкалимина проведено на трех экспериментальных моделях, соответствующих общепринятым принципам исследования химиотерапевтической эффективности препаратов (Г.Н.Першин, 1971): инфицированной ране белых крыс, гнойной язве белых крыс и стафилококковом экспериментальном вагините (С.А.Вичканова, 1981; С.Б.Изосимова, 1982; С.А.Вичканова, С.Б.Изосимова, 1985).

4.1. Изучение химиотерапевтической эффективности эвкалимина

на модели инфицированной раны белых крыс Эвкалимин изучали на данной модели в виде 0,25% и 1% растворов эвкалимина на 95% этиловом спирте. В качестве тест-культуры использовали лабораторный штамм Staphylococcus aureus 209-Р. Рану создавали у 44 белых крыс, самцов, массой 80-100 г на предварительно депилирован-ном участке (5x5 см) кожи спины. Под легким эфирным наркозом вырезали по трафарету кожный лоскут прямоугольной формы (30x10 мм), после чего в рану втирали по 0,3 мл инфицирующего материала (1мл взвеси в изотоническом растворе 40 млрд. микробных тел суточной бактериальной культуры и 1 мл голодного агара). Повторные контрольные высевы из гнойного отделяемого под струпом на агар Хотгингера показали наличие монокультуры, взятой для инфицирования. Лечение начинали через 72 часа после заражения и проводили путем орошения раны в течение 3-х минут ежедневно, один раз в сутки на протяжении всего опыта. Первой группе животных рану орошали 1% раствором эвкалимина, разведенным 1:50 стерильной дистиллированной водой. Второй группе животных применяли 95% этиловый спирт, разбавленный 1:50 дистиллированной водой (контроль лечения). В третьей группе животным наносили на рану 0,25% раствор эвкалимина. Контролем лечения к этой группе являлись животные четвертой группы, которым применяли на рану 95% этиловый спирт. Контролем заражения служила пятая группа инфицированных животных, не подвергавшихся лечению. Инфекционный процесс в ране контролировали путем периодических высевов из ран культуры. Результаты фиксировали по срокам заживления раны (в сутках), с учетом средней суммарной площади поражения (мм2). Статистическую обработку данных проводили по методу Стьюдента (М.Л.Беленький, 1963). Как видно из таблицы 4, разница в сроках заживления инфицированной раны белых крыс и суммарной площади поражения леченых эвкалимином животных в сравнении с контрольными группами, свидетельствует об эффективности эвкалимина при

раневой инфекции белых крыс, вызванной золотистым стафилококком. Химиотерапевтический индекс эвкалимина равен 500*. Данные статистически достоверны. Длительность эксперимента - три недели.

Таблица 4

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭВКАЛИМИНА НА МОДЕЛИ ИНФИЦИРОВАННОЙ РАНЫ БЕЛЫХ КРЫС

№ ЛЕЧЕНИЕ СРОКИ ЗАЖИВЛЕНИЯ

гру ппы Лекформа препарата Способ применения п S, им3 Сутки Р(и) Р(К2>

1 1% р-р эвкалимина на 95% этил.спирте в разведении 1:50 стерильной дист.водой 9 517,6 15,6+1,4 <0,05 <0,05

2 Этиловый спирт в разведении 1:50 стерильной дист.водой 9 874,4 19,1+0,01 >0,05 -

0,25% р-р

3 эвкалимина на 95% этил.спирте не разведенный 9 572,7 15,1 + 0,68 <0,05 <0,05

4 Этиловый спирт 95% 9 659,4 18,05 + 0,33 >0,5

5 Контроль заражения без лечения 8 730,4 18,3 + 0,49 „

к!. в сравнении с контролем без лечения; к^ в сравнении с основой (спирт этиловый, разбавленный 1:50 и спирт этиловый - 95%).

