Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов ДНК

На правах рукописи

Катаргин Алексей Николаевич

Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов ДНК

(14.01.12 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004601038

004601038

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени H.H. Блохина РАМН (директор — академик РАН и РАМН М.И. Давыдов)

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук H.H. Вейко; доктор медицинских наук М.Г. Якубовская

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится "Л? " 2010 г. в А часов на

заседании Диссертационного совета (Д.001.017.01) при РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

(Москва, 115478, Каширское шоссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан " 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

У доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин имс/к___

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим агентом рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска заболевания» (HPV 16, 18 и родственные им). Прогрессия опухоли, возникающей из инфицированной HPV клетки, проходит через несколько стадий. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании многих клеточных генов. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических мутаций, так и эпигенетических изменений - эпимутаций. К эпимутациям относится, в частности, нарушение паттерна метилирования ДНК. У млекопитающих энзима-тическому метилированию в ДНК подвергается главным образом цитозин в составе дину-клеотидов 5' CpG. Метилирование ДНК является одним из механизмов, определяющих тканеспецифическую и аллель-специфичную экспрессию генов (импринтинг), подавление экспрессии генов на инактивированной хромосоме X. Оно участвует также в обеспечении генетической стабильности клетки, ограничивая гомологические рекомбинации с участием повторяющихся элементов генома (повторов), их распространение по геному, их транскрипцию.

Опухолевые клетки отличаются глобальным изменением паттерна метилирования ДНК, которое носит сложный характер: в одних и тех же опухолях происходят, как глобальное деметилирование генома и активация транскрипции соответствующих генов и повторяющихся элементов, так и гиперметилирование локальных участков генома и подавление транскрипции ассоциированных с ними генов. Исследования последних лет показали, что опухоли разных локализаций могут отличаться по набору генов, подвергающихся аберрантному метилированию. Механизмы, активирующие в опухолевых клетках такие разнонаправленные процессы, как гипер- и гипометилирование ДНК, а также механизмы, определяющие специфичность маркеров метилирования для разных типов опухолей, до сих пор неизвестны. Понимание соотношения процессов гипер- и гипометилирования в опухолевой клетке особенно важно в связи с попытками использовать для противоопухолевой терапии агенты, деметилирующие ДНК (децитабин, 5-аза-цитидин, RG108 и др.).

Ранее в лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ Канцерогенеза при поиске GC-богатых участков ДНК, метилирование которых может быть изменено в опухолях шейки матки по сравнению с морфологически нормальными тканями, был выявлен макро-сателлитный 3,3-kb повтор. Успехи в расшифровке генома человека и животных способствовали изменению взгляда на повторяющиеся элементы как на нейтральные или вредные элементы генома. Появились данные о том, что повторы участвуют в структурной организации, эволюции генома, в регуляции экспрессии генов, и эти функции некоторых повторов нарушаются при канцерогенезе. Сведения о статусе метилирования каких-либо по-втряющихся элементов ДНК в опухолях шейки матки отсутствуют в литературе.

\

В связи с выше сказанным, исследование нарушения паттерна метилирования повторяющихся элементов как мишеней аберрантного метилирования ДНК в опухолях шейки матки представляется актуальным.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в определении статуса метилирования 3,3-kb повторов в нормальных клетках и его изменений в опухолях шейки матки.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Определить, изменяется ли статус метилирования 3,3-kb повтора в опухолях и клеточных линиях шейки матки по сравнению с морфологически нормальными тканями шейки матки; определить частоту изменения статуса метилирования 3,3kb повтора в опухолях шейки матки;

2) Сравнить частоту изменения статуса 3,3-kb повтора в опухолях шейки матки с частотой изменения статуса метилирования классического сателлитного повтора Sat2, известного маркера деметилирования для опухолей других локализациий;

3) Исследовать уровень транскрипции генов семейства DUX, локализованных внутри мономера 3,3-kb повтора, в опухолевых и нормальных тканях шейки матки;

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

Впервые обнаружено, что в HPV-позитивных опухолях шейки матки и HPV-пози-тивных клеточных линиях в отличие от гипометилирования классических сателлитных повторов Sat2 происходит гиперметилирование макросателлитных 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными тканями шейки матки. Впервые в клетках рака шейки матки обнаружено изменение статуса метилирования специфического участка ДНК S/MAR, расположенного вблизи кластеров 3,3-kb повторов на хромосомах 4 и 10. S/MAR участвует в прикреплении ДНК к ядерному матриксу. Впервые обнаружена транскрипция генов семейства DUX, локализованных в 3,3-kb повторах, в нормальных тканях шейки матки и подавление их транскрипции в опухолях шейки матки.

Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об организации эпигенома в нормальных клетках и её изменениях в опухолях. Данные о гипомети-лировании одних повторов и гиперметилировании других повторов в опухолях могут быть использованы при разработке и тестировании ДНК-деметилирующих агентов. Данные об изменении в опухолевых клетках статуса метилирования специфического участка ДНК S/MAR могут служить основанием для исследования роли S/MAR в доменной организации хроматина в опухолевых клетках.

Апробаиия результатов работы.

Основные результаты работы были представлены на международных научных конференциях и симпозиумах; Second Weissenburg Simposium - Biriciana, May 2004, Bayern, Germany; 6 international multidisciplinary congress "Eurogin", 2006, Paris, France; 23th international papillomavirus conference, 2006, Prague; 24th international papillomavirus conference,

2007, Beijing; IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов,

2008, Новосибирск.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных в работе материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста, включают 11 таблиц и 10 рисунков. В списке цитируемой литературы приведено 190 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы

Обзор литературы посвящен роли повторяющихся элементов генома в норме и в канцерогенезе. Рассмотрены структура, функциональные особенности и характер метилирования LTR-содержащих и LTR-несодержащих ретротранспозонов и сателлитных повторов в нормальных и опухолевых клетках. Подробно описана структура, локализация, характер экспрессии и патогенетическое значение макросателлитных 3,3-kb повторов.

Материалы и методы

Образцы опухолей и нормальных тканей шейки матки были собраны в НИИКО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН согласно правилам этического комитета РОНЦ им. Н.Н.-Блохина РАМН. Подтверждение клинического диагноза и определение гистологического типа опухоли было выполнено в Отделении патоморфологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Всего в работе было использовано 50 образцов опухолей шейки матки I, И и III стадий по классификации международного союза гинекологов и акушеров FIGO (плоскоклеточный рак и аденокарциномы). Опухоли были позитивны по HPV 16 или 18 типа по данным ПЦР. В работе использовали клеточные линии, полученные из опухолей шейки матки: HeLa, SiHa, CaSki, С-ЗЗА, С4-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки HeLa и C4-1 содержат геном HPV18, клетки SiHa и CaSki - геном HPV16, С-ЗЗА -безвирусная клеточная линия с мутацией в гене р53. В работе были использованы следующие методы исследования: выделение ДНК и РНК из образцов тканей и клеточных культур гуанидинизотиоцианатным методом; электрофоретическое разделение фрагментов геномной ДНК в агарозном геле; блот-гибридизация по Саузерну; получение радиоактивно-меченых зондов; метод обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР); клонирование продуктов ПЦР; бисульфитная конверсия ДНК с последующим определением нуклеотидной последовательности конвертированной ДНК.

