Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Эпидемиологические и микробиологичесике особенности хронической инфекции, вызванной бактериями комплекса Burkholderia cepacia, у больных муковисцидозом
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.02.02
Оглавление диссертации Алексеева, Галина Вальтеровна :: 2011 :: Москва
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ГЛАВА 1. ЭПИДЕМИОЛОГЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ БАКТЕРИЯМИ BURKHOLDERIA CEPACIA.
1 .Эпидемиологические особенности инфекции, вызванной бактериями комплекса В. cepacia у больных муковисцидозом.
2. Особенности биологии и экологии бактерий рода Burkholderia.
3. Клиническое значение бактерий В. cepacia для человека.
4. Методы исследования фенотипических и генотипических свойств бактерий В. cepacia.
ГЛАВА 2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CEPACIA.
1. Идентификация бактерий В. cepacia.
2. Антигенные свойства бактерий В. cepacia.
3. Особенности генома В. cepacia.
4. Необычные метаболические свойства В. cepacia.
5. Факторы патогенности бактерий В. cepacia.
6. Формирование биопленок.
7. Инсерционные последовательности (ИП).
8. Межклеточное и внутриклеточное выживание бактерий комплекса В. cepacia.
ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы.
2. Методы.
ГЛАВА 2. СТРУКТУРА МИКРОФЛОРЫ НИЖНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ ДЕТЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП.
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ИДЕНТИФИКАЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА В.CEPACIA.
1. Фенотипические методы исследования свойств клинических штаммов В. cepacia.
2. Изучение продукции факторов патогенности клиническими штаммами В. cepacia.
3. Молекулярно-биологические методы для исследования госпитальных штаммов бактерий В. cepacia.
4. Генетическое типирование штаммов В. cepacia, циркулирующих в различных клиниках г. Москвы и других городов России.
5. Выявление эпидемически значимых штаммов В. cepacia.
ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ В. CEPACIA, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ И ПАЦИЕНТОВ МОСКОВСКИХ СТАЦИОНАРОВ.
1. Сравнение продукции факторов патогенности.
2. Изучение чувствительности штаммов к антимикробным препаратам.
3. Изменение чувствительности штаммов к антибиотикам по годам.
4. Выявление эпидемических маркеров.
5. Выявление степени генетического родства между штаммами, выделенными от больных муковисцидозом и клиническими штаммами.
ГЛАВА 5. МОНИТОРИНГ ПЕРСИСТЕНЦИИ ШТАММОВ В. CEPACIA У ДЕТЕЙ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ.
1. Фенотипические свойства штаммов В. cepacia.
2. Генотипические свойства штаммов В. cepacia.
Введение диссертации по теме "Эпидемиология", Алексеева, Галина Вальтеровна, автореферат
Актуальность работы
Муковисцидоз (кистозный фиброз) — тяжелое системное генетически детерминированное заболевание, обусловленное мутацией трансмембранного регулятора муковисцидоза, характеризующееся поражением экзокринных желез. Оно поражает все внутренние органы, выделяющие слизь, в первую очередь - легкие и пищеварительную систему [Капранов Н.И., 1974, 1985, 1995, 2001], [11].
На сегодняшний день это самое распространенное аутосомно-рецессивное наследственное заболевание среди представителей белой европеоидной расы и встречается в среднем у 1 из 400 родившихся детей. В большинстве стран Европы и Северной Америки муковисцидозом заболевают от 1:2000 до 1 r4000 новорожденных. Частота гетерозиготного носительства мутантного гена среди населения в ряде стран (США, Швейцария, Франция), а также в нашей стране составляет от 2 до 20%. Прогноз заболевания в первую очередь зависит от поражения органов дыхания, в патогенезе которого весомую роль играет инфекция. Больные муковисцидозом на протяжении всей жизни страдают от рецидивирующих и хронических инфекций респираторного тракта, которые являются основной причиной заболеваемости, частых госпитализаций и смертности. Инфекционное поражение респираторного тракта является причиной смерти более чем 90% больных MB. [7]. Инфекционные осложнения при муковисцидозе характеризуются полиэтиологичностью, при этом лидирующее положение занимают S. aureus, Haemophilus influenzae и Р. aeruginosa, причем два первых микроорганизма выявляются главным образом у детей раннего возраста, тогда как для более старших возрастных групп основное значение приобретает синегнойная палочка [21]. Инфекция, вызванная В. cepacia, развивается обычно на фоне хронической колонизации Pseudomonas aeruginosa. Нередко присоединение В. cepacia ведет к быстрому прогрессированию бронхолегочного процесса при муковисцидозе, в ряде случаев - с летальным исходом [7, 8].
Инфицирование больных муковисцидозом бактериями комплекса В. cepacia представляет особую опасность, так как данный микроорганизм обладает природной антибиотикоустойчивостью и быстро приобретает резистентность к антимикробным препаратам. Это затрудняет его эрадикацию в процессе лечения, приводя к быстрому переходу острой инфекции нижних дыхательных путей в хроническую форму и значительному ухудшению функции легких. [2, 93]. Больные, инфицированные В. cepacia, являются источником возбудителя этой инфекции и представляют опасность для других пациентов. Также этот возбудитель способен вызывать так называемый «цепация-синдром» - некротизируюшую пневмонию с септицемией, нередко приводящую к летальному исходу. [Isles et al., 1984; Gilligan P.H.,1995; Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al., 2001].
Кроме того, колонизация нижних дыхательных путей бактериями В. cepacia является противопоказанием для пересадки легких, являющейся важной частью программы по увеличению продолжительности жизни у больных муковисцидозом [96].
Эпидемиологические проявления хронической инфекции В. cepacia остаются малоизученными, поскольку не внедрены пока в широкую практику лабораторные методы этиологической диагностики этой инфекции, поэтому она не подлежит официальной регистрации, и отсутствуют сведения о широте ее распространении в популяции.
К началу наших исследований при инфекционных осложнениях (бронхитах, пневмониях) у больных муковисцидозом исследователи выделяли из мокроты больных Burkholderia cepacia, но не было ясно, способны ли данные бактерии самостоятельно вызывать легочную инфекцию или являются только маркером тяжелого поражения легких. Не был изучен вопрос, в каком возрасте происходит колонизация больных этими возбудителями, в какие сроки начинает развиваться хроническая или персистирующая* инфекция и как она формируется, какие микроорганизмы доминируют при колонизации и в каких сочетаниях. Также не были достаточно изучены эпидемиологические особенности: источники инфекции, механизмы и пути распространения возбудителя и широта циркуляции штаммов В. cepacia в популяции больных муковисцидозом.
В течение последнего десятилетия были получены данные о том, что бактерии В. cepacia являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать внутрибольничные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии). В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции" легких [16]. В настоящее время вместо термина «внутрибольничные (госпитальные,, нозокомиальные) инфекции» в научной литературе, публикациях ВОЗ и нормативных документах большинства стран мира используется термин «инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи» - «healthcare-associated infections - HALs» как более точный и объединяющий характер этого понятия. [В.И. Покровский, В.Г. Акимкин, Н.И. Брико, 2011].
Бактерии комплекса В. cepacia обладают одним из самых сложных и пластичных геномов, что обусловливает сложность идентификации и дифференциации этого возбудителя внутрибольничных инфекций, до настоящего времени оставляя его за пределами внимания госпитальных эпидемиологов и микробиологов клинических лабораторий.
