Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Роль клеток стенки микрососудов в пролиферативных процессах соединительной ткани

РГ6 од

- 3 СЕЛ 1537

На правах рукописи

КОЛОКОЛЬЧИКОВА ЕЛЕНА ГЕОРГИЕВНА

РОЛЬ КЛЕТОК СТЕНКИ МИКРОСОСУДОВ В ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997

Диссертация выполнена в Институте хирургии им. A.B. Вишневского РАМН

Научный консультант:

академик РАМН, профессор Д.С. Саркисов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Банин доктор медицинских наук, профессор H.A. Юрина доктор медицинских наук, профессор В.В. Яглов

Ведущее учреждение - НИИ морфологии человека РАМН

Специализированного Совета Д.084.14.04 при Российском государственном медицинском университете (117869, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Защита состоится

года в /V

часов на заседании

Автореферат разослан "¿¿У" 1997

года.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук, профессор

А.Н. Тихомиров

Актуальность проблемы. Соединительная ткань является одним из самых распространенных тканевых типов. Важнейшей и всегда актуальной проблемой в изучении соединительной ткани была и остается проблема ее гистогенеза.

Представление о гистогенезе соединительной ткани в целом и ее разновидностей в частности сложилось несколько десятков лет тому назад и в основном сводится к центральной идее, что источником всех ее видов является полипотентная мезенхимная клетка, которая в зависимости от обстоятельств может дифференцироваться в различных направлениях: то грубоволокнистой, то фиброзной, то жировой, то костной, то хрящевой и др. тканей. В наиболее четкой и ясной форме эта идея была высказана

A.А.Максимовым (1925). Однако тут же возникают два неразрывно связанных между собой вопроса: где локализуется эта клетка и что это за клетка? Высказывались различные точки зрения по этим вопросам, однако, доказательств не было.

Так, в целом ряде работ наших ученых поддерживалась гипотеза, что сосуд и его ближайшее клеточное окружение являются зоной, содержащей клетки, способные дифференцироваться в различных направлениях (Фомин

B.Е., 1917; Абрикосов А.И., 1942; Заварзин A.A., 1947; Румянцев A.B., 1958; Русаков A.B., 1959; Щелкунов С.И., 1959).

К настоящему времени в связи с развитием методов исследования и появлением целого ряда новых данных сложилось представление, что местом локализации полипотентной мезенхимной клетки, дающей начало клеткам того или иного вида соединительной ткани является стенка мельчайших сосудов как некая камбиальная зона (Chung Е., Enzinger F., 1973; Enzinger F., Harvey D., 1975; Stiller D., Katekamp D., 1975; Lagace R. et al., 1979; Dale S. et al., 1982; Beranek J.T., 1990; Diaz-Flores L. et al., 1991; D'Amore P.A„ 1992; Sliepro D., Morel N.M., 1993; Decker B. et al., 1995; Jones A,R. et al., 1995). Если допустить, что это верно, то открытым остается вопрос, что это за клетка? Имеющиеся данные весьма противоречивы и не дают четкого ответа на этот вопрос.

Фибробласт является главным элементом соединительной ткани, поэтому вполне понятно пристальное внимание ученых к вопросу о

происхождении фибробласта. Более того, на наш взгляд, этот вопрос является центральным в решении проблемы гистогенеза соединительной ткани. До настоящего времени нет единой точки зрения на этот счет. Все существующие теории сводятся к двум противоположным мнениям: 1 -фибробласты имеют "центральное" или гематогенное происхождение ( Хрущев Н.Г., 1969; Allgower M., Hulliger L., 1960; Ross R., Benditt E, 1961; Shapiro F. et al., 1993) и 2 - источник фибробластов - местные клетки ( Максимов A.A., 1918; Рубашкин В.Я., 1933; Щелкунов С.И., 1959; Фриденштейн А.Я., 1974; Данилов Р.К. и др., 1994; Шехтер А.Б., Серов В.В., 1995; Mac Donald, 1959; Grillo Н.С., 1963, 1964; Hadfield G., 1963; Dodd R. et al., 1966; Van Winkle W., 1967; Crocker D.J et al., 1970; Ross R. et al., 1970; Weber К., Braun -Falco О., 1973; Van Furth R.V., 1976; Leblond C.P., Laurie G.W., 1986; Alvarez O.M., 1987; Bouissou H. et al., 1988; Beranek J .T., 1988,1989, 1990, 1991; Beranek J.T. et al., 1985, 1986, 1990; Rogers J.J.et al., 1995).

Высказанные гипотезы о происхождении фибробласта основывались, главным образом, на изучении гистогенеза грануляционной ткани, т.е. в условиях репаративной регенерации соединительной ткани, когда функциональная и пролиферативная активности клеток и, в частности, фибробласта достигают максимума или стремятся к нему. Однако изучение гистогенеза соединительной ткани, на наш взгляд, правильнее было бы начать с выявления нормальных тканевых соотношений в ней. Образцом для такого исследования может служить дерма кожи человека, не страдающего кожными заболеваниями.

В нормальной соединительной ткани физиологическая регенерация выражена довольно слабо, это постоянно текущий, медленный процесс, при котором пролиферация фибробласта - событие редкое, поэтому исследовать ее довольно трудно. Однако при определенных воздействиях на ткань (например, при ее растяжении), а также при некоторых патологических состояниях (например, заживление раны, при медленном опухолевом росте) функциональная и пролиферативная активности клеток усиливаются, сохраняя при этом основные черты своего физиологического прототипа. Изучая такую патологию ткани, мы, вместе с тем, изучаем ее физиологию.

Так, И.П.Павлов (1951) говорил о том, что патологические состояния, сопровождаясь интенсификацией физиологических процессов, тем самым, способствуют более четкой выраженности основных закономерностей последних: "Я, физиолог, могу познакомиться с ними только во время болезни, иначе я не вижу их работы". И.В.Давыдовский (1969) писал: " ... только в патологии и клинике можно познать весь диапазон физиологических функций организма".

Для более глубокого понимания закономерностей новообразовательных процессов в соединительной ткани полезным и необходимым является не только изучение их в различных условиях (в норме и при некоторых патологических состояниях), но также исследование их в различных видах соединительной ткани.

Окончательно не решен вопрос об источнике как физиологического обновления, так и репаративной регенерации кости.

Остается неясным гистогенез опухолей мягких тканей. Это объясняется большими трудностями, с которыми часто сталкивается исследователь при попытке определить, какие клетки дали начало развитию той или иной опухоли, т.е. источник ее происхождения. Это наложило отпечаток и на современную классификацию опухолей, основным принципом которой до сих пор остается принцип гистологический, т.е. основанный на внешних, морфологических признаках, • а не гистогенетический. С развитием электронной микроскопии и гистохимии, позволяющих провести тончайшие морфологические исследования, был сделан новый "виток" в развитии наших знаний, но, в основном, о морфологии многих опухолей. Представления же о гистогенезе мало продвинулись вперед и остаются на уровне традиционных.

Цель исследования. Определить источник происхождения клеток некоторых видов соединительной ткани в условиях физиологической и репаративной регенерации, а также некоторых опухолей мягких тканей.

Задачи исследования. Изучить роль клеток стенки микрососудов:

1) в соединительнотканной основе кожи человека при ее растяжении;

2) в процессе репаративной регенерации кожи при заживлении ран мягких тканей у человека и экспериментальных животных (крыс);

3) в процессе костеобразования при дистракционном остеосинтезе;

4) при развитии некоторых опухолей мягких тканей;

Новизна научных исследований. Показано, что в условиях физиологической и репаративной регенерации нормальной соединительной ткани, а также в некоторых медленно растущих опухолях мягких тканей наибольшей биосинтетической активностью, т.е. способностью синтезировать РНК и ДНК, обладают клетки стенки мельчайших сосудов, а также клетки, расположенные в непосредственной близости к ним.

Обнаружен неизвестный ранее феномен трансформации микрососудов в соединительнотканной основе нормальной кожи человека, при ее растяжении, а также в грануляционной ткани человека и экспериментальных животных. Описанный феномен представляет собой механизм, лежащий в основе как физиологической, так и репаративной регенерации кожи и состоящий в том, что микрососуд является источником образования новых клеточных элементов ткани.

Полученные результаты с большой степенью уверенности позволяют утверждать, что стенка микрососудов содержит мезенхимные клетки, которые являются источником физиологического обновления нормальной соединительной ткани, репаративной регенерации различных ее видов, а также ее опухолевого роста. Следовательно, сосуды являются не только транспортно-питающей, но и центральной генерирующей структурой соединительной ткани.

Анализ установленных фактов дает нам возможность предположить, что роль мезенхимной полипотентной клетки, дающей в силу пока неизвестных причин в одном случае начало фибробласту, в другом -адипоциту, а в третьем - остеобласту и т.д., скорее всего, принадлежит перициту.