Результаты и обсуждение

Анализ статуса метилирования 3,3-кЬ повторов в нормальных тканях, клеточных линиях и опухолях шейки матки методом блот-гибридизации по Саузерну.

Статус метилирования 3,3-кЬ повторов в нормальном цервикальном эпителии не был известен. Для его определения мы использовали ДНК, полученную из здоровых тканей шейки матки от больных с нецервикальной патологией. ДНК обрабатывали метил-чувствительными эндонуклеазами рестрикции с последующей блот-гибридизацией по Саузерну с радиоактивно-меченными зондами (рис. 1 и 2). Для оценки уровня метилирования в каждом образце определяли долю гибридизационного сигнала для высокомолекулярных полос в процентах по отношению к сигналу на всей дорожке автографа. Высокомолекулярными мы считали фрагменты, расположенные выше маркера размером 4,4 т.п.н., т.е. превышающие размер мономера повтора (3,3 т.п.н.).

эч-1 1 1 1

I-тли

шшш

ЬБаи Мэрий V . у активатор _ _транскрипции

ЗОНД-1 ЗОНД-2

\

8таI ■"-Ц—.......................1 ....... —^—.......... —

БасП М!и I

Иае! .........|............-.........

Б

Рисунок 1. А: Схема мономера 3,3 кЬ повтора. Изломанной стрелкой обозначена открытая рамка считывания 0иХ4, короткими стрелками - праймеры к транскриптам 0иХ4, квадратами - го-меобоксы. и эр-3 - районы, в которых исследовали статус метилирования 3,3 кЬ повто-

ра методом бисульфитного сиквенирования; зонд-1 и зонд-2 - зонды для блот-гибридизации по Саузерну. Б! Сайты узнавания метил-чувствительных эндонуклеаз (обозначены вертикальными линиями).

В нормальных тканях высокомолекулярные фрагменты присутствуют во всех дорожках (рис 2А). Это говорит о том, чт03,3-кЬ повторы существенно, хотя и не полностью, метилированы по сайтам узнавания всех использованных эндонуклеаз (например, 35-66% по эндонуклеазе Ыае I), что согласуется с полученными ранее данными для других нормальных тканей (Меп е1 а1., 2001). Обращает на себя внимание тот факт, что доля сигнала высокомолекулярных фрагментов в нормальных тканях шейки матки от разных индивидуумов существенно варьирует (35%, до 66% ) Это свидетельствуют о том, что паттерн метилирования 3,3-кЬ повторов в нормальных тканях индивидуум-специфичен.

В НРУ-позитивных линиях, НеЬа, вШа, С-41 и СаБУ не было выявлено никаких низкомолекулярных фрагментов (< 3.3 т.п.н.) по всем эндонуклеазам. (рис. 1Б). Это указывает на высокий уровень метилирования 3,3-кЬ повторов по исследованным СрО-сайтам. В то же время, в НРУ-негативной клеточной линии С-ЗЗА в отличие от нормальных тканей и других клеточных линий полностью отсутствует гибридизационный сигнал в высокомолекулярной зоне (в районе маркера 23 т.п.н.) для всех эндонуклеаз, что указывает на сильное деметилирование СрО-сайтов.

Nc-2

Nc-3

M

23,1 _ 9,4 _

Sna I Sac II Mlu I Nae I Sma I Sac II Mlu I Nae I Sma I Sac II Mlu I Nae I

Я

A 0.56 —

51%

<m 66%

' m

. v-o-6;

44%

CaSki

HeLa C4-1

M

23.1

6.5 -4.3 —

Sma I Sac II Mlii I Nae I Sma I Sac II MbJ I Nae I Sma I Sac II Mlu I Nao I Sma I Sac II Mlu I Sma I Sac II Mlu I

ff&^^W **

609 676 268 645 409 424 570 444

м 23.1 — 3.4 — 6.5 — N Т N Т N Т N Т N Т N Т N Т N Т

: («¡б НШ шш foil ft" й Щт Ц HW mm WW

3.3 т.п.н. Щ ш - ш- щ «ч> w. —

2,3 — 2]0 — r&i Щ ■■

В Ж '

0.56 —

гиперметишрование в опухоли

нет отличии

Рисунок 2. Блот-гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов после обработки геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами А, Б, В - гибридизация с зон-дом-1 к 5'-концевой области 3,3 kb повторов; Ai Nc -нормальные ткани шейки матки от больных с нецервикальными патологиями; цифрами указана доля сигнала в области > 4,1 т.п.н. от общего сигнала дорожки в процентах для Nae I, Б: клеточные линии карцином шейки матки; В: парные образцы (N - прилегающий к опухоли цервикальный эпителий, Т - РШМ); М - ДНК фага лямбда / Hind III.

Таким образом, в НРУ-позитивных клеточных линиях наблюдалось гиперметилирование 3,3-кЬ повторов в отличие от НРУ-негативной клеточной линии С-ЗЗА, в которой было выявлено сильное гипометилирование 3,3-кЬ повторов по сравнению с нормальными цервикальными тканями.

При исследовании НРУ-позитивных опухолей шейки матки было обнаружено, что ни в одном из 34 образцов уровень метилирования 3,3-кЬ повторов не снижался до уровня, характерного для НРУ-негативной клеточной линии С-ЗЗА. В 18 из 34 (53%) опухолей

было выявлено повышение уровня метилирования 3,3-kb повторов (гиперметилирование) по сравнению с прилегающими к опухоли нормальными тканями (рис.2В и рис. 3, первые 18 образцов). Учитывая индивидуальную специфичность паттерна метилирования 3,3-kb повторов, каждый образец опухоли сравнивали с нормальными цервикальными тканями, полученными от того же больного.

Таким образом, в HPV-позитивных карциномах шейки матки преобладающим событием является гиперметилирование 3,3-kb повторов, а не их гипометилирование. Сопоставление частоты гиперметилирования 3,3-kb повторов с размером опухолей и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы у больных не выявило корреляций, что говорит в пользу предположения о раннем нарушении статуса метилирования 3,3-kb повторов в ходе опухолевой прогрессии.

