Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Электрофоретическая подвижность форменныхэлементов крови при взаимодействии на их поверхностиантигенов и антител системы НLA

Минский ордена Трудового Красного Знамеии государственный медицинский институт

р Г - ОД На правах рукописи

, „, „ (Г,'!''

пГП'

ЯНОВИЧ Эльмира Абильевна

УДК 616.5-002.535.2: 612.118.221.2: 612.112

Электрофоретическая подвижность форменных элементов крови при взаимодействии на их поверхности антигенов и антител системы Н1Л

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови МЗ Республики Беларусь

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

Е.П.Ивапов кандидат медицинских наук ст.н.сотр. В.ИЛевин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.А.Милютин доктор медицинских наук М.П.Потапнев

Оппонирующая организация — Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится .1996 г.

в 4?... часов на заседании совета Д.ОЗ.18.05 при Минском ордена Трудового Красного Знамени государственном медицинском институте по адресу: 220И6, пр. Дзержинского, 83, Минский государственный медицинский институт

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского государственного медицинского института

Автореферат разослан ............"5.....1996 г.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций,

кандидат медицинских наук доцент

И.А.Крылов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Взаимодействие антител с мембранными антигенами форменных элементов крови в системе HLA лежит в основе многих иммунных реакций и иммунопатологических процессов и имеет важное фундаментальное и прикладное значение для биологии и медицины [Зарецкая, 1983, 1995; Зотиков, 1982, 1994; Наумов и др., 1994; Шабалин и Серова, 1988; Charron, 1992; Dalton and Bennet, 1992; MinchefT and Meriman, 1995].

Современные представления о результатах этого взаимодействия как in vitro, так и in vivo связаны главным образом с конечным эффектом, обусловленным высокой комплемент-зависимой цитотоксической активностью анти-H LA-антител, вызывающей гибель клеток-мишеней.

Однако для более детальной характеристики этого взаимодействия, с одной стороны, не достает знаний о ранних этапах контакта антител с HLA-антигенными рецепторами разных типов клеток и эффектах, вызываемых образованием на клеточной поверхности комплекса антиген — антитело, являющегося пусковым моментом и основой патогенеза иммунных процессов, развивающихся в организме [Ройт, 1991]. С другой стороны, существуют некоторые пробелы в знаниях, касающиеся как экспрессии и распределения антигенов HLA на клетках периферической крови человека, так и биологических свойств самих антител.

В настоящей работе предпринята попытка восполнить эти пробелы знаний с помощью метода аналитического электрофореза клеток, значительно расширяющего возможности исследования иммунологических реакций [Bauer et al., 1992].

Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР НИИ гематологии и переливания крови МЗ Республики Беларусь в рамках темы "Изучение закономерностей развития и некоторых клинических аспектов поспрансфузионных реакций негемолитического типа, вызванных антителами, направленными к антигенам системы HLA фенотипа реципиентов" (№ гос. регистрации 01860017586).

Цель исследования. Определить в экспериментах in vitro электрофоретическую подвижность (ЭФП) форменных элементов крови при действии анти-НЬА-антител, направленных к антигенам HLA I класса, а также выяснить с

помощью этого показателя некоторые закономерности экспрессии НЬА антигенов на клетках периферической крови.

Задачи исследования:

—определить действие анти-НЬА-антител на ЭФП лимфоцитов (суммарную популяцию, обогащенные взвеси Т-и В-клеток);

—выявить зависимость и характер изменений от температуры и времени воздействия, цитотоксической активности и титра анти-Н1А-сывороток, иммунологической специфичности действующих антител;

— изучить ЭФП лимфоцитов при обработке разновидностью анти-НЬА-антител, не обладающих цитотоксическим эффектом (феномен ЦНАП);

—выяснить влияние антител на ЭФП гранулоцитов и тромбоцитов, а также эритроцитов;

— провести сравнительные исследования взаимодействия анти-НЬА-антител с клетками крови в однородных и смешанных клеточных популяциях.

Научная новизна работы. Впервые изучены электрокинетические свойства лимфоцитов, гранулоцитов, тромбоцитов и эритроцитов человека при действии антител, направленных к антигенам НЬА I класса.

С помощью метода клеточного электрофореза впервые проведены сравнительные количественные исследования изменений, вызываемых данными антителами при действии на различные типы клеток, экспрессирующих НЬА-антигены; изучены ранние стадии взаимодействия цитотоксических антител с клетками-мишенями (до включения комплемента), отражающие их непосредственное действие на плазматическую мембрану.

Оригинальными являются исследования эффективности и уровня взаимодействия анти-НЬА-антител с форменными элементами крови в однородных и смешанных клеточных популяциях, позволившие установить конкуренцию за связывание антител между тромбоцитами и лимфоцитами.

