Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Воздействие апитоксинана некоторые показатели системы иммунитетав норме и при экспериментальномаллергическом энцефаломиелите(экспериментальное исследование)

Р Г 6 од

I 3 НЮН ТЯЯ7

На правах рукописи

Кочеткова Наталья Геннадьевна

Воздействие апитоксина на некоторые показатели системы иммунитета в норме и при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите

(экспериментальное исследование)

14.00.36-аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Челябинск - 1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии (зав. кафедрой доктор медицинских наук, профессор И.И. Долгушин Челябинской государственной медицинской академии

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

член- корреспондент РАЕН доктор медицинских наук, профессор Л.Я. Эберт

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

С. Н. Теилова доктор медицинских наук, Ю. Н. Савченко

Ведущая организация: Институт экспериментальной медицины

РАМН.

Защита состоится "_" _ 1997 года в_часов,

на заседании Диссертационного Совета Д-08404.02 при Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г.Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Доктор медицинских наук,

профессор А. В. ЗУРОЧКА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Демиелинизирующие заболевания являются важной медицинской и социальной проблемой в связи с поражением лиц молодого трудоспособного возраста, прогрессирующим течением, ведущим к инвалидности, отсутсвием эффективных методов лечения. Для изучения демиелинизирующих процессов в центральной нервной системе, патогенеза аутоиммунных расстройств и терапии неврологических и опосредуемых иммунной системой болезней используется экспериментальный аллергический энцефаломиелит (Хоружая Т.А., Бардахчьян Е.А.,1979, Житнухин Ю.Л., 1995). Увеличение в последние годы исследований, посвященных иммунологии демиелинизирующей патологии, привело к пониманию ведущей роли иммунологических расстройств в их патогенезе, что и послужило основанием для применения в комплексной терапии демиелинизирующих заболеваний медикаментозных и физических средств, так или иначе воздействующих на нарушенный иммунный гомеостаз. В то же время, несмотря на широкий спектр препаратов и методов воздействия на экспериментальный аллергический энцефаломиелит, остается актуальной проблема выбора новых подходов, которые могли бы быть использованы в клинической практике. Поиски таких средств постоянно продолжаются, в том числе и среди препаратов биологической природы. Одним из таких веществ, привлекающих в последние 15 лет интерес среди исследователей, является апитоксин (пчелиный яд).

Известно, что апитоксип, имея достаточно сложную структуру, оказывает различное действие в зависимости от дозы введения.

Так, по данным Е.Б.Романовой, 1980, 1987, апитоксин в

дозах 2,26-4,5 мг/кг вызывает иммунодепрессивный эффект, а в дозе 0,13 мг/кг (Савчук Н.А.,Савчук О.Е.,1970) - стимулирующий. Кроме того, определенный интерес для патогенетической терапии экспериментального аллергического энцефаломиелита представляют также следующие механизмы действия апитоксина: активация коры надпочечников с выбросом эндогенного кортизола в кровь (ЗайцевГ.П., Виноградова Т.В.,

1960, Орлов. Н.,1978, 1980, 1987); снижение уровня холестерина в крови(Зайцев Г.П.,Виноградова Т.В.,1974, Архангельский А.А.,1977); Одним из наиболее интересных механизмов представляется активность апитоксина по отношению к миелиновой оболочке нервного волокна. Работами Орлова Б.Н. (1972, 1973, 1987, 1988) было установлено, что апитоксин может противодействовать демиелинизации.

Изучение влияния апитоксина на звенья иммунитета в норме и при демислинизирующей патологии, позволило бы обосновать целесообразность применения апитоксина в качестве лечебного патогенетического средства при демиелинизирующих заболеваниях. Моделью ЭАЭ был выбран экспериментальный аллергичесий энцефаломиелит у крыс линии Вистар. Цель исследования:

Изучить в эксперименте на белых крысах воздействие апитоксина на неко торые показатели системы иммунитета в норме и при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите как адекватной модели демиелинизации. Задачи исследования:

1. Изучить воздействие апитоксина на систему иммунитета в норме.

