Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экстракорпорально модифицированные иммунодифициты и использование их для иммунокоррекции

о о я з •

НИШСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ¡ВМУНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 612.112.94:017:1-06:612.111

ПРОЗОРОВСКИЙ Николай Сергеевич

ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНО ЮДОВДРОВАННЫЕ ИММЭТЮЩГШ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИХ ДЛЯ ИММУ1КЖ0РРЕКЦИИ

14.00.36 - аллергология и нммупологил

АВТОРЕФЕРАТ -диссертации на соискание ученой степени доктора медицинск'лх наук

Москва - 1991

Рчбота выполнена В институте иммунологии Минздрава СССР

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор И.С.ГУЩИН доктор медицинских наук В.П.ЛЕСКОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

действительный член АМН СССР, профессор А.Г.ЧУЧАЛШ доктор медицинских наук, профессор А.А.ЯРШ1ЙН доктор медншшских наук Е.Л.НАСОНОВ

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Второй московский, ордена Ленина государстьенный медицинский институт им Н.И.Пирогова

Завита состойся О/СОи&Зи? 199/г. в /У час,

на заседании специализированного Совета Д 074.09.01 но защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское иоссе, 24, корпус 2.

Г. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета доктор биологических наук

А.В.КОЛОБОВ

rv-;. -3.

' Актуальность проблем). Важнейшим направлением развития современной .иммунологии являе-.ся поиск путей регуляции Функциональной

. к .

активности иммунной системы. Это связано прежде всего с тем, что

. .. '.г, i i

выявляется все большее число заболеваний, протекающих с различными (••ормами нарутешй иммунитета, требующими адекватной коррекции (Петров Р.В. и др. 1985, 1989; Покровский В.И. и др. 1979). Сегодняшний уровень иммунологии позволяет Формулировать новые подходы к иммунокоррекции, основанные на точно« знании как механизмов поражения иммунитета, так к механизмов действия самих иммунатропных препаратов, что позволяет осуществлять тонкую регулировку системы иммунитета путем точечной коррекции пораженного звена (Петров Р.В. и др. 193?., 1989; Хаитов P.M. и др. 1982).

Данного результата можно достичь, в конечном итоге, двумя оплозитными путями. Первый - воздействуя только на определенную клеточную популяцию пли на клетки, находящиеся на определенном этапе развития. 6 первую очередь, сюда относится применение медиаторов иммунной системы такта, например, как вятерлейнины (Чередеев А.Н. и др. 3989; Chang Л.Е. et al. 1989), интерферош (De Mayer Е. et al. 1S87; Borden E.G. et al. 1990), ииелогад (Михайлова Л.А. и др. 1989), Факторы тимуса (Арион В.Я. 1990) и ряд i других, имеющих ограниченное число точек приложения, а также комбинированных препаратов типа нммунотоксинов, специфичность действия которых обеспечивается моногслональньми антителами (Петров Р.Е. 1985). -

Принципиально другой путь - использование препаратов широкого спектра действия в условиях ограниченного выбора шшеней. Главнш ,'слсьием данного приема явллотся выделение при помовд тех или иных «•годов ограниченной клеточной популяции с. последующей модификацией )о Функциональной активности и зозпратом в организм >д.чкы из перспективных направлений такого подхода представляется ^пользование принципа введения з организм аутодогичных клеток-

регуляторов (продуцентов медиаторов), активированных in vitro к выполнению тех или иных Функций, продукции тех или иных медиаторов иммунной системы (Лесков В.П. и др. 1985, 1986)

Как известно, клетки-регуляторы иммунной системы (различного рода супрессоры и хелперц) контролируют все иммунологические реакции и модулируя in vitro активность той или иной т популяции, можно весьма прицельно регулировать Функционирование системы иммунитета (Петров Р.В. 1985, Чередеев А.Н. и др. 19В9). Действие таких клеток в организме сугубо специфично и направлено только на Физиологически предназначенные для этого клетки-мишени. В связи с тем что 1слвтки-регуляторы могут существовать в активной Форме длительное время и последовательно передавать сигнал нескольким эффекторным клеткам, введение в органмг относительно небольшого числа клеток-регуляторов может оказать значительное воздействие на Функцию иммунной системы в целом. К тому же применение активированных in vitro клеток-продуцентов медиаторов обладает целым рядом достоинств перед применением самих медиаторов в растворимой Форме. Во-первых, исключается рассеивание медиатора по всему организму и клетки-регуляторы, выступая как бы в Форме естественного депо, доставляют медиатор ь требуемые точки организма. Во-вторых, высокие локальнне концентрации медиатора, возникающие вокруг клетки-ироду-цента, способствуют более полноценней активации клеток-мизюней. В-уретьих, в целях активации клеток-регуляторов могут использоваться вещества, применение которых in vivo невозможно, либо лекарственные препараты в дозах намного превышающих, допустимые при ввэдеиад in vivo. В-четвертых, возможен строгий учет всех параметров стимуляции клеток и контроль эффективности этого процесса.

Целью настоящей работы была разработка и апробация нового приема иммукокодуляции, основанного на индукции in vitro клеток-регуляторов п его модификаций, а также разработка подходов к созданию новой оригинальной группы иммунокоррегируклцих препаратов

la основа Фиксированных на корпускулярной носителе биологически штивных соединений (искусственные.клетки-регуляторы).

На основании проведенного исследования предлагается новое ручное направлет:е, состоящее о создании иымунокоррегирующих ■репаратов базирующихся на использовании биологически активных юединении, их Фрагментов или их комбинации в фиксированной (сор-ированнсй) на корпускулярном носителе форме. -

В процессе проведения исследований решались следующие задачи:

1. Обосновать выбор типа клеток-регуляторсз для исследования.

2. Подобрать экспериментальные модели in vivo и in vitro, риыенимые для оценки активации хлеток-регуляторов in vitro.

3. Исследовать условия и параметры активации клэток-рйгуллто-зв in vitro.

4. В модельных системах in vitro и 'in vivo провести исследо-шие эффективности приема иммунокоррекции, основанного на исполь-звании активированных клеток-регуляторов.

5. Экспериментально обосновать возможности создания искус-гвенных клеток-регуляторов путем фиксации на корпуаеулярком нсси->ле биологически активных соединений.