Выполненное исследование, основным методом которого была электронно-микроскопическая радиоавтография - современный метод структурно-функционального анализа, позволяющий сопоставить структуру клетки с ее функцией, является оригинальным.

Практическая значимость работы. Наши данные представляют собой научную информацию, которая может быть использована в учебном

процессе в курсе общей и частной гистологии на биологических и медицинских факультетах высших учебных заведений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Клетки стенки микрососудов и их ближайшее клеточное окружение обладают наибольшей метаболической и пролиферативной активностью, проявляющейся в интенсивном синтезе нуклеиновых кислот - РНК и ДНК.

2. В процессе физиологической и репаративной регенерации соединительной ткани, а также при медленном опухолевом росте некоторых из ее разновидностей наряду с ростом и образованием микрососудов происходит трансформация их стенки, заключающаяся не только в их распаде вследствие прогрессирующих дистрофических изменений, но также в образовании новых, сохраняющих жизнеспособность свободно лежащих клеточных элементов ткани.

3. Микрососуд в соединительной тКани является структурно-функциональной единицей, обеспечивающей физиологическую и репаративную регенерацию ткани.

4. Стенка микрососуда является камбиальной зоной, содержащей полипотентные мезенхимные клетки, которые в зависимости от обстоятельств могут дифференцироваться в различных направлениях.

5. Предполагается, что роль полипотентной мезенхимной клетки принадлежит перициту.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены на научной конференции отдела патологической анатомии и на заседании Ученого совета Института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН, на совместном заседании отдела морфологии и электронной микроскопии MJ1K РГМУ и кафедр нормальной анатомии и гистологии лечебного факультета РГМУ, а также - на 14 Международном конгрессе по раку (Будапешт, 1986), Международном симпозиуме "Автоматизированные процедуры в лабораториях" (Москва, 1989), LX сессии Общего собрания АМН СССР (Ленинград, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ в центральных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 51 иллюстрацию и 1 таблицу. Список литературы включаётЧ^абот отечественных й^З^от иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При изучении закономерностей физиологической и репаративной регенерации соединительной ткани исследовали нормальную и растянутую кожу человека, грануляционную ткань человека и экспериментальных животных (крыс), костный регенерат у больных с открытыми переломами длинных трубчатых костей. Опухоли мягких тканей изучали на примерах десмоидной фибромы и липом (не увеличивающаяся липома и медленно растущая липома Маделунга).

Для изучения нормальной кожи человека исследовали кусочки кожи величиной 2-3 см, взятые от 6 больных в возрасте от 7 до 39 лет, оперированных по поводу врожденных пороков сердца или патологии органов брюшной полости, т.е. с заболеваниями, не сопровождающимися повреждениями кожи.

Растянутая кожа. Метод дозированного растяжения тканей, широко применяемый в последнее время в пластической и восстановительной хирургии, осуществляется различными способами в зависимости от цели растяжения. Растяжение кожи с помощью подшивания под нее тканевого расширителя (экспандера) используется с целью получения дополнительного лоскута кожи для хирургического лечения послеожоговых деформаций, дефектов мягких тканей, контрактур и облысений (Мороз В.Ю. и др., 1989, 1990). Для того, чтобы закрыть большой кожный дефект, например, обширную рану, в Институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН с 1988 г. стали применять метод растяжения кожи с помощью спиц Киршнера (Амирасланов Ю.А. и др., 1993). Этот метод заключается в том, что вдоль раны с двух сторон на расстоянии 1,5-2 см от края субдермально путем вкола проводят спицы. С помощью лигатур на

спицах постепенно и равномерно подтягивают края раны до их соприкосновения.

Изучение регенерации соединительной ткани в условиях растяжения кожи, осуществляемое с помощью экспандера, было проведено на биоптатах, полученных от 15 больных в возрасте от 10 до 54 лет. Растяжению подвергалась кожа шеи, лопатки, спины и головы. Процесс растяжения длился 1-1,5 мес., кожу волосистой части головы растягивали в течение 2-2,5 мес. Иногда кожа головы подвергалась повторному растяжению через 8-9 мес. Биоптаты нормальной кожи служили контролем для исследования растянутой кожи. Изучали отдельно глубокий и поверхностный слои дермы.

Кожу, которую растягивали с помощью спиц Киршнера, исследовали в процессе лечения у 4 больных. Площадь ран у этих больных составляла более 200 см2. Материал брали через различные, как правило, небольшие промежутки времени (7-19 дней) вплоть до закрытия раневого дефекта кожи. Контролем служила кожа тех же пациентов до растяжения.

Изучение раневого процесса проводили как на клиническом, так и экспериментальном материале. Для изучения грануляционной ткани человека были использованы биоптаты от 5 больных в возрасте от 33 до 46 лет с ранами мягких тканей конечностей, полученными в результате травмы.

В эксперименте рану наносили белым беспородным крысам как самцам, так и самкам, весом 180-220 г, иссекая под эфирным наркозом на спине лоскут кожи с подлежащей соединительной тканью площадью 3x4 (см2). Рану оставляли открытой. Исследовали ткань раны после забоя животных на 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60 и 90 сутки заживления. Всего в эксперименте было использовано-58 животных.

Было проведено изучение процесса костеобразования при дистракционном остеосинтезе у больных с открытыми переломами длинных трубчатых костей и обширными повреждениями мягких тканей.

В 1967 г. Г.А.Илизаровым был предложен метод дозированного компрессионно-дистракционного остеосинтеза, который получил широкое распространение. Метод основан на соединении (компрессии) обломков с последующим постепенным разъединением прилегающих друг к другу

концов остеотомированной кости, в результате чего образующийся диастаз выполняется регенератом, в дальнейшем преобразующимся в костную ткань.

Формирование регенерата прослежено у 3 мужчин, у которых в процессе дистракции были ликвидированы дефекты большеберцовой кости длиной от 5 до 19 см. Биопсию регенерата, как правило, производили дважды: сразу же после окончания дистракции с целью контроля за ходом костеобразования и установления сроков снятия дистракционного аппарата и в момент снятия внешней фиксации, когда рентгенологически определялась картина полноценного костного регенерата (через 1,5-2 года после окончания дистракции).

Десмоидные фибромы, удаленные в пределах здоровых тканей, исследовали у 3 мужчин и 1 женщины.

При изучении липом в качестве контроля исследовали неизмененную подкожную клетчатку из области хирургического разреза у 4 мужчин в возрасте 31-59 лет, оперированных по поводу язвенной болезни желудка (2 случая), рака легкого и десмоида.

Были исследованы годами не увеличивающиеся липомы, удаленные у 2 женщин в возрасте соответственно 35 и 54 лет. Медленно растущую липому (так называемая липома Маделунга), удаленную из области шеи, исследовали у 3 мужчин в возрасте 40-54 лет.

Для гистологического исследования взятый материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизон, толуидиновым синим. Окрашивание на эластические волокна производили по Вейгерту. При изучении липом жир окрашивали на замороженных срезах шарлахом красным. Костную ткань после фиксации в формалине перед заливкой в парафин декальцинировали. Для выявления фосфорнокислого кальция пользовались методом Косса (Меркулов Г.А., 1969).

Основным методом нашего исследования была электронно-микроскопическая радиоавтография. Этот метод является одним из самых информативных методов структурно-функционального анализа. Главное его достоинство заключается в том, что он, по существу, представляет собой сочетание двух таких важнейших методов исследования как биохимический

и морфологический. Как биохимический, этот метод дает возможность обнаружить наличие или отсутствие биосинтеза того или иного вещества, интенсивность этого биосинтеза. С точки зрения морфологии электронно-микроскопичская радиоавтография отвечает на вопросы, какие клетки синтезируют данное вещество, где происходит биосинтез и какие органеллы в нем участвуют, как транспортируется синтезируемое вещество и др. А как комплексный метод структурно-функционального анализа, электронно-микроскопическая радиоавтография позволяет сопоставить состояние ультраструктур клетки с уровнем биосинтетических процессов в ней, что дает возможность судить о функциональном состоянии клетки в момент исследования.

Подробно техника и особенности метода электронно-микроскопической радиоавтографии изложены в двух монографиях Д.С.Саркисова, А.А.Пальцына, Б.В.Втюрина: "Приспособительная перестройка биоритмов" (1975) и "Электронно-микроскопическая радиоавтография клетки" (1980).

В работе были использованы два низкомолекулярных радиоактивных предшественника нуклеиновых кислот: предшественник ДНК - 3Н-тимидин и предшественник РНК - 3Н-уридин. Синтез РНК, которая является матрицей для синтеза белка, отражает жизнеспособность клетки. Синтез ДНК, в которой закодирована наследственность клетки, происходит непосредственно перед ее делением и отражает способность клетки к пролиферации.