T/N

1.6 1,4 1.2

о,а 0.6 0,4

0,2 о

-0,2 -0,4 -0,6 -0,8

Рисунок 3. Частота гиперметилирования 3,3-kb повторов в карциномах шейки матки. T/N - отношение доли авторадиографического сигнала в высокомолекулярной области (> 4,3 т.п.н.) в опухоли к аналогичной величине в прилегающем нормальном эпителии (для парных образцов), или к среднему значению для образцов нормального эпителия ШМ от больных с нецервикальной патологией (для клеточных линий). Приведены значения T/N для гибридизации 3,3-kb повторов с зондом-1 (рестрикция по Nae I); Р - уровень значимости различий в степени метилирования между нормальными и опухолевыми тканями (парный критерий Вилкоксона).

Подтверждение гиперметилирования 3,3-кЬ повторов в нормальных тканях и карциномах шейки матки методом бисульфитного сиквенирования ДНК

Для того чтобы убедиться, что метод блот-гибридизации по Саузерну, использованный для определения частоты гиперметилирования в опухолях, адекватно отражает статус метилирования 3,3-кЬ повторов, использовали метод бисульфитной конверсии ДНК с последующим определением статуса метилирования СрО-сайтов сиквенированием. Для анализа были выбраны два образца опухолей с низким и средним уровнем гиперметилирования 3,3-кЬ повторов (рис 3, № 409 и 268), прилегающие к ним нормальные ткани шейки

матки, образцы нормальных тканей от больных с нецервикальной патологией (Nc-2 и Nc-3) и две клеточные линии с гипер- и гипометилированием 3,3-kb повторов. Исследовали три района в составе мономера повтора (рис.1 А): 1) sq-1 - район, входящий в состав зонда 1, использованного для блот-гибридизации по Саузерну; 2) sq-2 - район, соответствующий 5'-концу открытой рамки считывания гена DUX4 с прилежащим к нему промотором; sq-З - участок 3' конца мономера, деметилирование которого было показано в некоторых глиобластомах (Cadieux et al., 2006). Три исследованных района мономера 3,3-kb повторов были метилированы в разной степени в образцах нормальных тканей шейки матки (рис 4, например, образец Nc-3, 33, 62 и 49% метилированных CpG-сайтов в районах sq-1, sq-2 и sq-З, соответственно). Кроме того, две нормальные ткани статистически достоверно различались между собой по уровню метилирования, по крайней мере, по одному району. Эти результаты подтверждают индивидуум-специфичный характер метилирования 3,3-kb повторов, выявленный методом блот-гибридизации по Саузерну.

Было выявлено статистически значимое гиперметилирование 3,3-kb повторов в исследованных опухолях по сравнению с прилежащими нормальными тканями шейки матки, однако повышение уровня метилирования в трех анализируемых районах было неодинаковым (рис 4, образцы 268 и 409). Уровень метилирования Sq-2, включающего старт транскрипции гена DUX 4, существенно не изменялся в обеих опухолях. Умеренное, но статистически достоверное повышение уровня метилирования района Sq-З (в 1,3-1,5 раза) наблюдалось в двух опухолях. Таким образом, в отличие от глиом, мы не наблюдали ги-пометилирования повторов в этом районе в опухолях шейки матки (Cadieux et al., 2006). Значительное повышение уровня метилирования (в 1,6-2 раза) было выявлено в районе Sq-1 в двух опухолях по сравнению с нормальными тканями от этих же больных (N 268 и N409). В наиболее гиперметилированной по данным блот-гибридизации по Саузерну клеточной линии SiHa наблюдался высокий уровень метилирования района Sq-1 (87 %), превышающий уровень метилирования всех 4 исследованных нормальных тканей и 2 опухолей. В единственной клеточной линии С-33 А, не содержащей геном HPV и сильно гипо-метилированной по данным блот-гибридизации по Саузерну, наблюдалось деметилирование всех трех районов. В наибольшей степени подверженным деметилированию оказался также район Sq-1 (17 % против 22 и 44 % в двух других районах этой клеточной линии). Эти данные свидетельствуют о том, что изменения статуса метилирования 3,3-kb повторов в опухолях происходят сиквенс-специфично.

Таким образом, результаты бисульфитного сиквенирования подтвердили результаты блот-гибридизации по Саузерну. Обобщенные данные по этим двум методам позволили выявить индивидуальную специфичность паттерна метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях и высокую частоту их гиперметилирования в карциномах шейки матки.

ООО о-ООО о-ООО о-О ОО о-

N0-2

ООООО« ООООО« ООООО• ООООО•

вя-1

ООСОвОООО 0000*0 ООО ООООвО ООО оооо«о ООО

$ Р<10"

61%

• • • • •

• ОО •о о • о-о• о о-

ООО о-ООО о-о • • о-

• ООО-ООО о-ООО о-ООО О-

N0-3

• *о

• о»о»оо •••о**о

• оооюо •ооо»оо

■ •• • «ОО •ОО•«о• •овоооо

• О О О • О О

• ОООООО

• ОООООО

• о • с • • •

ОО«

»••ООО О • • о • • <

О••ООО •ОС•••

О О О • • С

ОО* о«о оооооо ттоото

оо«о«о ооооос

09»

О От ОО« ООО ООО ООО

I Р=0,008

о«о О- -

ООО О- • О® О О• • ООО о- • ото о- ■ ото о■ ■ ООО О- ■ X ООО 0-Х X ООО О- X х ООО о- X х

409 N

ООООО« ОО•ООв ОООООО ООООО»

•оовоо • ОО »оо

ОООО ОООО ООО ОООО

О • • •

о • • • о* •• о*»«

о ООО О ООО ОО ООО ООО ОО • о о

• О ООО ОО ОО» ОО ОО • ОО ОО • ОО ОО»

• о • с

• •• »-»••••»•

• о» • - -••••••

ООО •- •»О»»»»

• •• о - •О•О••О

О » О о - - О О О • О О ООО О- ■ ОО*»»» ООО о- ■*ооо*о

• оо о- ■ооотоо

• оо о- •оооооо О» • о- • х • О• о о

I Р=10" ••••••

• «о »•» »»»•••

ооо»оо ооюоо оооооо ОООООО ОООООО ОООООО

• • • • • • • • • • • • •

• • • от ото т т

• • О (

ОО • ООО ООО

ООО ■ • •

409 Т

вя-г

• О » •

• О ••

• о ••

т о тт *

ОООО ОО ООО ОООО ОО ООО ОООО О О ООО О О О О ОО ООО

о о » • » • •

• ••••••••• ••••XX» *»» »»»О»