2. Исследовать некоторые показатели иммунитета при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите.

3. Оценить влияние апитоксина на систему иммунитета при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование апитоксина на отдельные звенья иммунитета у экспериментальных животных в норме. Применена схема введения апитоксина, максимально приближенная к клинической.

Изучено влияние апитоксина на миелиновую оболочку нервного волокна в сочетании с изучением некоторых показателей иммунитета у животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом. Оценено влияние апитоксина на систему иммунитета у крыс с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом в сочетании с изучением клинических и гистологических изменений. Экспериментально обоснована возможность применения апитоксина в оптимальной дозе для патогенетической терапии при демиелинизирующей патологии.

Положения, выносимые на защиту.

¡.Введение апитоксина здоровым крысам линии Вистар вызывает увеличение массы и клеточности селезенки и количества антителообразующих клеток селезенки как проявление иммуностимулирующего действия яда на факторы гуморального иммунитета.

2.Апитоксин при введении крысам с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом не приводит к повышению активности перитонеальных макрофагов и усилению реакции гиперчувствительности замедленного типа по сравнению со здоровыми животными.

3.Апитоксин облегчает клиническое течение экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс, способствует более быстрому регрессу неврологических растройств, уменьшает демиелинизацию нервных волокон в центральной и периферической нервной системе, что свидетельствует о возможном его применении при демиелшшзирующих состояниях в клинической практике.

Внедрение в практику.

Результаты проведенных исследований внедрены в работу клиники медицинского объединения "АПИ" г.Челябинска.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Ассоциации неврологов Челябинской области (Челябинск, 1996), на XI Европейском конгрессе по рассеянному склерозу (Иерусалим, Израиль, 1995), на XII Европейском конгрессе по рассеянному склерозу (Копенгаген, Дания, 1996).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 340 источников, в том числе 162 зарубежных автора. Работа иллюстрирована 25 таблицами, 10 микрофото, 7 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа выполнена на 360 половозрелых крысах-самцах линии Вистар. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит воспроизводился путем однократной инокуляции основного белка миелина с полным адъювантом Фрейнда в подушечки лап крыс. В работе изучены следующие показатели: масса и клеточность тимуса и селезенки (Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И.,1983)

количество антителобразующих клеток в селезенке крыс (Jeme N.K.,Nordin A.A., 1963)

функциональная активность перитонеальных макрофагов (Долгушин И.И. и соавт., 1992,Маянский А.Н. и соавт.,1977, Park B.N. et al.1968, Segal A.W.,1974)

реакция гиперчувствительности замедленного типа (Langrade Р.Н. et al., 1974, 1980)

Использовался яд-сырец пчелы Apis mellifera расы "среднерусская", полученный методом электростимуляции. Раствор яда готовился ex tempore и вводился подкожно в дозе 0,25 мг/кг массы животного через день в течение 14 суток.

Яд сертифицирован Уральским региональным учебно-технологическим центром "Апис плюс" Челябинского агроинженерного университета. Химический состав яда представлен в таблице N 1.

Таблица № 1. Химический состав нспользованного в эксперименте яда-сырца

Предмет анализа, единицы измерения яда-сырца Требования по нормативным актам Результат анализа

Структура Порошок из чешуек и крупинок-по ТУ Порошок в виде крупинок

Цвет От сыровато-желтого до бурого по ФС, ТУ Серовато-желтый

Потерн в массе при высушивании, % Не более 12% по ФС, ТУ 2,1%

Нерастворимый в воде осадок, % Не более 10% по ФС 4,1%

Окраска раствора в разведении 1:300 Не должна превышать эталон № За по ТУ Не превышает раствор № За

Содержание Сахаров Не нормируется 4,8%,

Гемолитическая активность, мин. Не более 8 мин. по ФС 1,33 мин.

Предмет анализа, единицы измерения яда-сырца Требования по нормативным актам Результат анализа

Фосфолниазная активность, мкг. Не более 8 мкг. по ТУ Менее 4 мкг.

Содержание мелнттина Не нормируется Не опр.