Среди всех представителей бактериальной микрофлоры: P. aeruginosa, S. aureus, Haemophilus influenzae, грибы рода Candida, Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp. [Шагинян И.А., Капранов Н.И. и др., 2010], способных вызывать хроническую инфекцию у больных муковисцидозом, диагностика и типирование бактерий комплекса В. cepacia представляет наибольшие трудности, так как требует комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов. Таких разработок в стране до настоящих исследований не было, поэтому практические клинические лаборатории испытывают трудности с идентификацией бактерий этого вида. Точная и быстрая индикация и идентификация данного возбудителя необходима для ранней диагностики, выявления потенциальных источников возбудителя» инфекции и, определения других эпидемиологических особенностей.
Для того чтобы изучить ряд важных вопросов эпидемиологии и микробиологии инфекций, вызванных В. cepacia, необходимо было разработать такой алгоритм идентификации и типирования данного возбудителя, который бы позволял: а) идентифицировать его до геномовара; б) изучать его патогенные свойства; в) определять потенциальную способность В. cepacia вызывать хроническую инфекцию; г) выявлять эпидемиологическую, значимость штаммов.
Цель работы
Изучить эпидемиологические и микробиологические особенности формирования хронической инфекции, вызванной бактериями комплекса В:, cepacia у больных муковисцидозом, с помощью разработанных молекулярно-генетических схем идентификации и типирования.
Задачи исследования
1. Изучить структуру микрофлоры нижних дыхательных путей у детей разных возрастных групп, страдающих муковисцидозом для определения эпидемиологической значимости бактерий комплекса В. cepacia.
2. Усовершенствовать алгоритм идентификации и типирования бактерий комплекса В. cepacia с целью улучшения диагностики инфекций, вызванных данным возбудителем.
3. Создать коллекцию клинических штаммов В. cepacia, выделенных от пациентов Российского Центра Муковисцидоза, многопрофильных стационаров г. Москвы и других регионов Российской Федерации. Изучить особенности штаммов данного возбудителя (генетическое родство, устойчивость к антибиотикам, патогенные свойства) с целью получение данных о структуре популяций госпитальных штаммов и изучения их широты циркуляции среди больных муковисцидозом и пациентов многопрофильных клиник.
4. Провести многолетний молекулярно-генетический мониторинг штаммов, В. cepacia, выделенных от больных муковисцидозом, для определения возможных источников инфекции; и путей- передачи, возбудителя, характеристик персистирующих штаммов («микроэволюция»).
5. Выяснить эпидемиологические и микробиологические закономерности формирования, распространения и циркуляции штаммов В. cepacia в лечебно-профилактических учреждениях,, используя методы молекулярной эпидемиологии.
6. Обосновать тактику профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования пациентов данным возбудителем и ограничения распространения инфекции, вызванной В. cepacia, в стационарах разного профиля. V
Научная новизна
- Оценено эпидемиологическое значение бактерий^ комплекса В. cepacia. Показано, что характерным проявлением инфекционных осложнений у больных муковисцидозом является смешанная инфекция, вызванная ассоциацией микроорганизмов, среди которых особое значение имеет сочетание В. cepacia и Pseudomonas aeruginosa.
- Доказано, что у больных муковисцидозом штаммы В. cepacia, не элиминируются, а длительно персистируют в нижних дыхательных путях, что имеет важное эпидемиологическое значение, так как эти больные являются источниками возбудителя инфекции и представляют угрозу для других пациентов.
- Установлено, что бактерии комплекса В. cepacia способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах и передаваться от пациента к пациенту.
- Собрана и охарактеризована российская коллекция штаммов бактерий комплекса В. cepacia по фенотипическим и генотипическим признакам, в том числе методами молекулярной эпидемиологии с помощью ПЦР и пульсэлектрофореза, что может быть использовано для дальнейших эпидемиологических исследований.
- Разработанный алгоритм для идентификации и типирования бактерий В. cepacia дополнен ПЭФ и апробирован на коллекции штаммов В. cepacia с целью усовершенствования лабораторной диагностики данного возбудителя.
- Обоснована тактика профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования больных муковисцидозом штаммами В. cepacia и распространения этой инфекции в стационарах, состоящая в ранней и точной диагностике инфекции, вызванной данным возбудителем, изоляции и ограничении контактов больных, дезинфекции инфицированных предметов.
Практическая значимость
- Впервые усовершенствованы методы лабораторной диагностики штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью алгоритма, включающего в себя молекулярно-биологические методы (ПЦР, пульсэлектрофорез) для ранней диагностики В. cepacia и выявления возможных источников инфекции;
- Изучена широта распространения штаммов В. cepacia в Российском Центре Муковисцидоза, многопрофильных стационарах г. Москвы и других регионов РФ;
- Рекомендованы профилактические мероприятия для снижения риска инфицирования больных муковисцидозом штаммами В. cepacia;
- На основе полученных результатов разработаны Методические рекомендации «Выявление и идентификация! бактерий комплекса Burkholderia cepacia» [Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005] для клинических бактериологических лабораторий, утвержденные советом по внедрению ФГБУ «НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, и учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» [Ред. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Москва, 2006].
Положения, выносимые на защиту
1. Показана необходимость совершенствования тактики лабораторной диагностики инфекции, вызванной В. cepacia, поскольку применение для идентификации штаммов бактерий комплекса В. cepacia только коммерческих биохимических тест-систем в ряде случаев может приводить к ошибкам идентификации. Геномовары В. cepacia имеют очень похожие фенотипические признаки, их невозможно дифференцировать, учитывая только биохимические тесты. Также невозможно поставить этиологический диагноз по клиническим проявлениям инфекции.
2. Выявлено, что наиболее эпидемиологически значимым является геномовар В. cenocepacia подтип ЗА. В каждом регионе РФ циркулируют специфические для этих территорий штаммы. В московском регионе установлена циркуляция штаммов, характерных как для данного стационара, так и общих для нескольких клиник.
3. Больные муковисцидозом, инфицированные В. cepacia, могут быть опасны как источник инфекции для других пациентов, т.к. штаммы В. cepacia не элиминируются из нижних дыхательных путей в течение длительного времени. Штаммы В. cepacia способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах и представлять эпидемиологическую опасность для пациентов клиник.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены на- III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва 2004); 5-й Всероссийской конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва 2004); международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней» (Санкт-Петербург 2003); IV Российской научной» конференции (Оренбург 2003); XXXVII научной конференции «Оптимизация больничной среды средствами новых технологий» (Санкт-Петербург 2004); международном конгрессе МАКМАХ (Москва 2006); конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Москва 2007); X Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2011).
Апробация диссертации состоялась 29.06.11 на научной конференции отделов эпидемиологии и медицинской микробиологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи-Минздравсоцразвития России.
Все исследования, представленные в работе, были проделаны лично автором.
Публикации
По результатам исследований опубликовано 19 работ, в том числе 6 статей, в журналах рекомендованных ВАК РФ.
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение диссертационного исследования на тему "Эпидемиологические и микробиологичесике особенности хронической инфекции, вызванной бактериями комплекса Burkholderia cepacia, у больных муковисцидозом"
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что при хронической инфекции нижних дыхательных путей у больных муковисцидозом колонизация дыхательных путей осуществляется ассоциацией микроорганизмов. При этом у госпитализированных больных муковисцидозом ассоциация в 60% случаев представлена 3-5 микроорганизмами, тогда как у амбулаторных больных - только 2-3 видами возбудителей бактериальных инфекций. Исходя из этого, можно предполагать, что инфицирование пациентов в, основном происходит в условиях стационара.