Для электронно-радиоавтографического исследования вырезали из взятой ткани кусочки размером 1 мм3, которые инкубировали при температуре 37-38 °С в среде 199 или среде "Игла". Среда содержала 20 мкКи/мл 3Н-тимидина (удельная активность 21,6 Ки/мМ) или 100 мкКи/мл ЗН-уридина (удельная активность 26,0 Кл/мМ). Инкубация продолжалась 1,5 часа. После инкубации материал отмывали от невключившегося радиоактивного предшественника сначала холодной средой (температура +4 °С), а затем несколько раз холодным фосфатным буфером (рН=7,4). Дааее материал фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида и 1% раствором четырехокиси осмия. В начале нашей работы материал заливали в

эпон, затем перешли на эпон-аралдитовую смолу, а в последнее время - на аралдит, поскольку мы пришли к выводу, что хорошая резка нашего довольно плотного соединительнотканного материала обеспечивается при заливке в сравнительно мягкую смолу.

Полутонкие срезы помещали на стекла и покрывали фотоэмульсией типа "М". Срок экспонирования стекол - 3 суток. Для проявления стекол с полутонкими срезами, а также в дальнейшем - бленд с тонкими срезами использовали проявитель Д-19. После проявления полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и просматривали в световом микроскопе. По результатам этого анализа на блоках, с которых снимали полутонкие срезы, вырезали пирамидки для ультратомии. Ультратонкие срезы помещали на бленды, которые покрывали фотоэмульсией "М" методом петли. Эти бленды экспонировали в темноте при температуре +4°С в течение 30-35 дней. Проявленные срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по E.S.Reynolds (1963). Полученные таким образом электронно-микроскопические радиоавтографы изучали в электронном микроскопе JEM-100B.

Использование в электронно-микроскопической радиоавтографии бленд, а не сеток, является одной из особенностей метода. Это связано с тем, что иногда включение радиоактивного предшественника, например, такого как 3Н-тимидин, отражающего пролиферативную активность клетки, является событием довольно редким, и обнаружение одной меченой клетки в срезе - большая удача. Поэтому использование сеток с их переплетами, которые перекрывают большую часть среза, совершенно недопустимо при таких исследованиях. Кроме того, помещение тонких срезов на бленды дает возможность провести изучение исследуемого материала на серии срезов, что позволяет, во-первых, отдифференцировать артефакты, а, во-вторых, проследить за судьбой какого-то заинтересовавшего явления на довольно большой ленточке срезов.

Так как полутонкий срез, сделанный с исследуемого кусочка жировой ткани, содержит мало интерстициальных клеток и ядер адипоцитов, для определения среди них меченых клеток с каждого кусочка исследовали по 10-20 ступенчатых срезов. Содержание меченых клеток в стенке сосуда

подсчитывали в каждом отдельном кусочке ткани. Эти величины определяли в 3 группах: 1) нормальная жировая клетчатка; 2) неувеличивающаяся липома; 3) липома Маделунга. Значимость различий этих групп определяли по критерию Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В соединительнотканной основе (дерме) нормальной кожи человека сосуды и фибробласты располагались довольно редко среди массивных пучков коллагеновых волокон. Фибробласты проявляли различную степень функциональной активности - от клеток, интенсивно включающих в ядра 3Н-уридин, т.е. синтезирующих РНК, до разрушающихся - с пикнотическим ядром и вакуолинизированной цитоплазмой. Нередко синтез РНК наблюдали в клетках стенки микрососудов - эндотелиоцитах и перицитах. Более редкой находкой было обнаружение эндотелиоцита или перицита, включающего 3Н-тимидин, т.е. синтезирующего ДНК и проявляющего пролиферативную активность. Других синтезирующих ДНК клеток в дерме интактной кожи не наблюдали. О том, что изучаемые микрососуды являются кровеносными, мы судили по наличию в их просветах эритроцитов.

Наряду с мелкими сосудами дермы, имеющими на поперечном срезе типичное строение, были обнаружены при просмотре серий срезов" сосуды, стенки которых были изменены в той или иной степени. Так, встречали сосуды, у которых была разрушена часть стенки, у других - почти полностью отсутствовала одна из стенок и, наконец, стенки некоторых сосудов были столь сильно изменены, что слабо различались - от них сохранялся лишь клеточный детрит, и только скопление эритроцитов свидетельствовало о том, что ранее это был сосуд. Вместе с таким постепенным распадом стенок микрососудов наблюдали и другой тип их структурных изменений. Он заключался в том, что эндотелиальная стенка истончалась, связь между составляющими ее клетками утрачивалась, и они оказывались свободно лежащими в ткани. Важно отметить, что клетки, образующие стенку таких сосудов, имели различную функциональную активность: одни клетки сохраняли не только свою структуру, но и

функцию, что проявлялось включением в их ядра 3Н-уридина (синтез РНК), другие же - находились в деструктивном состоянии. Можно предположить дальнейшую судьбу этих клеток после окончательного распада сосуда: если первые сохранятся и могут функционировать в качестве свободной клеточной единицы ткани, то вторые - разрушатся и будут лизированы. Просвет таких распавшихся сосудов заполняется пучками тонковолокнистой ткани.

Таким образом, при изучении дермы нормальной кожи человека нами впервые был обнаружен неизвестный ранее феномен трансформации мелких сосудов кожи. Он заключается в том, что микрососуды претерпевают своеобразные структурные изменения, в результате которых сосуды распадаются на фрагменты или элементы, при этом некоторые из них сохраняют свою биосинтетическую активность. Мы предполагаем, что последние могут дать начало новым клеточным элементам ткани, а именно - фибробластам.

Следовательно, структурные преобразования стенки мелких сосудов кожи представляют собой одно из проявлений физиологической регенерации соединительнотканной основы кожи.

О физиологической регенерации соединительнотканной основы кожи, как уже было сказано выше, известно мало. Считают, что ее обеспечивают фибробласты, продуцирующие все компоненты соединительнотканного матрикса (Шехтер А.Б., 1995). Но много неясного остается в отношении самого фибробласта и, в первую очередь, вопрос о его происхождении.

Как показало наше исследование, фибробласты кожи, проявляющие функциональную активность, т.е. синтезирующие РНК, встречались не часто. Вероятно, это еще раз подтверждает тот факт, что фибробласты кожи считают незрелыми, неактивными формами, отличающимися от фибробластов заживающей раны, и часто их называют фиброцитами (Alvarez О.М., 1987). Однако полагают, что последние в большинстве случаев могут превращаться в фибробласты.

С другой стороны, мы наблюдали, что клетки стенки микрососудов -эндотелиоциты и перициты были, как правило, функционально активны, а, главное, только в них можно было обнаружить синтез ДНК. Других

синтезирующих ДНК клеток в дерме кожи мы не обнаружили. Следовательно, можно предположить, что начало фибробластам могут дать клетки, образовавшиеся в результате структурных преобразовании мелких сосудов дермы или вследствие отхождения от них каких-то клеток, например, перицитов.

Перициты рассматриваются многими учеными в качестве предшественников фибробластов (Максимов A.A., 1918; Рубашкин В.Я., 1933; Абрикосов А.И., 1942; Щелкунов С.И., 1959; Данилов Р.К. и др., 1994; Шехтер А.Б., Серов В.В., 1995; Mac Donald, 1959; Grillo Н.С., Potsaid M.S., 1961; Van Winkle W., 1967; Weber K., Braun-Falco O., 1973; Leblond C.P., Laurie G.W., 1986; Alvarez O.M., 1987).

Другими словами, мы предполагаем, что мелкие сосуды дермы кожи, непрерывно "погибающие" и образующиеся вновь, и являются основным источником, индуктором физиологической* регенерации клеток и волокнистых структур соединительнотканной основы кожи.

Исследование растянутой с помощью экспандера и растягиваемой с помощью спиц Киршнера кожи проводили в сравнении с нормальной кожей. Основное внимание было сосредоточено на вопросе, что происходит с мелкими сосудами дермы при растяжении кожи.

Растяжение кожи с помощью экспандера. Макроскопически биоптаты растянутой и нормальной кожи отличались по толщине. Нормальная кожа была приблизительно в 2-4 раза толще растянутой. Мы не отметили разницы в толщине эпидермиса, тоньше при растяжении становилась дерма, главным образом ее поверхностный слой, прилежащий к эпидермису.

По данным K.A.Pasyk и соавторов (1987, 1988) при растяжении кожи человека с помощью экспандера от 5 нед. до 5 мес. наблюдается значительное утолщение эпидермиса, а также значительное утоньшение дермы.

Гистологическое исследование биоптатов нормальной и растянутой кожи не выявило существенных различий между ними. Была заметна оживленная клеточная реакция в виде скопления макрофагов, лимфоидных клеток и фибробластов вокруг некоторых сосудов в дерме растянутой кожи. Но тоже самое можно было наблюдать и в некоторых препаратах

нормальной кожи. В растянутой коже наблюдали истончение слоя дермы под самым эпидермисом. Коллагеновые волокна здесь были представлены в виде тонкой сеточки. Не было заметно разницы в строении эластических волокон в нормальной и растянутой коже.