Новыми являются также данные об индивидуальных и популя-ционных изменениях поверхностных свойств форменных элементов крови при их сенсибилизации антителами.

Установлено наличие на эритроцитах человека широкого спектра НЬА-антигенов I класса, а также уточнены данные о присутствии на тромбоцитах отдельных частных НЬА-специ-фичностей.

Найден и разработан простой, высокочувствительный, единый универсальный тест, применимый ко всем форменным элементам крови, позволяющий регистрировать первую специфическую фазу реакции антиген — антитело в системе HLA. Предложена удобная адекватная модель для оценки ранних изменений в клетках-мишенях при воздействии цитотоксических антител, с помощью которой можно получать количественные данные и проводить исследования на живых клетках в динамике.

Теоретическая значимость проведенной работы заключается в том, что она изменяет существующие сведения о распределении HLA-антигенов на клетках периферической крови человека; расширяет и углубляет представления о биологических свойствах анти-НЬА-антител и их роли в механизмах иммунных конфликтов.

Практическая значимость и пути реализации работы. Снижение ЭФП форменных элементов крови следует рассматривать как одно из первичных звеньев в патогенезе состояний, обусловленных HLA-сенсибилизацией, и учитывать при проведении терапии и иммунокоррекции.

Полученные данные позволяют определить участие и степень вовлечения тех или иных клеток крови в иммунные конфликты, опосредованные антителами, при проведении различных гемо-терапевтических мероприятий, а также при аллогенных трансплантациях и некоторых осложнениях беременности, инициированных анти-НЬА-антителами. Показано более важное значение в условиях HLA-сенсибилизации совместимости по антигенам HLA-B-локуса и прежде всего по Н1_А-В7-антигену.

Установленная возможность идентификации HLA-фенотипа лиц по эритроцитам периферической крови может ускорить и упростить процесс типирования, что является весьма существенным в случаях, когда HLA-типирование по лимфоцитам затруднено или невозможно.

Выявленные преимущества ЭФП-теста по сравнению с общепринятой лимфоцитотоксической реакцией (ЛЦР) способствуют более адекватной оценке действия антител in vitro и in vivo.

Разработан комплекс простых, доступных и экономичных для научных и практических лабораторий методов, в основу которого положен биофизический принцип регистрации реакции антиген — антитело в системе HLA. Данный принцип удобен для

создания многопрограммных роботизированных систем в иммуно-гематологических исследованиях.

Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре гематологии БелГИУВа, внедрены в лаборатории иммуно-гематологии НИИГиПК, в лаборатории иммунологического типирования органов и тканей РСПК, Центре трансплантации костного мозга на базе 9-ой клинической больницы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Втором (Минск, 1984) и Третьем (Ленинград, 1985) всесоюзных рабочих совещаниях по тканевому типированию; Объединенной конференции патофизиологов, врачей спортивной медицины и ЛФК (Минск, 1985); Четвертом съезде гематологов и трансфузио-логов Белоруссии (Минск, 1988); Первом съезде иммунологов Белоруссии (Минск, 1990).

Апробация диссертации состоялась 14 декабря 1995 г. на заседании Ученого совета БелНИИГиПК.

Публикация работы. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 94 страницы основного текста, 15 таблиц и 18 рисунков. Состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, и списка литературы. Библиографический указатель включает 220 наименований печатных работ (85 на русском и 135 на иностранных языках).

Работа выполнена в Белорусском республиканском центре иммунологического типирования органов и тканей (рук. ст. научный сотрудник канд. мед. наук В.ИЛевин) НИИ гематологии и переливания крови МЗ Республики Беларусь (директор профессор Е.П.Иванов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены в экспериментах in vitro с использованием различных типов клеток крови человека и анти-HLA-антител против антигенов HLA I класса. Объем исследований представлен в табл.1.

В основу исследования положен метод аналитического клеточного электрофореза. Кроме того, использованы современные иммунологические и серологические методы, в том числе и в собственной модификации, основанные на

традиционных приемах регистрации реакции антиген — антитело (ЛЦР, ГЦР, реакция солевой агглютинации на плоскости, проба Кумбса, непрямой тест Штеффена, ИШ-метод тканевого типирования и др.).