4.2. Изучение химиотерапевтической эффективности эвкалимина

на модели гнойной язвы белых крыс Химиотерапевтическую эффективность эвкалимина в виде 1% раствора на 95% этиловом спирте изучали на модели гнойной язвы белых крыс в сравнении с хлорофиллитом в виде 1 % раствора на 95% этиловом спирте. У 32 белых крыс, самцов, весом 100+10,0 г вызывали подкожный абсцесс путем подкожного заражения в депилированный участок кожи спины культурой Staphylococcus aureus 209-Р. Для заражения использовали 8 млрд. микробных тел в виде взвеси в 1 мл изотонического раствора и 1 мл 0,4% голодного агара. На 4 сутки под легким эфирным наркозом срезали верхнюю часть абсцесса, в результате образовывалась гнойная язва разме-

ром 1,5x1,5 см2. Высевы, произведенные при вскрытии гнойного абсцесса, подтвердили наличие монокультуры, взятой для инфицирования. Лечение проводили ежедневно, путем орошения в течение трех минут язвы растворами препаратов, приготовляемыми ex tempore. Первой группе животных язву орошали 1% раствором эвкалимина, разведенным 1:5 0,25% раствором новокаина. Во второй группе для лечения использовали 1% раствор эвкалимина, разведенный изотоническим раствором натрия хлорида. Животных третьей группы лечили 1% раствором хлорофиллипта, разведенным 1:5 0,25% раствором новокаина. Контролем заражения служила группа животных, не подвергавшихся лечению. Длительность опыта - 18 суток. Динамику инфекционного процесса контролировали путем периодических высевов. Опыт учитывали по средним срокам заживления гнойной язвы и средней суммарной площади поражения (мм2). Статистическую обработку проводили по методу Стьюдента.

Таблица 5

ИЗУЧЕНИЕ 1% РАСТВОРА ЭВКАЛИМИНА НА МОДЕЛИ

ГНОЙНОЙ ЯЗВЫ (в сравнении с 1% раствором хлорофиллипта)

№ ЛЕЧЕНИЕ СРОКИ ЗАЖИВЛЕНИЯ

труп ПЫ Препарат Способ разведения а S мм: Сутки Р(к) р и

1 Эвкалимин (1% р-р) 1:5 0,25% р-ром новокаина 7 577,1 13,3+1,91 <0,01 <0,05

2 Эвкалимин (1% р-р) 1:5 изотоническим р-ром 9 591,9 13,8 + 1,8 <0,01 -

3 Хлорофил-липт (1 % р-р) 1:5 0,25% р-ром новокаина 9 653,8 15,4+ 1,41 >0,1 -

4 Контроль заражения без лечения 7 647,7 16Д+ 0,57

Р (к) - в сравнении с контролем без лечения; Р („) - в сравнении с хлорофиллиптом

Исследование показало (табл.5), что применение эвкалимина на данной модели оказывает значительный химиотерапевтический эффект. Более ранние сроки заживления гнойной язвы белых крыс и суммарная площадь поражения свидетельствуют о преимуществе эвкалимина перед хлорофил-липтом при сравнении их в одной и той же лекарственной форме и дозе. Данные статистически достоверны.

4.3. Изучение химиотерапевтической эффективности эвкалимина на модели экспериментального стафилококкового вагинита белых

крыс

Химиотерапевтическое изучение эффективности эвкалимина в детской лекарственной форме (суппозитории, содержащие 0,03 г эвкалимина) проводили на модели экспериментального вагинита белых крыс. В качестве препарата сравнения применяли 2% масляный раствор хлорофиллипта. Для инфицирования использовали клинический штамм Б^аигеиБ 291, выделенный от больного и обладающий устойчивостью к ампициллину и цефалексину (ЦКИБ №1), для которого в предварительных исследованиях была определена вирулентность для белых беспородных мышей весом 1416г путем внутрибрюшинного введения им взвеси суточной агаровой культуры в количестве 200 тыс., 400 тыс., 600 тыс., 800 тыс. и 1 млрд. микробных тел на мышь в 1 мл 0,4% агара. Вагинит белых крыс вызывали у 35 половозрелых самок массой 250-300 г путем интравагинального заражения взвесью суточной культуры БСаигеиз 291 в дозе 1 млрд. микробных тел на крысу в 0,2 мл 0,4% голодного агара, что приводило к развитию явлений воспаления и отека наружных половых органов животного, сформировавшихся в течение первых 24-48 часов. Заражение контролировали путем асептических высевов из вагины на питательные среды (МПА и манитно-солевой агар). Лечение начинали через 48 часов после заражения и проводили один раз в сутки путем интравагинального введения животным первой группы - 4 мг эвкалимина в 0,2 мл расплавленного суппозитория, животным второй группы - 4 мг хлорофиллипта в 0,2 мл 2% мае-