Сосуды, клетки которых хорошо метятся 3Н-уридином и благодаря этому четко видны на полутонких срезах, разбросаны по всей дерме, однако, поверхностный слой более богат ими, особенно здесь много мелких сосудов типа капилляров и прекапилляров. Встречающиеся сосуды представляли собой как бы "оазисы жизни" среди коллагеновых масс - вокруг живого сосуда, клетки которого хорошо включают 3Н-уридин, концентрически располагались расходящиеся, меченные 3Н-уридином клетки. Метка отражала синтез РНК этими клетками, т.е. их жизнеспособность.

Электронно-радиоавтографическое исследование не выявило каких-либо структурных или функциональных различий между сосудами и клетками растянутой и нормальной кожи. Клетки сосудистой стенки -эндотелиоциты и перициты активно включали 3Н-уридин Функциональную активность проявляли также и другие клетки ткани, в частности, фибробласты. Встречали тучные клетки, способность которых к включению метки (3Н-уридин) определялась их функциональным состоянием: метка присутствовала в сохранной, полной гранул, клетке или в клетке на ранних стадиях ее дегрануляции и отсутствовала при сильно выраженной дегрануляции клетки.

Иногда обычное строение сосуда было нарушено, стенка с измененными, деструктивными эндотелиоцитами была истончена или разрушена. Метка в таком сосуде в зависимости от степени его разрушения могла присутствовать в сохранившихся клетках или отсутствовать.

В растянутой коже, так же как и в нормальной, обнаруживали "расходящиеся" сосуды, т.е. такие, в которых контакты между клетками стенки были разрушены. Клетки такого сосуда уже почти не были связаны друг с другом, однако, располагались они довольно близко и сохраняли общий контур сосуда. Степень деструкции каждой клетки была различна: от клеток, сохраняющих не только структуру, но и функцию (метка 3Н-уридина в ядре), до клеток, от которых сохранились лишь фрагменты.

Растянутая кожа волосистой части головы отличалась от растянутой кожи других участков тела человека, что обусловлено различиями между этими видами кожи в норме.

Гистологический анализ препаратов растянутой кожи волосистой части головы показал, что она не претерпевает существенных изменений по сравнению с интактной кожей головы. Толщина эпидермиса, как и толщина всей кожи, определяемая индивидуальными особенностями, изменялась в небольших пределах у каждого больного. Что касается дермы, то при растяжении она становилась тоньше, а точнее, пучки коллагеновых волокон в ней были более тонкие и нежные по сравнению с дермой интактной кожи. Она представляла собой один слой с большим количеством разбросанных в ней сосудов. Наличие весьма развитого микроциркуляторного русла в коже волосистой части головы делало затруднительным суждение о динамике его изменений в процессе растяжения, однако, можно с уверенностью сказать, что в растянутой коже увеличивалось количество крупных сосудов и очень "оживлялась" клеточная реакция вокруг них: сосуды, как муфтой, в несколько слоев были окружены скоплениями макрофагов, лимфоидных клеток и фибробластов.

Светомикроскопическая картина кожи головы после повторного растяжения через 8-9 месяцев несколько отличалась от описанной выше. В эпидермисе исчезала складчатость. Дерма растянутой кожи по сравнению с дермой после первого этапа растяжения утолщалась, однако, оставалась тоньше интактной. Мы полагаем, что утолщение дермы происходило за счет накопления коллагена, синтезированного фибробластами, большое количество которых образовалось во время первого этапа растяжения. Здесь также было много сосудов, большая часть из которых имела довольно крупный диаметр. Сосуды отчетливо выделялись среди массы коллагеновых волокон, образующих многочисленные пучки.

При более детхтьном морфологическом исследовании с использованием полутонких срезов толщи ной 1-2 мкм также не было выявлено каких-либо отличий растянутой кожи головы от нормальной. Эпидермис имел типичное строение и был образован большим количеством мелких однородных эпителиальных клеток. Дерму растянутой кожи нельзя

бьшо отличить от нормальной. Встречающиеся здесь сосуды нередко были довольно крупными, иногда - тонкостенными, а иногда их окружала клеточная "муфта", в которой были видны коллагеновые волокна. Вблизи сосудов часто можно бьшо видеть тучные клетки, а иногда - и плазматические. Фибробласты встречали редко. Обращали на себя внимание в дерме растянутой кожи скопления недифференцированных клеток. Нередко эти клетки окружали сосуды.

При электронно-радиоавтографическом исследовании дермы растянутой кожи фибробласты, которые находили, чаще всего, были довольно зрелыми: имели крупное ядро, иногда с ядрышком, и цитоплазму, в которой канальцы гранулярной цитоплазматической сети были, как правило, расширены. Как бьшо показано нами ранее, такое строение фибробластов свидетельствует о том, что их коллагенопродуцирующая функция в основном завершена и они находятся в стадии секреции коллагена во внеклеточное пространство. Это подтверждается скоплением большого количества пучков коллагеновых фибрилл вокруг фибробластов. Кроме того, встречали фибробласты, от которых отшнуровывалась часть цитоплазмы с расширенными канальцами гранулярной цитоплазматической сети, заполненными, как следует полагать, коллагеном.

Сосуды, обнаруженные в исследованной ткани, имели в основном типичное строение. Как правило, клетки стенки сосудов проявляли заметную биосинтетическую активность: в их ядрах часто можно было наблюдать синтез РНК, а также синтез ДНК. Наряду с типичными, встречали сосуды с деструктивными изменениями стенки. Это выражалось в истончении стенки, местами с разрывами, "размытости" или отсутствии какой-то ее части и, наконец, отхождении клеток стенки друг от друга и их своеобразном расположении среди других структур ткани. Часто стаз эритроцитов наблюдали именно в таких сосудах.

В дерме кожи после повторного растяжения не было обнаружено каких-либо отличий от дермы кожи, подвергшейся только однократному растяжению. Встречавшиеся сосуды имели в основном типичное строение и были хорошо развиты. Фибробласты в большинстве своем также имели хорошо развитую структуру.

Основная часть соединительнотканной капсулы, образующемся вокруг подшиваемого под растягиваемую кожу экспандера, была представлена молодой растущей тканью. Электронно-радиоавтографическое исследование показало присутствие в ней множества мелких и довольно крупных сосудов, клетки которых - эндотелиоциты и перициты хорошо метились не только 3Н-уридином, но нередко включали и 3Н-тимиднн. Выраженную функциональную активность обнаруживали фибробласты, присутствующие в ткани в большом количестве и в разных формах - от молодых до зрелых, некоторые из них имели признаки разрушения. О зрелости и функциональной активности фибробластов свидетельствовал не только синтез РНК в их ядрах, но и морфология клетки - это, прежде всего, хорошо развитая гранулярная цитоплазматическая сеть, многочисленные канальцы которой заполняли подчас всю цитоплазму. Окружающие фибробласты коллагеновые фибриллы были представлены в довольно большом количестве. Некоторые из фибробластов обнаруживали способность к пролиферации, т.е. включали 3Н-тимидин. Кроме фибробластов, в ткани капсулы встречали макрофаги, лейкоциты и тучные клетки. Многие из этих клеток синтезировали РНК. Нередко можно было видеть, что клетки располагались около сосудов, как вокруг центра, т.е. сосуд с окружающими его клетками образовывал функционально активный клеточный комплекс.

Растяжение кожи с помощью спиц Киршнера. Анализ гистолопгческих препаратов показал, что в растягиваемой коже эпидермис и его толщина практически не претерпевают изменений, тогда как дерма становится несколько тоньше по сравнению с дермой нормальной кожи.

Уже через 1 нед. после растяжения в дерме наблюдали увеличение количества сосудов. Это явление отмечали и спустя I мес. после начала растяжения кожи. Вокруг сосудов наблюдалась оживленная клеточная реакция в виде скопления различных клеток. Иногда в дерме растягиваемой кожи наблюдали очаги воспаления в виде скопления лейкоцитов. Обращало на себя внимание большое количество фибробластов не только вокруг сосудов, но и в строме среди пучков коллагеновых волокон. Как и в

интактной коже, коллагеновые волокна были представлены в основном в виде крупных пучков.

При более детальном морфологическом исследовании (полутонкие срезы) отметили, что в дерме интактной и растягиваемой кожи сосуды с расположенными вокруг них клетками находятся как бы в своеобразных "окнах" среди массы коллагеновых волокон.