6. Провести клиническую апробацию приема ишунокоррекции с , пользованием стимулированных вне организма клеток-пегуллторов

•а

больных С различны®! НОЗОЛОГ11Я1/И.

?. Оценить оФ£ектинность клинического применения метода.

Поставленные задачи решались с помощь» следующих базовых. торов: оценка пролиферативной активности иммунокомгетенткых етск. продукции ши медиаторов иммунной системы и определенно тивности-естественных клеток-киллеров анализ Функциональной тирнооти клеток-регуляторов иммунной системы в условиях in vitro in vivo, метоцк твердофазного ишуно$ермег-,ного анализа, Ерка и ".©деления высвобождения гистамина из клетох-мишене?. аллергия, а еже исследование эффективности лечебного применения модиФициро-

ванных клеток-регуляторов в модельных системах in vivo.

Научная новизна работы. .....

Впервые показано, что регуляторная активность стимулированных диуцифонои клеток-регуляторов опосредуется интерлейкином-2. Определены концентрационные и временные параметры, оптимальные для индукции этого процесса. Эффективность лечебного применения активированных диуцифонои иммуиоцитов в условиях адоптивного переноса показана на примере экспериментальной терапии животных с ожоговой травмой и вирусными инфекциями. Установлены ограничения для применения активированных диуцифоноы ишуноцитод в случае некоторых острых вирусных инфекций.

Впервые показано, что иммуномодулирущее действие активированных диуцифоноы, циклогексимидом и интерфероном-альфа шмуноцитов, а также перигонеалышх тучных клеток крыс определяется, по крайней мере, двумя механизмами: во-первых, за счет секреции растворимых продуктов во внеклеточную среду и, во-вторых, за счет представления фиксированной Формы медиатора на мембране клетки регулятора. Впервые показано, что интерлейкин-2 в форме, Фиксированной на корпускулярном носителе, сохраняет свою биологическую активность.

Впервые продемонстрировано прямое гистаминвысвоболщающее, действие мононкуклеаршх клеток больных атопическим дерматитом и бронхиальной астмой в период обострения заболевания и показана возможности индукции Фармакологическими препаратами клеток-регу-ллторов, блокирующих указанное действие клеток больных.

Впервые показана высокая терапевтическая эффективность иммуно-коррекции с использованием аутологичкых индуцированных диуциФоном ■ слэток продуцентов интерлейкина-2 у больных вторичными иммунодефк-циташ (синдром Лайела, тяжелый атопичеснии синдром, хронический гнойный холангит). Продемонстрирована также, терапевтическая эффективность применения аутолсгичтк модифицированных преднизолс-ном и витамином Ь12 мояонуклеарных клетск у больньл с атопическим

г 7.

дерматитом и бронхиальной астмой.

Практическая ценность результатов. .

Разработаны принципиально новые подходы к иммунокоррегирущей терапии, состоящие, с одной стороны, в адоптивном переносе экстракорпорально индуцированных клеток-продуцентов регуляторных медиаторов и, с другой сторони, в использовании таких медиаторов в.Фиксированной на корпускулярных носителях Форме. Окспериментально обоснованы пути использования адоптивной терапии Фармакологически модифицированными клетками при аллергических состояниях как путем модуляции иммунологической, так и патохимической стадии аллергического процесса. Клинические испытания показали перспективность терапевтического применения при иммунопатологических и аллергических заболеваниях адоптивного переноса аутологичных модифицированных определенным образом клеток-регуляторов реакций аллергии и иммунитета.

Материалы диссертации опубликована в 22 работах, из них 9 -в центральных журналах, 13 - в сборниках трудов.

Внедрение в практику. '

Разаработаняый метод имыуйокоррекцин с использованием клеток-регуляторов, модифицированных in vitro диуцпфоноы, внедрен в ; практику работы отделений общей аллергии и реанимации Института ' иммунологии Минздрава СССР для лечения больных с тяжелым атоническим синдромом, синдромом Лайела и хроническим гнойным холангитом. Совместно с коллективом авторов получено авторское свидетельство К 1311733 "Способ лечения гнойной кожной инфекция при атопическсм дерматите" С 1987г. ) и выпушены всесоюзные методические рекомендации 'Острые токсико-аллергическио реакций на медикаменты" (утверждены Ьшздравом СССР в 1988г.). Работа отмечена премией Ленинского сомамола (1987) и золотой медалью ВДНХ СССР '1987):

Метод лечения аллергических забалеЕаний с применением клоток-»егуляторов, стимулированных внеоргатзмапредниэолоном и ситами-

• . 3-

ном В12, внедрен в практику работы отделения общей аллергии Института иммунологии Минздрава СССР для лечения больных с гормонозави-симыми Формами атопического дерматита и бронхиальной астмы. С коллективом авторов подана заявка ни изобретение N 4915717/14 (18982) "Способ лочения глюкокортикостероидозависимых заболеваний" (1991г.).

На защиту выносятся следующие основные положения:

Экстракорпоральная ишунофариакотерапяя с применением активированных дауциФоном клеток-продуцентов интерлейкина-2 является высокоэффективным иммунокоррегирующим приемом при вторичных ш-мунодефицитных состояниях.

В основе патогеназа некоторых аллергических заболеваний лежит прямое гистаминвывобовдаюп;ее действие м.нонуклеарных клеток, которое блокируется обработкой клеток предоизолоноы в комбинации с, витамином В12. Такие обработанные лимфоциты приобретают свойства клеток-регуляторов и способны тормозить гистамшвысвобождающее действие интактных лимфоцитов. Введение аутологичных обработанных преднизолонои н витамином В12 иононуклеарных клеток больным с гор-монозависимыми формами атопического дерматита и бронхиальной астмы

оказывало выраженное лечебное действие, в

В основе механизма действия различного рода клеток-регуляторов иммунной системы лежит участие меыбран-ассоциированных молекул, в том числе, иитерлейкина-2. Передача сигнала при этом происходит в процессе прямого взаимодействия клеток-регуляторов с клеткаш-акцептораыи при участии таких ыеибран-ассоциироЕанных структур. Данный тип регуляции в достаточной степени универсален. Тот факт, что ичтерлейкин-2 сохраняет после фиксации на мембране эритроцитов свои биологические свойства позволяет рассчитывать на создание нового типа иымунокоррегирущих препаратов на основе медиаторов иммунной системы, их Фрагментов или их различных сочетании на корпускулярное носителе.