Таблица 1

Объем выполненных исследований

№ п/п Объект исследования Количество исследованных образцов Специфичность анти - HLA-антител

анти-HLA-сывороток клеток

Однородные популяции

1 Лимфоциты (суммарная популяция) 30 7 60 А2,9,11,19,25,28 В5,7,8,12,13,15,21, 27,40, Cw2,3,4, полиспецифические сыворотки

2 Т-лимфоциты 7 4 А2, В7,15,40

3 В-лимфоциты 5 4 А2, В7,15,40

4 Гранулоциты 10 10 А2,9, В5,7,15,18.27,40

5. Тромбоциты 15 25 А2,9,25, В5,7,8,12,13,15, 17,27,35,39,40

6 Эритроциты 30 25 Al,2,3,9,10,11,26,29, В5,7,8,12,13,15,18, 27, 40,41, Cw2,4

Смешанные популяции

7 Эритроциты+ лимфоциты 7 7 А2, В5,7,8,12

8 Тромбоциты+ лимфоциты 10 9 А2,9,25 В5,7,8,12,13,15,18

Всего образцов 121 144

Источником антител служили высокостандартизированные типирующие реагенты (Ы),7—0,9) — аллогенные моно- и ди-специфические анти-НЬА-сыворотки, содержащие антитела к антигенам HLA-A, В, С-локусов, а также несколько образцов анти-Н1А-сывороток полиспецифического характера, заготовленных от больных, получавших множественные гемотрансфузии. Объектом исследования явились клетки периферической крови здоровых лиц известного HLA-фенотипа, ABO- и Rh-принадлеж-

ности. В части опытов, выполненных так называемым слепым методом, форменные элементы выделяли из крови доноров с неидентифицированным НЬА-антигенным типом, определение которого проводили после завершения эксперимента. Клетки выделяли в градиенте плотности фиколл—верографина, разделение суммарной популяции лимфоцитов на Т- и В-клетки проводили сепарацией на нейлоновой вате (Репша!, США).

Клетки-мишени инкубировали с равными объемами сывороток, затем трижды отмывали. Одну часть клеток использовали для постановки серологических и иммунологических тестов, другую — для измерения ЭФП. С целью контроля за специфичностью взаимодействия клетки обрабатывали в тех же условиях сывороткой АВ(1У) и/или анти-НЬА-сыворотками, не содержащими антител к антигенам данного образца клеток-мишеней. В отдельных опытах измерение ЭФП клеток проводили в присутствии небольших доз сывороток.

Сенсибилизацию анти-НЬА-антителами лимфоцитов и грану-лоцитов контролировали в лимфоцитотоксическом и грануло-цитотоксическом тестах соответственно [Зотиков, 1988].

Образование иммунного комплекса в системе ША на клеточной поверхности эритроцитов подтверждали в непрямом варианте теста Штеффена [Йегер, 1990] и в ЭФП-тесте с антиглобулиновой сывороткой (собственная разработка). Отсутствие в сыворотках антител к специфическим антигенам эритроцитов проверяли в реакции солевой агглютинации и пробе Кумбса [Прокоп и Гелер, 1991].

Для идентификации НЬА-антигенов I класса использовали панель из 120 тестовых гистотйпирующих сывороток, "открывающих" 43 антигена, в том числе 15 в локусе А, 23 в локусе В и 5 антигенов локуса С.

ЭФП измеряли на цитоферометре фирмы "Орюп" (ФРГ) в стандартных условиях при физиологических для клеток крови значениях рН и ионной силы растворов. В каждой серии для лейкоцитов измерялась подвижность не менее 30-50 клетрк, для эритроцитов и тромбоцитов — 15—30.

О достоверности различий между средними значениями ЭФП клеток сравниваемых групп судили по критерию Фишера-Стью-дента, для оценки различий между величинами стандартного отклонения использован Р-критерий.

Содержание работы ДЕЙСТВИЕ АНТИ-Н1А-АНТИТЕЛ НА ЭФП ЛЕЙКОЦИТОВ

Обработка лимфоцитов в контрольных сериях неспецифическими анти - Н ЬА- сы во ротками или сыворотками АВ(1У) группы крови, не оказывала влияния на их ЭФП. Наоборот, обработка антисыворотками, содержащими любые по специфичности антитела, направленные к одному из НЬА-антигенов, экспрессированных на клетках-мишенях, приводила к выраженному снижению ЭФП лимфоцитов в среднем на 9,9% (Р<0,05), с колебаниями в отдельных опытах от 5 до 25%.

60 -|

□ 1 □ 2 м 3

0.56-0.6 0.68-0.7 0.80-0.910.92-1.031.04-1.15 1.16-1.27

Рис. 1. Гистограмма распределения лимфоцитов по ЭФП:

1 — интактные клетки; 2 — лимфоциты, обработанные сывороткой АВ(ГУ); 3 — лимфоциты, сенсибилизированные анти-Н1_А-антителами. По оси абсцисс — % клеток, по оси ординат — значения ЭФП.