Электронно-микроскопическая радиоавтография растягиваемой кожи показала, что клетки стенки сосудов (эндотелиоциты и перициты) хорошо включали 3Н-уридин, а некоторые из них - и 3Н-тимидин. На ранних сроках растяжения (9 дней) в дерме можно было видеть рядом с сосудом малодифференцированные клетки: их ядро занимало большую часть клетки, а структуры цитоплазмы были трудно различимы. Можно предположить, что это какие-то камбиальные клетки, обеспечивающие ткань новыми клеточными элементами. Иногда сосуды были достаточно сильно сужены и извиты, часто их обрамляли пучки коллагеновых фибрилл. Наряду с сосудами типичного строения, встречались сосуды с деструктивными изменениями стенки.

В дерме растягиваемой кожи наблюдали различные по зрелости формы фибробластов. Для ранних сроков растяжения были характерны молодые формы с высокой синтетической активностью в ядрах этих клеток обнаруживали синтез РНК. Гранулярная цитоплазматическая сеть (ГЦС) таких фибробластов имела узкие канальцы. Зрелые фибробласты с расширенными канальцами ГЦС часто встречались на протяжении всего процесса растяжения. Встречали фибробласты с выраженными деструктивными изменениями.

Таким образом, основной вывод, который мы делаем на основании результатов исследования растянутой кожи, заключается в том, что существенных, принципиальных различий между нормальной и растянутой кожей не обнаружено. Наше изучение показало, что эти различия носят главным образом количественный характер и состоят в следующем:

- растянутая кожа была тоньше нормальной, причем, толщина эпидермиса практически не изменялась, тоньше становилась дерма, главным образом, ее поверхностный слой, подлежащий под эпидермисом.

- микрососуды и клетки, в частности, фибробласты, в дерме растянутой кожи не имеют каких-то структурных и функциональных особенностей, однако, их количество при растяжении увеличивается.

Коллагеновые фибриллы, несмотря на нередко наблюдавшееся их перекручивание в пучках, разрывы, а иногда и хаотичное расположение, сохраняли правильную поперечную исчерченность и свой обычный диаметр.

Таким образом, основное значение растяжения для ткани заключается в том, что оно стимулирует пролиферативные процессы в ней, что выражается в росте сосудов дермы (увеличивается их количество, в том числе - крупных сосудов) и возрастании числа клеточных элементов, в первую очередь, фибробластов, окружающих сосуды.

Полученные нами результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что при растяжении кожи возрастает число активных фибробластов и усиливается кровоснабжение ткани (Austad E.D. et al., 1982; Pasyk K.A. et al., 1982, 1987; Hong Ch. et al., 1987).

Мы не ставили перед собой задачу изучения механизмов растяжения, однако, вопрос, что же лежит в основе растяжения, что стимулирует рост ткани - увеличение количества сосудов, клеток и межклеточного вещества, встает неизбежно.

Можно предположить следующее. Растяжение кожи, несмотря на то, что оно осуществляется дозировано, является травмой для тканей, хотя и "мягкой". В первую очередь, растяжение действует на коллагеновые и эластические волокна, деформация и разрушение которых являются сигналом, передающимся по механизму обратной связи на фибробласты. Последние должны усилить свою работу по выработке межклеточного вещества, главным образом, коллагена и эластина. Но функция фибробластов может усиливаться как за счет усиления функциональной активности одной клетки, так и за счет увеличения количества работающих клеток, т.е. должна увеличиваться как функциональная, так и пролиферативная активность фибробластов. Эти события нельзя представить без участия микрососудов. Во-первых, они обеспечивают доставку питания работающим структурам и обмен веществ в них. Во-вторых, мы предполагаем, что количество фибробластов может увеличиться не только за

счет возрастания их пролиферативной активности, но за счет каких-то клеток-предшественников. На эту роль мы выдвигаем клетки стенки микрососудов. Почему?

Изучение растянутой кожи показало, что клетки стенки сосудов и их ближайшего окружения во всех исследованных образцах проявляли значительную биосинтетическую активность: в них отмечен как синтез РНК, так и синтез ДНК. Это свидетельствует о функциональной активности и росте сосудов. Наряду с сосудами типичного строения, наблюдали "распадающиеся" сосуды, описанные нами выше. Причем, некоторые клетки, образующие стенку таких сосудов, проявляли не только метаболическую, но и пролиферативную активность. Синтез РНК в такой клетке может свидетельствовать об ее дифференцировке и превращении в новый активный клеточный элемент соединительной ткани. Синтез ДНК, в большинстве случаев, отражает способность клетки к пролиферации и образованию дочерних клеток. Можно предположить, что после дифференцировки эти клетки могут превратиться, например, в фибробласты.

Таким образом, изучение растянутой кожи позволяет предположить, что источником образования новых клеточных элементов ткани являются клетки стенки микрососудов.

Что касается репаративной регенерации кожи, то наилучшей моделью ее изучения является процесс заживления раны.

Изучение грануляционной ткани в процессе ее созревания у человека и экспериментальных животных показало, что на всех исследованных сроках в этой ткани, отличающейся содержанием большого количества мелких сосудов, особенно на ранних сроках, клетки стенки сосудов -эндотелиоциты и перициты среди множества других клеточных элементов проявляли всегда высокую функциональную и пролиферативную активность. Наряду с такими типичными сосудами грануляционной ткани, мы постоянно находили сосуды, стенка которых была подвержена структурным изменениям, выраженным в различной степени: от почти полного разрушения составляющих ее клеток до перестройки с постепенным расхождением клеток, замещением просвета сосуда нежноволокнистой

соединительной тканью и образованием новых свободных клеточных элементов ткани, нередко с сохраненной функциональной, но, самое главное, и пролиферативной активностью.

Следовательно, феномен трансформации мелких сосудов, обнаруженный нами в дерме нормальной кожи человека, а также при ее растяжении, наблюдается и в грануляционной ткани человека и экспериментальных животных.

Что вытекает из этого наблюдения? Во-первых, что оно отражает важный механизм, лежащий в основе процесса, который принято называть "созревание грануляционной ткани". Давно и хорошо известно, что этот процесс заключается в прогрессирующем уменьшении числа сосудов и клеток и нарастании массы коллагеновых волокон, а заканчивается формированием рубца. Но как это происходит, каким образом исчезают сосуды и как появляются фибробласты - оставалось неясным. Про сосуды говорили, что они "запустевают", но что это означает? Описанный феномен трансформации мелких сосудов в значительной мере способствует решению этого важного вопроса. С помощью электронной микроскопии мы видим, что сосуды исчезают, не только окончательно разрушаясь, но также распадаясь на отдельные фрагменты и клетки. Поэтому правильно ли называть последнее "распадом", "разрушением" и т.п.? Мы полагаем, что это более сложное биологическое явление, заключающееся в том, что клетки, ранее составлявшие стенку сосуда и сохранившие жизнеспособность, о чем свидетельствуют данные радиоавтографии, не гибнут, а становятся свободными клеточными элементами, возможно, способными превратиться в фибробласты. Предшественниками фибробластов могут быть перициты, о чем мы говорили выше. В нашем исследовании мы наблюдали включение ЗН-тимшшна перицитами, что указывает на их способность к пролиферации и образованию новых клеток и не дает оснований для отрицания возможности дифференцировки последних в фибробласты.

Существует также точка зрения, что эндотелиальные клетки могут быть источниками образования соединительнотканных клеток при заживлении раны (Вегапек .1.Т. е! а1., 1985; Вегапек .1.Т., С1еуу Л.Р., 1986; Вегапек ХТ. еХ а!., 1986).

Если наше предположение о роли клеток стенки мелких сосудов верно, то становится понятно, почему грануляционная ткань столь богата сосудами: они необходимы не только как источник питания ткани, но и как источник образования фибробластов - основных продуцентов межклеточного вещества формирующейся рубцовой ткани. Таким образом, мы предполагаем, что пополнение фибробластов в грануляционной ткани происходит местно, за счет клеток стенки сосудов. Однако нельзя исключить и другой путь образования фибробластов в грануляционной ткани - гематогенный, за счет поступления их предшественников из крови, хотя доказательств этого пока не получено.

Обобщая вышесказанное, можно сделать предположение, что сущность давно и хорошо известного уменьшения числа сосудов в процессе созревания грануляционной ткани состоит не только в их исчезновении вследствие прогрессирующих дистрофических изменений стенок (это только один из механизмов редукции капиллярной сети), но и в своеобразных перестройке и преобразовании мелких сосудов, заключающихся в постепенном разрушении стенки сосуда, как бы расхождении составляющих ее клеток и превращении их в клеточные элементы, свободно лежащие в межуточной ткани.

Таким образом, в результате проведенных исследований неизвестный ранее феномен трансформации мелких сосудов был обнаружен нами и в грануляционном ткани. То, что этот феномен был выявлен в нормальной и растянутой различными способами коже человека, а также в грануляционной ткани человека и экспериментальных животных, придало нам уверенности в том, что это не случайная находка, а отражение действительного положения вещей. Мы полагаем, что наше наблюдение вскрывает важный механизм, лежащий в основе как физиологической, так и репаративной регенерации соединительнотканной основы кожи. Он заключается в том, что мелкие сосуды основы кожи являются источником образования новых клеточных элементов ткани, а именно, фибробластов.

