Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Эпидемиологические и микробиологические особенности хронической инфекции, вызванной бактериями комплекса Burkholderia cepacia, у больных муковисцидозом

На правах рукописи

005005716

Алексеева Галина Вальтеровна

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ БАКТЕРИЯМИ КОМПЛЕКСА BURKHOLDERIA CEPACIA, У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ

14.02.02 -Эпидемиология

03.02.03 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 8 ДЕК 2011

Москва 2011

005005716

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России).

Научные руководители: доктор медицинских наук

Ведущая организация:

ГБОУ ДПО Российская Медицинская Академия последипломного образования Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 23 декабря 2011 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, Д.18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан«^» ноября 2011 г.

Ученый секретарь

Шагииян Игорь Андроникович

доктор медицинских наук Чернуха Марина Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Селькова Евгения Петровна

доктор медицинских наук, профессор

Миронов Андрей Юрьевич

диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор

Актуальность работы. Муковисцидоз (кистозный фиброз) — тяжелое системное генетически детерминированное заболевание, обусловленное мутацией трансмембранного регулятора муковисцидоза, характеризующееся поражением экзокринных желез. Оно поражает все внутренние органы, выделяющие слизь, в первую очередь - легкие и пищеварительную систему. (Капранов Н.И., 1974, 1985, 1995, 2001; Самсонова М.В., Черняев A.JL, Амелина Е.Л., 2006).

На сегодняшний день это самое распространенное аутосомно-рецессивное наследственное заболевание среди представителей белой европеоидной расы и встречается в среднем у 1 из 400 родившихся детей. В большинстве стран Европы и Северной Америки муковисцидозом заболевают от 1:2000 до 1:4000 новорожденных. Частота гетерозиготного носительства мутантного гена среди населения в ряде стран (США, Швейцария, Франция), а также в нашей стране составляет от 2 до 20%. Прогноз заболевания в первую очередь зависит от поражения органов дыхания, в патогенезе которого весомую роль играет инфекция. Больные муковисцидозом на протяжении всей жизни страдают от рецидивирующих и хронических инфекций респираторного тракта, которые являются основной причиной заболеваемости, частых госпитализаций и смертности. Инфекционное поражение респираторного тракта является причиной смерти более чем 90% больных MB. (Капранов Н.И., Шабанова JI.A., Каширская Н.Ю. и др., 2002). Инфекционные осложнения при муковисцидозе характеризуются полиэтиологичностью, при. этом лидирующее положение занимают S. aureus, Haemophilus influenzae и P. aeruginosa, причем два первых микроорганизма выявляются главным образом у детей раннего возраста, тогда как для более старших возрастных групп основное значение приобретает синегнойная папочка. (Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2005). Инфекция, вызванная В. cepacia, развивается обычно на фоне хронической колонизации Pseudomonas aeruginosa. Нередко присоединение В. cepacia ведет к быстрому прогрессированию бронхолегочного процесса при муковисцидозе, в ряде случаев - с летальным исходом (Капранов Н.И., Шабанова JI.A., Каширская Н.Ю. и др., 2002; Капустина Т.Ю., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. и др., 2005).

Инфицирование больных муковисцидозом бактериями комплекса В. cepacia представляет особую опасность, так как данный микроорганизм обладает природной антибиотикоустойчивостью и быстро приобретает резистентность к антимикробным препаратам. Это затрудняет его эрадикацию в процессе лечения, приводя к быстрому переходу острой инфекции нижних дыхательных путей в хроническую форму и значительному ухудшению функции легких. (Зубков М.Н., Самойленко В .А., Гугуцидзе E.H., 2001; Leitao J. Н„ Sousa S. A., Cunha М. V. et al.,

2008). Больные, инфицированные В. cepacia, являются источником возбудителя этой инфекции и представляют опасность для других пациентов. Также этот возбудитель способен вызывать так называемый «цепация-синдром» - некротизируюшую пневмонию с септицемией, нередко приводящую к летальному исходу. (Isles et al., 1984, Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al., 2001).

Кроме того, колонизация нижних дыхательных путей бактериями В. cepacia является противопоказанием для пересадки легких, являющейся важной частью программы по увеличению продолжительности жизни у больных муковисцидозом. (Liou T.G., Adler F.R., FitzSimmons S.C. et al., 2001).

Эпидемиологические проявления хронической инфекции В. cepacia остаются малоизученными, поскольку не внедрены пока в широкую практику лабораторные методы этиологической диагностики этой инфекции, поэтому она не подлежит официальной регистрации, и отсутствуют сведения о широте ее распространении в популяции.

К началу наших исследований при инфекционных осложнениях (бронхитах, пневмониях) у больных муковисцидозом исследователи выделяли из мокроты больных Burkholderia cepacia, но не было ясно, способны ли данные бактерии самостоятельно вызывать легочную инфекцию или являются только маркером тяжелого поражения легких. Не был изучен вопрос, в каком возрасте происходит колонизация больных этими возбудителями, в какие сроки начинает развиваться хроническая или персистирующая инфекция и как она формируется, какие микроорганизмы доминируют при колонизации и в каких сочетаниях. Также не были достаточно изучены эпидемиологические особенности: источники инфекции, механизмы и пути распространения возбудителя и широта циркуляции штаммов В. cepacia в популяции больных муковисцидозом.

В течение последнего десятилетия были получены данные о том, что бактерии В. cepacia являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать внутрибольничные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии). В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции легких (Чернуха М.Ю., 2008). В настоящее время вместо термина «внутрибольничные (госпитальные, нозокомиальные) инфекции» в научной литературе, публикациях ВОЗ и нормативных документах большинства стран мира используется термин «инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи» - «healthcare-associated infections - HALs» как более точный и объединяющий характер этого понятия. (В.И. Покровский, В.Г. Акимкин, Н.И. Брико, 2011).