»»••00»»»0 • » о о • • о сто тоот т

•о - о*о* ■ О • 00«0«- о • •• ***• •

• о•о*о*о о ■ о о•о•• о - •• ••• •

• о • о « о « • о • оо•о•• о • •• ••• •

О ■ О - ■• ••ООСООООО ООО о««о « О • О - • О■ • • О ООООО• О О О • О « « О « -0-00000-00---0- • ОО! О'ОО •

- о•о•о * - о • о о « о « • о • •• •••■ •

55%

• • • • то ооо

о о о о тт х о о

ох • о • о ООО

ох х • » • • • •

• • О • О О * * О ОО ООО О XX ОООО О О ООО ОООО ОО ООО

• • *о* оо*оо**о • • тотттт т О т ■ тт ооттоттт т о тоотт ■ т т • о** *о**о -о* • • о* • *о • о

о о о*о *о-*о*о* о • ■•••о- •

• • х*о «о - -о*о- »о -о- • • ■ • ■ • ••• оо»о*о** о • тоттт • т т т т*т о»«ох*оо • • осх««« х

- • XX» 00*0*0хх о • ХО»»»- О

О • •ОО • • ООО• • • О • ОО•ООО ■

• О • ••■О •

о • «

• о о о •

*и

33%

I Р=0,02

62%

ОООО оо ООО ОООО ОО ООО ОООО ОО ООО ОО ООООООО О • ОООО ООО 0-00 ОО ООО

• о • о *о о*о

• о • о *о о*о

• о • о то ото »о о*о

23%

• • *о* оо*»»»»» » » »»••••

О ' ••• -о*оо****« ••■••

о * ото то ■ тоттт о т ■ ттоо т * о** *о**о - о* * * о» • »о о » о»о »о • »о»»» о » ■ »»оо

• » **• *о*-о-о* * • *о**о- * * * *

• * * • о тото ■ тот т ■ ооотт • * * о * -о»*- •■о*-»в«*о *о-о-- • о** о ■ *оо ■ о ■ о**** » • • - • *о - о • • • - • * • * то■отот■ о • оо*о* о - * * х х »»» »о»-О-о» X • »0»»0 • • X » »

I » » »

о » » » • • • • о »о о»•

о о »о оо»

О О »О ООО О О ОО ООО О О ОООО ООО О О О О ОО ООО

• » »О» О»»»»»»» • •

• • ••• оооо**оо • •

• • ••• -о*-ОООО о •

• • -О» оо***'«« « -

о • «оо • о • о«««« « »

• « **о • о • • о • о* ■ *

■ • тто оо■ - ооо- • о

■ О ••• •00***Х* • •

х » »•* Х00»0 »0 х ■

»»»»•о •

о

••••-» ■

*»•• с

о»»» • • ••• •

71%

тото * **•• »

»»•• о

-и

II

О о о • ттот о

47%

68%

вя-З

59%

) * • о • *о оо-

►.....• о о •

> о• • • оо о о•

> о • - • о* о о -

► •ооооо оо*

оо оо о о *о

I Р=10~4

о *о о о

49%

о • *о о о о ■ о * о о- * о оо • о о о- • • О Ох х о

42%

• О«« «

• «О* •

о о • • •

ОО" •

о • • • •

о - • » о о о- о ■ о о- о о о ■ - о • о о- о о

65%

3 о о о о > • * О С •

»••ОС ■ООО« • ООО!

со

LO

oooooooo«

t Р=0,014

; • • • • çr\

I о « о * ij » • * О * Г*-

о • * о • о • • * - • •

••■00»

О О • X • •

• • • о • ■

» о о • * ■

» О О • О X

» • • о • о

• * * -Ох

• • • О • X

о о • • • *

• • О О О X

I Р=10ч

*о*оо«ооооо „о

• OOOOOOOOOÛ 0х

• 0«00«00000 ^f • oêoooooo ' • CN •••сооооо- • **оооо*оооо

•••OOOOOOOO ••ооооооооо •••OOOOOOOO

OJ

о

Ö II û.

•••OOOOOOOO

• »ооооооооо ••ooeoooooo ••ооооооооо OOIIOOOOOOO •OOOOOOOOOÛ •ооовоооооо •0*00000000 ooooeoooooo

• * • • • •

••ooooooo ооооооооо ••ooooooo

5*000*0000

»••ooooooo ►•oooooooo . о ....... -

►•oooooooo ►*oooo*ooo

►•OOOOOOOO

»ооооооооо

• • • • •

• о • • •

• « « о «

• • о о >

О • • • 4

со со

• • • ' • о • >

• • о о • о • >

• о • с • о • «

• • о о о • о • о о ■ • • о • с

• о о • «

• • • ■ >

• • • • -

• • • • с о о • • «

• • • о • • ■

I Р=10^

о о «

00

0 0 0 0 *0 о о о о • о

O O X X O о

• ••000*00x0 СО

• ••000*00x0

• *OOOOCO*OX

•*«ооо«о»*о

•**ооооо*о* **о*оо***оо

о»о»ооооооо

••ООООООхв» ••ОООООвхОО

»ooo«o»oioo •oeoooooeo* •••00000*00

• ••00000*00 ••000000*00 О» »OOOIOOO» »OIOOOOOOOO •ооовоооооо •о«»оосоо11 •о«»оооо«оо ••••оо*о*оо

•»•OOOOOIO» : : : : : : ¿ : : : : 1_ о о • о о о с о о • о * • о СО о о • о * * * СО

О О О О * * О Ç\J

3 О О » О *

» о *

' о О • О ö ^

? ? : ? Т ж eg з • ■ ¿ó * см з о о о о э

» О О • О • 3 * О О • о 3 О о ■ ■ X 0 0 0 03 • О О О о

• о о * • _

3 о О О О - I 3 О О • * О Q

• * о ■ * • о * • о СО •000*0 0000

• • О • О • 4

• О О 3 о о

• о о 3 о о

■ о о • ■ о о о о •

V CL

о о • о о о о о о о

I Р=10"5

• о О • ООО

• О • ■ с • •

• О О О С О • С О О О О С О

• О О • ОС*

• • О О с с •

• о о о о о •

• О О • О . о

• о • о о • о о • • • о о •

о о • • о о о с о • • - о о

• О • »CC«

• о • о о о •

т

о

V а

I P=10~4

•оооооооооо • ОООООО • ООО ••ООООООООО 000*0000000 •ОООООО•ООО OOOOOOO • ООО 00*00000000 •0*0000•ООО •ОООООООООО

» о о

OOOOOOOO OOOOOOO» —.