Роль сосудов в процессе костеобразования при дистракционном остеосинтезе. Ткань костного регенерата, взятая сразу после прекращения дистракции, была на ощупь плотно-эластическая, серовато-беловатого цвета.

Микроскопически она состояла из волокнистой соединительной ткани, представленной большим количеством микрососудов и единичными фибробластами, которые располагались среди массы тонких коллагеновых волокон, ориентированных в продольном направлении. Среди коллагеновых волокон и фибробластов встречались небольшие участки формирующейся кости. Они были представлены балками различных размеров, некоторые из них состояли из грубых коллагеновых волокон, переходящих в остеоидную и костную ткань, иногда в участке остеоидной ткани можно было наблюдать начальные признаки минерализации в виде мелких кристалликов гидрооксиапатита. Вокруг таких очагов остеогенеза было заметно большое количество остеобластов. Обнаруживались и вполне сформированные костные балочки.

В поздние сроки после прекращения дистракции, когда по рентгенологическим данным регенерат представлен уже полноценной костной тканью, гистологически наблюдали нормально сформированную костную ткань.

Наши наблюдения формирования костного регенерата в области диастаза полностью согласуются с описанием других авторов (Виноградов Т.П., Лаврищева Г.И., 1974; Илизаров Г.А., Берко В.Г., 1980; Гюльназарова C.B., Штин В.П., 1983).

Электронно-радиоавтографическое исследование регенерата на ранних стадиях формирования показало, что клетки, составляющие стенку микрососудов, а также клетки их ближайшего окружения проявляют значительную функциональную активность: интенсивно включают в свои ядра 3Н-уридин. Отмечено и включение 3Н-тимидина этими клетками, что свидетельствует об их способности к пролиферации. По мере удаления от сосуда биосинтетическая активность клеток затухает - меченные 3Н-уридином, т.е. синтезирующие РНК клетки встречаются значительно реже, а клетки, включающие 3Н-тимидин, т.е. пролиферирующие, на отдалении от сосуда вообще не встречаются.

Таким образом, наши данные показывают, что регенерат на ранних стадиях формирования представляет собой ткань с высокой функциональной активностью составляющих ее клеток.

Наблюдая большое количество капилляров в образующемся регенерате, нельзя не задаться вопросом, выполняют ли они здесь лишь трофическую функцию или они играют роль и в формировании костной ткани?

Касаясь вопроса о механизмах формирования новообразованной кости, как правило, говорят о так называемом десмальном остеогенезе, в основе которого лежит последовательная дифференцировка остеогенной клетки-предшественницы через стадию фибробластоподобной клетки и преостеобласта в остеобласт. При этом ангиогенез рассматривают как процесс, сопутствующий остеогенезу, протекающий параллельно с ним и обеспечивающий питание и рост регенерата. Таким же образом оценивается роль сосудов при преобразованиях, которым подвергается костный трансплантат (Виноградов Т.П., Лаврищева Г.И., 1974; Vrist М., 1965). В целом вопрос о соотношении остеогенеза и ангиогенеза, в частности, о том, только ли сопутствуют друг другу эти два процесса или они где-то и перекрещиваются, сливаясь в единый источник новообразования кости, является нерешенным.

Таким образом, в настоящее время многие исследователи придерживаются точки зрения, что источником как физиологического обновления кости, так и ее репаративной регенерации является недифференцированная костномозговая клетка, которая обладает остеогенными потенциями и не имеет отношения к стенке сосуда (Kassem М. et al., 1991; Caplan A.J., 1991; Shapiro F. et al., 1993; Gitelman S.E. et al., 1995).

Однако целый ряд ученых придерживаются противоположной точки зрения. Так, А.В.Румянцев (1958) и А.В.Русаков (1959) полагали, что мезенхиматозные клетки, служащие источником образования кости, расположены по ходу мелких сосудов. "Ангиогенное происхождение" остеобластов поддерживают Г.А.Оноприенко (1981), А.Хэм и Д.Кормак(1983), J.T.Beranek (1989), C.T.Brighton с соавторами (1992); A.M.Schor с соавторами (1995); A.R.Jones с соавторами (1995); В.Decker с соавторами (1995). Большинство этих исследователей роль источника

остеогенных клеток отводят мезенхимальным периваскулярным клеткам (перицитам).

В нашем исследовании обнаружение клеток, синтезирующих ДНК, в стенке сосуда или в непосредственной близости от нее, свидетельствует о том, что именно мелкие сосуды являются "очагами пролиферации" в ткани молодого регенерата. Способность к пролиферации наблюдали главным образом в перицитах. Эти результаты согласуются с приведенными выше данными литературы и позволяют рассматривать перицит в качестве мезенхимальной полипотентной клетки, способной через ряд превращений: перицит —фибробластоподобная клетка - остеобласт - участвовать в образовании костной ткани. Возможно, оно идет и иным путем, но и в этом случае пролиферативная активность клеток сосудов представляет собой одно из важных звеньев остеогенеза. Так, L.Diaz-Flores с соавторами (1992) считают перициты дополнительной популяцией в пуле остеогенных клеток, помимо уже существующих в надкостнице.

Значение мнкрососудов в развитии некоторых опухолей мягких тканей. Из большого числа опухолей соединительной ткани мы изучали опухоли волокнистой соединительной ткани (десмоидная фиброма) и жировой (липомы). Эти опухоли по разработанной в 1969 г. Международной гистологической классификации относят к опухолям мягких тканей (Смольянников A.B., 1993).

Что касается десмоидов, то к ним относят гетерогенную группу доброкачественных фиброзных опухолей, иногда достаточно агрессивных по клиническому проявлению и даже смертельно опасных (Clark S.К., Philips R.K., 1996). Многими патологами они классифицируются как фиброматозы, поскольку являются результатом пролиферации вполне дифференцированных фибробластов, которые инфильтрируют ткань. Гистологически это редкие опухоли (0,1% всех опухолей).

Все исследованные нами образцы опухоли имели волокнистое строение. Соотношение площадей, занятых клетками, с одной стороны, и пучками коллагеновых волокон и основным веществом, с другой, варьировали у разных больных и в пределах одной и той же опухоли, однако, в целом коллаген и основное вещество занимали большую часть

среза. Наиболее часто в опухоли встречались фибробласты, реже -макрофаги, адипоциты и тучные клетки. Сосуды также были не частым явлением.

Характерным в изучаемой опухоли было то, что наблюдаемые клетки образовывали скопления или группы, концентрируясь вокруг микрососуда. Таким образом, сосуды с окружающими их клетками, наблюдаемые в этой волокнистой опухоли, представляли собой как бы клеточные "оазисы" среди массы коллагеновых волокон. Особенно хорошо эти клеточные скопления выявлялись на полутонких срезах по включению 3Н-уридина. Интенсивно метились 3Н-уридином эндотелиоциты и перициты микрососудов. Фибробласты также обнаруживали синтез РНК в своих ядрах. Можно было наблюдать, что интенсивность включения радиоактивного предшественника РНК в клетки опухоли снижалась по мере их удаления от сосуда.

Электронно-радиоавтографическое исследование показало, что меченные 3Н-тимидином клетки встречались редко (1-3 на 50 срезов). Срезы для элекгронно-радиоавтографического исследования делали с участка, сравнительно богатого клеточными элементами, и все же последних обычно было не более 10-15 на срез. Включение 3Н-тимидина было обнаружено в клетках стенки сосудов - эндотелиоцитах и перицитах, а также в некоторых клетках опухоли.

Большинство клеток опухоли находилось в состоянии деструкции. Как правило, 3Н-уридин такие клетки не включали, а цитоплазма их отличалась повышенной прозрачностью и разреженностью структур. Важно отметить, что мы наблюдали не только разрушение клеток, но и сосудов опухоли. Это выражалось как в деструктивных изменениях их стенки - истончении, разрывах и т.д., так и в своеобразной перестройке сосудов - расхождении составляющих их клеток и расположении среди других клеток и волокнистых структур. Иногда среди такой группы клеток можно было наблюдать клетку, включившую 3Н-тимидин.

Таким образом, проведенное исследование показало, что сосуд с окружающими его клетками представляет собой как бы элементарную структурно-функциональную единицу опухоли. Эта единица динамична и зональна в том смысле, что клетки по мере образования перемещаются из

внутренней ее зоны в наружную. Мы предполагаем, что пролиферируюшпе клетки стенки сосуда, образующие внутреннюю зону, обеспечивают пополнение клеток этой структурно-функциональной единицы. Окружающие сосуд клетки представляют собой среднюю зону: синтез РНК в них отражает дифференцировку и специфическую функцию, а синтез ДНК -способность этих клеток к размножению. Специфическая функция фибробласта приводит к накоплению коллагена и основного вещества между ним и стенкой сосуда, в результате чего он все дальше отодвигается от сосуда и постепенно изолируется от него. В конечном итоге, вместе с исчерпанием жизненной программы клетки, это приводит к ее отмиранию. Такие клетки составляют наружную зону.