Изменения ЭФП хорошо видны на гистограммах (рис. 1) и характеризуются сдвигом влево в область низких для лимфоцитов значений ЭФП, сокращением фракций "быстрых" клеток, сменой модального класса; неравномерным изменением ЭФП индивидуальных клеток, что приводит к еще большему возрастанию внутрипопуляционной электрофоретической гетерогенности лимфоцитов (различия в значениях стандартных отклонений интактной и НЬА-сенсибилизированной популяциях статистически достоверны, Р<0,01).

Изменения электрофоретической подвижности носят стойкий необратимый характер и регистрируются спустя 48 ч после воздействия антител. Они не являются следствием цитотоксичес-

кого эффекта, поскольку наступают в отсутствие комплемента, а жизнеспособность клеток остается на уровне контрольных значений. И только последующая обработка комплементом приводит к цитотоксическому повреждению мембраны и лизису клеток. Очевидно, что изменение ЭФП наступает в результате иммунной сорбции антител на клеточной поверхности (реакция антиген — антитело) и отражает, в отличие от ЛЦР, прямое непосредственное действие антител на клетку. Тем не менее, между степенью ингибиции ЭФП и комплементзависимой цито-токсической активностью анти-НЬА-сывороток существует прямая корреляция. Вместе с тем, между этими проявлениями действия антител найдены и другие важные отличия (рис. 2).

Рис. 2. График зависимости изменений ЭФП лимфоцитов (2) и выраженности лимфоцитотоксической реакции (1) от титра анти-НЬА-сыворотки: по оси абсцисс — титр анти-Н1_А-сыворотки, по оси ординат слева — снижение ЭФП в %, справа — выраженность ЛЦР.

Кривые, описывающие изменения ЭФП, отражают близкую к линейной зависимость этого показателя от снижения титра антител. Для кривых, отражающих цитотоксическое действие, характерен выход на плато с последующим довольно резким снижением до нуля — свидетельство существования порогового эффекта и более низкой чувствительности ЛЦР.

Выраженность изменений ЭФП зависела также от продолжительности контакта клеток с антителами (10, 30, 60 мин) и иммунологической специфичности действующих антител. Оказалось, что антитела, направленные к антигенам НЬА-В-локуса, и прежде всего к В7-антигену, обладают более сильным модифицирующим действием по сравнению с антителами против антигенов А-локуса.

Исследование влияния антител на ЭФП Т- и В-лимфоцитов не выявило каких-либо принципиальных отличий по сравнению с их действием на суммарную популяцию. Об этом свидетельствовали практически одинаковое снижение ЭФП (на 11,6 и 12,5% соответственно), однотипные изменения на гистограммах, возрастание в обеих популяциях величины стандартного отклонения.

Аналогичные изменения получены в отношении гранулоцитов — ЭФП снижалась в среднем на 12% (Р<0,01) и совпадала с положительной реакцией в гранулоцитотоксическом тесте.

В целом проведенные эксперименты показали, что анти-ША-антитела способны воздействовать непосредственно (т.е. в отсутствие комплемента) на клеточную мембрану, приводя к изменению ЭФП лейкоцитов, а следовательно и величины их поверхностного заряда. А это, в свою очередь, позволило установить новый принцип учета реакции антиген — антитело в системе НЬА.

ДЕЙСТВИЕ АНТИ-Н1А-АНТИТЕЛ НА ЭФП ТРОМБОЦИТОВ

Действие антител на . ЭФП тромбоцитов оказалось аналогичным действию на лейкоцитарные клетки (табл. 2, рис. 3),

Таблица 2

ЭФП тромбоцитов, обработанных анти-НЬА-сыворотками

Объект исследования ЭФП тромбоцитов в икм-С^В'^см Кол-во опытов Снижение ЭФП в %

х±эх ст п

Интактные тромбоциты 0,864±0,011 0,044 16 -

Тромбоциты, обработанные специфическими анти-Н ЬА-сыворотками 0,809±0,010 0,039 14 6,3*

Тромбоциты, обработанные неспецифическими анти-НЬА-сыворотками 0,860±0,015 0,061 16 1,4

Примечание. * — различия по отношению к ЭФП контрольных серий достоверны (Р<0,01).

однако количественный эффект был не столь выраженым. Снижение ЭФП тромбоцитов было почти в 2 раза меньшим и составляло в среднем 6,3%, а изменение ЭФП индивидуальных тромбоцитов, в отличие от лимфоцитов и гранулоцитов, носило равномерный характер. Особенно заметно проявилось на тромбоцитах и более сильное модифицирующее действие анти-НЬА-В-антител.