Бактерии комплекса В. cepacia обладают одним из самых сложных и пластичных геномов, что обусловливает сложность идентификации и дифференциации этого возбудителя внутрибольничных инфекций, до настоящего времени оставляя его за пределами внимания госпитальных эпидемиологов и микробиологов клинических лабораторий.

Среди всех представителей бактериальной микрофлоры: Р. aeruginosa, S. aureus, Haemophilus influenzae, грибы рода Candida, Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp. (Шагинян И.А., Капранов Н.И. и др., 2010), способных вызывать хроническую инфекцию у больных муковисцидозом, диагностика и типирование бактерий комплекса В. cepacia представляет наибольшие трудности, так как требует комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов. Таких разработок в стране до настоящих исследований не было, поэтому практические клинические лаборатории испытывают трудности с идентификацией бактерий этого вида. Точная и быстрая индикация и идентификация данного возбудителя необходима для ранней диагностики, выявления потенциальных источников возбудителя инфекции и определения других эпидемиологических особенностей.

Для того чтобы изучить ряд важных вопросов эпидемиологии и микробиологии инфекций, вызванных В. cepacia, необходимо было разработать такой алгоритм идентификации и типирования данного возбудителя, который бы позволял: а) идентифицировать его до геномовара; б) изучать его патогенные свойства; в) определять потенциальную способность В. cepacia вызывать хроническую инфекцию; г) выявлять эпидемиологическую значимость штаммов.

Цель работы: изучить эпидемиологические и микробиологические особенности формирования хронической инфекции, вызванной бактериями комплекса В. cepacia у больных муковисцидозом, с помощью разработанных молекулярно-генетических схем идентификации и типирования.

Задачи исследования:

1. Изучить структуру микрофлоры нижних дыхательных путей у детей разных возрастных групп, страдающих муковисцидозом для определения эпидемиологической значимости бактерий комплекса В. cepacia.

2. Усовершенствовать алгоритм идентификации и типирования бактерий комплекса В. cepacia с целью улучшения диагностики инфекций, вызванных данным возбудителем.

3. Создать коллекцию клинических штаммов В. cepacia, выделенных от пациентов Российского Центра Муковисцидоза, многопрофильных стационаров г. Москвы и других регионов Российской Федерации. Изучить особенности штаммов данного возбудителя (генетическое родство, устойчивость к антибиотикам, патогенные свойства) с целью получение данных о структуре популяций госпитальных штаммов и изучения их широты циркуляции среди больных муковисцидозом и пациентов многопрофильных клиник.

4. Провести многолетний молекулярно-генетический мониторинг штаммов В. cepacia, выделенных от больных муковисцидозом, для определения возможных источников инфекции и путей передачи возбудителя, характеристик персистирующих штаммов («микроэволюция»).

5. Выяснить эпидемиологические и микробиологические закономерности формирования, распространения и циркуляции штаммов В. cepacia в лечебно-профилактических учреждениях, используя методы молекулярной эпидемиологии.

6. Обосновать тактику профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования пациентов данным возбудителем и ограничения распространения инфекции, вызванной В. cepacia, в стационарах разного профиля.

Научная новизна

- Оценено эпидемиологическое значение бактерий комплекса В. cepacia. Показано, что характерным проявлением инфекционных осложнений у больных муковисцидозом является смешанная инфекция, вызванная ассоциацией микроорганизмов, среди которых особое значение имеет сочетание В. cepacia и Pseudomonas aeruginosa.

- Доказано, что у больных муковисцидозом штаммы В. cepacia, не элиминируются, а длительно персистируют в нижних дыхательных путях, что имеет важное эпидемиологическое значение, так как эти больные являются источниками возбудителя инфекции и представляют угрозу для других пациентов.

- Установлено, что бактерии комплекса В. cepacia способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах и передаваться от пациента к пациенту.

- Собрана и охарактеризована российская коллекция штаммов бактерий комплекса В. cepacia по фенотипическим и генотипическим признакам, в том числе методами молекулярной эпидемиологии с помощью ПЦР и

пульсэлектрофореза, что может быть использовано для дальнейших эпидемиологических исследований.

- Разработанный алгоритм для идентификации и типирования бактерий В. cepacia дополнен ПЭФ и апробирован на коллекции штаммов В. cepacia с целью усовершенствования лабораторной диагностики данного возбудителя.

- Обоснована тактика профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования больных муковисцидозом штаммами В. cepacia и распространения этой инфекции в стационарах, состоящая в ранней и точной диагностике инфекции, вызванной данным возбудителем, изоляции и ограничении контактов больных, дезинфекции инфицированных предметов.

Практическая значимость

- Впервые усовершенствованы методы лабораторной диагностики штаммов бактерий комплекса Burkholdereria cepacia с помощью алгоритма, включающего в себя молекулярно-биологические методы (ПЦР, пульсэлектрофорез) для ранней диагностики В. cepacia и выявления возможных источников инфекции;

- Изучена широта распространения штаммов В. cepacia в Российском Центре Муковисцидоза, многопрофильных стационарах г. Москвы и других регионов РФ;

- Рекомендованы профилактические мероприятия для снижения риска инфицирования больных муковисцидозом штаммами В. cepacia;

- На основе полученных результатов разработаны Методические рекомендации «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholdereria cepacia» (Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005) для клинических бактериологических лабораторий, утвержденные советом по внедрению ФГБУ «НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, и учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» (Ред. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Москва, 2006).