ТУ-ТУ 46 РСФСР 67-72 "Яд пчелиный-сырец"

ФС- Фармакопейная статья № 42-2683-89 Фармакопеи СССР.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием "Statgraphics Vers.7.0". Для каждого показателя рассчитывали среднюю арифметическую (М) и стандартную ошибку средней (ш). Достоверность различий между группами определяли с помощью критерия Стьюдента (t). Различия считали достоверными при р<0,05. Результаты работы и их обсуждение.

Экпериментальный аллергический энцефаломиелит был получен методом однократной инокуляции основного белка миелина с полным адъювантом Фрейнда в подушечки лап крыс.

Наличие ЭАЭ верифицировано морфологически по методу Шпильмейера и неврологически по наличию парезов и параличей конечностей у животных. Признанными изменениями со стороны иммунной системы при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите считаются уменьшение количества Т-супрессоров с изменением их функциональной активности, возрастание уровня Т-хелперов, снижение активности киллеров, стимуляция B-клеточных клонов ЦНС, сенситивация лимфоцитов к основному белку миелина и присутствие в крови циркулирующих иммунных комплексов (Гусев Е.И., Аристова P.A., Савина Н.Г., 1983, Тункель О.И., 1983, Неретин В .Я. с соавт., 1990).

Однако, остается спорным вопрос, являются ли эти

изменения причиной или следствием разрушения миелиновой оболочки нервного волокна. Одни авторы считают, что дефект иммунитета при ЭАЭ является признаком развития заболевания по аутоиммунному типу и в связи с этим рекомендуют иммуносупрессивную терапию. Другие относят активность В-лимфоцитов и снижение Т-лимфоцитов к проявлениям иммунодефицитного состояния и рекомендуют иммуностимуляторы клеточного иммунитета.

Поэтому поиск иммунотропных веществ, способных оказывать лечебное действие при ЭАЭ является важным в выборе терапии этого заболевания. Целью настоящего исследования было изучение воздействия апитоксина (пчелиного яда) на состояние некоторых показателей иммунитета у животных с ЭАЭ. Мы использовали ЭАЭ для изучения влияния апитоксина на различные звенья иммунитета в сочетании с гистологической картиной спинного и головного мозга у экспериментальных животных в сравнении со здоровыми животными.

Апитерапия как метод лечения известна достаточно давно и используется в лечении целого ряда заболеваний. В течение последних 20 лет значительно расширились знания состава пчелиного яда, его биологических эффектов. Есть и клинические данные об эффективном использовании апитоксина в лечении больных с демиелинизирующей патологией (Лудянский, 1980, 1994). Поэтому экспериментальное изучение возможности применения яда в терапии этой патологии позволило бы более широко и обдуманно рекомендовать апитерапию как метод лечения в данной области.

Исследования показали, что под влиянием апитоксина на систему иммунитета в норме происходят следующие изменения.

Иммунокомпетентные органы, в качестве которых

использовались селезенка и тимус, реагировали на введение яда по-разному. Так, со стороны селезенки наблюдалось увеличение ее массы и клеточности с сохранением этой тенденции в течение 14 суток. Достоверных данных со стороны массы и клеточности тимуса выявлено не было.

Таким образом, апитоксин в дозе 0,25мг/кг массы у крыс вызывает стимуляцию селезенки, что позволяет предполагать активацию гуморального иммунитета. И действительно, при изучении антителобразующих клеток обнаружено достоверное увеличение их количества в первые сутки после окончания введения апитоксина.

Дальнейшее снижение их количества связано, без сомнения, с прекращением введения апитоксина, который, возможно, выступал как антиген в силу своей сложной белковой структуры.

Достоверных различий при изучении перитонеальных макрофагов под действием апитоксина у крыс между контрольной и опытной группами не выявлено. По данным других авторов (Орлов Б.Н., Романова Е.Б., 1980), апитоксин вызывает активацию макрофагов. Это, очевидно, связано с применением более высоких доз апитоксина, которые использовались в этих исследованиях.