Рис. 3. Гистограмма распределения тромбоцитов в зависимости от их ЭФП: 1 — интактные клетки; 2 — клетки, сенсибилизированные анти-НLA-антителами. По оси абсцисс — значения ЭФП в мкм С"1!?"1 см, по оси ординат — количество клеток в %..

Необходимо отметить, что статистически значимое снижение ЭФП тромбоцитов наблюдалось при обработке антителами, направленными к любым без исключения HLA-антигенам, в том числе и к так называемым "сомнительным" для тромбоцитов антигенам — В12, В8, В40, что доказывает их присутствие на тромбоцитах и позволяет говорить о полной идентичности HLA-антигенного состава лейкоцитов и тромбоцитов.

ДЕЙСТВИЕ АНТИ-Н1А-АНТИТЕЛ НА ЭФП ЭРИТРОЦИТОВ

Если присутствие антигенов HLA I класса на клеточной мембране лейкоцитов и тромбоцитов — хорошо установленный факт, то на эритроцитах достоверно определены только три HLA-антигена — В7, В17, А28. Однако анализ литературы последних лет [Рагимов, 1988; Majsky, 1990, 1991; Pestañe г et al., 1995] позволяет предположить, что антигены HLA 1 класса могут быть широко представлены на эритроцитах.

В первой серии опытов, поставленных с эритроцитами 5 доноров Н1А-В7-антигенного типа и тремя образцами анти-HLA-

В7-сывороток, во всех случаях происходило четкое снижение ЭФП эритроцитов. Это свидетельствует об адекватности ЭФП-теста для выявления экспрессии НЬА-анти генов и на эритроцитах.

В последующих опытах при обработке эритроцитов анти-НЬА-антителами, направленными к другим Н1_А-антигенам I класса всех трех локусов был получен аналогичный эффект.

В целом ЭФП эритроцитов изменялась на 5,8%, при колебаниях этой величины от 4 до 18%. Различия в контрольных и опытной группах высоко достоверны (Р<0,001).

При анализе характера (рис. 4) и динамики изменений ЭФП красных клеток крови отмечаются те же закономерности, что и при Ш-А-сенсибилизации ранее исследованных клеток.

Тот факт, что обработка эритроцитов специфическими антителами к различным Н1_А антигенам I класса приводит к изменению их ЭФП, совершенно очевидно указывает на наличие данных общетканевых антигенов на эритроцитарной мембране.

Образование иммунного комплекса анти-ША-антител с мембранными структурами эритроцитов подтверждено нами в тесте потребления антиглобулина собственной разработки (табл.3) и пробе Штеффена.

Таблица 3

ЭФП НЬА-сенсибилизированных эритроцитов в тест-системе с антнглобулиновой сывороткой (АТС)

Серии опытов Кол-во опытов ЭФП в мкм-С"'В''см Снижение ЭФП в % Р между сериями

Эритроциты, обработанные сывороткой АВ(ГУ) группы (контроль 1) 8 1.154+0.059

Эритроциты, сенсибилизированные анти-Ш-А-антителами 16 1.061±0.031 8.1 Р,_2<0.001

Эритроциты, обработанные сывороткой АВ(ГУ) группы + АГС (контроль 2) 8 1.140±0.053 1,2 Р,.3>0.05

Эритроциты,сенсибилизированные анти-Н1А- антителам и + АГС 16 1.011 ±0.034 12.4 Р1.4<0.001 Р2.4<0.001 Р,.4<0.001

Таким образом, применение метода аналитического микроэлектрофореза клеток позволило выявить на эритроцитах широкий спектр Ш-А-антигенов I класса и установить возможность участия эритроцитов в иммунологических реакциях, обусловленных НЬА-несовместимостью.

ИЗУЧЕНИЕ ЭФП ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ АНТИ-Н1А-АНТИТЕЛ НА ИЗОЛИРОВАННЫЕ И СМЕШАННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК

Используя ЭФП-тест в качестве универсального критерия иммунного взаимодействия в системе Н1А, мы провели серию сравнительных экспериментов, выясняющих характер и уровень взаимодействия анти-НЬА-антител с форменными элементами крови в однородных и смешанных клеточных популяциях.

Рис. 4. Гистограмма распределения эритроцитов в зависимости от их ЭФП: 1 — интактные клетки; 2 — обработанные анти-НЬА-сывороткой эритроциты (однородная популяция); 3 — обработанные анти-НЬА-сывороткой эритроциты в смеси с лимфоцитами (смешанная популяция). По оси абсцисс — значения ЭФП в мки-С^В^ см, по оси ординат — количество клеток в %.

Результаты, полученные в первой модельной системе с эритроцитами и лимфоцитами, показали, что способность эритроцитов связывать антитела не утрачивалась в присутствии лимфоцитов, являющихся основными клетками-мишенями.