Положения, выносимые на защиту

1. Показана необходимость совершенствования тактики лабораторной диагностики инфекции, вызванной В. cepacia, поскольку применение для идентификации штаммов бактерий комплекса В. cepacia только коммерческих биохимических тест-систем в ряде случаев может приводить к ошибкам идентификации. Геномовары В. cepacia имеют

очень похожие фенотипические признаки, их невозможно дифференцировать, учитывая только биохимические тесты. Также невозможно поставить этиологический диагноз по клиническим проявлениям инфекции.

2. Выявлено, что наиболее эпидемиологически значимым является геномовар В. cenocepacia подтип ЗА. В каждом регионе РФ циркулируют специфические для этих территорий штаммы. В московском регионе установлена циркуляция штаммов, характерных как для данного стационара, так и общих для нескольких клиник

3. Больные муковисцидозом, инфицированные В. cepacia, могут быть опасны как источник инфекции для других пациентов, т.к. штаммы В. cepacia не элиминируются из нижних дыхательных путей в течение длительного времени. Штаммы В. cepacia способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах и представлять эпидемиологическую опасность для пациентов клиник.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены на III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва 2004); 5-й Всероссийской конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва 2004); международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней» (Санкт- Петербург 2003); IV Российской научной конференции (Оренбург 2003); XXXVII научной конференции «Оптимизация больничной среды средствами новых технологий» (Санкт-Петербург 2004); Международном конгрессе МАКМАХ (Москва 2006); конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Москва 2007); X Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2011).

Апробация диссертации состоялась 29.06.11 на научной конференции отделов эпидемиологии и медицинской микробиологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России.

Все исследования, представленные в работе, были проделаны лично автором.

Публикации

По результатам исследований опубликовано 19 работ, в том числе 6 статей, в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 177 машинописи и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 20 рисунками. Указатель литературы содержит 159 источников, из них 21 отечественный и 138 зарубежных.

Материалы и методы

Штаммы. В течение 1999-2009 годов в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России впервые в Российской Федерации собрана коллекция штаммов В. cepacia, состоящая из 144 культур.

За период с 2008 по 2009 год из Российского Центра муковисцидоза получено 56 штаммов, выделенных от детей больных муковисцидозом (контрольная группа).

В качестве группы сравнения были использованы 63 российских штамма, выделенных от пациентов с раневой инфекцией и госпитальной пневмонией в нескольких стационарах г. Москвы (ГКБ им. Боткина, госпиталь им. H.H. Бурденко, ГКБ №№ 7) 15, 61), за период с октября 1999 года по апрель 2001 года. Из них 44 штамма выделены от больных с пневмонией и 11 - с раневой инфекцией. Из госпиталя им. Бурденко получено 22 штамма, 10 штаммов из ГКБ им Боткина, 7 штаммов из ГКБ №61, 4 из ГКБ № 15, 10 штаммов - из ГКБ №7, из института кардиохирургии им. Бакулева - 10 штаммов, а также 14 клинических штаммов, полученных из больниц Красноярска, Екатеринбурга, Краснодара и Санкт-Петербурга, 6 штаммов, полученных в 1989 году из Волгоградского противочумного института, 2 штамма из института им. Пастера (Франция), 4 штамма из Германии, поступивших в 1989-1999 г.г., а также 5 референс штаммов из Бельгии (представители геномовара I - В. complex (В. cepacia sensu stricto), геномовара II (В. multivorans), геномовара IIIA - ЗА16656 (В. cenocepacia), геномовара HIB - ЗВ18829 (В. cenocepacia), геномовара IV (В. stabilis) (2005 г.).

Для изучения структуры микрофлоры нижних дыхательных путей у разных возрастных групп детей, страдающих муковисцидозом, были проанализированы 114 историй болезней детей разных возрастных групп, больных муковисцидозом, проживающих в г. Москве и Московской области и проходивших лечение в отделении медицинской генетики Республиканской детской клинической больницы (РДКБ), а также проведен анализ выписок из историй болезней 29 детей, больных

муковисцидозом, из различных регионов Российской Федерации, периодически проходивших лечение в отделении медицинской генетики РДКБ в 2006 году. Среди детей, проживающих в Московском регионе, 21 ребенок был в возрасте до 1 года, 28 детей - 1-4 лет, 16 детей — 5-7 лет, 29 — 8-14 лет и 20 детей — 15-18 лет. Среди детей из других городов 5 детей были в возрасте 5-7 лет, 13 — в возрасте 8-14 лет и 11 — в возрасте 15-18 лет. В динамике на протяжении двух лет обследовано 84 ребенка больных муковисцидозом жителей г. Москвы и московской области. 40 детей проходили лечение в отделении медицинской генетики РДКБ, 44 ребенка находились на амбулаторном лечении в Московском центре муковисцидоза.

Таблица 1

Возрастная структура обследованных детей

Регион Всего До 1г. 1-4 г. 5-7 л. 8-14 л. 15-18 л.

Московский 114 21(18,5%) 28(24,6%) 16 (14%) 29(25,4%) 20(17,5%)

Другие 29 - - 5 (17,2%) 13(44,8%) 11(40%)

Методы

Идентификация штаммов. Все штаммы были идентифицированы с помощью коммерческих тест-систем: API 20NE "BioMerieux" (Франция), "BBL Cristall Enteric/Nonfermenter ID Kit" "Beckton Dickenson microbiology System" (США), 24 NE "Lachema" (4P) в соответствии с инструкцией производителя. Рост на селективном агаре (BCSA) (Henry D., Campbell М., McGimpsey С. Et al., 1999) наблюдали при t=37 °С через 24 ч. и при t=30 °С через 48 ч. Продукцию пигмента учитывали при выращивании бактерий на L-arape с 1% глицеролом при t=37 °С в течение 24-х и 48 часов. Рост бактерий при 42 °С в L-бульоне оценивали через 48 часов по наличию мутности.