Так как мы исследовали только перитонеальные макрофаги, вполне возможно, что со стороны других популяций макрофагов может быть иная реакция. Этот факт представляет интерес для дальнейшего изучения. При исследовании гиперчувствительности замедленного типа получены следующие результаты. Как описано в главе "Обзор литературы", апитоксин в своем составе имеет большое количество химических соединений с выраженными аллергогенными свойствами. Поэтому при постановке реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа мы могли ожидать ее активацию. Но при анализе данных исследования апитоксина на ГЗТ у здоровых животных

достоверных различий между контрольной группой и крысам, которым вводился апитоксин, не получено. С нашей точки зрения, это связано с дробным введением малых доз яда, которые способствуют гипосенсибилизации. Это совпадает с мнением Артомасовой А.В.,1977, Васильева П.С.,1990, Младенова С., 1982, которые считают такой подход возможным для лечения людей с аллергическими реакциями на укусы насекомых. При изучении клинических эффектов введения апитоксина у животных с ЭАЭ было выявлено, что выраженность симптомов поражения нервной системы у крыс, получавших апитоксин, была меньше, чем у нелеченных. В то же время восстановление нервной системы к 14-м суткам после окончания введения яда произошло в большей степени у леченных животных, чем у крыс без лечения. Это подтверждается и гистологическими исследованиями. У животных, получавших апитоксин, отмечалось уменьшение размера очагов глиоза, а также у 40% животных наблюдалось лишь частичное поражение миелиновых волокон с сохранением их параллельного расположения. У 10% крыс не было выявлено изменений со стороны миелиновых волокон. Таким образом, можно говорить о том, что апитоксин в дозе 0,25 мг/кг массы уменьшает степень демиелинизации и облегчает клиническое течение ЭАЭ у крыс.

Оставалось неясным, как же соотносятся изменения в системе иммунитета с данными гистологических и клинических наблюдений.

Сначала мы изучили данные, которые были получены у животных с ЭАЭ, не получавших апитоксин. Наблюдалось достоверное увеличение массы и клеточности селезенки у больных животных по сравнению с контрольной группой, которое сохранялось на протяжении всего срока наблюдения. Достоверным оказалось и увеличение АОК у крыс с ЭАЭ, которое

также сохранялось в течение 14 суток. Изменений со стороны перитонеальных макрофагов выявлено не было, несмотря на то, что повышение активности макрофагов является патогномоничным для ЭАЭ.

Гиперчувствителыюсть замедленного типа у крыс с ЭАЭ достоверно увеличивалась по сравнению со здоровыми животными и сохранялась примерно на одном уровне на протяжении всего периода наблюдения. Это подтверждает данные о том, что ГЗТ является одним из основных звеньев патогенеза рассеянного склероза.

Таким образом, при ЭАЭ наибольшие изменения представлены со стороны АОК и гиперчувствителыюсти замедленного типа.

В дальнейшем нами было изучено влияние апитоксина на систему иммунитета у животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом. Исследовались те же показатели иммунной системы, что и ранее.

При изучении изменений со стороны селезенки и тимуса достоверных различий между показателями у крыс с ЭАЭ, не получавшими апитоксин, и у крыс, которым вводился яд, не получено. Не получено также различий и для количества антителообразующих клеток. Очевидно, механизм влияния апитоксина на гуморальный иммунитет у крыс с ЭАЭ, где уже изначально есть изменения этого звена иммунитета, другой, чем у здоровых животных и требует более подробного дальнейшего исследования. Отсутствие достоверной реакции со стороны перитонеальных макрофагов на введение апитоксина у животных с ЭАЭ является положительным фактором, так как мы можем предполагать, что такой же эффект может быть и со стороны макрофагов, находящихся в

цнс.

И если раньше возможная активация макрофагальной

реакции являлась ограничением для применения апитоксина в лечении рассеянного склероза, то теперь мы можем утверждать, что яд в использованной нами дозе не приводит к этому.