2. Определен* состав^ ассоциаций, в которые, кроме основных возбудителей хронической инфекции нижних дыхательных путей — бактерий видов Р. aeruginosa и S. aureus, наиболее часто входят представители грамотрицательныхл неферментирующих видов бактерий - Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii. Частой ассоциацией является сочетание - Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia.
3. Разработан алгоритм, основанный на сочетании микробиологических и молекулярно-генетических методов, позволяющих решать ряд актуальных вопросов микробиологии и эпидемиологии хронической инфекции, вызываемой данным возбудителем, а именно: а) идентифицировать возбудитель до геномовара; б) определить вирулентные свойства микроорганизма; в) выявить способность вызывать хроническую инфекцию; г) установить общие генотипические признаки между штаммами, циркулирующими в стационаре и среди больных В. cepacia.
4. Установлено: а) все клинические штаммы комплекса В. cepacia, циркулирующие в различных стационарах г. Москвы, а также в популяции больных муковисцидозом относятся к геномовару Burkholderia cenocepacia подтип IIIA; б) выявлено регион - специфическое распределение штаммов в РФ и их поликлональное распространение внутри различных стационаров в) у 20,1% клинических штаммов, выделенных в московских стационарах, выявлен BCESM, свидетельствующий об эпидемиологической значимости циркулирующих в данных стационарах штаммов В. cepacia.
5. Штаммы В. cepacia, выделенные от больных муковисцидозом, характеризовались высокой степенью генетического родства между собой. Они отличались от штаммов, вызвавших госпитальную пневмонию у пациентов многопрофильных стационаров г. Москвы, по фенотипическим и генотипическим свойствам. У 82% штаммов; выделенных от больных муковисцидозом, обнаружен BCESM, что свидетельствует о способности к эпидемическому распространению штаммов, вызывающих у больных муковисцидозом хроническую инфекцию.
6. Выявлено, что штаммы В. cepacia, у больных муковисцидозом; в отличие от других видов.микроорганизмов, не элиминируются в течение длительного времени, несмотря на проводимые курсы антибиотикотерапии. С помощью пульсэлектрофореза и метода RAPD-ПЦР выявлены 4 группы штаммов, составивших 3 генотипа. Доминирующим был генотип, включающий 17 штаммов (80%), выделенных от 8 обследованных в динамике больных, что свидетельствует о едином источнике инфекции.
7. Установлено, что данные микроорганизмы способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах. По данным молекулярно-генетического мониторинга за хронической инфекцией, вызванной В. cepacia, можно предполагать, что основными механизмами распространения возбудителя являются аспирационный и контактный, а передача возбудителя от пациента к пациенту осуществляется воздушно-капельным или бытовым путями.
8. Обоснована тактика профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования штаммами В. cepacia больных муковисцидозом, направленных на применение ПЦР для быстрой и точной индикации В. cepacia у пациентов, ограничение контактов пациентов, соблюдение правил противоэпидемического режима.
СВОДНЫЕ ТАБЛИЦЫ ХАРАКТЕРИСТИК ШТАММОВ В. CEPACIA
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последнее время в Российской Федерации и за рубежом уделяется большое внимание изучению роли бактерий рода В. cepacia как возбудителя инфекционных заболеваний человека.
Инфекция, вызванная В. cepacia является чрезвычайно важной проблемой, так как этот микроорганизм обладает природной антибиотикоустойчивостью и быстро приобретает резистентность к антимикробным препаратам в процессе лечения, что затрудняет его эрадикацию и приводит к хронизации инфекции.
Особое значение данный патоген имеет для больных муковисцидозом, у которых он играет существенную роль в развитии хронической инфекции нижних дыхательных путей и ассоциируется со значительным ухудшением функции легких и увеличению количества смертельных исходов.
Лечение муковисцидоза в настоящее время стало национальной приоритетной программой в Российской» Федерации. Совершенствование лечебно-реабилитационных режимов способствует постоянному увеличению средней продолжительности жизни больных MB. Это ведет к трансформации некогда фатальной патологии детского возраста в хроническую болезнь взрослых. По данным J. Dodge, средняя ожидаемая продолжительности жизни больных MB для рожденных в 2000 году в Великобритании превысит 50 лет [57].
В1 ходе нашей работы были выявлены некоторые эпидемиологические и микробиологические закономерности, касающиеся инфекционных осложнений у детей больных муковисцидозом. А именно: а) основными возбудителями инфекции легких у больных детей муковисцидозом являются P. aeruginosa и S. aureus, причем в первые годы жизни доминирует S. aureus, а затем основным возбудителем становится P. aeruginosa; б) хроническая синегнойная, стафилококковая или смешанная инфекция начинает диагностироваться у 25% детей уже в возрасте 1-4 года, а к 18 годам отмечается у 80% больных муковисцидозом; в) в 2/3 случаев инфицирование легких осуществляется не монокультурой, а ассоциацией микроорганизмов, причем у госпитализированных больных эти ассоциации в 60% случаев представлены более чем двумя микроорганизмами; г) в составе ассоциаций, кроме Р. aeruginosa, часто встречаются другие представители грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов - В. cepacia, S. maltophilia, A. baumanii, что, вероятно, обусловлено тропизмом этих видов микроорганизмов к легочной ткани [21].
Полученные нами данные послужили основанием для заключения, что для больных муковисцидозом характерным проявлением инфекционных осложнений является смешанная инфекция и что В. cepacia является» типичным представителем госпитальной микрофлоры. О видах микроорганизмов Р. aeruginosa, S. aureus как основных возбудителях легочной инфекции у больных муковисцидозом имеется достаточное число публикаций, как и о роли В. cepacia в возникновении тяжелых инфекционных осложнений в 20% случаев, приводящих к возникновению «цепация синдрома» — легочной пневмонии, сепсису и летальному исходу. Однако данных о том, что характерным проявлением инфекционных осложнений является смешанная инфекция, ранее не представлялось. Нами установлено; что одной из часто встречающихся ассоциаций смешанной инфекции является сочетание P. aeruginosa и В. cepacia. В клинике по свидетельству врачей, работающих в отделении медицинской генетики, такое сочетание возбудителей, как правило, подразумевает тяжелое клиническое течение инфекционного, осложнения и неблагоприятный прогноз.
Сравнение микробиологического статуса пациентов в 2000 и 2008 году свидетельствует об уменьшении доли Staphylococcus aureus (с 52% до 43,7%) в структуре патогенов и роста высева изолятов неферментирующей грамотрицательной микрофлоры [77].
В работе Поликарповой C.B. (2005) показано, что у детей, наблюдавшихся в Московском центре по лечению детей с муковисцидозом в 2000 - 2003 г.г. В. cepacia выделялась у 1% обследованных. В нашем исследовании выявлено, что в 2008 - 2009 г.г. В. cepacia высевалась в 24% случаев. Это может быть связано с усовершенствованием методов диагностики или увеличением эпидемиологической значимости данного возбудителя для больных MB.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для больных муковисцидозом характерным проявлением является хроническая смешанная инфекция. Расшифровка возможных механизмов, инфицирования легких больных муковисцидозом позволит разработать научно-обоснованную систему профилактики инфекционных легочных осложнений у таких больных.