Апробация работа. -

Материалы диссертации доложены на XIX и XX конференциях Европейского общества по исследованию гисташна (Куопио 1990, Марбург 1S91 ), международном симпозиуме "Регуляция и клиническое значение IgE" (Москва, 1990), I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989), Всемирном конгрессе патофизиологов (Москва, 1991), Всесоюзной конференции с международным участием "Ичмунодефициты и аллергия" (Москва, 1986), конференции "Актуальные проблемы иммунологии" (Владивосток, 1987), конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии (Москва, 1987), конференции "Актуальные вопросы клишческой и экспериментальной аллергологии и иммунологии" (Каунас, 1986), Апробация диссертации проведена на заседании секции H 2 Ученого совета Института иммунологии Минздрава СССР (1991).

Объем и структура диссертации.

Работа сост ит из введения, обзора литературы, 5 глаз собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа излокеиа на 236 страницах машинописи. Библиография включает 341 источника, из них 61 публикация отечественных и 280 публикаций зарубежных авторов. ,

КЖШ-РШУЛЯТОРИ, ЭДЩЙРОБА.ЧККЕ ДИУЩКЯЮМ.

Ранее установлено, что иммукостинулятор диуцифон способен шдуцировать продукцию КНК человека зеществэ с активностью фактора ■оста 'Г-клеток (Лескоп В.П. и др. 198S). Исследования Функциональней активности МНК человека, стимулированных диуциФоном « родукции Фактора роста Т-клеток, показали, что такие Ш1К более увстЕИталыш к воздействию митогенов, а будучи добавленными в уо'ьтуру интактпых аутологичкых клеток, усиливают пролиФератив-»■й ответ последних на ФГА (Лесков В.11. я др. 1SB5V. Это.позволило ^сказать предположение о потенциальой возможности применения таких шток в клинической практике в целях иммуиокоррекцчи (Лесков В.П.,

1986). •

Вместе с тем, до начала клинических испытаний метода следовало идентифицировать природу Фактора, выделяющегося из клеток, стимулированных диуцифонок, исследовать основные параметры этого процесса и определить оптимальные условия активации клеток, а также сопоставить способность клеток к продукции этого Фактора и оказанию модулирующего действия на доугие клетки. Важно' было также осуществить анализ возможных механизмов, участвующих в реализации модулирующей активности стимулированных препаратом клеток и исследовать эффективность действия таких клето* в различных экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

Результаты тестирования в системе клеток CTLL-2 супернатантов стимулированных диуцифоном в концентрациях 10 и 50 мкг/мл МНК периферической крови 7 разных доноров свидетельствовали о тои, что во всех случаях в них обнаруживалась ростовая активность, что позволило идентифицировать секретируемый клетками Фактор как ИД2. Параллельная оценка способности ИНК 3 доноров продуцировать Ш12 и оказывать стимулирующее действие на штоген-индуцированную пролиферацию аутологичшх КНК после стимуляции их различными концентрациями диуцифона показала, что и максимальный уровень продукции клетками ИЛ2 и максимум их стимулирующей активности приходится на один и тот же диапазон концентраций препарата (10 - 50 мкг/мл) . Вместе с тем, уровень стимулирующей активности, как оказалось, был непропорционален содержания) Щ2 в сулернатаятах. Так, близкие по значению уровни стимулирующей активности достигались как при относительно низком, так и при высоком уровне секреции JW!2 i рис. 1а и рис. 16 соответственно). Мохно также отметить, что, с одной стороны, э 2чительная стимулирузовая активность имела мйсто при отсутствии определяемых.количеств ИД2 Б супернатантах Срис. 1а, концентрация диуцифона 1 ыкг/мл), а, с другой стороны, значительное содержание. ИЛ2 не сопровождалось появлением стицулирующей активное -ти актив!зровашз4х диуцифоном (1 мкг/мл) МНК (рис. 16). Дальяейшз

наш исследования подтвердили отсутствие прямой связи между накоплением ИЛ2 в супернатаите стимулированных диуцифоном МНК к проявлением стимулирующей активности клеток in vitro. Анализ зависимости этих показателей от времени контакта МНК с диуцифоном позволил установить, что и тот и другой процессы максимальны в случае 3-х часовой преинкубации с препаратом, однако резкое падение содержания № в супернатантах при L-ти часовой преинкубации с препаратом не сопровождалось отменой или существенным снижением стймулирущей активности МНК.

* МО, Л

Н

Or-

м

и 1

£5 »

н о

Qi lOOf *

Я <

О с*

В

loe ф

<

•a g О

н в в

to SO 100 1

Д Ш У B¡ И <S> О К (ЛКГ/МЛ)

i-I-«■

« 10 н «о

РЙО. 1 Зависимость продукции интерлейкина 2 и проявления хелпер-ной активности стимулированных диуцифсном МНК от концентрации препарата.

По с си абсцисс - концентрация диуцяфона (мкг/мл). По оси ординат - уровень пролиферативнсго ответа шток CTLL-2 в процентах к контролю в присутствии оупернатзнтон стимулированных диуиифонои МНК (левая шкала, кривая 1) и пролифетатиацый ответ интактных МНК в присутствии IOS клеток, обоаботанннх диуцифоном (правая шкала, кривая 2). На А,Б и В - соответствующе показатели МНК ó разных дочорсв.

Функциональная активность шмунокомпетентных клеток (ИКЮ, обработанных диуцифоном, не ограничивается костимулирущим эффектом в отношении ыитоген-индуцированной пролиферации лимфоцитов. Так, в экспериментах было показано, что диуцифон сам по себе (рис 2а), а также МВД, стимулированные препаратом (рис. 26), обладали способностью усиливать ЕК-активность. Как хорошо видно, характер действия диуцифона при непосредственном внесении в культуру (50 мкг/мл) иди 10% обработанных им клеток на этот процесс был сходным. Существенным моментом для проявления модулирующего действия диуцифона и обработанных и« клеток являлась длительность их воздействия (контакта) на интактяые NHK перед добавлением клеток-мишеней. Усиление ЕК-активности было существенно выше в том случае, когда внесение клеток-мишеней MOLT-4 происходило через 4 часов после контакта МНК с диуцифоноц или после внесения 10% обработанных клеток. Такой характер действия может косвенно свиде тельствовать о том, что и сам диуцифон, и обработанные им МНК вызывают накопление ЛАК-клеток, требующих для своей индукции знач тельного промежутка времени (Rosenberg S., 1985).