оооо ■ оо» |

ЗОООООООО О »•0*00000

30*000*00 W

з»ооо»ооо ~

ЗОООООООХ LL зоооовоох ^^

3 о о

» о о » о о » о о » о о

3 о о j о о ► о о

оо»ооо»с 000*000« о о о * ■ О О i OOOOOOO« OOOOOOO« OOOOOOO* : ? ? :

OOOOOOO* ,„ OOOOOOO» (О 0*000000 I OOOOOOO*^}

<

• CO

)»OI 3 • * i

> о о •

• * * о * *

о о о о о

t Р=0,01

• * • ■

• * * -

• * • a

• • о «

• • • • • °

» • о • • • • • • • •

► • о • • • '

► • о • • • X • »•ООО«««

► • • • О ■ X •

• • 4

О - ■

О О i

> • • • • • О • •

3 • • • О • с • • >•**•■ • * *

• • • • • *

***оо«**

• • • о • • • о

• ■ ••••••

I Р=0,002

• ••••оо**о рч.

• •••*оо**о 00

» о 03 .О и

Рисунок 4. (см. страницы 10 и 11) Анализ статуса метилирования CpG-сайтов в трех фрагментах 3,3 kb повтора методом бисульфитного сиквенирования ДНК.

Т - плоскоклеточный РШМ, N - прилегающий цервикаль-ный эпителий, Nc - нормальный цервикальный эпителий от больных с нецервикальной патологией (нумерация как на рис. 2 и 3); Sq-1, Sq-2, Sq-3 - фрагменты 3,3-kb повтора (см. рис. 1); один ряд символов в каждой колонке соответствует одному сиквенированному клону; каждый символ обозначает статус метилирования отдельного CpG-сайта. Указаны проценты метилированных CpG от общего числа анализированных CpG-сайтов. Р - уровень значимости различий в доле метилированных CpG-сайтов: горизонтальные стрелки - отличие между разными фрагментами повтора для одного образца; вертикальные стрелки - отличие по одному и тому же фрагменту между образцами (точный критерий Фишера). Приведены только уровни значимости меньше 0,05, в остальных случаях различия между анализируемыми районами недостоверны.

Гиперметилироеание 3,3-kb повторов и гипометилирование повторов Sat2 в клеточных линиях и опухолях шейки матки

Высокая частота гиперметилирования ДНК 3,3-kb повторов в опухолях (более 50%), ранее не была описана. Более того, сведения об изменении уровня метилирования каких-либо повторов в опухолях шейки матки к началу нашего исследования отсутствовали. Чтобы выяснить, происходит ли в HPV-позитивных карциномах шейки матки наряду с гиперметилированием 3,3-kb повторов гипометилирование других повторов, описанное для других типов опухолей, исследовали статус метилирования сателлитных повторов Sat2. Для анализа использовали обработку образцов ДНК эндонуклеазой BstBI с последующей блот-гибридизацией по Саузерну (рис 5). В нормальных цервикальных тканях, прилегающих к опухоли, не было выявлено низкомолекулярных фрагментов ДНК. Это указывает на то, что повторы Sat2 в них сильно метилированы, как и в других нормальных тканях человека. В то же время в опухолях (Т409, Т415 и Т436) и клеточных линиях карцином шейки матки наблюдалась значительная фракция низкомолекулярных фрагментов (ниже 4,4 т.п.н.), указывающая на гипометилирование повторов Sat2. Гипометилирование повторов Sat2 было обнаружено в 17 из 21 случаев (81%, рис. 5Б). В клеточных линиях, как в HPV-позитивньгх (HeLa, SiHa, CaSki, C-4-I), так и в HPV-негативной С-ЗЗА, также наблюдалось гипометилирование Sat2 по сравнению с условно нормальными цервикапьными тканями (рис. 4В)

Таким образом, в HPV-позитивных опухолях шейки матки, как и во всех исследованных ранее типах опухолей, с высокой частотой происходит деметилирование повторов Sat2.

Статус CdG: символ

Неметилированный CpG 0

Метилированный CpG •

Утрата CpG

Отсутствие конверсии X

409

415

434

М

23,1 -9.4 -

4.3 -

2,3 ■ 2,0 ■

мвй ■as- 'f j щ л

> i ш \ И

1 ш \ W1?

436

С-ЗЗА CaSki SiHa С4-1 HeLa NT NTNT NT

. 1*.

№ .

T/N

Б В

Рисунок 5. Гипометилирование повторов Sat2 в карциномах шейки матки. N - прилегающий к опухоли цервикальный эпителий, Т - РШМ. А; Блот-гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов после обработки геномной ДНК метил-чувствительной эндонуклеазой Bst BI, гибридизация с олигонуклеотидом специфичным для Sat2; М - ДНК фага лямбда I Hind III. Б и В: T/N -отношение доли авторадиографического сигнала в высокомолекулярной области (> 4,3 kb) в опухоли к аналогичной величине в прилегающем нормальном эпителии (для парных образцов), или к среднему значению образцов нормального эпителия ШМ (для клеточных линий). Р - уровень значимости различий в степени метилирования между нормальными и опухолевыми тканями (парный критерий Вилкоксона).

Профиль метилирования генов и повторов в опухолях шейки матки

Для 13 образцов из нашей выборки, был известен статус метилирования семи генов-супрессоров опухолевого роста и двух типов повторов (Таблица 1). Из представленных данных видно, что в одной и той же опухоли могут одновременно присутствовать гиперметилирование 3,3-кЬ повторов и гипометилирование повторов 8а12 (таблица 1, образцы 289, 235, 284). В то же время, в ряде опухолей наблюдалось изменение статуса только одного из повторов (образцы 234, 438, 431). Это указывает на независимое изменение статуса метилирования двух типов повторов в опухолях. Гиперметилирование 3,3-кЬ повторов наблюдается в опухолях с разным числом гиперметилированных маркеров (от 1 до 4), т.е. оно не является следствием общей активации системы метилирования в этих опухо-

Анализ паттерна метилирования отдельных опухолей показал, что опухоли отличаются друг от друга по набору генов и повторов, изменивших статус метилирования по сравнению с нормальными прилегающими тканями, т.е. каждая опухоль имеет индивиду-

альный паттерн метилирования. Таким образом, этот анализ говорит не только о независимом характере процессов гипо- и гиперметилирования в опухолях, но и о независимости изменения статуса метилирования каждого маркера от других маркеров. Уникальный для каждой опухоли паттерн метилирования говорит скорее о нарушении в опухоли специфической для каждого гена и повтора эпигенетической регуляции, чем об общем нарушении работы системы метилирования.

Sat2 (демет.)

у.

н/т

: Щ

Таблица 1. Профиль метилирования генов и повторов в опухолях шейки матки.

Черный прямоугольник - гиперметилирование; серый прямоугольник - гипометилирование; белый прямоугольник - статус метилирования неизменен по отношению к прилегающим нормальным тканям; «н/т» - не тестировали.