В настоящее время нет достаточно точных сведений о происхождении клеток опухолей из волокнистой соединительной ткани. Некоторые исследователи, обсуждая вопрос о гистогенезе Десмондов, полагают, что их источником являются "незрелые фибробласты", т.е. производные мезенхимы, которые могут дифференцироваться в различных направлениях (липоцит, хондроцит, остеоцит и др.), однако, они не говорят о том, где в опухоли локализуется эта полипотентная мезенхимная клетка (Welsh А., 1966; Razzuk M. et al., 1971; Goellner J.R., Soûle E.H., 1980; Greco A. et al., 1980; Pietrow D. et al., 1980). Другие исследователи на основании полученных данных высказывают предположение, что такими плюрипотентными мезенхимными клетками как источниками формирования и роста некоторых опухолей волокнистой соединительной ткани являются клетки мелких сосудов - эндотелиоциты и, особенно, перициты (Stiller D., Katekamp D., 1975). Это предположение основывается, в частности, на том, что в опухолях подобного рода обращает на себя внимание концентрация клеток вокруг мелких сосудов наподобие муфты.

При исследовании десмоиднои фибромы мы также получили данные в пользу того, что источником новых клеток опухоли, в частности, фибробластов, являются клетки стенки сосудов - эндотелиоциты или перициты. Обнаружение синтеза ДНК, главным образом в клетках стенки микрососудов, снижение интенсивности синтеза РНК в фибробластах по мере удаления от просвета сосуда, а также наблюдение отмирающих клеток

только вдали от сосуда свидетельствует о том, что главная роль в образовании клеточных элементов опухоли и, в частности, фибробластов, принадлежит клеткам мелких сосудов.

Основное внимание при изучении липом было сосредоточено на кольцевой липоме шеи или липоме Маделунга, который впервые описал ее и охарактеризовал как диффузную жировую опухоль, в большинстве случаев медленно растущую (Madelung О.W., 1888).

Исследование этой опухоли проводили в сравнении с нормальной жировой клетчаткой и неувеличивающейся липомой. Гистологическое строение трех сравниваемых объектов было однотипным, что согласуется с данными литературы (Калинин А.П. и др., 1983). Лишь в некоторых участках липомы Маделунга была выявлена умеренная пролиферация клеточных элементов. В этой липоме обнаружили небольшое число молодых адипоцитов, что явилось единственным морфологическим отличием сравниваемых объектов. Молодые адипоциты - это мультилокулярные и мелкие (размер жировой вакуоли близок к размеру ядра) адипоциты. Содержание молодых адипоцитов в липоме Маделунга составило 0,2%. По образованию молодых адипоцитов можно было проследить динамику формирования адипоцитов: мелкие капли жира появлялись в перицитах и клетках периваскулярной зоны - образовывались мультилокулярные клетки, характеризующиеся наличием нескольких содержащих жир полостей. Постепенное увеличение таких полостей приводит к истончению перегородок между ними и слиянию полостей в одну жировую вакуоль, размер которой вначале близок к размеру ядра - унилокулярная клетка. В дальнейшем жировая вакуоль становится значительно больше ядра и оттесняет его вместе с ободком цитоплазмы к периферии клетки.

Что касается включения радиоактивных предшественников, то 3Н-тимидин включали исключительно эндотелиоциты и перициты во всех исследованных видах жировой ткани. Однако, если содержание меченых клеток стенки сосуда в нормальной жировой клетчатке и неувеличивающейся липоме было примерно одинаковым: 0,5% и 0,45% соответственно, то в липоме Маделунга их количество было достоверно выше, чем в двух других видах жировой ткани, и составило 1,6% (Р< 0,01).

Меченные ЗН-тлмидином аднпошггы были редкой находкой и только в липоме Маделунга (0,3%).

Включение 3Н-уридина во всех исследованных образцах жировой ткани было однообразным: метились все эндотелиоциты и перициты. Большинство адипоцитов 3Н-уридином не метились, однако, во всех трех видах жировой ткани количество меченых клеток оказалось примерно одинаковым: около 10%. Метка была незначительной в адипоцитах, содержащих грубый гетерохроматин в ядре, и весьма интенсивной в клетках с более дисперсным распределением хроматина.

Известно, что у нормального взрослого человека и даже при ожирении число адипоцитов сохраняется постоянным (Brook С., 1972; Salans L.B. et al., 1973; Greenwood M., Hirsch J., 1974). Однако мы нашли в жировой ткани трех исследованных видов (нормальная жировая клетчатка, неувеличивающаяся липома и растущая липома Маделунга) гибнущие клетки. Но разрушение клеток должно компенсироваться их новообразованием. Кроме того, в растущей липоме Маделунга обнаруживаются молодые адипоциты. Поскольку полностью дифференцированные адипоциты не делятся (Максимов A.A., 1918; Peckham S.C. et al., 1962; Hollenberg C.H., Vost A., 1968, 1970; Fröhlich J. et al., 1972), а только способны увеличиваться в размерах, следовательно, их новообразование должно осуществляться за счет каких-то " клеток-предшественников.

В настоящее время точно не известно, какие клетки являются предшественниками адипоцитов. Предполагают, что это могут быть фмбробласты (Максимов A.A., 1918; Slavin B.G.,1972; Van R. et al., 1976; Greenberger J.S., 1979; Verrando P. et al., 1980; Alvarez O.M., 1987; Katon J. et al., 1994; Tontonoz P. et al., 1994), примитивные мезенхимные клетки (Fujita H. et al., 1969), а также гистиоцито-подобные клетки (Mohr W., Beneke G., 1969). Недавно была получена уникальная популяция клеток-предшественников адипоцитов из костного мозга крысы (Marko О. et al., 1995).

Полученные данные позволяют нам высказать предположение, что роль предшественников адипоцитов могут выполнять клетки сосудистом

стенки. Почему? Прежде всего, это обнаружение мелких капель жира в перицитах и клетках периваскулярной зоны, позволяющее представить, что формирование адипоцитов начинается с клеток мелких сосудов. Именно эти клетки - эндотелиоциты и перициты проявляли наибольшую биосинтетическую активность. Постоянное и интенсивное включение 3Н-уридина в клетки стенки сосудов, возможно, отражает процесс их ускоренной дифференцировки. Но самым главным, конечно, является обнаружение как в эндотелиоцитах, так и перицитах синтеза ДНК, т.е. способности этих клеток к пролиферации. Наши результаты показали, что в растущей жировой опухоли - липоме Маделунга количество синтезирующих ДНК клеток сосудов было достоверно больше, чем в двух других видах жировой ткани. На наш взгляд, этот факт является довольно веским аргументом в пользу того, что эти клетки могут служить источником образования новых адипоцитов. Кроме того, других лролиферирующих клеток в исследуемых образцах жировой ткани практически не было.

Следовательно, можно сказать, что наши результаты подтверждают давно уже высказанное рядом исследователей предположение, что клетки стенки сосудов и их ближайшего окружения являются источником обновления как волокнистой соединительной ткани, так и жировой (Фомин В.Е., 1917; Максимов A.A., 1925; Scarpelli D., Creider М., 1963; Chung Е., Enzmger F., 1973; Enzinger F., Harvey D., 1975; Stiller D., Katekamp D., 1975; Lagace R. et al., 1979). Наши результаты исследования доброкачественных опухолей хорошо дополняются данными, полученными при изучении злокачественных опухолей (Смольянников A.B. и др., 1982, 1984).

Таким образом, изучение с помощью электронно-микроскопической радиоавтографии физиологической и репаративной регенерации соединительнотканной основы кожи человека, репаративной регенерации костной ткани, а также медленно растущих опухолей мягких тканей (десмоидная фиброма, липомы) показало, что наибольшей биосинтетической активностью, т.е. способностью синтезировать РНК и ДНК, обладают клетки стенки микрососудов - эндотелиоциты и перициты, а также клетки, расположенные в непосредственной близости к ним. По мере удаления от стенки сосуда число таких клеток убывает. Это свидетельствует

о том, что сосуд и периваскулярная область представляют собой зону физиологической и репаративной регенерации соединительной ткани, а также ее опухолевого роста.

Полученные данные позволяют считать, что стенка сосудов является местом концентрации камбиальных полипотентных клеток, обеспечивающих физиологическую и репаративную регенерацию соединительной ткани, а также ее опухолевый рост. Эти полипотентные клетки в зависимости от пока непонятных причин и обстоятельств могут дифференцироваться в направлении то фиброзной, то жировой, то костной или другой ткани.