Об этом свидетельствовали практически одинаковые изменения средних значений ЭФП и гистограмм, полученных для эритроцитов в однородной и смешанной популяциях (рис. 4).

50

1.04-1.08 1.09-1 13 1 14-1.18 1 19-1.23 1.24-1.28 1.29-1.33 1.34-1.38

Присутствие эритроцитов, в свою очередь, не оказывало заметного влияния на интенсивность реакции анти-НЬА-антител с лимфоцитами.

Иные результаты получены во второй модельной системе с тромбоцитами и лимфоцитами. Как оказалось, способность тромбоцитов реагировать с анти-НЬА-антителами в чистой взвеси полностью или в значительной степени терялась в присутствии лимфоцитов. Если при обработке антисыворотками изолированных тромбоцитов четко изменялись как средние значения ЭФП, так и профили гистограмм, то при обработке смешанной популяции эти показатели мало отличались от таковых для интактных тромбоцитов (рис. 5).

0.68-0.72 0.73-0 77 0.78-0 82 0.83-0.87 0 88-0 92 0.93-0 97

Рис. 5. Гистограмма распределения тромбоцитов в зависимости от их ЭФП: 1 — интактные клетки; 2 — обработанные анти-НЬА-сывороткой тромбоциты (однородная популяция); 3 — обработанные анти-Н1_А-сывороткой тромбоциты в смеси с лимфоцитами (смешанная популяция). По оси абсцисс — значения ЭФП в мкм СЕИсм, по оси ординат — количество клеток в %.

В исследуемой системе происходило преимущественное связывание анти-НЬА-антител лимфоцитами, что позволяет говорить о существовании между лимфоцитами и тромбоцитами конкурентных отношений за связывание анти-НЬА-антител.

Наличие подобных отношений хорошо объясняет отсутствие ряда эффектов и клинических проявлений, связанных с тромбоцитами, при Н1А-несовместимых иммунных конфликтах [Йергер, 1990; гкасе! е! а1, 1991; ТаапшБ е! а1, 1992, ! 995 Ь

ВЫВОДЫ

1. Обработка форменных элементов крови — лимфоцитов, гранулоцитов, тромбоцитов и эритроцитов — анти-HLA-антителами, специфическими по отношению к антигенам, экспрессированным на клеточной поверхности, вызывает модификацию физико-химического состояния поверхностной мембраны и приводит к снижению ЭФП клеток.

2. Изменения ЭФП наступают в результате первой специфической фазы реакции антиген — антитело, протекающей на клеточной поверхности, носят необратимый характер и вызываются всеми разновидностями анти-НЬА-антител, независимо от их серологической характеристики.

3. Степень изменения ЭФП зависит, с одной стороны, от типа клеток-мишеней, причем более выраженные изменения отмечены для лимфоцитов и гранулоцитов и менее выраженные — для тромбоцитов и эритроцитов, с другой стороны, — от активности и титра антисыворотки, иммунологической специфичности действующих антител, времени инкубации (10, 30, 60 мин), и не зависит от температуры взаимодействия (20—37°С).

4. При действии антител найдены различия во внутрипопуляционных изменениях поверхностных свойств лейкоцитарных и нелейкоцитарных клеток, заключающиеся в различной степени снижения ЭФП индивидуальных клеток — для лимфоцитов и гранулоцитов и одинаковой — для тромбоцитов и эритроцитов.

5. В модельных экспериментах in vitro установлено, что в присутствии лимфоцитов тромбоциты в значительной степени утрачивают способность связывать анти-НЬА-антитела. Это может свидетельствовать о существовании неизвестных ранее конкурентных отношений между лимфоцитами и тромбоцитами. Подобная конкуренция между эритроцитами и лимфоцитами отсутствует.

6. Впервые установлено, что на эритроцитах экспрессирован широкий спектр антигенов HLA I класса, и подтверждено наличие ряда HLA-специфичностей на тромбоцитах. При этом показано, что HLA-антигенный состав на лейкоцитах, тромбоцитах и эритроцитах индивидуума идентичен, что свидетельствует об универсальности экспрессии и распределения HLA-антигенов на клетках крови человека.

7. Результаты исследований вносят новые представления и определенный вклад в понимание процессов, обусловленных Н1А-несовместимостью, способствуют более полному пониманию механизмов иммунных конфликтов, а также могут быть полезны при разработке способов коррекции иммунопатологических процессов, обусловленных аллоантителами. Снижение ЭФП форменных элементов крови следует рассматривать как одно из звеньев в патогенезе состояний, обусловленных анти-НЬА-антителами.