Мы провели ^ исследование имеющейся коллекции, штаммов по фенотипическим и генотипическим признакам. Нами была изучена антибиотикочувствительности штаммов. Все изученные штаммы были устойчивы к аминогликозидам; что является видовым признаком бактерий комплекса В. cepacia. Выявлен также высокий процент штаммов устойчивых к имипенему, цефепиму, ципрофлоксацину. Реже всего регистрировалась устойчивость к меропенему, цефтазидиму и тазобактаму. - Показано, что клинические штаммы В. cenocepacia с выраженной способностью к образованию биоплёнок характеризуются большим спектром резистентности к антибиотикам, что согласуется с данными литературы о том, что при формировании биоплёнок устойчивость. микроорганизмов к антибактериальным препаратам возрастает в 100 и более раз по сравнению с уровнем устойчивости планктонных бактерий
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что более 83% клинических штаммов В. cepacia способны формировать биопленку, а, следовательно, колонизировать поверхности органов и тканей (прежде всего, легких, ран) и вызывать хроническую госпитальную инфекцию [16]. Выявление в ПЦР гена cbl и BCESM, обнаружение у штаммов хитинолитической и протеолитической способности могут считаться маркерами эпидемиологической значимости клинических штаммов В. cepacia с потенциально выраженной способностью к формированию биопленки, а, следовательно, штаммов, способных вызывать хронические госпитальные инфекции или формировать хронические резервуары возбудителя на медицинских приборах, оборудовании и в госпитальной среде.
Одной из актуальных' задач является разработка современных методов идентификации и дифференциации бактерий комплекса В. cepacia, так как они обладают среди микроорганизмов - одним из самых сложных и пластичных геномов. Сложность идентификации и- дифференциации', этого возбудителя внутрибольничных инфекций до настоящего времени оставляет его за пределами внимания- госпитальных эпидемиологов и микробиологов клинических лабораторий. В проведенных исследованиях нами для идентификации бактерий В. cepacia были одновременно использованы ряд микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов.
В результате изучения госпитальных штаммов В. cepacia с помощью фенотипических методов выявлено, что применение только коммерческих биохимических тест-систем в ряде случаев может приводить к ошибкам идентификации. Учет отдельных биохимических тестов оказался не эффективным и при определении геномоваров. С помощью фенотипических методов удалось дифференцировать Российские штаммы и отнести их к группе из 3-х геномоваров (I, III, IV), имеющих очень похожие фенотипические признаки. Сравнение антибиотикограмм не подтвердило клональности исследованных штаммов, однако позволило выявить рост антибиотикорезистентности у московских госпитальных штаммов по годам. К фенотипическим признакам можно отнести и наличие у штаммов способности к образованию биоплёнки. Более 83% штаммов обладали способностью к формированию биоплёнки. Однако проведенные исследования показали, что использование одних микробиологических и биохимических методов недостаточно для точной идентификации.
Применение молекулярно-генетических методов подтвердило принадлежность исследованных штаммов к бактериям комплекса В. cepacia и позволило более четко дифференцировать Российские штаммы Ш-го геномовара, отнеся их к группе IIIA. Данные литературы, касающиеся исследований штаммов В. cepacia, полученных из различных источников за рубежом (больные кистозным фиброзом, пациенты клиник с другими заболеваниями, окружающая среда), указывают на широкую распространенность штаммов, относящихся к Ш-му геномовару [120]. Было продемонстрировано, что штаммы, относящиеся к геномовару IIIA, доминируют среди пациентов с кистозным фиброзом в Великобритании, Канаде и Италии, a IIIB - в США [105], [149].
Нами установлено, что популяция Российских штаммов отличается от популяции штаммов В. cepacia, циркулирующих за рубежом. Кроме того, выявлено, что штаммы, выделенные от больных с кистозным фиброзом, отличаются от штаммов, выделенных от пациентов.с другими заболеваниями.
У эпидемических штаммов, принадлежащих к геномовару IIIA, присутствуют контагиозные пили, посредством которых происходит специфическое связывание с муцинкарбогидратами и эпителиальными клетками. Поэтому одним из эпидемиологических маркеров бактерий комплекса В. cepacia является сЫА ген, ответственный за продукцию пилина А. Однако не все штаммы III геномовара несут ген, кодирующий их синтез (ген cbl). Известно; что некоторые штаммы, лишенные cbl-маркера, например В. multivorans, способны к эпидемическому распространению. Среди исследованных нами Российских штаммов cbl-маркер присутствовал у штаммов, выделенных не во всех клиниках, и процент его обнаружения был невысоким (от 10% до 31,6%). Другими эпидемиологическими маркерами у бактерий комплекса В. cepacia являются маркер ISH (гибрид двух инсерционных последовательностей IS 402 и IS 1356), маркер эпидемических штаммов BCESM консервативная открытая рамка считывания длиной 1,4 kb, которые выявляются только в эпидемических штаммах и отсутствуют у штаммов В. cepacia, вызывающих спорадические случаи заболеваний [137, 147, 153]. По данным зарубежной литературы, ISH- маркер присутствует у эпидемических штаммов. Он способствует увеличению трансмиссивности эпидемических штаммов или может быть просто маркером таких штаммов [136, 140, 146]. У московских штаммов этот маркер не был обнаружен. Предполагается, что наличие BCESM-маркера обеспечивает способность штаммов распространяться между пациентами, хотя сообщалось, что штаммы, выделенные от больных со спорадическими) случаями инфекции, также могут обладать этим маркером. Среди штаммов нашей коллекции BCESM-маркер был обнаружен у штаммов В. cepacia, выделенных в 3-х клиниках из пяти. Количество таких штаммов не превышало, 30% от образцов, выделенных в каждой клинике. У больных ,муковисцидозом не было выявлено маркеров сЫ и ISH, a BCESM присутствовал у 82% исследованных штаммов. Таким образом, в результате проведенных исследований была определена эпидемиологическая значимость московских штаммов, обладающих эпидемическими маркерами, имеющих характерные показатели для каждой клиники и установлено, что Российские штаммы обладают своими особенностями. Наряду с определением эпидемической значимости штаммов в схему идентификации В. cepacia было включено генотипирование штаммов. С помощью-RAPD-ПЦР удалось выявить, что в стационарах города Москвы циркулируют как штаммы В. cepacia, характерные для каждого стационара, так и общие для Москвы. Выявление у штаммов коллекции генов cepl и cepR [16] позволило подтвердить эпидемиологическую значимость штаммов, обладающих, благодаря регуляторной системе QS, потенциальной способностью быть патогенными и персистировать в организме больного.
Для типирования штаммов от больных муковисцидозом был использован метод пульсэлектрофореза. С помощью этого метода удалось установить, что пациенты инфицированы двумя клонами штаммов, а также получить данные о том, что штаммы В. cepacia способны длительно персистировать в легких.
Таким образом, разработанная система идентификации бактерий В. cepacia с использованием набора традиционных фенотипических (бактериологических, биохимических) и молекулярно-генетических методов, а также дополнительного использования генотипирования и выявления эпидемических маркеров позволит более точно идентифицировать возбудителей и выявлять источник внутрибольничной инфекции, вызванной бактериями комплекса В. cepacia, а также изучать молекулярно-генетические механизмы патогенности бактерий В. cepacia. Бактериологические и биохимические тесты может выполнить любая- клиническая, лаборатория, молекулярно-генетические методы для-идентификации и типирования бактерий В. cepacia в настоящее время за рубежом выполняют референс-лаборатории, в Российской Федерации может выполнить лаборатория, обладающая необходимым арсеналом молекулярно-биологических методов идентификации и типирования, референс-штаммами бактерий В. cepacia. Необходимо иметь сеть референс-лабораторий в Российской Федерации, способных проводить идентификацию и типирование бактерий комплекса В. cepacia.