* Использованы данные, полученные в лаборатории ранее.

** Во всех исследованных опухолях отсутствует метилирование промотора гена р16 и присутствует мРНК и белок р16 (Ivanova, Т. А., Katargin, et al., 2007).

Исследование уровня экспрессия генов DUX в нормальных тканях, клеточных линиях и опухолях шейки матки методом ОТ-ПЦР

В составе копии 3,3-kb повтора, клонированной из области D4Z4, ранее была обнаружена безинтронная открытая рамка считывания, названная DUX4. Низкий уровень транскриптов генов семейства DUX, в том числе и DUX4, был обнаружен ранее в некоторых тканях взрослого организма. Чтобы установить, присутствуют ли какие-либо транскрипты генов семейства DUX в нормальных тканях и опухолях шейки матки, и зависит ли уровень их транскрипции от статуса метилирования 3,3-kb повторов, мы анализировали уровень транскрипов методом ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к гену DUX4.

Продукты ОТ-ПЦР ожидаемых размеров были выявлены в нормальных тканях шейки матки и большинстве условно нормальных тканях шейки матки, прилежащих к опухолям (рис. 6; таблица 2). Учитывая низкий уровень экспрессии мРНК в нормальных тканях, для подтверждения подавления транскрипции генов DUX в опухолях ПЦР продукты переносили на мембрану и гибридизовапи с Р32-меченным олигонуклеотидом, специфичным к гену DUX4. В 30 из 44 (68,2%) карцином шейки матки продукты ПЦР или отсутствовали,

или были слабее, чем в прилегающих тканях (рис. 6, образцы № 436 и 409, соответственно, таблица 2). Продукты ПЦР отсутствовали в 4 HPV-позитивных клеточных линиях и в 5 из 19 (26,3%) нормальных цервикальных тканей, прилежащих к опухолям. Последнее наблюдение говорит о раннем подавлении транскрипции генов DUX в процессе развития опухолей шейки матки.

Для подтверждения того, что в ходе ПЦР амплифицировались лишь мРНК, родственные генам DUX, продукт ПЦР (299 п.н.), полученный с кДНК С-ЗЗА, был клонирован, и 11 копий сиквенированы. Все копии были высокогомологичны генам DUX4 (90100 %) и DUX10 (89-99,7%).

Таким образом, показано присутствие транскриптов, высокогомологичных генам DUX4 и DUX 10 в нормальных тканях шейки матки. Полное отсутствие транскриптов или снижение их уровня более чем в 3 раза по сравнению с условно нормальными тканями шейки матки было обнаружено в 68% цервикальных карцином.

CaSki +

С-ЗЗА SiHa CaSki 5-аза-дС RT+- + - + -+ _

р» ф т

299 п.н. GAPDH —» —* 409 N 409 Т RT + — + — 436 N + — 436 Т + —

яррщ

299 п.н.

GAPDH

Nc-3 + —

i

Рисунок 6. Анализ экспрессии генов DUX в нормальном эпителии ШМ, PLUM и цервикальных клеточных линиях методом ОТ-ПЦР. Электрофорез в 1,5% агарозном геле продуктов ПЦР с 0иХ4-специфичными праймерами (размер продукта ПЦР - 299 п.н.); Р12 - результаты гибридизации продуктов ПЦР с DUX-специфичным радиоактивным олигонуклеотидным зондом (верхний ряд в каждой панели), RT-обратная транскриптаза. GAPDH - ген «домашнего хозяйства», контроль количества кДНК. CaSki + 5-аза-дС (клетки CaSki, обработанные в ходе культивации 5-аза-дезоксици-тидином. Т -опухоль, N - прилегающий к опухоли нормальный эпителий, Nc-1, Nc-2 и Nc-З -эпителий ШМ от больных с нецервикальной патологией.

Nc-1 Nc-2

299 п.н.

GAPDH «Ж W

Таблица 2. Экспрессия генов семейства DUX в опухолях, клеточных линиях и нормальных тканях шейки матки.

Образцы

кол- Присутствие Подавление во транскриптов транскрипции

Нормальные ткани шейки матки 5 5 -

Нормальный эпителий, прилегающий к РШМ 19 14 5 (26,3 %)**

Рак шейки матки (PLUM)_44 14 30 (68,2 %)*

Клеточные линии РШМ

HPV-позитивные линии 4 0 4** _HPV-негативная линия_1_1_0_

* отсутсвие транскриптов или снижение их уровня не менее чем в 3 раза по сравнению с прилежащим к опухолям нормальным эпителием;

**транскрипты не были обнаружены

Сравнение статуса метилирования и транскрипции 3,3-kb повторов в клеточных линиях и опухолях шейки матки

Для 24 парных образцов были получены одновременно данные по статусу метилирования 3,3-kb повторов и транскрипции генов DUX (таблица 3). Во всех 10 образцах опухолей с гиперметилированием 3,3-kb повторов экспрессия DUX отсутствовала. В 4 гиперме-тилированных клеточных линиях экспрессия DUX также отсутствовала и была выявлена только в сильно гипометилированной линии С-ЗЗА. Таким образом, гиперметилирование 3,3-kb повторов во всех случаях сопровождается подавлением экспрессии генов DUX . Тем не менее, в 8 из 18 (44%) опухолей с подавлением экспрессии DUX не наблюдалось изменений статуса метилирования повтора. Это указывает на то, что помимо метилирования ДНК существуют другие механизмы подавления транскрипции генов DUX в опухолях.

При обработке клеток деметилирующим агентом 5-аза-дезоксицитидином реактивация транскрипции DUX наблюдалась только в одной из 4 гиперметилированных линий, CaSki (рис.6.) Этот эксперимент подтверждает предположение о том, что в подавлении транскрипции генов в карциномах DUX могут играть роль, как гиперметилирование ДНК, так и другие механизмы.

Таблица 3. Корреляция между гиперметилированием 3,3-kb повторов и подавлением экспрессии генов семейства DUX в опухолях шейки матки и клеточных линиях.