8. Предложен комплекс простых экономичных методов выявления и идентификации антигенов и антител системы НЬА по изменению биофизического параметра клеток (ЭФП). Положенный в основу новый принцип учета иммунного взаимодействия в системе НЬА позволяет регистрировать первую специфическую фазу реакции антиген — антитело, применим к различным клеткам крови, технологичен для создания автоматизированных многопрограммых приборов для исследований в иммуногематологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обоснование использования анти-НЬА-антител в иммунотерапии лимфопролиферативных заболеваний / Левин

B.И., Павлова М.П., Драпезо Л.Н., Соловей А.Н., Григорьева Е.М., Шиманская Т.В., Янович Э.А., Свирновский А.И.// Роль иммунной системы в патогенезе лимфопролиферативных заболеваний: Тез. докл. Всесоюзн. конф,— Новосибирск, 1984.—

C. 101-103.

2. К вопросу о стандартизации анти-НЬА-реагентов / Левин В.И., Семенов Г.В., Янович Э.А., Луц Л.С. // Клиническое значение лейкоцитарных антигенов.— Л., 1984,— С. 26—30.

3. Янович Э.А. Электрофоретическая подвижность сенсибилизированных клеток крови // Механизмы адаптации и компенсации, методы их тренировки, контроля и стимуляции: Тез. докл. объед. респ. конф. патофизиологов, врачей спорт, медицины и ЛФК,— Мн., 1985.- С. 64.

4. Возможность использования анти-Н1А-сывороток для модуляции функциональных свойств лимфоцитов и пассивной иммунотерапии / Левин В.И., Соловей А.Н., Атаманенко Л.Г.,

Пилатович B.C., Санько Н.М., Янович Э.А., Драпезо JI.H.// Вестн. АМН СССР - 1988.-№ 7,- С. 57-62.

5. Янович Э.А. Влияние анти- Н LA-антител на электрофоретическую подвижность лимфоцитов // Средства и методы биоспецифической коррекции в гематологии и трансфузиологии: Тез. докл. IV съезда гематологов и трансфузиологов Белоруссии. — Мн., 1988.— С. 138—139.

6. Определение электрофоретической подвижности клеток крови в лабораторно-клинической практике / Левин В.И., Луц Л.С., Янович Э.А., Свирновская Э.Л., Пилатович B.C.// Материалы II респ. конф. Литовского респ. научн. о-ва гематологов и трансфузиологов,— Вильнюс, 1989.— С.163—164.

7. Электрофоретическая подвижность лимфоцитов, сенсибилизированных анти-НЬА-сыворотками / Левин В.И., Янович Э.А., Зотиков Е.А.// Иммунология,— 1990,—№4,—С.31—33.

8. Янович Э.А. Влияние анти-НЬА-антител на ЭФП форменных элементов крови // Тез. докл. I иммунологического съезда Белоруссии. — Мн., 1990,— С. 22—23.

9. Влияние анти-НЬА-антител на электрофоретическую подвижность эритроцитов / Левин В.И., Янович Э.А., Луц Л.С., Иванов Е.П. // Гематол. и трансфузиол.— 1991.— № 3.— С. 7—8.

10. Янович Э.А. Электрофоретическая подвижность клеток крови как критерий их сенсибилизации / Актуальные проблемы иммунологии и аллергологии: Тез. докл. III съезда Белорусского научн. о-ва иммунологов и аллергологов. — Гродно., 1995.— С. 200-201.

Рэзюме

Янсшч Э.А. Электрафарэтычная рухомасць форменных элементау крыв1 пры узаемадзейнасщ на ix naBepxiii антыцелау i антыгенау астэмы HLA

анал1тычны электрафарэз клетак, анты-НЬА-антыцелы, HLA-антыгены, клетю крьш, л1мфацыты, Т- i В-л1мфацыты, гранулацыты, трамбацыты, эрытрацыты, рэакцыя антыген — антыцела, электрафарэтычная рухомасць, ЭФР

У экспериментах in vitro упеРшыню даследавана электрафарэтычная рухомасць (ЭФР) клетак Kpbmi чалавека — лейкацытау (сумарная папуляцыя, Т- i В-клетю), гранулацытау, трамбацытау, эрытрацытау — пры сенабшзацьп анты-HLA-антыцеламь

Даследаванш выкананы з мэтай вывучэння раннк этапау кантакта пам1Ж aнтыцeлaмi i клеткамл-м1шэням1, а таксама з мэтай пошуку прынцыпова новага крытэрыя ¡муннага узаемадзеяння у cicT3Me HLA i вызначэння з яго дапамогай некаторых заканамернасцяу экспрэси HLA-антыгенау на клетках перыферычнай крывк

Выкарыставаны метады аналпычнага электрафарэзу клетак (цытаферометр ф1рмы "Opton", ФРГ) i шэраг сучасных ¡муналапчных i сералапчных метадау, заснаваных на традыцыйных прыемах рэпстрацьи рэакцьи антыген — антыцела.