Исследование факторов патогенности. Гемолитическую активность оценивали по зонам гемолиза после выращивания штаммов на кровяном агаре (с эритроцитами барана) при 30 °С через 24 и 48 часов.

Определение липазной активности проводили по методу, описанному Lonon М.К., Woods D.E., Straus D.C. (1988).

Протеолитическую активность определяли на среде, содержащей 2% L-arap и 30% молока. Бактерии высевали уколом в среду и инкубировали 24-48 часов при 30-37 °С. Вокруг колоний штаммов, обладающих протеолитической активностью, наблюдали зоны ферментативного гидролиза казеина молока.

Хитинолитическую активность определяли методом, разработанным Monreal J., Rees Е.Т. в 1969 г.

Чувствительность к антимикробным препаратам определяли в соответствии с МУК 4.2.1890-04 методом серийных разведений в бульоне. Исследовали чувствительность к меропинему, цефтазидиму, ципрофлоксацину, гентамицину, имипинему, тобрамицину, цефепиму и комбинациям - цефтазидим+клавулановая кислота и пиперациллин + тазобактам. Антибиотики были выбраны в соответствии с рекомендациями для лечения заболеваний, вызванных грамотрицательными неферментирующими бактериями.

Генотипирование штаммов проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером, размером 10 нуклеотидов Shi (Short 1) - AATCGGGCTG. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с помощью программного обеспечения ТгееСоп for Windows v.l.3.b на основе метода невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) с использованием коэффициента генетического различия Nei and Li (1979), при котором расстояние между двумя кластерами вычисляется как среднее расстояние между всеми парами объектов в них.

Определение геномовара проводили с помощью ПЦР с геномовар-специфическими праймерами согласно методам, описанных в работах Bauernfeind A., Schneider I., Jungwirth г. Et al., 1999, Mahenthiralingam E., J. Bishof, S.K.Byrne et al., 2000.

Выявление эпидемиологических маркеров BCESM, ISH, cbl - гена осуществляли в ПЦР (Clode F.E., Kaufmann М.Е., Malnick H. et al., 2000).

Пульсэлектофорез. Приготовление образцов ДНК, заключенных в агарозе, макрорестрикция образцов ферментом Spei и проведение пульсэлектрофореза было выполнено в соответствии с инструкцией прозводителя (Gene Path Group I Reagent Kit Bio-Rad Laboratopies).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Microsoft Excel», численных и графических методов описательной статистики.

Проведенные эпидемиологические исследования включали в себя: ретроспективный эпидемиологический анализ, оперативный эпидемиологический анализ и эпидемиологическое обследование очагов ВБИ.

Результаты исследований

Изучение структуры микрофлоры нижних дыхательных путей у детей различных возрастных групп, больных муковисцидозом.

Основной причиной летальных исходов у больных муковисцидозом являются инфекционные процессы в легких, часто происходящие с генерализацией инфекции. Поэтому мы сочли целесообразным изучение микрофлоры нижних дыхательных путей разных возрастных групп детей, страдающих муковисцидозом, в динамике для выявления ее изменений и определения возможных источников инфекции (таблица 1). Установлено, что основными возбудителями инфекции легких у детей, больных муковисцидозом, является Р. aeruginosa и S. aureus, причем в первые годы жизни доминирует S. aureus, а затем основным возбудителем становится Р. aeruginosa. Хроническая синегнойная, стафилококковая или смешанная инфекция выявляется у 25% детей уже в возрасте 1-4 года, а к 18 годам отмечается у 80% больных муковисцидозом. В 60% случаев инфицирование легких осуществляется не монокультурой, а ассоциацией микроорганизмов, при этом у госпитализированных больных муковисцидозом ассоциация в 60% случаев представлена 3-5 микроорганизмами, тогда как у амбулаторных больных только 2-3 видами возбудителей бактериальных инфекций. В составе ассоциаций у госпитализированных больных муковисцидозом, кроме Р. aeruginosa, часто встречаются другие представители грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов - В. cepacia, S. maltophilia, А. anthropi, что, вероятно, обусловлено тропизмом этих видов возбудителей к легочной ткани. Частой ассоциацией является сочетание Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia, последняя (в 5-7% случаев) может вызывать хроническую инфекцию самостоятельно. Эти два микроорганизма способны потенцировать патогенное действие друг друга (Чернуха М. Ю., 2008), поэтому сочетание В. cepacia и Р. aeruginosa имеет особое значение для пациентов с муковисцидозом, так как существенно ухудшает течение и прогноз заболевания, снижает качество жизни, затрудняет изучение эпидемиологических особенностей моноинфекции В. cepacia.

При сравнении микробного пейзажа у амбулаторных и госпитализированных детей установлено, что у амбулаторных больных В. cepacia высевается в 7,7% случаев, у госпитализированных - в 55%, то есть в 7 раз чаще (р<0,05). Из этого можно сделать вывод, что В. cepacia является типичным представителем госпитальной микрофлоры и возбудителем нозокомиальной инфекции.

Разработка алгоритма идентификации и тииирования бактерий комплекса В. cepacia. Поскольку для идентификации и типирования В. cepacia требуется комплекс фенотипических и генотипических методов, а

также исследование штаммов, полученных от пациентов с хронической инфекцией в динамике на протяжении ряда лет, для изучения изменчивости персистирующих штаммов, нами был разработан соответствующий алгоритм (рис. 1), позволяющий решать ряд актуальных вопросов микробиологии и эпидемиологии хронической инфекции, вызываемой данным возбудителем.