_Экспрессия мРНК__Гиперметилирование

есть нет

Карциномы шейки матки отсутствует / подавлена 10 8

не изменена* 0 6

_Всего_10_14_

Клеточные линии отсутствует / подавлена 4 0

не изменена* 0 1

Всего 4 1

Анализ статуса метилирования S/MAR в клеточных линиях карцином шейки матки с гипо- и гиперметилированием 3,3-кЬ повторов

S/MAR был обнаружен в локусах 4q35 и 10q26 перед кластерами 3,3-kb повторов (Petrov A et al., 2006; Рис. 7, A). S/MAR (от англ. scaffold/matrix attachment region) - это специфический участок ДНК, узнаваемый белками, обеспечивающими связывание ДНК с ядерным матриксом. Связывание ДНК с ядерным матриксом приводит к доменной организации хроматина. Известно, что некоторые белки, участвующие в прикреплении ДНК к ядерному матриксу, связываются со своими сайтами узнавания только в том случае, если они метилированы. Однако, ничего неизвестно о влиянии статусов метилирования S/MAR на прикрепление их к ядерному матриксу. Данные о статусе метилирования S/MAR в нормальных тканях и об изменении этого статуса при каких-либо патологиях, а также о корреляции статусов метилирования S/MAR и 3,3-kb повторов отсутствуют. Для того чтобы установить наличие или отсутствие связи между статусом метилирования 3,3-kb повторов и S/MAR на 4 и 10 хромосомах, мы выбрали две клеточные линии карцином шейки матки, резко различающиеся по уровню метилирования 3,3-kb повторов - SiHa и С-ЗЗА. В клетках SiHa 3,3-kb повторы сильно метилированы, а клетках С-ЗЗА они сильно деметилиро-ваны по сравнению с нормальными тканями шейки матки и клеточной линей SiHa (рис. 2). На рис. 7. представлены результаты бисульфитного сиквенирования S/MAR на 4 и 10 хромосомах. Уровни метилирования S/MAR в двух клеточных линиях карцином шейки матки достоверно различаются и коррелируют с уровнем метилирования 3,3-kb повторов каждой из них (S/MAR - 14 % и 54 %; район Sq-1 3,3-kb повтора - 17 %, и 87% для С-ЗЗА и SiHa, соответственно). Эти данные впервые демонстрируют, что в клеточных линиях карцином происходит изменение статуса метилирования S/MAR и это изменение может происходить координировано с изменением статуса метилирования 3,3-kb повторов: наблюдается или гипо- или гиперметилирование и S/MAR и 3,3-kb повторов одновременно.

G2 3,3-kb повторы

FRG1

TUB84Q

S/MAR

С-ЗЗА

ООО» ООО»

ООО« ООО » ООО»

оо»о оооо оооо оооо оооо оооо

• о»«

• о»«

• о»«

• оо<

• оо<

• OOI

оо»« оо»«

ООО« ООО« ООО«

54%

• о»»

оо»»

ООО»

о»оо

ООО» ОООО

Рисунок 7. Анализ статуса метилирования S/MAR в нормальных тканях и клеточных линиях карцином шейки матки методом бисульфитного сиквенирования. А. Схема прителомерного локуса хромосомы 4. Стрелками указано расположение генов в локусе. Увеличенным шрифтом обозначен исследованный район S/MAR (NT 022792 GenBank); Б. Статус метилирования S/MAR. Белый кружок - не-метилированный CpG-динуклеотид, черный кружок - метилированный CpG-дину-клеотид в последовательности S/MAR; каждый ряд кружков представляет один клон; цифры - количество метилированных CpG-динуклеотидов в процентах от общего числа анализированных CpG-динуклеотидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Снижение транскрипции 3,3-kb повторов за счет метилирования ДНК или других механизмов происходит с высокой частотой (68%) в карциномах шейки матки. Какова же роль гиперметилирования 3,3-kb повторов и подавления их транскрипции в канцерогенезе?

Мы обнаружили транскрипты генов семейства DUX в нормальных тканях шейки матки. Транскрипты генов семейства DUX были выявлены ранее в отдельных фетальных и взрослых тканях (Beckers et al., 2001; Ding et al., 1998; Lyle et al., 1995). Однако до сих пор не удалось получить каких-либо доказательств того, что белковые продукты генов DUX присутствуют в нормальных клетках. Некоторые свойства белков DUX известны в настоящее время. Продукты экзогенной трансляции мРНК генов DUX4 и DUX10 обладают свойствами транскрипционных факторов. DUX4 обладает проаптотическими свойствами, а его прямая транскрипционная мишень - ген PITX1, является активатором гена р53 и негативным регулятором RAS-сигнального пути. Не исключено, что белок DUX4 может присутствовать в нормальных тканях в крайне низких концентрациях и может быть одним из первичных спусковых факторов, запускающих каскад транскрипционных факторов, регулирующих онкогены и опухолевые супрессоры. Высокая частота снижения транскрипции в цервикальных опухолях (68%) может служить косвенным указанием на существование белков DUX в нормальных тканях.

Существует альтернативная точка зрения на функцию 3,3-kb повторов. Предполагают, что 3,3-kb повторы выполняют регуляторную функцию, не связанную с кодированием белков, и в нормальных клетках участвуют в формировании и поддержании структуры хроматина в субтеломерных локусах 4 и 10 хромосом, возможно, тем самым, подавляя экспрессию генов, расположенных в этих районах (Tawil and Van Der Maarel, 2006). В связи с этим представляет интерес дальнейшее исследование вопроса о том, влияет ли изменение статуса метилирования 3,3-kb повторов и S/MAR на изменения доменной организации локуса в опухолевых клетках и экспрессию генов в нем.

Таким образом, для получения ответа на вопрос о том, какую роль играет гиперметилирование 3,3-kb повторов и подавление их транскрипции при канцерогенезе, необходимы дальнейшие исследования.

Выводы

1) Впервые в HPV-позитивных опухолях шейки матки и в 4 HPV-позитивных клеточных линиях обнаружено гиперметилирование макросателлитных 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными тканями шейки матки. Гиперметилирование 3,3-kb повторов наблюдается в 53% опухолей.

2) Статус метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях индивидуум-специфичен; изменение статуса метилирования в опухолях происходит сиквенс-спе-цифично.

3) Обнаружено гипометилирование повторов Sat2 по сравнению с нормальными тканями в 80 % случаев рака шейки матки и в 5 клеточных линиях. Гиперметилирование 3,3-kb повторов и гипометилирование Sat2 в клетках рака шейки матки происходят независимо.

4) Впервые в клетках рака шейки матки обнаружено изменение статуса метилирования по сравнению с нормальными тканями специфического участка ДНК S/MAR, расположенного на хромосомах 4 (4q35) и 10 (10q26).

5) Транскрипты, высокогомологичные генам DUX4 и DUX10, обнаружены в нормальных тканях шейки матки; подавление транскрипции генов DUX обнаружено в 68 % опухолей шейки матки как с гиперметилированием 3,3-kb повторов, так и без него.

Список работ, опубликованных по теме диссертаиии:

1) Киселева Н.П., Катаргин А.Н., Гра Д.В. Эпигеномика и канцерогенез: уникальность паттерна метилирования ДНК опухолевой клетки.// Вопросы онкологии. - 2007. - № 1. - С. 14.