Обоснование тактики профилактических мероприятий для предупреяедения инфицирования больных штаммами В. cepacia
Поскольку бактерии комплекса В. cepacia являются возбудителями внутрибольничных инфекций необходимо проведение мероприятий по предупреждению внутрибольничных инфекций в стационарах. Основные направления профилактики ВБИ изложены в ПИСЬМЕ МИНЗДРАВА РФ ОТ 17.04.2000 N 2510/4196-32 "О ПРОФИЛАКТИКЕ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ
ИНФЕКЦИЙ" (ВМЕСТЕ С "КОНЦЕПЦИЕЙ "ПРОФИЛАКТИКА ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ").
Как видно из зарубежной литературы и проведенных нами исследований, инфицирование В. cepacia серьезно ухудшает прогноз для пациентов с MB: сокращает продолжительность жизни, делает невозможной пересадку легких, не поддается эрадикации, имеет больший спектр устойчивости к антибиотикам, чем синегнойная палочка и быстро приобретает устойчивость к антимикробным препаратам, применяемым для терапии: Следовательно, все усилия- должны быть направлены на то, чтобы пациенты не были инфицированы штаммами В. cepacia.
Обзор литературы и проведенные исследования показывают, что наиболее часто пациенты инфицируются t при прохождении лечения в стационарах. Поэтому необходимо организовать работу отделения таким» образом, чтобы исключить контактирование- инфицированных и неинфицированных пациентов. В поликлиническом отделении необходимо потоки инфицированных и неинфицированных пациентов* разделить во времени, то- есть организовать их прием в разные. дни. Для первично поступивших в стационар организовать «карантинную» палату. Инфицированные штаммами В. cepacia пациенты должны содержаться в особом отделении, целесообразно выделение для, них отдельного персонала. Врачи при переходе из одного отделения в другое должны менять халаты и тщательно мыть руки.
Поскольку длительное пребывание в стационаре увеличивает риск заражения госпитальными штаммами, целесообразно свести к возможному минимуму сроки пребывания больных в стационаре, а проведение необходимых процедур организовать в амбулаторных условиях. Пребывание в домашних условиях наряду с улучшением качества жизни пациентов (привычная среда обитания, питание, уход и пр.) позволит избежать перекрестного инфицирования госпитальными штаммами среди больных и предотвратит распространение антибиотикорезистентных микроорганизмов.
Для быстрой и точной диагностики инфекции В. cepacia необходимо использовать молекулярно-генетические методы исследования (ПЦР), позволяющие быстро выявить наличие микроорганизма непосредственно в мокроте без выделения чистой культуры. Известно, что рост В. cepacia может подавляться сопутствующей флорой, а при применении биохимических тестов возможны^ ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Поскольку штаммы В. cepacia могут передаваться контактным путем, необходимо разъяснять пациентам необходимость соблюдения правил личной гигиены: тщательно и часто мыть руки, пользоваться индивидуальными ингаляторами и защитными масками. Недопустимо оплевывание мокроты в раковины. Для этого должны быть специальные плевательницы с дезраствор.
С целью создания эффективной- системы профилактики внутрибольничных инфекций, вызванной бактериями комплекса В. cepacia, госпитальным эпидемиологам необходимо организовать молекулярно-генетический мониторинг, позволяющий получать данные о структуре популяций госпитальных штаммов и расшифровывать механизмы появления, формирования и циркуляции эпидемических штаммов в стационарах. Это позволит прогнозировать эпидемиологически неблагоприятную обстановку и предотвращать возникновение внутрибольничных инфекций.
Соблюдение таких профилактических мероприятий снизит частоту инфицирования пациентов и, соответственно, и риск развития инфекционных осложнений, что позволит увеличить продолжительность и повысить качество жизни больных муковисцидозом.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Алексеева, Галина Вальтеровна
1. Зубков М.Н:, Самойленко В.А., Гугуцидзе E.H., Чучалин А.Г. Микробиологические аспекты этиологии и антимикробной терапии бронхолегочной инфекции при муковисцидозе у взрослых. Пульмонология 2001; т. 11, №3, с. 38-41.
2. Малышев В., Картель H.A. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений. Молекулярная Биология 1997; т. 31, с. 197-208.
3. Капранов Н.И. Современные проблемы ш достижения в области изучения муковисцидоза в России. Пульмонология 1994; т. 4, №3, с. 616.
4. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. Актуальные проблемы муковисцидоза на современном этапе в России. Пульмонология 1997; т.7, №4, с. 7-16.
5. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Петрова Н.В. Муковисцидоз. Достижения и проблемы на. современном этапе. VII национальный конгресс по муковисцидозу: сборник статей и тезисов. М. 2005; с. 3-19.
6. Капранов Н.И., Шабалова Л.А., Каширская Н.Ю., Воронкова А.Ю., Блистинова З.А., Лубская Т.В., Осипова И.А., Капранов А.Н. Муковисцидоз (Современные достижения и проблемы). Методические рекомендации. М.: Медпрактика 2001.
7. Капустина Т.Ю., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Состояние гепатобилиарной системы у детей, больных муковисцидозом. Пульмонология 2006; Приложение, с. 22-24.
8. Капустина Т.Ю., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Чесноков СВ.,
9. Воронкова А.Ю. Российский регистр больных муковисцидозом. VII национальный конгресс по муковисцидозу: сборник статей и тезисов. М. 2005; с. 48-50.
10. Кучкина Н.В., Самсонова М.В. Влияние осмотичности среды на морфофункциональное состояние нейтрофилов крови при MB. Пульмонология 1996; №4, с. 77-79.
11. Самсонова М.В., Черняев А.Л., Амелина Е.Л. Патология лёгких при муковисцидозе. Пульмонология 2006; Приложение, с. 113-117.
12. Сулимова Г.Е., Шайхаев Г.О., Берберов Э.М., Маркарян А.Ю., Кандалова Л.Г. Генотипирование локуса каппа-казеина у крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции. Генетика 1991; т.27, с. 2053-2062.
13. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу. Генетика 1995; т.31, №9, с. 1294-1299.
14. Черкасский Б.Л. Традиционные и новые понятия в современной эпидемиологии. Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва 2007; т. 1, с. 36-38.
15. Чернуха М.Ю. Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции. Автореферат докторской диссертации. М. 2008.
16. Шабалова JI.A., Передерко Л.В., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Аллергический бронхолёгочной аспергиллёз у детей с муковисцидозом. Пульмонология 2006; Приложение, с. 52-56.
17. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы. Вестник РАМН 2000; т. 1, с. 22-28.
18. Шагинян И.А., Першина М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологиибактериальных инфекций. Журн. микробиол. 1997; №4, с. 54-59.
19. Шагинян И.А., Тарасевич И.В. Молекулярная эпидемиология: предмет,iцель и задачи новой науки. Материалы IX съезда Всероссийскогонаучно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва 2007; т. 1, с. 41-42.
20. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Неферментирующие грамотрицательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: клинические, микробиологические эпидемиологические особенности. Клиническая микробиология и антимикробная терапия 2005; т.7, №3, с. 271-285.
21. Agodi A., Mahenthiralingam Е., Barchitta М. et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis: prevalence, epidemiology, and genomovar status. J. Clinical microbiology 2001; vol. 39, n. 8, p. 2891-2896.