Рис. 1. Схема идентификации бактерий В. cepacia

Разработанная схема идентификации штаммов включает 2 последовательных этапа исследования: применение фенотипических методов и молекулярно-биологических методов. Бактериологические методы позволяют провести первоначальную селекцию штаммов и определить их фенотипические свойства. К этим методам относятся: рост на селективном агаре, способность ферментировать различные соединения (биохимические тесты), а также дополнительные тесты для выявления потенциальных факторов патогенности: пигментообразование; протеазную, оксидазную, липазную, гемолитическую активность; способность расти при различных температурах; антибиотикоустойчивость, способность образовывть биопленки как маркер способности вызывать хроническую инфекцию.

Все штаммы, входящие в коллекцию, растут на BCSA (селективный агар для выделения В.cepacia), в одинаковой мере обладают протеазной,

липазной, оксидазной активностью, также все штаммы способны образовывать биопленки. Гемолитической активностью обладают 68,2% штаммов, выделенных от пациентов многопрофильных стационаров, штаммы от больных муковисцидозом способностью к гемолизу не обладают (таблица 2).

Таким образом, нами установлено, что все штаммы продуцируют факторы патогенности и способны вызывать хроническую инфекцию.

Таблица 2

Продукция факторов патогенности штаммами В. cepacia

Штаммы Активность Способность образовывать биопленки

Гемолитическая Липаз-ная Протео-литическая Окси-дазная

От больных муковисцидозом - 100% 100% 100% +

От пациентов московских клиник 43 штамма (68,2%) 100% 100% 100% +

Мы исследовали и сравнили чувствительность к антимикробным препаратам штаммов В. cepacia, выделенных от больных муковисцидозом и от пациентов многопрофильных стационаров (таблица 3). Штаммы, полученные из московских клиник, характеризуются устойчивостью к 2-3 антибиотикам, в то время как штаммы, выделенные от больных муковисцидозом, резистентны к 5-6 антибиотикам и проявляют сходство по спектру устойчивости. Это является косвенным подтверждением госпитального происхождения штаммов, выделенных от больных муковисцидозом.

Использование молекулярно-биологических методов для идентификации и типирования штаммов В. cepacia. Нами были подобраны ПЦР - системы для точной идентификации штаммов и определения их принадлежности к одному из 16 геномоваров, составляющих комплекс бактерий В. cepacia.

Для определения эпидемиологической значимости штаммов мы отобрали праймеры и подобрали условия реакции для выявления эпидемиологических маркеров: сЫ - гена, IS -гибрида, BCESM, а также праймеры для выявления генов cepl и cepR, которые являются компонентами регуляторной системы "Quorum sensing", ответственной за экспрессию факторов патогенности.

Таблица 3

Антибиотикочувствительность штаммов В. cepacia, выделенных от пациентов многопрофильных клиник и от больных муковисцидозом

Пациенты многопрофильных клиник Больные муковисцидозом

Антибиотик R S I Антибиотик R S I

Цефтазидин 0% 98% 2% Цефтазидин 4% 95% 1%

Гентамицин 100% 0% 0% Гентамицин 100% 0% 0%

Ципрофлоксацин 26% 28% 46% Ципрофлоксацин 9% 86% 5%

Тобрамицин 100% 0% 0% Тобрамицин 96% 4% 0%

Имипинем 30% 20% 50% Имипинем 55% 30% 15%

Меропинем 0% 90% 10% Меропинем 26% 55% 19%

Цефепим 50% 4% 46% Аугментин 100% 0% 0%

Ванкомицин 100% 0%- 0%

Амикацин 100% 0% 0%

Для генетического типирования штаммов и выявления эпидемических связей между ними использовались RAPD-ПЦР и пульсэлектрофорез.

С помощью ПЦР все штаммы были точно идентифицированы и определен их геномоварный статус. Штаммы, выделенные от больных муковисцидозом и пациентов россиийских клиник, принадлежали к геномовару В. cenocepacia, подтип ЗА. То есть, из 16 геномоваров, входящих в комплекс В. cepacia, этот геномовар является наиболее эпидемически значимым.

Для определения эпидемиологической значимости штаммов мы использовали ПЦР для выявления эпидемиологических маркеров. СЫ - ген кодирует продукцию пилина А, необходимого для синтеза контагиозных пилей.

Гибрид двух инсерционных последовательностей IS 402 и IS 1356 (ISH-маркер), характерный для штаммов эпидемической линии ЕТ 12, и маркер эпидемических штаммов BCESM выявляются только у штаммов, способных к эпидемическому распространению, и отсутствуют у штаммов, вызывающих спорадические случаи заболеваний (Т. Conye, LiPuma, 2008).

Из 58 исследованных штаммов В. cenocepacia из московских стационаров у 53,4% выявлялся хотя бы один эпидемиологический маркер, в то время как у штаммов, выделенных от больных муковисцидозом,

маркеры СВЬ и 18-ЫЬг1с1 не были обнаружены, а ВСЕБМ выявлен у 82% обследованных.

При сравнении этих групп штаммов видно, что сЫ ген выявлен у 24 % штаммов от пациентов московских клиник (группа сравнения) и отсутствует у штаммов от больных муковисцидозом. Маркер ГБ-ЫЬпс! также не выявлялся в последней группе и обнаружен у 5,2% штаммов из группы сравнения. ВСЕЭМ выявлялся у штаммов, выделенных от больных муковисцидозом в 4 раза чаще, чем у второй группы штаммов (82% и 20,1% соответственно) (таблица 4).

Таблица 4

Выявление эпидемических маркеров у клинических штаммов и штаммов, выделенных от больных муковисцидозом

штаммы маркеры

BCESM CBL IS-hibrid

От больных муковисцидозом (контрольная группа) 41 штамм (82%) 0% 0%

Московские клинические (группа сравнения) 12штаммов (20,1%) 14штаммов (24%) 3 штамма (5,2%)

Таким образом, нами впервые оценено эпидемиологическое значение госпитальных штаммов В. cepacia. Исходя из наших наблюдений, можно сделать вывод, что штаммы, циркулирующие среди больных муковисцидозом, имеют высокую способность к распространению между пациентами. Штаммы, полученные от пациентов из многопрофильных стационаров (с раневой, катетер-ассоциированной инфекцией, госпитальной пневмонией), проявляют большую способность к синтезу контагиозных пилей, необходимых для адгезии на эпителиальных клетках или других поверхностях, чем штаммы от больных муковисцидозом.