Полученные данные позволили уточнить способ действия диуцифона на МНК человека. Исследование свойств биологической активности, продуцируемой клетками, обработанными диуциФоноу, на клетках ИЛзависимой линии впервые позволило однозначно идентифу цирорать ее как ИЛ2. Параллельное исследование хелперной активное стимулированных диуцифоном клеток in vitro и продукции ими ИЛ 2 дг основание говорить, что оба эти процесса индуцируются препаратом одних и тех же диапазонах доз и эта дозы оказываются практически одинаковыми для разных доноров. Последний результат имел крайне важное значение, поскольку позволял использовать препарат для индукции клеток-регуляторов во зремя лечебных процедур в узких пределах концентраций (2Ь - 50 мкг/мл) без индивидуального подбо;

200-л

Д (раствор)

Hi

DIO 950

DfO 1)50

-24 ч

3ИС.2 Зависимость услиливающего действия диуцифока и обработанных им клеток от времени преинкубация перед внесением клеток-мишеней M0LT-4 на ЕК-активность КНК человека.

По оси ординат - уровень ЕК-активности экспериментальных культ •ур МНК. выраженный в процентах к таковому контрольных интактных :ультур МШ (А) или культур МНК с внесенными туда 10S преинкубиро-анных без дауцифона клеток (Б). По оси ординат - концентрации иуцифона (10 и 50 мкг/мл), использованные при прямом внесении в ультуру (А), или при обработке клеток (Б). На рисунке отмечены ультуры МНК, преннкубкрованше с диуциФоном (А), или с 10% ктивированных диуцифоном (Б) клеток в течение 24 (темные столбики) ли 48 (светлые столбики) часов перед внесением клеток-мишеней 0LT-4. Соотношение клетск-мишекей к МНК в культуре - 1 : 6.

Полученные результаты расширили также представление о ,'нкциона.пь.ной активности обработанных диуцифоном клеток. Их юсобнгсть усиливать ЕК-активность представляется весьма важной в iane потенциальной эффективности использования таких клетсч для ¡чения онкологических заболеваний и является косвенным псцтзержда-1см сходства действующего начала этих клеток и Vi Л?., также способ-го усиливать ЕК-активность (Rosenberg et al. 1936).

В дополнение к экспериментальным данным, полученным в отношении Функциональной активности активированных диуцифоном '.'Ж на моделях in vitro, нами было предпринято исследование эффективности их действия in vivo. Как уже указывалось, основным критерием выбора моделей для этого было Формирование и ведущая роль иммуно-дефицитньх состояний в развитии экспериментального патологического процесса.

Хорошо известно, что комплекс повреждающих Факторов ожогового поражения и послеожогового периода вызывает нарушения Функции систоиы иммунитета (Echinard С.Е. et al. 1287). Последние, в свою очередь, обусловливают нарушения репаративных процессов и у тягол е-утяжеление течения присоединяющейся вторичной инфекции. В связи с этим оправданный было испытание возмог ости применения активированных диуцифоном клеток-регуляторов для экспериментальной терапии животных, подвергнутых ожоговой травме и инфицированных синегнойной палочкой. В этих опытах у мышей СВА на следующие сутки после ожога и инфицирования выделяли КС и после обработки 100 ыкг/н-к диуцпФона и отмывки возвращали в/в животным той же группы в количеств 5 шн/ыыть. Показали,-что перенос необработашшх препаратом спленоци-тов не изменял продолжительности жизни (68,3+7,3% против 6S,<U7,7% выживших животных в основной контрольной группе) Вместе с тем,, перенос КС, обработанных диуцифоном, обладал значительным защитны« эффектом. В этой груше выживаемость мшей била существенно выше, чем в 2 остальных и составила 91 3¿3,4S (p<0,00i). У мышей после переноса обработанных диуцифоном спленоцитов достоверно повышался пролиферативкый ответ КС на субоптимальные дозы митогенов и Ш12, а также в 1,5 раза ускорялись сроки заживления рак.

Другой системой, в которой наш было исследовано лечебное действие обработанных диуцифоном 1IKK явилась модель острой гриппозной инфекции. Известно, что гибель иксей при заражении вирусом гриппа происходит, как правило, вследствие развития нммунодефицитного

состояния и присоединения вторичной инфекции в форме тяжелой геморрагической пневмонии (Denroan A. et al. 19ВЗ). Поэтому можно было ожидать, что стимуляция иммунитета за счет введения в организм клеток-продуцектсв ИЛ2 может в какой-то степени компенсировать эти : арушения и предотвратить гибель животных.

В ваших экспериментах мышей СВА интраназально заражали LD 50 штамма вируса WSN. На следующий день после заражения часть мнией была использована для получения КС, которые впоследствии инкубировали без или в присутствии 100 мкг/мл диуцифона, отмывали и вводи-

6

ли в/в в количестве 5 х 10 животным из той же группы. Результаты учитывались на 14 сутки.

Во всех 5 опытах введение обработанных диуцифоном клеток снижало гибель жшоткых в среднем на 20% (с 75% в контроле и 71,6% в группе, получавшей необработанные, клетки до 50% в экспериментальной группе).

Известно, что в отличие от острой гриппозной инфекции, при которой гибель животных в большей степени зависит от инфекционных осложнений (Семенов Бп др. 1939) и, как следует из наших данных, поддающейся в связи с этим леченжо при поыоци клеток-продуцентов I1JI2, существует целый ряд вирусных заболеваний, при которыхÍ причиной гибели является поражение вирусом жизненно важных органов и тканей. Очевидно, что усиление клеточной цитотоксичности, опосредуемое клетками-продуцентами 1UI2,может в этом случае способствовать усилении гибели. Подтверждение« тому являются результаты, (ссученные на модем инфекции, вызванной у морских свинок вирусом •оиоррагическсй лихорадки Марбург. В этих экспериментах воспроизве-1ение лихорадки осуществляли в/б заражение« морских свинок вирусом ярбург в дозе 8 LD 50. Через 3 ч. после заражения у животных олучали стандартным методом выделения на градиенте Фиколл-верогра-ана МЯК, обрабатывали по стандартной методике диуцифоном (25 ír/мл) вводили после отмывки тек же аииоткы. Параллельно аценива-

ли изменение пролиферативной активности Ш1К этих же животных до и на 1, 3 и 5 сутки после инфицирования и переноса клеток.