22. Aubert D. F., Flannagan R. S., Valvano M. A. A novel sensor kinase-response regulator hybrid controls biofilm formation and type VI secretion system activity in Burkholderia cenocepacia. Infection and Immunity 2008; vol. 76, n. 5, p. 1979-1991.
23. Avgeri S.G., Matthaiou D.K., Dimopoulos G., Grammatikos A.P., Falagas M.E. Therapeutic options for Burkholderia cepacia infections beyond co-trimoxazole: a systematic review of the clinical evidence. Int. J. Antimicrob.
24. Agents 2009; 33(5), p. 394-404.
25. Ambrose C.B., Kadlubar F.F. Toward an integrated approach to molecular epidemiology. Am. J. Epidemiol. 1997; 146, p. 912-918.
26. Anthony M., Rose B., Pegler M.B. et al. Genetic analysis of Pseudomonas aeruginosa isolates from the sputa of Australian adult cystic fibrosis patients. J. Clin. Microbiol. 2002; 40, p. 2772-2778.
27. Arber W. Promotion and limitation of genetic exchange. Science 1979; vol. 205, p. 361 -365.
28. Arbeit R.D. Laboratory procedures for the epidemiologic analysis of microoranisms. Manual Clin microbiol. ASM Press 1995; p. 190-208.
29. Avise J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman and HALL: An International Thomson Publishing Company 1994.
30. Bauernfeind A., Schneider I., Jungwirth R. et al. Discrimination of Burkholderia multivorans and Burkholderia vietnamiensis from Burkholderia cepacia genomovars I,III, and IV by PCR. J. Clinical microbiology 1999; vol.37, n. 5, p. 1335-1339.
31. Berger M., Sorensen R.U., Tosi M.F. et al. Complement receptor expression on neutrophils at the inflammatory site, The Pseudomonas-infected lung in cystic fibrosis. J. Clin. Invest 1989; 84, p. 1302-1313.
32. Bombieri C., Giorgi S., Carles S. A new approach for identifying non-patogenic mutations. An analysis of the cystic fibrosis transmembrane regulator gene in normal individuals. Hum. Genet. 2000; vol. 106, p. 172-178.
33. Bonfeld T.L., Konstan M.W., Burfeind P. et al. Normal bronchial epithelial cells constitutely produce the anti-inflammatory cytokine IL10 which is down regulated in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995; 13, p. 257261.
34. Bontemps C., Elliott G. N., Simon M. F. et al. Burkholderia species are ancient symbionts of legumes. Molecular Ecology 2010; vol. 19, n. 1, p. 4452.
35. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.V. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Amer. J. Hum. Genet 1980; vol. 32, p. 314-331.
36. Burns J.L., Emerson J., Stapp J.R. et al. Microbiology of Sputum from patients at cystic fibrosis centers in United States. Clin. Infect. Dis. 1998; 27, p. 158-163.
37. Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2), p. 383-416.
38. Cheng H., Lessie T. Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17616. J. Bacteriol. 1994; vol .176, p. 4034-4042.
39. Chiarini L., Bevivino A., Dalmastri C., Tabacchioni S., Visca P. Burkholderia cepacia complex species: health hazards and biotechnological potential. Trends in Microbiology 2006; vol.14, n. 6, p. 277-286.
40. Christenson J. C., Welch D.F., Mukwaya G., Muszynski M.J., Weaver R.E., Brenner D.J. Recovery of Pseudomonas gladioli from respiratory tract specimens of patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 1989 February; 27(2), p. 270-273.
41. Coenye T., and LiPuma J.J. Molecular epidemiology of Burkholderia species. Fronti. Biosci. 2003; 8, p. 55-67.
42. Coenye T., LiPuma J. J., Henry D. et alr. Burkholderia cepacia genomovar VI, a new member of the Burkholderia cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001; n. 51, p. 271-279.
43. Coenye T., Mahenthiralingam E., Henry D. et al. Burkholderia ambirafaria sp.nov., a novel member of the Burkholderia cepacia complex including biocontrol and cystic fibrosis-related isolates. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001; vol. 51, p. 1481-1490.
44. Coenye T., Vandamme P., Gowan J.R.W., Lipuma J.J. Taxonomy and identification of the Burkholseria cepacia complex. J. Clin. Microbiol. 2001; vol. 39, p. 3427-3436.
45. Coenye T., Vandamme P. Burkholderia: molecular microbiology and genomics. Horizon Scientific Press 2007.
46. Cystic Fibrosis Foundation. Patient Registry 1999 Annual Data Report. Cystic Fibrosis Foundation. Bethesda 2000.
47. Dahl M., Tybjaerg-Hansen A., Lange P., Nordestgaard B.G. Asthma and COPD in.cystic fibrosis intron-8 5T carriers. A population-based study. Respiratory research 2005; vol. 113, №60, p. 1155-1163.
48. De Rose V. Mechanisms and markers of airway inflammation in cystic fibrosis. Eur. Respir. J. 2002; 19, p. 333-340.
49. Deng Y., Boon C., Eberl L., Zhang L.-H. Differential modulation of Burkholderia cenocepacia virulence and energy metabolism by the quorum-sensing signal BDSF and its synthase. Journal of Bacteriology 2009; vol. 191, n. 23, p. 7270-7278.
50. Dodge J.A., Lewis P.A., Stanton M. et al. Cystic fibrosis mortality and survival in the United Kingdom, 1947 to 2003. Eur. Respir. J. 2006 Dec 20.
51. Donlan R.M. Biofilms and device-associated infections. Emerg. Infect. Dis. 2001; n. 7, p. 277-281.
52. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev 2002; 15, p. 167-193.
53. Drevinek P., Vosahlikova S., Dedeckova K., Cinek O., and Mahenthiralingam
54. E. Direct culture-independent strain typing of Burkholderia cepacia complex in sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology 2010; vol. 48, n. 5, p. 1888-1891.
55. Dubarry N., Du W., Lane D., Pasta F. Improved electrotransformation and decreased antibiotic resistance of the cystic fibrosis pathogen Burkholderia cenocepacia strain J2315. Applied and Environmental Microbiology 2010; vol. 76, n. 4, p. 1095-1102.
56. Duff A. J. A. Psychological consequences of segregation resulting from chronic Burkholderia cepacia infection in adults with CF. Thorax 2002; 57, p. 756-758.
57. Estrada de los Santos P., Bustillos-Cristales R. and Caballero-Mellado J. Burkholderia, a genus rich in plant-associated nitrogen éxers with wide environmental and geographic distribution. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67, p. 2790-2798.
58. Frederiksen B., Koch C., Hoiby N. Changing Epidemiology of Pseudomonas aeruginosa infection in Danish cystic fibrosis patients (1974-1995). Pediatric pulmonology 1999; 28, p. 159-166.
59. FitzSimmons S.C. The changing epidemiology of cystic fibrosis. Curr. Probl. Pediatr. 1994; 24, p. 171-179.
60. Foxman B., Riley Lee. Molecular Epidemiology: Focus on Infection. American Journal of Epidemiology; vol. 153, n. 12, p. 1135-1141.
61. Gan Y.H. Interaction of Burkholderia pseudomallei with host immune response: sleeping with the enemy? J. Infect. Dis. 2005; 192, p. 1845-1850.
62. George A. M., Jones P. M., and Middleton P. G., Cystic fibrosis infections: treatment strategies and prospects. FEMS Microbiology Letters 2009; vol. 300, n. 2, p. 153-164.