ляного раствора хлорофиллипта. В качестве контроля заражения служила группа инфицированных животных без лечения. Высевы из вагины производили ежедневно перед введением очередной дозы препаратов. Химиоте-рапевтическую эффективность эвкалимина в суппозиториях на модели экспериментального вагинита белых крыс учитывали по срокам высевае-мости стафилококка в процессе лечения. Исследования обоих препаратов в равных дозах показало (табл.б), что химиотералевтическая эффективность эвкалимина (суппозитории для детей) выше химиотерапевтической активности хлорофиллипта (2% масляный раствор). Данные статистически достоверны.

Таблица 6

ИССЛЕДОВАНИЕ СУППОЗИТОРИЕВ ЭВКАЛИМИНА НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ВАГИНИТА

№ гру ппы ЛЕЧЕНИЕ Доза препарата, мг/крыс 7 п Длительность высеваемости к Рхл

1 Эвкалимин (суппозитории для детей) 4 15 2,7 + 0,5 <0,001 <0,01

2 Хлорофиллипт (масляный р-р) 4 10 4,5 .+ 1,0 <0,02 -

3 Контроль без лечения - 10 6,0 + 0,6 - -

Таким образом, изучение эвкалимина на экспериментальных моделях локализованных инфекций (инфицированная рана, гнойная язва и стафилококковый вагинит) показало, что эвкалимин оказывает значительное статистически достоверное химиотерапевтическое действие при лечении стафилококковых инфекций, в том числе вызываемых полирезистентным клиническим штаммом возбудителя. Выявлено преимущество эвкалимина в сравнении с хлорофиллиптом как по срокам излечения, так и по срокам высеваемости.

Глава 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДА БИОЛОГИЧЕСКОЙ СТАНДАРТИЗАЦИИ ЭВКАЛИМИНА

Метод определения биологической активности препарата основан на принципе диффузии в агар. Этот принцип положен в основу общепринятых методов определения биологической активности антибиотиков (ГФ X и ГФ XI). В качестве стандарта принята одна из серий эвкалимина, обладающая антимикробным спектром, специфичным для эвкалимина. Была подобрана соответствующая среда с определенным количеством аминного азота и pH. В качестве тест-культуры использован Bacillus subtilis 6633. Для растворения препарата наиболее пригодным оказался диметилсуль-фоксид (ДМСО), полностью растворяющий эвкалимин в исследуемых концентрациях и способствующий образованию четких зон угнетения роста Bac.subtilis 6633. Сам ДМСО в данных условиях опыта зон не образует.

Методом серийных разведений в 10 параллельных рядах в 3-х по-вторностях был определен бактериостатический эффект эвкалимина стандарта в отношении Bac.subtilis 6633 в концентрации 5,7 мкг/мл, принятой за единицу действия (1 ЕД). Исходя из этой активности было принято, что в 1 мг PCO эвкалимина должно содержаться 175 ЕД +5 ЕД. Этот показатель был определен как диапазон заданной активности PCO эвкалимина.

Методом диффузии в агар была определена активность в отношении Bac.subtilis 6633 ряда концентраций PCO эвкалимина, используемых для построения стандартной кривой. Количество повторностей опытов более 8. При этом были использованы следующие концентрации: 4 мг/мл, 2,5 мг/мл, 2 мг/мл, 1,7 мг/мл , 1,4 мг/мл, 1,25 мг/мл и 1 мг/мл. Контрольной концентрацией являлась 2 мг/мл. Величина диаметра зоны контрольной концентрации после ее поправки составляла 17 мм + 0,2 мм. Метрологическая характеристика представлена в таблице 6. Исправление размеров зон, построение стандартной кривой и расчет активности проводили согласно ГФ X издания, стр.943. Метод биологической стандартизации эвкалимина

предназначен для количественной оценки антимикробной активности препарата, получаемого при промышленном производстве, наработке рабочего стандарного образца эвкалимина, а также построения стандартной кривой. Разработанный метод подтверждает высокую биологическую активность и стабильность эвкалимина, включен в СТП 64-10-39-4589 "Эвкалимин - рабочий стандартный образец для биологического контроля". Метод является обязательным, наряду с использованием химического метода количественного определения эвкалимина при промышленном выпуске эвкалимина-субстанции.