Введение МНК, обработанных диуциФоноы, достоверно и существенно снижало продолжительность жизни животных, причем эта же процедура вызывала достоверное увеличение, спонтанной пролиферативной активности МНК животных в этой rpyraie на 3 и 5 сутки. По всей видимости, усиление гибели животных в экспериментальной группй может быть связано с повышением пролиферативной активности эффекторных лимфоцитов in vivo под действием стимулированных диуциФоном клеток-продуцентов ИЛ2. Это, в свою очередь, приводит к усилению цитотрксичностп в отношении клеток органов-мишеней, инфицированных вирусом, и ускорению гибели животных.

Т.о., полученные нами результаты ппволяют сделать вывод о том, что клетки, обработанные диуциФоном, способны оказывать иммуномодулирувдее действие in vitro и in vivo. Представляется, что такая процедура введения в организм,клеток-продуцентов ЙЙ2 наиболее оправдана при вторичных тшунодефицитных состояниях, лежащих в патогенеза того или иного заболевания. Очевидно, что стимулирующее действие клеток-продуцентов ИЛ2 окажет в этом случае положительное злияние. Напротив, в тех случаях, когда иммунная

а

система сама участвует в деструктивных процессах, дополнительное стиму.тщрузоцее воздействие может отрицательно сказаться на течении заболевания.

МЕДИАТОРЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ НА КОРПУСКУЛЯРНОМ НОСИТЕЛЕ КАК

МОДЕЛЬ КЛЕТОК-РЕГУЛЯТОРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ.

Ранее показано, что на существует полного совпадения мзжду хелперной активностью клеток, обработанных диуциФоном, и уровнем продукции ;ми Ш12. Данный Феномен может иметь, по крайней маре, три возможных объясигнкя. Во-перьых, не исключено, что .диуциФон помимо продукта1. ИЛ2 способен индуцпрозать'продукцию «ли секрецию иных биологически активных соединений, действие которых не рэгкстриру-

ется о системе клеток ИЛ2-зависимой линии. Во-вторых, продукция стимулированными диуцифоном клетками ИЛ2 носит дискретный характер. В связи с этим Функционально значимой для осуществления действия клеток-регуляторов можеть Быть продукция ИЛ2 за пределами исследованных промежутков времени. И, наконец, в-третьих, секреция U12 может не являться обязательным условием проявления активности теток-регуляторов. Кзвесчно, что передача сигнала от клетки-проду-1ента ИЛ2 клетке-акцептору может осуществляться в процессе межклеточного взаимодействия (Steinmann et al. 1384). Поэтому, вероятно, >ункция клеток-регуляторов в большей степени опосредуется [омбран-ассоциированной, нежели растворимой Формой ИЛ2. Принимая о внимание тот Фа>?т, что существование г.:ембран-ассоциированной ормы ИЛ2. показано (Kaplan D.R. et al. 1988), можно предположить, то и в случае с клетоками-регулятораш, спшулированными диуциФс-ом, экспрессирозанные на их мембране структуры могут пршишать -гастие в механик je действия таких клеток.

Мы предприняли попытку ответить- па этот вопрос. С этой целью

Dt человека были стимулированы к продукции ИД 2 диувдфоном и

^Фиксированы глютаротш альдегидом (ГА) для предотвращения синтеза

секрецш ими растворимых продуктов. Затем такие Фиксированные 1

в*

¡етки были внесены в культуру интшгпшх стимулированных митогеном тологичных KHK и оценено их ишунорегуляторное дейг.тние. На р»;с. 3 едставлены результаты параллельного исследования в ауто.топтчно:': стеме холперной активности 5% МКК-Дц необработанные (рис. За) и работанных (рис. 36) 0,253! ГЛ (ИЖ-ДцГА).

Как следует из рис. За,б, как так и Фиксированные ГА

способны оказывать достоверное стимулирующее действие на жиФератквнш ответ интактных стимулирозакных ФГА МНК. ¡доьательно, МПК-ДцГА, неспособны?, ироцуциро ать растворимые татора, изменяют, тем не менее, пролкфэратквкый ответ. Вероятно, ализм их действия связан с экспрессированнчми на таких клетках

мембранными структурами белковой природа. Об этом свидетельствуют данные, представленные на рис. Зв. В этих экспериментах МНК были обработаны 100 мкг/мл трипсина'(30 мин., 37*с) до или после инкуба" ции с диуцифоном, зафиксированы ГА так же как и контрольные нетрипсинизированныа МНК-ДцГА и внесены в количестве 5Х в культуру свсж.выделенных аутологичных ИНК, стимулированных $ГА. Как видно, трип синизация клеток после стимуляции диуцифоном полностью отменяла их усиливающее действие, в то время как трипсшшзация, предсест-вовавшая периоду инкубации с. препаратом лишь снижала этот эффект. С большой долей вероятности можно предположить, что стимулирующее действие МНК-ДцГА осуществляется благодаря взаимодействию таких клеток с иитактньыи МНК посредством рецептора к 1U12. Показано, что внесение в культуру клеток цоноклоналылх анти-Тас антител, направлешшх против рецептора к Ш12, зависимым от дозы способом, отменяло усиливающее действие МНК-ДцГА.

Помимо экспериментов in vitro) изучено действие ДцГА-клеток в модельной системе in vivo. Получение дашша свидетельствуют, что и в этой случае стимулированные диуцифоном и фиксированные ГА клетки селезенки щлпей обладали иммуностимулирующей активностью. В этта экспериментах у интактных ышей СБА. получали клетки селезенки (КС), обработывали по стандартной ' методике диуцифоном (100 :жг/мл, 3 часа), фиксировали 0,25% ГА, отминали и вводили в/в животным одновременно с в/б иммунизацией 10 мкг./иыыь овальбумдт. Контрольным животным вводили преинкубирован-ные фиксированные ГА КС. Черз 3 недели тавотных повторно иммунизировали овальбумином. Введение мышам КС-ДцГА существенно понышало уровень IgC- антител к овальбумину на 15-21 сутки после первой иммунизации и резко усиливало антителообразозаше на 5-10 суткл после повторной иммунизации.