63. Gilligan P.H., Lum G., Vandamme P., Whittier S. Burkholderia,
64. Stenotrophomonas, Ralstonia, Brevundimonas, Comamonas, Delftia, Pandorea, and Acidovorax. In: Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H., editors. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington: ASM Press 2003; p. 729-748.
65. Goldstein R., Sun Li, Ru-zhang Jjang et al. Structurally variant classes of pilus appendage fibers coexpressed from Burkholderia (Pseudomonas) cepacia. J. Bacteriol. 1995; vol. 177, n. 4, p.1039-1052.i
66. Govan J.R.W., Brown P.H., Maddison J. et al. Evidence for transmission of P.cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet 1993; vol. 342, p. 15-19.
67. Govan J.R.W., Vandamme P. Agricultural and medical microbiology: a time for bridging gaps. Microbiol. 1998; vol. 144, p. 2373-2375.
68. Guggino W.B. Cystic fibrosis and the salt conroversy. Cell 1999; 96, p. 607610.
69. Holden M. T. G., Seth-Smith H. M. B., Crossman L. C. et al. The genome of Burkholderia cenocepacia J2315, an epidemic pathogen of cystic fibrosis patients. Journal of Bacteriology 2009; vol. 91, n. 1, p. 261-277.
70. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human health. Emerg. Infect. Dis. 1998; n. 4, p. 221-227.
71. Henry D.A., Mahenthiralingam E., Vandamme P. et al. Biochemical and molecular approaches for determining genomovar status of the ofv Burkholderia cepacia complex. Pediatr. Pulmonol.1999; Suppl. 19, p. 271.i
72. Henry D.A., Mahenthiralingam E., Vandamme P. et al. Phenotypic methods for determining genomovar status Burkholderia cepacia complex. J. Clinical microbiology. 2001; vol. 39, n. 3, p. 1073-1078.
73. Hodson M.E., Geddes D.M. Cystic fibrosis. London: Chapman 1995.
74. Hutchison M., Poxton I. R., Govan J. R. Burkholderia cepacia produces a Hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes. Infect. Immun. 1998; vol. 66, n. 5, p. 2033-2039.
75. Jelsbak L., Johansen H.K., Frost A.-L. et al. Molecular epidemiology and dynamics of Pseudomonas aeruginosa populations in lungs of cystic fibrosis patients. Infect. Immun 2007; 75, p. 2214-2224.
76. Jensen E.T., Giwercman B., Ojeniyi B. et al. Epidemiology of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis and the possible role of contamination by dental equipment. J. Hosp. Inf. 1997; 36, p. 117-122.
77. Jia B., Yang J.-K., Liu W.-S., Li X., and Yan Y.-J. Homologousoverexpression of a lipase from Burkholderia cepacia using the lambda Red recombinase system. Biotechnology Letters 2010; vol. 32, n. 4, p. 521-526.
78. Jones A.M., Govan J.R., Doherty C.J. et al. Spread of a multiresistant strain of Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Lancet 2001; 358, p. 557-558.
79. Jones A.M., Todd M.E., Webb A.K. Burkholderia cepacia: current clinical issues, environmental controversies and ethical dilemmas. Eur. Respir. J. 2001; n. 17, p. 295-301.
80. Kikuchi Y., Meng X.Y., Fukatsu T. Gut symbiotic bacteria of the genus Burkholderia in the broad-headed bugs Riptortus clavatus and Leptocorisa chinensis (Heteroptera: Alydidae). Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71, p. 4035-4043.
81. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T. Chakrabarty A.M. Biodégradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia II. Appl. and Environ. Microbiol. 1982; v. 44, №1, p. 72-78.
82. Lee W.Riley. Molecular Epidemiology of Infectious Diseases. Principles and Practices. ASM Press 2004.
83. Leelarasamee A. Recent development in melioidosis. Curr. Opin. Infect. Dis. 2004; 17, p. 131-136.
84. Leitao J. H., Sousa S. A., Ferreira A. S., Ramos C. G., Silva I. N., and Moreira L. M. Pathogenicity, virulence factors, and strategies to fight against
85. Burkholderia cepacia complex pathogens and related species. Applied Microbiology and Biotechnology 2010; vol. 87, n. 1, p. 31^40.
86. Lennin E. and DeCicco B. Plasmid of P.cepacia strains of diverse origins. Appl. Environ. Microbiol. 1991; vol.57, p. 2345-2350.
87. Liou T.G., Adler F.R., FitzSimmons S.C. et al. Predictive 5-year survivorship model of cystic fibrosis. American Journal of Immunology 2001; 153, p. 345352.
88. LiPuma J.J., Mahenthiralingam E. Commercial use of Burkholderia cepacia. Emerg. Infect. Dis. 1999; n. 5, p. 305-306.
89. Mahenthiralingam E., Baldwin A., and Dowson C.G. Burkholderia cepacia complex bacteria: opportunistic pathogens with important natural biology. Journal of Applied Microbiology 2008; vol. 104, n. 6, p. 1539-1551.
90. Mahenthiralingam E., Baldwin A., Vandamme P. Burkholderia cepacia complex infection in patients with cystic fibrosis. J. Med. Microbiol. 2002; 51, p. 533-538.
91. Mahenthiralingam E., Campbell M.T., Foster J. et al. Random amplified polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 1996; 34, p. 1129-1135.
92. Mahenthiralingam E., Urban T.A., Goldberg J.B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nature Reviews. Microbiology 2005; vol.3, n. 2, p. 144-156.
93. Mann T., Ben-David D., Zlotkin A. et al. An outbreak of Burkholderia cenocepacia bacteremia in immunocompromised oncology patients. Infection 2010; vol.38, n. 3, p. 187-194.
94. Matsui H., Grubb B.R., Tarran R. et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell 1998; 95, p. 1005-1015.
95. McCallum S.J., MJ. Gallagher, J.E. Corkill et al. Spread of an epidemic Pseudomonas aeruginosa strain from a patient with cystic fibrosis (CF) to non-CF relatives. Thorax 2002; 57, p. 559-560.
96. McDowell A., Mahenthiralingam E., Moore J.E. et al. PCR-based detection and identification of Burkholderia cepacia complex pathogens in sputum from cystic fibrosis patients. J. Clinical microbiology 2001; vol.39, n. 12, p. 42474255.
97. Nakazawa T., Yamada Y., Ishibashi M. Characterization of hemolysin in extracellular products of Pseudomonas cepacia. J. Clin. Microbiol. 1987; vol.25, p. 195-198.
98. Ngauy V., Lemeshev Y., Sadkowski L., Crawford G. Cutaneous melioidosis in a man who was taken as a prisoner of war by the Japanese during World War II. J. Clin. Microb. 2005; 43, p. 970-972.
99. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H., Tettelin H., Nelson K. E., et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei Genome. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2004; 101, p. 14246 14251.
100. Noone P., Zhou Z., Silverman L. Cystic fibrosis gene mutations and pancreatitis risk: relation to epithelial ion transport and trypsin inhibitor gene mutations. Gastroenterology 2001; vol. 6, p. 1310-1319.
101. Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms. J. Clin. Microbiol. 1999; 37, p. 1661-1669.
102. Olsen G.J., Woese C.R. Ribosomal RNA: a key to philogeny. FASEB 1993; 7, p. 113-123.
103. Palleroni N. J. Genus I Pseudomonas Migula 1894. Bergeys manual of systematic bacteriology volume 1. Williams and Wilkins. Baltimore, USA 1984.