Таблица 6

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ _ПОСТРОЕНИЯ СТАНДАРТНОЙ КРИВОЙ_

Число

Концентрация набл. X в2 е Р

0,2 69 17,6 + 0,7 0,129 4 1,66 <0,05

контрольная

0,4 9 19,46 + 0,39 0,129 2 4,87 <0,001

03 9 10,03+0,42 0,029 2 а 3,76 <0,002

0,25 8 18,36+ 0,42 0,032 2,3 5,38 <0,001

0,17 9 17,4 + 0,55 0,031 3,2 1*37 <0,25

0,14 8 16,26 + 0,5 0,058 3,0 3,62 <0,01

0,125 8 16,5 +0,26 0,013 1,6 5,16 <0,001

0,11 6 16,45 + 0,46 0,034 2,8 3,52 <0,01

0,1 9 16,0 + 0,51 0,049 3,1 9,65 <0,001

При проведении НИР в институте с использованием разработанного метода была изучена биологическая активность более 700 объектов, представленных отделом фитохимии института, и установлено, что за антимикробную активность эвкалимина ответственны именно соединения фе-нолоальдегидной природы. Эти данные способствовали установлению в химико-аналитических подразделениях института спектральных характеристик действующих веществ и разработке спектрофотометрического метода анализа фенолоальдегидов (Н.С.Цыбулько, 1994) в субстанции, сырье и лекарственных формах эвкалимина, и разработке государственно-

го стандартного образца эвкалимина для спектрофотометрического определения.

Клинические исследования эвкалимина (в лекарственных формах 1% и 0,25% спиртовые растворы, ректальные и вагинальные суппозитории по 0,05 г, а также суппозитории для детей по 0,03 г) на 1572 больных в возрасте от 1 года до 80 лет в 22 клинических учреждениях показали хорошую переносимость препарата, отсутствие местнораздражающих, аллерге-зирующих и общетоксических проявлений и высокий лечебный эффект, не уступающий современным лекарственным средствам (ампициллин, фура-циллин, хлоргексидин, диоксидин и др.).

Таким образом, проведенное исследование, включающее изучение чувствительности к эвкалимину 160 моно- и полирезистентных патогенных клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, изучение вероятности возникновения лекарственной резистентности к эвкалимину, изучение химиотерапевтической эффективности эвкалимина на трех экспериментальных моделях локализованных инфекций, а также разработку метода биологической стандартизации препарата, позволило придти к определенным выводам.

ВЫВОДЫ

1. Изучен новый оригинальный , разработанный НПО «ВИЛАР» РАСХН, растительный препарат ЭВКАЛИМИН, выделенный из эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.) и представляющий собой очищенную сумму терпеноидных фенолоальдегидов флороглюцинового ряда (эуглобали формулы С23Н30О5 и СгвНззО}) и терпеноидов.

2. Впервые установлено, на основании изучения 100 клинических штаммов грамположительных бактерий, ингибирующее действие эвкалимина в отношении бактерий рода ENTEROCOCCUS (Str. faecalis) в концентрации 0,49-1,95 мкг/мл, бактерий рода STAPHYLOCOCCUS и STREPTOCOCCUS - 1,95-31,2 мкг/мл, а также токсигенных штаммов Coiynebacterium diphtheria - 3,9-62,5 мкг/мл, независимо от наличия у них

моно- или лолирезистеитности к применяемым в настоящее время антибактериальным средствам.

3. Впервые выявлено, на основании изучения 60 клинических штаммов грамотрицательных бактерий, наличие чувствительности к эвкалими-ну (в концентрации 15,6-62,5 мкг/мл) у микроорганизмов рода ACINETO-BACTER, SERRATIA и ENTEROBACTER.

4. Установлено, что при длительном контакте эвкалимина с возбудителем не наблюдается развития резистентности изученных тест-микроорганизмов к эвкалимину.

5. Установлено, что эвкапимин, препарат из Eucalyptus viminalis La-bill., за биологическую активность которого ответственны фенолоальдеги-ды флороглюцинового ряда (эуглобали), по антибактериальному действию в несколько раз выше в сравнении с хлорофиллиптом, выделенным из Eucalyptus globulus Labill., содержащим смесь хлорофиллов.