7. о., полученные нами данные согласуются с предположением о том, что механизм имыунорегуляторного действия клеток, обработанных

диуциФоном, может быть обусловлен не только секрецией Ю12, как это предполагалось ранее, но и экспрессией в процессе инкубации с препаратом мембран-ассоциированной Формы ЙЛ2. Есть основания полагать, что Передача сигнала посредством мембран-ассоциированных <*ч>рм медиаторов, а не секреция медиаторов во внешнюю среду является весьма распространенной- Такая точечная передача сигнала от клетки к клетке не затрагивает никаких других систем, органов иди клеток. Это положение может отчасти служить объяснением выявляемого многообразия Функций медиаторов иммунной системы.

30'

20-

а -с

<Ь

!

=5>

Со

€ §

а

* *

10

* *

В

4,

I

5 Ю

5 Ю 20

Д ДГ ТД

ИС.З Влияние обработки стимулированных циуцкфоком МНК гдаотаровым альдегидом и трет окном на проявление их модулирующей активности. ,

По оси ординат - индекс усиления нролкфератчвного ответа культы МНК. з присутствии обработанных диуциФоном ШК л о отношению к левому культур МНК в присутствии культивированных без препарата 'л го к, вяраженньй в процентах. На А - проинкубированные без или в итоутстаии 50 мкг/мл диущчфона КИК внесены а культуру аут о логичных !етск без Зяксадаи Г'Д- На Б - такие же клеткг внесены в культуру юле Фиксации ах 0,125?« раствором ГА. На В - культуры МНК, держащие 53С Фиксированных ГА клеток, предварительно обработанных уциФоном (Д) или в разной последовательности диуциФоном и ипсикоч (ДТ), или трипсином и дауциФонок (ТД). На. А и Б указано оцентное содержание Фиксированных .слеток в культуре.

О том, что имыунорегуляторкое действие клеток может быть опосредовано на секретируемыш медиаторами, а именно мембранными структурами и что выявленные наш закономерности действия стимулированных диуцифоном зафиксированных иммунокомлатентных клеток (ИКК) не'являются исключением, свидетельствует целый ряд данных, полученных наш в иных модельных системах.

В качестве препарата, который йог бы вызвать индукцию клеток с имыунорегуляториой активностью был выбран циклогексимид. Выбор был обусловлен его способностью вызывать супериндукцию ИЛ2 в лимфоцитах (Efrat S. et al. 1984) и изменять экспрессию некоторых вспомогательных молекул взаимодействия (Cavender D. et al. 19S7). С целью проверки возможности генерации под действием 1JT клеток, способных оказывать ишунорегуляторноо действие, " нормальный интакишм КС мышей СБА добавляли 10 X КС, обработанных ЦТ в стандартных условиях ( 3 часа, 37°а ) ц отмытых. Как видно из таблицы N 1 .добавление 10Х КС, обработанных ЦТ (КС-ЦТ) приводило к значительному увеличению пролиферативной реакции смеси нормальных КС и КС-ЦГ, а Фиксация таких клеток ГА не отменяла их стимулирующей активности (Табл.2 ).

. „ Таблица 1 Исследование пролиферативной реакции на ФГА смеси нормальных и обработанных цдаслогексимидом клеток селезенки шшеи СБА.

номер клетки в Уровень пролиферативной реакции на дозы ФГА группы культуре 1,25 мкг/мл 2,5 мкг/мл 5 мкг/мл

1. НКС 3625 i 546 11283 i 2720 30183+3450

2. ИКС ■> 10.4 КС-В 48С2 i 526 16662 ± 1370 40658 £ 3700

3. 1 .С + 10Х КС-ЦГО,2 8757 i 2В623 i 3558 50S93 ± 2280

4. НКС + 10* КС-ЦП 7887 i 193 34075 ± 6773 44422 i 4590

Примечаниэ: Представлены значения включения метки, выраженные в ихтулъсах в минуту. КС-Б - нормальные КС, преиняубированиые без ЦГ; КС-1ДХ), 2 и КС-ЦП - КС, обработанные циклогексимидои в концентрациях 0,2 и 1 мкг/ыл соответственно. В грушах 1-3 р<0,05.

Таблица 2

Влияние Фиксированных глютаровым альдегидом клеток-усилителей на пролиферативный ответ иммуноцитов на ФГД.

номер гоуппы Клетки в Пролиферативный ответ ИКС при добавлении КС-ЦТ культуре необработанных ГА обработанных ГА

1. ИКС + КС-В 24930 ± 8694 33697 i 12510

2. ИКС + КС-ЦГ1 о4138 ¿ 1994 42162 i 8915

3. ЖС + КС-ЦГЗ 73342 * 4252 94524 t 483

Примечание: обозначения групп - аналогичное таблица . Уровень пролиферативной реакции ШС составлял 25В68 - 4358. Достоверные различия - между группами 1 и 3. Доза ФГА - 5 мкг/мл.

Сходный данные были получены и при исследовании влияния мононукелеаров чзлоЕека, обработанных in vitro ЦТ, на пролифера-тивнуге реакций аутологичных клеток периферической крови на ФГА.

Серии экспериментов in vivo показали,' что введение мкшам 6

ЗШУс 5x10 КС, инкубированных с ЦТ в течение 3 часов и

многократно отмы.ых от препарата одновременно с эритроцитами барана

6

иммунизирующая доза - 2x10 на шшь) приводило к более чем юстикратному увеличению иммунной реакции по сравнению с контролем мыш ползавшие только эритроциты). Исследование рож мембранассо-шроианних структур, активированных ЦТ клеток-усилителей в тимуляции иммунного ответа реципиентов, прс . ¡монстрировало, что нкубкровачные в присутствии ЦТ и Фиксированные ГА клетки злеэзнки, усилизаит иммунный ответ иктактннх реципиентов в той э степени, что и нефиксированные обработанные ЦГ ¿ммфоппты.

Т.о., полученные каш результата о характере дейстзия клетск-iryлятооов, стимулированных ЦГ к, прежде вссго, о возможности хранения кх Функциональной активности после фиксации глютаровым ьдегидом хорошо согласуются с приведенными выко данными а отно-ниь механизма кммунорегуляториогс эФФ^к^а с-имулированных уциФоном клеток продуцентов ИЛ2. Вероятно, б обоих случаях рочь ít of; участии в процессах иммунорегуляции не только растворимых

Факторов, но и мембранных структур, экспрессирукицихся или трансформирующихся в процессе инкубации клеток со стимулирующими агентами, и модулирующих иммунологические реакции в процессе взаимодействия клеток регуляторного и эффекторного звена иммунитета ■.