Генетическое типирование штаммов В. cepacia, циркулирующих в различных клиниках города Москвы и других городов России. С целью выявления некоторых эпидемиологических характеристик штаммов В. cepacia, таких как источники инфекции, механизмы распространения и широта циркуляции штаммов буркхолдерии в стационарах Москвы и других городов было проведено типирование методом РАПД-ПЦР коллекции штаммов, собранной в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ НИИЭМ им Гамалеи Минздравсоцразвития России.

При анализе полученных данных установлено, что в разные периоды времени в Московском регионе циркулировали штаммы как характерные для каждого стационара, так и общие для нескольких клиник. Также эти

штаммы по своему генотипу существенно отличались от штаммов В. cepacia, полученных из Франции, Германии и Бельгии. На основании этого можно сделать предположение, что в Российской Федерации циркулируют специфические для данной территории штаммы.

Таким образом, с помощью алгоритма собранная коллекция штаммов была охарактеризована по фенотипическим и генотипическим признакам. Мы подтвердили, что разработанный нами метод работает и позволяет проводить точную идентификацию возбудителя до геномовара, определять вирулентность микроорганизма и его способность вызывать хроническую инфекцию, выявлять эпидемиологические связи между штаммами.

Эпидемиологическая характеристика хронической инфекции, вызванной В. cepacia. Бактерии комплекса В. cepacia продуцируют факторы патогенности, способны образовывать биопленки, что повышает вирулентность штаммов и позволяет им длительно сохраняться в окружающей среде, обладают природной антибиотикоустойчивостью и быстро приобретают резистентность к ним при антибиотикотерапии.

Установлено, что из 16 геномоваров, составляющих комплекс В. cepacia, наиболее эпидемиологически значимым является геномовар В. cenocepacia подтип ЗА. При сравнительном анализе дендрограмм, выделенных в клиниках г. Москвы и других городов РФ, выявлено регион-специфическое распределение штаммов и поликлональное их распределение внутри регионов.

Мониторинг штаммов В. cepacia у детей, больных муковисцидозом. Был проведен многолетний мониторинг штаммов, полученных от детей с муковисцидозом, которые находились на лечении (наблюдались амбулаторно или подвергались повторным госпитализациям) в отделении медицинской генетики РДКБ, с тем, чтобы оценить степень генетического родства штаммов, выделенных от разных пациентов, наблюдать изменчивость штаммов, полученных от одного и того же пациента в динамике, также выявить закономерности формирования и циркуляции штаммов В. cepacia среди детей больных муковисцидозом.

Установлено, что штаммы, выделенные от пациентов с муковисцидозом, имеют высокую степень генетического сходства между собой (степень родства более 85%), в то же время они существенно отличаются от штаммов, вызвавших госпитальные пневмонии у пациентов московских клиник (степень генетического сходства менее 40%). У 82% штаммов, выделенных от больных муковисцидозом, выявлен маркер эпидемических штаммов В. cepacia (BCESM). Таким образом, впервые показано, что среди больных муковисцидозом циркулируют

специфические для них штаммы, имеющие один и тот же источник инфекции.

Мы использовали пульсэлектрофорез для динамического мониторинга штаммов, полученных от пациентов с муковисцидозом, находившихся на стационарном лечении в отделении медгенетики в РДКБ. Было проведено генотипирование 21 штамма, полученного от 9 пациентов с интервалом выделения штаммов от 2 недель до полутора лет (рис.2).

Пациент Штамм Дата выделения

1.М-В 7554 08.09.08

2.М-В 7226 20.03.08

3. А-ов 7891 04.05.09

4. А-ов 7867 20.04.09

5. М-е 7162 04.02.08

6. М-е 7284 14.04.08

7. Х-кий 7561 11.09.08

8. Х-кий 7280 10.04.08

9. Х-кий 8030 09.07.09

10. О-в 7178 21.04.09

11. О-в 7818 26.03.09

Рисунок 2. Пульсэлектрофореграмма штаммов, выделенных от больных муковисцидозом в процессе динамического мониторинга

Анализ дендрограммы выявил 3 генотипа штаммов. Доминирующим был генотип, включающий 17 штаммов (80%), выделенных от 8 пациентов в результате повторных высевов в течение 2 лет (рис. 3).

5 & =1 3

С о

3 I

и а

5 о 4>

5 а

X £

£

п п п

» 2 § § о = о

2 = ° 2 М |

^ « ^ » « Я 5

» ж а в в

(М

3 °

£ Й й 00 а " * СО Ю I- I— -

14 1Л Г5 ^ и « »

— Г'. С ГЧ &1П _

* ! ' бв I V

П. .

Рисунок 3. Дендрограмма штаммов, выделенных от больных муковисцидозом в процессе динамического мониторинга (метод пульэлектрофорез)

Для определения возможных источников инфицирования больных детей муковисцидозом в Московском центре муковисцидоза и в отделении медицинской генетики РДКБ были взяты образцы (смывы) с процедурных столов, столов с инструментарием, стерильных лотков, рук медперсонала, внешней среды процедурных кабинетов. Из проведенных 25 анализов в Московском центре муковисцидоза 13 проб оказались стерильными. В 10 образцах выявлены бактерии вида S. epidermidis в количестве, не превышавшем 300 КОЕ/тамп. и в 2-х образцах — Enterococcus spp. в количестве, не превышавшем 300 КОЕ/тамп.