Выяулена, што узаемадзеянне антыцелау з НЬА-антыгенным1 рэцэптарам1 клетак KpbiBi (рэакцыя антыген — антыцела) вядзе да неадваротных змен ф1зжа-х1\ичнага стану мембраны i зшжэннго вел!чыш адмоунага зараду клетачнай паверхш. Дыскутуецца роля гэтых зменау у патагенэзе ¡мунных канфлжтау.

Упешыню з дапамогай метаду клетачнага электрафарэзу на эрытрацытах выяулены шырою спектр антыгенау HLA I класа, установлены раней невядомыя канкурэнтныя узаемаадносшы за звязванне анты-НЬА-антыцелау па.м1ж л1мфацытам1 i трамбацытамь

Прапанаваны просты ушверсальны крытэрый ¡муннага узаемадзеяння у сыстэме HLA, прыдатны для навуковых i пракгычных мэтау.

РЕЗЮМЕ

Янович Э.А. Электрофоретическая подвижность форменных элементов крови при взаимодействии на их поверхности антител и антигенов системы HLA

аналитический электрофорез клеток, анти - Н LA- антител a, HLA-антигены, клетки крови, лимфоциты, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, гранулоциты, тромбоциты, эритроциты, реакция антиген — антитело, электрофоретическая подвижность, ЭФП

В экспериментах in vitro впервые исследована электрофоретическая подвижность (ЭФП) клеток крови человека — лимфоцитов (суммарной популяции, Т- и В-клеток), гранулоцитов, тромбоцитов и эритроцитов при сенсибилизации анти-ША-антителами.

Исследования выполнены с целью изучения ранних этапов контакта антител с клетками-мишенями, а также поиска принципиально нового критерия иммунного взаимодействия в системе HLA и определения с его помощью некоторых закономерностей экспрессии HLA-антигенов на клетках периферической крови.

Использованы методы аналитического электрофореза клеток (цитоферометр фирмы "Opton", ФРГ) и ряд современных иммунологических и серологических методов, основанных на традиционных приемах регистрации реакции антиген—антитело.

Показано, что взаимодействие антител с HLA-антигенными рецепторами клеток крови (реакция антиген — антитело) приводит к необратимым изменениям физико-химического состояния мембраны и уменьшению ЭФП всех типов клеток, и, следовательно, к снижению величины отрицательного заряда клеточной поверхности. Рассмотрена роль этих изменений в патогенезе иммунных конфликтов.

Впервые с помощью метода клеточного электрофореза на эритроцитах выявлен широкий спектр антигенов HLA I класса, установлены ранее неизвестные конкурентные отношения за связывание анти-НЬА-антител между лимфоцитами и тромбоцитами.

Предложен простой универсальный критерий иммунного взаимодействия в системе HLA, применимый в научных и практических целях, технологичный для создания автоматизированных систем для иммунологических исследований.

Resume

Yanovich E.A. Electrophoretic mobility of the blood cells during interaction on its surface of antibodies and antigens of the HLA system

analytical cell elecrophoresis, anti-HLA-antibodies, HLA-antigens, blood cells, lymphocytes, T-lymphocytes, B-lymphocytes, granulocytes, thrombocytes, erythrocytes, electrophoretic mobility, antigen — antibody reaction

Electrophoretic mobility of the blood cells during anti-HLA-antibody sensibilization — lymphocytes (total population, T- and B-cells), granulocytes, thrombocytes, erythrocytes — was investigated.

Experiments were made to study the early period of the contact between antibodies and target cells with the help of new method of regisrtation of such interaction. The expression of HLA-antigens on the the blood cell surface was also studed by this method.

Analytical cell elecrophoresis method (cytopherometer "Opton", Germany) and other modern immunological and serological techniques, based on traditional methods of registration of antigen — antibody interaction, were used.

It has been established that interaction between anti-HLA-antibodies and antigens results in irreversible changes of physico-chemical properties of the cell membrane and decreasing of the cell surface negative charge. The role of this changes in pathogenesis of immune conflicts is discussed.

By analytical cell elecrophoresis it has been established for the first time, that a wide range of I class HLA antigens are expressed on the erythrocytes, and that there are competitive relatonships between the lymphocytes and the thrombocytes for binding of the anti-HLA-antibodies.

It has been proposed a simple criterion for evaluation of immune reactions in HLA system, which is valid for scientific and practical aims.