2) Киселева Н.П., Катаргин А.Н., Гра Д.В. Уникальность паттерна метилирования опухолевой клетки.// Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. - 2008. -С. 228.

3) Ivanova Т., Kisseljova N., Petrenko A., Katargin A., Kisseljov F. New cellular sequences hypermethylated in cervical tumors.// Second Weissenburg Simposium, Biriciana, Bayern, Germany. - 2004. - p. 49.

4) Kisseljov F., Kisseljova N., Katargin A., Volgareva G., Golovina D., Skvortsov D., Rubtsova M., Zvereva M. Epigenetic changes in cervical carcinomas.// 6th International Multidisciplinary Congress "Eurogin", Paris, France. - 2006.-FC54-12.

5) Kisseljov F., Kisseljova N., Katargin A., Ivanova Т., Volgareva G., Golovina D., Donzova O., Skvortsov D. Epigenetic markers of cervical tumor progression.// Abstracts of 23th International Papillomavirus Conference, Prague. - 2006. - P-287.

6) Ivanova Т., Golovina, D., Zavalishina, L., Volgareva, G., Katargin, A., Andreeva Y., Frank G., Kisseljov F., Kisseljova N. Up-regulation of expression and lack of 5' CpG island hypermethylation of pl6 INK4a in HPV-positive cervical carcinomas.// BMC Cancer. - 2007. - Vol. 7. - p. 47.

7) Katargin A., Kisseljova N. Both Hypomethylation And Hypermethylation of DNA Repeats In HPV-Positive Cervical Carcinomas.// Abstracts of 24th international papillomavirus conference, Beijing. - 2007. - PS21-02.

8) Katargin A., Pavlova L., Kisseljov F., Kisseljova N. Hypermethylation of genomic 3.3-kb repeats is frequent event in HPV-positive cervical cancer.// BMC Medical Genomics. - 2009. - Vol. 2. - p. 30.

Подписано в печать 16. о з. 10 Формат 60х 84/16. Бумага офисная «Бу^оСору». Тираж 100 экз. Заказ №240 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак шейки матки является одной из наиболее распространенных форм опухолей. По частоте заболеваемости и смертности рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим агентом рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска заболевания» (HPV 16, 18 и родственные им, WHO, Press Release, 1996). Большая часть инфицированных HPV пациентов с течением времени спонтанно избавляется от инфекции, однако приблизительно у 5% пациентов развиваются опухоли. Прогрессия опухоли, возникающей из инфицированной HPV клетки, проходит через несколько стадий. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании клеточных генов, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности и другие. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических событий (мутаций), так и вследствие эпигенетических изменений - эпимутаций. Химические модификации ДНК и гистоновых белков формируют сложную регуляторную сеть, которая модулирует структуру хроматина и регулирует функции генома, не меняя генетического кода. Вся совокупность этих модификаций составляет эпигеном клетки. К эпимутациям, часто наблюдаемым в опухолях всех типов, относятся нарушения химической модификации ДНК, а именно метилирования ДНК. В клетках млекопитающих энзиматическому метилированию подвергается главным образом цитозин в составе динуклеотидов 5' CpG. Присутствие метилированных CpG-динуклеотидов в регулятроных областях генов соответствует, как правило, транскрипционно неактивному состоянию гена. Метилирование ДНК является одним из механизмов, определяющих тканеспецифическую экспрессию генов в клетках с одинаковым набором хромосом, участвуя в подавлении транскрипции разного набора генов в разных клетках взрослого организма. Оно участвует также в обеспечении генетической стабильности клетки, ограничивая процессы рекомбинации с участием повторяющихся элементов ДНК (повторов) и распространение по геному мобильных повторяющихся элементов. Для опухолевых клеток характерно сложное нарушение паттерна метилирования ДНК: гиперметилирование локальных участков ДНК и снижение общего уровня метилирования ДНК, связанное с деметилированием повторов, составляющих значительную часть генома человека. Исследования последних лет показали, что опухоли разных локализаций могут отличаться по набору генов и повторов, подвергающихся аберрантному метилированию с высокой частотой. В связи с этим необходимо определение маркеров метилирования для каждого типа опухолей. Механизмы, активирующие в опухолевых клетках такие разнонаправленные процессы, как гипер- и гипометилирование ДНК, а также механизмы, определяющие специфичность маркеров метилирования для разных типов опухолей, до сих пор неизвестны. Понимание соотношения процессов гипер- и гипометилирования в опухолевой клетке и их роли в возникновении опухолей особенно важно в связи с обратимостью реакции метилирования ДНК и попытками использовать для противоопухолевой терапии агенты, деметилирующие ДНК (децитабин, 5-аза-цитидин, RG108 и др.).

В связи с выше сказанным, исследование нарушения паттерна метилирования ДНК, определение мишеней и механизмов аберрантного метилирования в опухолевых клетках представляются актуальными.

Выводы

1) Впервые в HPV-позитивных опухолях шейки матки и в 4 HPV-позитивных клеточных линиях обнаружено гиперметилирование макросателлитных 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными тканями шейки матки. Гиперметилирование 3,3-kb повторов наблюдается в 53% опухолей.

2) Статус метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях индивидуум-специфичен; изменение статуса метилирования в опухолях происходит сиквенс-специфично.

3) Обнаружено гипометилирование повторов Sat2 по сравнению с нормальными тканями в 80% случаев рака шейки матки и в 5 клеточных линиях. Гиперметилирование 3,3-kb повторов и гипометилирование Sat2 в клетках рака шейки матки происходят независимо

4) Впервые в клетках рака шейки матки обнаружено изменение статуса метилирования по сравнению с нормальными тканями специфического участка ДНК S/MAR, расположенного на хромосомах 4 (4q35) и 10 (10q26).

5) Транскрипты, высокогомологичные генам DUX4 и DUX10, обнаружены в нормальных тканях шейки матки; подавление транскрипции генов DUX обнаружено в 68% опухолей шейки матки как с гиперметилированием 3,3-kb повторов, так и без него.

1.5. Заключение

Обнаруженные в последнее время многообразные механизмы, с помощью которых разные повторяющиеся элементы участвуют в функционировании генома, позволяют говорить о них как об эпигенетических регуляторах генома. Несомненное участие метилирования ДНК в регуляции существующих взаимоотношений повторов и генома в нормальных клетках и постоянно присутствующее в опухолях нарушение паттерна метилирования многих повторяющихся элементов указывают на то, что в опухолях, по-видимому, происходит масштабная дестабилизация эпигенетической регуляции функционирования генома. В свете этих данных исследование нарушений функционирования повторяющихся элементов в опухолях должны существенно расширить представления о механизмах канцерогенеза.

Глава 2. Материалы и методы