Если место локализации камбиальных клеток соединительной ткани в настоящее время в достаточной мере можно считать определенным, то вопрос, какая клетка стенки сосуда (перицит или эндотелиоцит) выполняет функцию лолипотентной клетки - до сих пор остается невыясненным. Большая часть исследователей на эту роль выдвигает перицит, считая, что эндотелиоцит к этому отношения не имеет (Щелкунов С.И., 1959; Scarpelli D., Creider М., 1963; Stiller D., Katekamp D., 1975; Lagace R. et al., 1979; Diaz-Flores L. et al., 1991; D'Amore P.A., 1992; Shepro D., Morel N.M., 1993). Эта точка зрения основывается, главным образом, на том, что эндотелиоцит является высокоспециализированной клеткой, выполняющей важнейшую сложную функцию транспорта через клетку различных веществ, тогда как перицит клетка с более низким уровнем дифференцировки, обладающая большим мезенхимным потенциалом. Однако существует мнение, что эндотелиоцит также способен дифференцироваться в другие клеточные формы соединительной ткани (Beranek J.Т. et al., 1986; Beranek J.T., 1988, 1989; Decker В. et al., 1995; Jones A.R. et al., 1995).

Мы довольно часто наблюдали перициты, как бы отошедшие от эндотелиальной стенки сосуда и интенсивно синтезирующие ДНК, т.е. можно предположить, что их готовность к пролиферации означает образование новых клеточных элементов ткани, которые через стадию дифференцировки способны дать начало фибробластам.

При изучении формирования костного регенерата мы обнаружили, что способностью к пролиферации обладают, главным образом, перициты.

Кроме того, полученные нами данные, как было сказано выше, позволяют предположить, что предшественниками адипоцитов, скорее всего, являются перициты.

Таким образом, наши данные, полученные с помощью одного из самых современных методов структурно-функционального анализа -электронно-микроскопической радиоавтографии способствуют тому, что точка зрения на перицит как на полипотентную мезенхимную клетку стала более реальной и доказательной.

Итак, в заключение можно сказать, что сосуды в соединительной ткани - не только источник, обеспечивающий кровоснабжение и обменные процессы в ткани, но, что особенно важно, это центральная структура, стержень, вокруг которого развертывается все многообразие процессов образования и дифференцировки клеточных элементов в различных новообразованиях соединительной ткани.

ВЫВОДЫ

1. Изучение методом электронно-микроскопической радиоавтографии физиологической и репаративной регенерации соединительнотканной основы кожи, репаративной регенерации костной ткани при дистракционном остеосинтезе и некоторых опухолей мягких тканей (десмоидная фиброма, липомы) показало, что наибольшей биосинтетической активностью, т.е. способностью синтезировать ДНК и РНК, обладают клетки стенки микрососудов. Это свидетельствует о том, что эти клетки играют важную роль в физиологической и репаративной регенерации различных видов соединительной ткани.

2. Обнаружен феномен трансформации микрососудов в соединительнотканной основе нормальной кожи человека, а также при ее растяжении и в грануляционной ткани, заключающийся в том, что клетки, составляющие стенку мелких сосудов, могут постепенно утрачивать связь друг с другом и превращаться в свободно лежащие клеточные элементы. Уменьшение числа сосудов в процессе созревания грануляционной ткани заключается не только в их исчезновении вследствие прогрессирующих

дистрофических изменений клеток их стенки, но также в отмеченной перестройке их стенки.

3. Изучение процесса костеобразования при днстракциоином остеосинтезе показало, что клетки, обладающие высокой метаболической и пролиферативной активностью (синтезирующие соответственно РНК и ДНК), располагаются либо в стенке мельчайших сосудов, либо в непосредственной близости от нее. Обнаружение клеток с высокой пролиферативной активностью (синтез ДНК) позволяет предположить, что они могут быть предшественниками остеогенных клеток, а, следовательно, это говорит о тесной связи между остеогенезом и ангиогенезом.

4. Достоверное увеличение количества пролиферирующих клеток стенки микрососудов в растущей липоме Маделунга (Р<0,01) по сравнению с нормальной жировой клетчаткой и неувел1тчивающейся липомой, обнаружение капель жира в перицитах и клетках периваскулярной области, а также наши данные о роли фибробластов в образовании адипоцитов при созревании грануляционной ткани - все эти факты дают нам основание предполагать, что клетки стенки микрососудов, скорее всего, перициты, могут быть предшественниками адипоцитов.

5. Микрососуд с окружающим его комплексом клеток является как бы элементарной структурно-функциональной единицей соединительной ткани. Пролиферативная активность этих клеток (синтез ДНК в них) обеспечивает пополнение клеточных элементов ткани. По мере отдаления от стенки сосуда снижается уровень биосинтетической активности в клетках, а также нарастают явления деструкции в большинстве из них.

6. Основываясь на полученных результатах, можно утверждать, что сосуды не только обеспечивают кровообращение и питание органов и тканей организма, а являются центрхчьной структурой, вокруг которой, как вокруг стержня, развертываются не только собственно обменные процессы, но и разнообразные по клеточной и тканевой дифферениировке физиологическая и репаративная регенерация соединительной ткани, доброкачественные и злокачественные лролиферативные процессы.

7. Наши данные, полученные с помощью одного из наиболее современных методов структурно-функционального анализа электронно-

микроскопической радиоавтографии, способствуют тому, что точка зрения большого числа авторов на перицит как мезенхимную полипотентную клетку, которая в силу пока неизвестных причин в одном случае дает начало фибробласту, в другом адипоциту, а в третьем - остеобласту и т.д., стала более реальной и доказательной.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Материалы диссертации вошли в качестве главы "Некоторые вопросы гистогенеза опухолей мягких тканей" в Руководство "Патологоанатомическая диагностика опухолей человека" (п/ред. H.A. Краевского, A.B. Смольянникова, Д.С. Саркисова).

Список научных работ по теме диссертации:

1. Саркисов Д.С., Пальцын A.A., Адамян A.A., Колокольчикова Е.Г. -О клеточных элементах сосудов как источнике развития десмоидной фибромы. - Бюлл. экспер. биол., 1983, N12, 100-101.

2. Саркисов Д.С., Пальцын A.A., Адамян A.A., Колокольчикова Е.Г. -Электронно-радиоавтографическое изучение синтеза нуклеиновых кислот в нормальной жировой ткани и липомах. Бюлл. экспер. биол., 1984, N5, 618621.

3. Саркисов Д.С., Костюченок Б.М., Амирасланов Ю.А., Колокольчикова Е.Г. и соавт. - Электронно-радиоавтографическое исследование костеобразования при дистракционном остеосинтезе. - Бюлл. экспер. биол., 1984, N7, 97-99.

4. Саркисов Д.С., Костюченок Б.М., Амирасланов Ю.А., Колокольчикова Е.Г. и соавт. - Костеобразование в условиях дозированной дистракции у больных с открытыми переломами длинных трубчатых костей, осложненными гнойной инфекцией. - Архив пат., 1985, N2, 17-23.

5. Саркисов Д.С., Колокольчикова Е.Г., Пальцын A.A. О структурных преобразованиях сосудистой системы соединительнотканной основы кожи. -Бюлл. экспер. биол., 1987, N6, 730-732.

6. Саркисов Д.С., Колокольчикова Е.Г., Каем Р.И., Пальцын A.A. -Об изменениях сосудов в созревающей грануляционной ткани. - Бюлл. экспер. биол., 1988, N4, 501-503.

7. Саркисов Д.С., Колокольчикова Е.Г., Каем Р.И., Пальцын A.A. - О некоторых механизмах редукции сосудистой системы грануляционной ткани в процессе ее созревания.- Архив пат., 19S9, N1, 9-14.

S. Саркисов Д.С., Колокольчикова Е.Г., Каем Р.И., Пальцын A.A. -Новые данные о роли сосудистой системы в физиологической и репаративной регенерации соединительной ткани. - Тез. докл. на LX сессии Общего собрания АМН СССР 'Актуальные проблемы современной ангиологии", Ленинград, 1990, 35-37.

9. Гришкевич В.М., Мороз В.Ю., Ваганова H.A., Колокольчикова Е.Г. - Использование латексных экспандеров отечественного производства в лечении Рубцовых алопеций. - Тез. докл. I' междунар. конф. "Соврем, подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимеров мед. назначения", М., 1992, 149.

10. Саркисов Д.С., Колокольчикова Е.Г., Пальцын A.A. - Некоторые вопросы гистогенеза опухолей мягких тканей. - Глава в рук-ве: Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. М., Медицина, 1993, 374-408.

11. Амирасланов Ю.А., Саркисов Д.С., Колокольчикова Е.Г. и-соавт. -Пластика дефектов мягких тканей методом дозированного растяжения. -Врач, 1993, N2, 25-27.

12. Колокольчикова Е.Г., Амирасланов Ю.А. - Некоторые закономерности физиологической и репаративной регенерации соединительнотканной основы кожи. - Архив пат., 1994, N5, 34-39.