6. Установлен высокий статистически достоверный химиотера-певтический эффект 0,25% и 1% растворов эвкалимина на экспериментальных моделях раны и гнойной язвы, инфицированных стафилококком, при этом выявлено преимущество эффективности эвкалимина (1% раствор) в сравнении с хлорофиллиптом (1% раствор).

7. Установлен высокий химиотерапевтический эффект эвкалимина в лекарственной форме суппозитории для детей по 0,03 г на модели вагинита, вызванного полирезистентным к антибиотикам (ампициллин и цефалексин) штаммом золотистого стафилококка, при этом выявлено статистически достоверное преимущество суппозиториев с эвкалимином в сравнении с 2% масляным раствором хлорофиллипта в равнозначных дозах.

8. Разработан и утвержден метод биологической стандартизации эвкалимина, основанный на принципе диффузии в агар, включенный в НТД в соответствии с требованиями Фармакопейного Комитета МЗ РФ ( СТП

64-10-39-45-89 "Эвкалимин - рабочий стандартный образец для биологического контроля") и используемый при контроле промышленного производства субстанции эвкалимина, наряду с химическим методом контроля качества препарата.

9. Использование разработанного метода биологической стандартизации эвкалимина при проведении НИР позволило выявить биологически активные вещества, ответственные за антибактериальное действие препарата, а также способствовало разработке химического метода контроля качества препарата и стандартных образцов эвкалимина.

10. На основании проведенных исследований после успешной клинической апробации разрешены для применения в медицинской практике 0,25% и 1% спиртовые растворы эвкалимина у взрослых и детей, вагинальные и ректальные суппозитории по 0,05 г - у взрослых; а также разрешены Фармакологическим Государственным Комитетом МЗ РФ клинические испытания детской лекарственной формы эвкалимина (суппозитории для детей по 0,03 г); утверждена инструкция по применению эвкалимина в медицинской практике.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1. Исследование антимикробных свойств лекарственного сбора из фармакопейных растений /С.А.Вичканова, В.В.Адгина, Т.В.Фатеева, Н.М.Крутикова, А.Щ.Нургалиева// В кн.: Вторая республиканская конференция по медицинской ботанике. Тез. докл., АН Укр.ССР, К. 1988, с.218.

2. Новый высокоэффективный лекарственный сбор антимикробного и противовоспалительного действия /С.А.Вичканова, В.ВАцгина, М.И.Губарев, Н.М.Крутикова, Т.В.Фатеева// В кн.: Медико-физиологические аспекты реабилитации плавсостава. Мат-лы научно-практической конференции, Рига, 1990, с.97-101.

3. Элекасол - новый лекарственный сбор антимикробного и противовоспалительного действия /С.А.Вичканова, Н.М.Крутикова, Т.В.Фатеева, В.В.Адгина // В кн.: 1 Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство", тез. докл., М., 1992, с. 196.

4. Изучение антимикробной и противовирусной активности эвкалимина /Н.М.Крутикова, Т.В.Фатеева, И.Ю.Симонова, Н.Ю.Цыбулько //Там же, с.206.

5. Изучение эффективности эвкалимина в отношении антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов / Н.М.Крутикова, С.А.Вичканова, Н.И.Габриелян, М.П.Корженкоаа, И.А.Гришина, З.И.Абрамова II В кн.: Международный научный конгресс "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты", тез. докл., М., 1993.С.170.

6. Изучение бактериостатической активности эвкалимина в отношении антибиотикорезистентных штаммов Streptococcus pneumoniae / Н.М.Крутикова, С.А.Вичканова, Т.Я.Липчанская // В кн.: 2-й Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство", тез. докл.,М., 1995, с 237.

7. Эффективность эвкалимина при экспериментальном вагините, вызванного ле-карственнорезистентным штаммом стафилококка / Н.М.Крутикова// В кн.: 3-й Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство", тез. докл., М., 1996, с.29.

8. Изучение антимикробных свойств эвкалимина в эксперименте / Н.М.Крутикова // В кн.: 2-й Международный научный конгресс "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты", тез.докл., Чебоксары, 1996, с.83.

9. Метод биологической стандартизации эвкалимина. / Н.М.Крутикова / Там же, с.83.