И, пожалуй, наиболее важным моментом является опровержение предположения, существовашего ранее, что апитоксин может усиливать реакцию гиперчувствительности замедленного типа при демиелинизирующей патологии и приводить к усилению демиелинизации нервного волокна. В дозе 0,25 мг/кг массы тела апитоксин этот показатель достоверно не изменяется.

Если же сравнивать данные клинического наблюдения и гистологического исследования у животных с ЭАЭ, получавших и не получавших апитоксин, то очевидным является тот факт, что заболевание протекает легче и с более быстрым регрессом признаков у животных, которым вводился апитоксин.

Гистологическое исследование также подтверждает уменьшение демиелинизации нервных волокон у крыс, леченных ядом.

При сопоставлении клинических и гистологических признаков с показателями иммунной системы очевиден тот факт, что при явной положительной динамике и в клиническом течении, и при морфологическом исследовании у крыс с ЭАЭ, получавших апитоксин, не выявлено достоверных различий среди использованных показателей иммунитета. Поэтому необходимо дальнейшее разностороннее изучение механизмов влияния апитоксина на миелиновое волокно с целью создания обоснованной методики применения яда при демиелинизирующей патологии.

Таким образом, исследования показали, что апитоксин существенно не влияет на функции иммунной системы животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом, но дает выраженную положительный эффект на состояние нервной системы крыс, что позволяет предположить его возможное

положительное влияние на демиелинизирующие состояния и при применении в клинической практике. Учитывая, что интактные животные на введение апитоксина отвечали усилением гуморального иммунного ответа, можно предположить, что апитоксин у больных с демиелинизирующими состояниями будет изменять те или иные звенья иммунитета. Но эти исследования, по-видимому, требуют использования более чувствительных методов.

ВЫВОДЫ.

1. Апитоксин в дозе 0,25 мг/кг массы,

введенный здоровым крысам линии Вистар, вызывает увеличение массы и клеточности селезенки и количества антителообразующих клеток, что говорит об иммуностимулирующем действии яда на факторы гуморального иммунитета.

2. Апитоксин не оказывает достоверного влияния на массу и клеточность тимуса и перитонеальные макрофаги.

3. Апитоксин при введении животным с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом не приводит к достоверным различиям использованных показателей деятельности иммунной системы по сравнению с таковыми у животных, не получавшими яд.

4. Апитоксин в указанной дозе облегчает клиническое течение экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс и способствует более быстрому регрессу неврологических расстройств.

5. При гистологическом исследовании апитоксин в уменьшает демиелинизацию нервных волокон в центральной и периферической нервной системе.

6. Полученные нами данные о положительном влиянии апитоксина на нервную систему при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите свидетельствует о возможном его применении при демиелинизирующих состояниях в клинической практике.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комплексная апирефлексотерапия как метод иммунореабилитации у больных с аутоиммунными заболеваниями

// Тезисы I Международного конгресса по иммунореабилитации Москва, 1994. /соавтор И. В. Кривопалов, Л. Я. Эберт.

2. The possibility of bee venom usage in complex with other methods of multiple sclerosis tretment.

//Journal of neuroimmunology. Abstracts of the 11 th European Congress on multiple sclerosis. Jerusalem, 1995 /et Krivopalov I.-p.64.

3. Possibilities of applying apitoxin to correction of experimental allergic encephalomyelitis.// European journal of neurology.

Abstracts of the European congress on multiple sclerosis. Copenhagen, 1996/et Krivopalov I.-p.28

4. Об эффектах апитокснна на системы крови и иммунитета и возможность его использования для иммунокоррекции при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите

// материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 60 летию МГ КБ №4 . Челябинск, 1996 г. / соавтор Кривопалов И. В.- стр. 75-76.

5. Влияние апитоксина на иммунитет крыс линии Вистар // Факторы клеточного и гуморального иммунитета

при различных физиологических и патологических состояниях. Тезисы докладов XIII Российской научной конференции. Челябинск, 1997 г. / соавтор Л. Я. Эберт. -стр. 75-76.

Заказ 1226 от 25 мая-97 г. Макет сверстан в рекламной группе МАРК. Гарнитура Тайме. Тираж 100 экз.