Еще одним подтверждением универсальности механизмов участия повгрхностных структур Iелеток в регуляции иммунологических процессов стали результаты, полученные нами в отношении участия обработанных рекоыбшшшшм интерфероном-альфа (РФ) ШК человека в регуляции синтеза IgE in vitro. Как и следовало оздцать, в соответствии с литературными данными (Delespesse G. et al. 1989; Romagnani S. 1990), РФ оказывал в случае прямого внесения в культуру тормозящее действие на спонташ jfl синтез IgE МНК здорового донора и больных атопическш дерматитом. Совершенно иная ситуация имела место в случае добавления 20% обработанных РФ клеток (7-1НК-РФ) в культуру аутологишгых интакт1шх М1ПС. Тшше клетки способны были стимулировать продукцию IgE у тех же самых доноров, у которых прямое внесение РФ оказывало тормозящее действие. Стимулирующее действие МЖ-РФ имело место только у доноров с уже запущенным аштезом. IgE, т.е. в случае оадтимого спонтанного синтеза IgE в культуре, но не у доноров, у которых спонтанный синтез IgE . ' отсутствовал. Фиксация МНК-РФ 0,1-0,2% раствором глютарового альдегида, так же как и в случае клеток-регуляторов, стимулированных днуиифоном и цнклогексимидом, не отменяла их активности.

По всей видимости, преинкубацяя клеток с РФ ведет к увеличению экспрессии па клетках антигенов П класса или других структур, принимающие участие в регуляции IsS-ответа При отом для проявления биологического действия таких клеток ка синтез Ig£ не требуется секреции растворкмых медиаторов, а передача сигнала осуществляется в процессе прямого взаимодействия МНК-РФ с клеткаки-мшгенякк с участием упомянутых структур, выступающие в роли мембрая-асссцлиро-'ванннх мгдиаюрол, ■ -

Известно, что тучные клетки (ТК), основные клетки-мишени эФ-фекторной Фазы аллергических реакций, опосредуют внешние проявления реакций аллергии и воспаления. Исследованиями последних лет показан широкий спектр Функциональных возможностей ТО, а также их связь с "ммунокоупетентными клетками (ККК) и с развитием иммунологических процессов (Ferguson Л. et al. 1987; Plaut М. et al. 1939). В.нашей работе в системе in vitro исследовано влияние крысиных перитонеаль-ных та на спонтанную и Т-митогениндуцированную пролиферашзо 'ЛКК, полученных из разных лимфоидных органов крыс, и предпринята попытка анализа механизмов иммунорегуляторного действия ТК. Данные, представленные на рис.4 , показывают, что в пределах испытанных концентраций ТК оказывали зависимое от их концентрации усиливающее действие на спонтанную пролиферацию КС и ИКК из лимфатических узлов (рис,4а), а также на пролиферации этих клеток, вызванную КонА (рис.4б), но существенно не влияли на спонтанную и митогек-индуцированную пролиферацию тимоцитов. При этом не било обнаружено генетической рестрикции дейс-ТЕИя ТО.

Исследование влияния супернатантов, нреичкубнрозашпас различные промежутки врэмогл ТК (полная SPKI-1G40, 37"с, 1 млн ТК в мл) на нролифере.тивный ответ КС и содержание в них гнстаыина показало, . что супернатянтн ТК стимулировали спонтгишый д вызванный ФГА пролиферативный ответ КС, причем уровень стимулирующей активности супернатзнтов от ТК прекнкубировакинх 1 минуту и 73. часа был идентичен. 3 то ,-ке время содержание гистамина.в зтих супернатзнтах неуклонно росло от 3% до 60% медиатора, содержавшегося в ТК.

Полученные результаты позволяли сделать вывод о том, что ■ммукомодулирущая активность ТК не обусловлена, вероятно, гысвобожцением гнстакимна и что эта активность появляется в ;уперкатаитах практически моментально после н'чала инкубации ТК. !оследнее обстоятельство свидетельствовало о том, что 'ГК спонтанно :екретируыт активность, которая ужа предсущептвует в клетках к

моменту начала культивирования. Однако, вопрос о том, является ли эта секреция активным энергозависимым процессом оставался открытым.

РИС.4 Влияние тучных клеток крысы на пролиФеративный ответ ИКК.

«в

По оси абсцисс - число тучных клеток, вносимых в культуру ИКК. По оси ордашат - коэффициент стимуляции спонтанной (А) и КонА-индуцированной (Б) пролиферации ИКК, полученных из селезенки ( • ), лимфоузлов С » ) и тимуса ( а ) в присутствии тучных клеток. Представлены результаты одного из трех репрезентативных опытов.

С целью проверки этого предположения наш были получены супернатанты 'ГК через различные промежутки времени инкубации, их при 37". 20* и 4*с. Оказалось, что супернатанты ТК, полученные при всех темпе, ггурных режима;: обладали абсолютно одинаковой активностью в отнопеник спонтанной и ФГА-индуцированной пролиферации КС, причем даже 10-ти секундного интервала присутствия ТК в среде было вполне достаточно для проявления максимального уровня иммуностимулирующей активности.

Т.о., можно сдолать вывод о том, что появление иммуностимулирующей активности в супернатантах ТК является пассивным, неэнерго-зависимым процессом. Вместе с тем, тот Факт, что содержание гистамина в супернатантах было крайне низким, свидетельствует об отсутствии связи этого процесса с разрушением ТК и высвобождением биологически активных соединений. Скорее всего, речь может идти о спонтанном снятии с мембран ТК в процессе манипуляций с ними (культивирование, центрифугирование) каких-то структур с иммуностимулирующей активностью. В связи с этим была изучена шмуномодули-рующая активность Фиксированных ГА ТК (ТК-ГА), предполагая, что если в основе кммуномодулирухщего эффекта ТК лежит участие мембранных структур, а не секреция растворимых медиаторов, то следует ожидать, что такие ТК, так же как и Фиксированные ГА ИКК, сохранят свою активность после такой.обработки.