В 28 образцах, взятых из внешней среды отделения медицинской генетики РДКБ, в 25% случаев выявлены Р. aeruginosa, в 21,4% случаев — S. epidermidis, в 10,7% случаев - плесневые грибы, О. anthropi, Р. fluorescens, в 7,1% случаев - В. cepacia и S. maltophilia.

Эти данные позволяют предположить, что внешняя среда, объекты процедурных кабинетов и руки медперсонала Московского центра муковисцидоза не являлись причиной инфицирования амбулаторных больных детей муковисцидозом, в то время как объекты внешней среды отделения медицинской генетики могли быть одним из возможных факторов формирования микрофлоры во время пребывания пациентов в стационаре.

Учитывая высокую степень генетического родства исследованных штаммов, их множественную антибиотикоустойчивость, наличие у них эпидемиологического маркера и способности образовывать биопленки, можно сделать вывод, что штаммы, полученные от больных муковисцидозом, имеют один источник инфекции госпитального происхождения, способны передаваться между пациентами, длительно персистировать в дыхательных путях, не подвергаются элиминированию в результате длительных повторных курсов антибиоткотерапии, способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах. По данным молекулярно-генетического мониторинга за хронической инфекцией, вызванной В. cepacia, можно предполагать, что основными механизмами распространения возбудителя являются аспирационный и контактный, а передача возбудителя от пациента к пациенту осуществляется воздушно-капельным или бытовым путями.

Разработанная нами система идентификации бактерий В. cepacia, включающая набор традиционных фенотипических (бактериологических, биохимических) и молекулярно-генетических методов, а также дополнительное использование генотипирования, выявления эпидемических маркеров, генов cepl и cepR, характеризуется последовательным применением различных методов по принципу от общего к частному. Комплексный подход позволяет более точно

идентифицировать возбудителей и выявлять источник внутрибольничной инфекции, вызванной бактериями комплекса В. cepacia, а также изучать молекулярно-генетические механизмы патогенности бактерий В. cepacia.

Выводы

1. Установлено, что при хронической инфекции нижних дыхательных путей у больных муковисцидозом колонизация дыхательных путей осуществляется ассоциацией микроорганизмов. При этом у госпитализированных больных муковисцидозом ассоциация в 60% случаев представлена 3-5 микроорганизмами, тогда как у амбулаторных больных - только 2-3 видами возбудителей бактериальных инфекций. Исходя из этого, можно предполагать, что инфицирование пациентов в основном происходит в условиях стационара.

2. Определен состав ассоциаций, в которые, кроме основных возбудителей хронической инфекции нижних дыхательных путей - бактерий видов Р. aeruginosa и S. aureus, наиболее часто входят представители грамотрицательных неферментирующих видов бактерий - Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii. Частой ассоциацией является сочетание - Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia.

3. Разработан алгоритм основанный на сочетании микробиологических и молекулярно-генетических методов, позволяющих решать ряд актуальных вопросов микробиологии и эпидемиологии хронической инфекции, вызываемой данным возбудителем, а именно: а) идентифицировать возбудитель до геномовара; б) определить вирулентные свойства микроорганизма; в) выявить способность вызывать хроническую инфекцию; г) установить общие генотипические признаки между штаммами, циркулирующими в стационаре и среди больных В. cepacia.

4. Установлено: а) все клинические штаммы комплекса В. cepacia, циркулирующие в различных стационарах г. Москвы, а также в популяции больных муковисцидозом относятся к геномовару Burkholderia cenocepacia подтип IIIA; б) выявлено регион -специфическое распределение штаммов в РФ и их поликлональное распространение внутри различных стационаров в) у 20,1% клинических штаммов, выделенных в московских стационарах, выявлен BCESM, свидетельствующий об эпидемиологической значимости циркулирующих в данных стационарах штаммов В. cepacia.

5. Штаммы В. cepacia, выделенные от больных муковисцидозом, характеризовались высокой степенью генетического родства между

собой. Они отличались от штаммов, вызвавших госпитальную пневмонию у пациентов многопрофильных стационаров г. Москвы, по фенотипическим и генотипическим свойствам. У 82% штаммов, выделенных от больных муковисцидозом, обнаружен BCESM, что свидетельствует о способности к эпидемическому распространению штаммов, вызывающих у больных муковисцидозом хроническую инфекцию.

6. Выявлено, что штаммы В. cepacia, у больных муковисцидозом, в отличие от других видов микроорганизмов, не элиминируются в течение длительного времени, несмотря на проводимые курсы антибиотикотерапии. С помошью пульсэлектофореза и метода RAPD-ПЦР выявлены 4 группы штаммов, составивших 3 генотипа. Доминирующим был генотип, включающий 17 штаммов (80%), выделенных от 8 обследованных в динамике больных, что свидетельствует о едином источнике инфекции.

7. Установлено, что данные микроорганизмы способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах. По данным молекулярно-генетического мониторинга за хронической инфекцией, вызванной В. cepacia, можно предполагать, что основными механизмами распространения возбудителя являются аспирационный и контактный, а передача возбудителя от пациента к пациенту осуществляется воздушно-капельным или бытовым путями.

8. Обоснована тактика профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования штаммами В. cepacia больных муковисцидозом, направленных на применение ПЦР для быстрой и точной индикации В. cepacia у пациентов, ограничение контактов пациентов, соблюдение правил противоэпидемического режима.

Практические рекомендации

- Для быстрой и точной диагностики инфекции, вызванной В. cepacia, необходимо использовать молекулярно-генетические методы исследования (ПЦР), позволяющие быстро выявить наличие специфических маркеров микроорганизма непосредственно в мокроте без выделения чистой культуры.