104. Rabkin C.S., Jarvis W.R., Martone W.J. Current status of Pseudomonas cepacia typing systems. Eur. J. Epidemiol. 1987; 3, p. 343-346.
105. Rabkin C.S., Jarvis W.R., Anderson R.L., Govan J. et al. Pseudomonas cepacia typing systems: collaborative study to assess their potencial in epidemiologic investigation. Rev. Infect. Dis. 1989; 11, p. 600-607.
106. Reddi K., Phagoo S.B., Anderson K.D. et al. Burkholderia cepacia-induced IL-8 gene expression in an alveolar epithelial cell line signaling through CD14 and mitogen-activated protein kinase. Pediatr. Res. 2003; vol. 54, p. 297-305.
107. Riley L.W. Molecular Epidemiology of Infectious Diseases. Principles and Practices. ASM Press 2004.
108. Rioddan J.R., Romens J.M., Keren B.S. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 1989; vol. 245, p. 1066-1073.
109. Romens J.M., Iannuzzi M.C., Keren B.S. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 1989; vol. 245, p. 1059-1065.
110. Saiman L., Siegel J. Infection control in cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17, p. 57-71.
111. Saijan S. and Forstner J. Identification of the mucin-binding adhesin of P.cepacia isolated from patients with cystic fibrosis. Infect. Immun. 1992; vol. 60, p. 1434-1440.
112. Saijan S. and Forstner J. Role of a 22-kilodalton pilin protein in binding of P. cepacia to buccal epithelial cells. Infect Immun. 1993; vol. 61, p. 3156-3163.
113. Sald'ias M. S., Lamothe J., Wu R., and Valvano M. A. Burkholderia cenocepacia requires the RpoN sigma factor for biofilm formation and intracellular trafficking within macrophages. Infection and Immunity 2008; vol. 76, n. 3, p. 1059-1067.
114. Sald'ias M. S. and Valvano M. A. Interactions of Burkholderia cenocepacia and other Burkholderia cepacia complex bacteria with epithelial and phagocytic cells. Microbiology 2009; vol. 155, n. 9, p. 2809-2817.
115. Scordilis G.E., Ree H., Lessie T.G. Identification of transposable elements which activate gene expression in Pseudomonas cepacia. J. Bacteriol. 1987; vol. 169, p. 8-13.
116. Seigle-Murandi F., Guiraud P., Croize J., Falsen E., and Eriksson K. L. Bacteria Are Omnipresent on Phanerochaete chrysosporium Burdsall. Applied and Environmental Microbiology Journal 1996 July; 62(7), p. 2477-2481.
117. Sharrer G. Terry. The Great Glanders Epizootic, 1861-1866: A Civil War Legacy. Agricultural History. Winter 1995; 69(1), p. 79-97.
118. Shaw D., Poxton I.R., Govan J.R. Biological activity of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia lipopolysaccharide. FEMS Immunol. Mol. Microbiol. 1995; n. 11, p. 99-106.
119. Smith J.J., Travis S.M., Greenberg E.P., Welsh M.J. Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid. Cell 1996; 85, p. 229-236.
120. Snyder M.P., Kimbrell D., Hunkapiller M., Hill R., Fristrom J., Davidson N. A transposable element that splits the promoter region inactivates a
121. Drosophila cuticle protein gene. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 1982; vol. 79, p. 7430-7434.
122. Sommerhof C.P., Nadel J.A., Basbaum C.B., Caughey G.H. Neutrophil elastase and catepsin G stimulate secretion from cultures bovine airway glands. J. Clin. Invest. 1990; 85, p. 682-689.
123. Sousa S.A., Ramos C.G., and Leitäo J.H. Burkholderia cepacia Complex: Emerging Multihost Pathogens Equipped with a Wide Range of Virulence Factors and Determinants. International Journal of Microbiology 2011.
124. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separeted by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975; 98, p. 503-517.
125. Stull T.L., LiPuma J.J., Edling T.D. A broad-spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA. J. Infect. Dis. 1988; 157, p. 280286.
126. Sun L., Jiang L.Z., Steinbach S. et al. The emergence of a highly transmissible lineage of cbl+ Pseudomonas (Burkholderia) cepacia causing CF center epidemics in North America and Britain. Nat. Med. 1995; n. 1, p. 661-666.
127. Tateda K., Ishii Y., Horikawa M. et al. The Pseudomonas aeruginosa Autoinducer N-3-Oxododecanoyl Homoserine Lactone Accelerates Apoptosis in Macrophages and Neutrophils. Infect. Immun. 2003; vol.71, n. 10, p. 57855793.
128. Thiel T., Kota R., Grosse I., Stein N., Graner A., SNP2CAPS: a SNP and INDEL analysis tool for CAPS marker development. Nucleic Acids Research 2004; vol. 32, n. 1, p. e5.
129. Trezise A., Buchwald M. In vivo cell-specific expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Nature 1991; vol. 353, p. 434-437.
130. Tyler S.D., Rozee K.R., Johnson W.M. Identification of IS 1356, a newinsertion sequence, and its association with IS402 in epidemic strains of Burkholderia cepacia infecting cystic fibrosis patients. J. Clin. Microbiol. 1996; vol. 34, p. 1610-1616.
131. Van Belkum A., Renders N.H.M., Smith S. et al. Comparison of conventional and molecular methods for the detection of bacterial pathogens in sputum samples from cystic fibrosis patients. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000; vol. 27, p. 51-57.
132. Van Borm S., Buschinger A., Boomsma J.J., Billen J. Tetraponera ants have gut symbionts related to nitrogen-fixing rootnodule bacteria. Proceedings of the Royal Society of London. Biological Sciencees 2002; 269, p. 2023—2027.
133. Van de Peer Y. TREECON for Windows user manual. Antwerp (UIA), 1998.
134. Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A. and Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoLA-DRB3 Gene Distinguished by PCR-RFLP II. Animal Genetics 1992; v. 23, n. 6, p. 483-496.
135. Van Pelt C., Verduin C.M., Goessens W.H.F. et al. Identification of Burkholderia spp. in the clinical microbiology laboratory: comparison of conventional and molecular methods. J. Clin. Microbiol. 1999; vol. 37, p. 2158-2164.
136. Vandamme P., Pot B., Gillis M. et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol. Rev. 1996; vol. 60, p. 407-438.
137. Vasil M.L., Krieg D.P., Kuhns J.S. et al. Molecular analysis of hemolytic and phospholipase C activities of Pseudomonas cepacia. Infect. Immun. 1990; vol. 58, p. 4020-4029.
138. Venter J.C., Ramington K., Heidelberg J.F. et al. Environmental genome shotgun secueencing of the Sargasso Sea. Science 2004; vol. 304, p. 66-74.
139. Vinion-Dubiel A.D., Goldberg J.B. Lipopolysaccharide of Burkholderia cepacia complex. Endotoxin Res. 2003; n. 9, p. 201-213.
140. Walker R., Emslie K.A., Allan E.J. Bioassay methods for the detection of antifungal activity by Pseudomonas antimicrobica against the grey mould pathogen Botrytis cinerea. J. Appl. Bacteriol. 1996 Nov; 81(5), p. 531-537.
141. Wallace R. B. DNA recombinant technology. Boca Raton (Fla.): CRC press, 1983.
142. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitraryprimers. Nucleic Acids Res. 1990; v. 18, p. 7213-7218.
143. Wheelis M. First shots fired in biological warfare. Nature 1998; №395, p. 213.
144. Williams J. G., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990; 22, 18, S. 6531-6535.