С целью создания эффективной системы профилактики внутрибольничных инфекций, вызванной бактериями комплекса В. cepacia, госпитальным эпидемиологам необходимо организовать молекулярно-генетический мониторинг, позволяющий получать данные о структуре популяций госпитальных штаммов и расшифровывать механизмы появления, формирования и циркуляции эпидемических штаммов в

стационарах. Это позволит прогнозировать эпидемиологически неблагоприятную обстановку и предотвращать возникновение внутрибольничных инфекций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шагинян И.А., Хмель И.А., Романова Ю.М., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В. и др. Клинические штаммы комплекса Burkholderia cepacia: характеристика и выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing//Muii. генетика, микробиол.. вирусол,- М.-2003.-№4.-С.15-20.

2. Чернуха М.Ю., Шагинян И.А., Романова Ю.М., Хмель И.А., Веселова М.А., Алексеева Г.В., Гинцбург А.Л.. Факторы патогенности и компоненты регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов комплекса Burkholderia cepacia //Материалы Международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы». - г. Санкт-Петербург-2003.- С.181.

3. Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л., Значение молекулярно-генетических методов в индикации возбудителей внутрибольничных инфекций (ВБИ), вызванных бактериями комплекса. // XXXVII научная конференция «Оптимизация больничной среды средствами новых технологий».//ч. II Вопросы профилактики внутрибольничной инфекции.-С.-Петербург. -2004.-С.67-70.

4. Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Молекулярно-генетические методы как основа полифазного таксономического подхода в индикации и выявлении источника внутрибольничной инфекции, вызванной бактериями комплекса Burkholderia cepacia.// Сб. трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней»,-М.-2004.-Т.2.-С. 136-139.

5. Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Сидоренко C.B., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Исследование динамики антибиотикорезистентности госпитальных штаммов Burkholderia cepacia, выделенных от больных из московских клиник. «Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций» .//Тезисы доклада Российской научно-практической конференции с международным участие.-М.-2004.-С.93.

6. Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Сидоренко C.B., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Использование фенотипических и генотипических методов методов для исследования госпитальных штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia. «Узловые вопросы борьбы с инфекцией»// Материалы Российской научно-практической конференции. - С.-Перербург.-2004.-С.274-275.

7. Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Ковтун В.П., Шагинян И.А. Молекулярно-генетические методы в изучении эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызываемых бактериями комплекса Burkholderia cepacia.// «Фундаментальная наука и прогресс клинической медицины» III конференция молодых ученых России с международным участием. Сборник тезисов. М. 2004,461-462.

8. Chernukha M.U., Alekseeva G.V., Shaginyan I.A., Ginzburg A.L.. The virulent properties of nosocomial strains of Burkholderia cepacia complex, isolated from parients of Moscow hospitals// CMI Clinical Microbiology and Infection, 15 Europian Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases. -V. 11 .-Suppl/2/-April/-2005/-P.607-608.

9. Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Романова Ю.М., Степанова Т..В., Батов А.Б., Шагинян И.А., Гинцбург A.JL Исследование вирулентных свойств госпитальных штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia, выделенных в стационарах г. Москвы// Журнал микробиол.-2005.-№6.-С. 46-51.

10. Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В, Шагинян И.А. Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia.// Методические рекомендации. - Москва.-2005.

11. Алексеева Г.В., Аветисян JI.P., Батов А.Б. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг как основной элемент эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями. //International scientific conference proceedings dedicated to the 75-th anniversary of YSMU after M. heratsi, Erevan, 2005/ c.61-62.

12. Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Батов А.Б. Изучение эпидемиологической значимости штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia, выделенных от больных хирургических отделений и интенсивной терапии в клинках г. Москвы.// International scientific conference proceedings dedicated to the 75-th anniversary of YSMU after M. heratsi, Erevan, 2005 c.59-60.

13. Чернуха М.Ю., Данилина Г.А., Алексеева Г.В., Батов А.Б., Шагинян И.А., Гинцбург A.JI. Антибиотикорезистентность и формирование биопленок у клинических штаммов бактерий комплекса B.cepacia. //Клин, микробиология и антимикрорбная химиотерапия, 2006, т.8., №2,- С.41-42.

14. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., Данилина Г.А., Алексеева Г.В. Эпидемиологическая значимость формирования биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса B.cepacia.// Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней». Сборник научных трудов (выпуск 8).-М.-2006.-С. 193-199.

15. Алексеева Г.В, Чернуха М.Ю., Шагинян И.А. Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР.// «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии». Учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов, Москва, 2006, глава 2.7, С. 117-126.

16. Шагинян И.А., Данилина Г.А., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В, Батов А.Б. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик.// ЖМЭИ, 2007, № 1, С.3-9.

17. Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Данилина Г.А., Шагинян И.А. Мониторинг персистенции Burkholderia cepacia у больных муковисцидозом.// Клиническая микробиология и антимикробная терапия 2010, т.12, №2, с.13.

18. Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Аветисян JI.P., Данилина Г.А., Капранов Н.И., Семыкин С.Ю., Пивкина Н.В., Поликарпова C.B. «Микроэволюция» штаммов Burkholderia cepacia при их персистенции у больных муковисцидозом.//Молекулярная диагностика, 2010, т.2, с.437-438.

19. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Семыкин С.Ю., Аветисян JI.P., Данилина Г.А. Поликарпова C.B., Пивкина Н.В. Микробный пейзаж нижних дыхательных путей у детей больных муковисцидозом. //«Муковисцидоз у детей и взрослых» X Национальный конгресс по муковисцидозу - г. Ярославль, 2011.

Подписано в печать 21.11.2011 г. Тираж 70 экз.

Илит Гла