Действительно, ТК-ГА, столь же эффективно, как и необработанные ТК, усиливали спонтанную и митогениндуцировалную пролиферацию КС. Это может свидетельствовать о том, что стимулирующая активность ТК обусловлена мембранным: структурами. В пользу такого вьпзода говорят и тот факт, что Обработка ТК трипсином (70 мкг/мл, Ь7"с. 30 мин.) с последующей фиксацией ГА (0,12%) и ппосекпе-ы в ку.и.гуру КС полностью блокировала их активность. Вероятно, трипсин снимает мембраны функционально активные структуры, а ГА препятствует их рсэкспрессш, которая может иыеть место у нефиксированных те. Последнее, вероятно, и является причиной того, что иммуностимулирующая активность живых ТК была нечувствительна к обработке клеток трипсином.

Т.о., полученное даяние убэдительно свидетельствуют о том, что ТК обладают пряны;/. я ксстимулирующим »¿итегетшм действием з отношении ИКК, причем этот эффект обусловлен ыембранньаси структурами, не свяэан:11ик с комплексом антигенов гистособмэсти-мости. По всей видимости, речь может идти о мембран-ассощофоаа.-!.™;:

Формах медиаторов, активными продуцентами которых пуляются ТК (Plaut М. et al. 1989; Steffen М. et al. 1989).

Следовательно, принцип передачи сигнала от клетки клетке в процессе межклеточного контакта, свойственный, ка^ показано в предыдущих экспериментах, коммуникации ИКК между собой, эффективен и в случае межсистемного взаимодействия ТК и ИКК. Это подтверждает ег.о универсальность и раскрывает потенциальные шмунорегуляторные свойства ТК. .

Зое проведенные ранее исследования позволяют сделать вывод о том, что регуляторные клетки, лишенные способности продукции и секреции биологически активных соединений сохраняют, тем не менее, свою Функциональную активность е испытанных нами системах. Единственным объяснением этому являемся непосредственное участие в процессах регуляции иммунологических реакций мембранных структур, осуществляемое при прямом взаимодействии клеток. Среди этих структур значительное: место следует отвести и мембран-ассоциированном формам медиаторов иммунной системы, в частности, интерлейкину 2. Как известно,существование такой Формы ИЛ2 показало (Kaplan D.R. et al. 1988). Наш данные,представленные выше, также свидетельствуют в пользу этого. Для получения более убедительных доказательств сохранения Функциональной активности VJ.2 при Фиксации его на корпускулярном носителе и получения экспериментальных дачных, обоиювипавЕих бы соэдазже нового типа иммунокоррегирувдих препаратов на основе биологически активных соединена!, шшоб1р_изо-ванчых на корпускулярном носителе, нами был проведен следующий цикл ис.следоьа'-ий.

В этих экспериментах км испытнсг^'к в различных биологически системах in vitro с^ойстза нагруженных оекомбинаит^ым МЛ2 и

о <$«лсируваиг.ых ГА эритроцитов (ЭРКЛ2). 3 ''предварительных опытах были

125 '

.".пределен;» с нрим^нзнион мочегногс 1 рькэмбинантного Ш12 штшалът.'е условия посадки (pH 5,0, 3?ec, ЗС мин. в. Ф3£)'к коли-

чества связывающегося с эритроцитами в этих условиях ИЛ2 (17. ед 6

на 1x10 эритроцитов) и продемонстрировано, что после Фиксации обработанных Ш12 эрироцитоз ГА не происходит ощутимой пассивной диффузии ИЛ2 в жидкую фазу.

Исследовашга Фушсциональной активности ЭрШ1-2-ГА показало, что они способны зависимым от количества в культуре способом вызывать пролиферацию клеток Ш2-зависимой линии НТ-2. Добавление контрольных или обработанных ЧСм эритроцитов нэ оказывало такого эффекта (Рис.5). Известно, что преднизалон подавляет пролифэративный ответ лимфоцитов за счет блокады синтеза /101-2 и проявления рецепторов к этому медиатору (СЬаХепоис! Ь. еЬ а1. 1890), а добавление ИД-2 гущественно снижает этот эффект. В связи с этим мы исследовали влияш^е добавления ЭрИЛ-2-ГА на пролиферацию КНК человека под действием ФГА в присутствии рагных концентраций преднизолона. ''лк видно из рис.С, добавление ЭрИЛ-2-ГА существенно усиливало пролиферацию ММ на субоптимальные дозы §ГА и отменяло подавляющее действие преднизолона при использовании субоптимальиых доз '¿ГА и значительно его уменьшает при использовании оптимальных доз. Обработка ЭрИЛ-2-ГА перед'внесением в культуру антителами к »1312 фактически полностью отменяла стимулирующую активность таких эритроцитов.

го

Е

зо |с

I" го £

ю

/

.-ф

;:/ г. в 1'0

Соотношение ЬТТ :

УИС.Ь

Влияние Эр"Л2 на прели.фера-тивнкй ответ клеток НТ-2

По оси абсцисс- сос/гноиентс в культуре клеток НТ-2 и эритроцитов. По оси ординат-пролифе-ративкый отзет в «¿пульсах з миьуту х зоЧ Симьолаьи отмечены культуры клеток с внесенными туда контоол^нкми ?р,;?рс-цитами.(Зр), эритр^ци'.ймх, обработанным 1 мг/нл ЧСА (ЭрЧСДу или Ш <ЭрйЛ2). Содержание-клеток НТ-2 - Ь г. Ю4 н> .-.унку

5

й (ФГД 0,5) 20 Б(ФГЛ5)

В(ФГД10)

'Ч!

во- г

50'

^ V

\

7-

О

г— —г

-|- -I I/- Г- I > > " Г- -г--1

35 15 О 0.1 аз 2.5 О 0,1 0,5 Концентрация преднизалона, мкг/мл

25

О 0,1 35

Рис.6 Влияние ЭРИЛ2 на угнетение пролифератизного ответа МШ на штогены, вызванное преднизолоном.

По оси абсцисс - концентрация преднизолона в культуре в мкг/мл. По оси ордиьат - пролиферативнкй ответ в импульсах в минуту х 10 на ФГА в концентрации 0,5 (А),.5 (Б) и 10 (В) мкг/мл. На А, Б и В отмечены: 11 - уровень пролиферации контрольных культур МНК ч присутстяи преднизолона; 1С% ЭР - в присутствии 10% контрольных Фиксированных ГА эритроцитов; 10Я ЭРШ12 - в присутствий! соответствующего количеа^ва сорбировавших ЙЛ2 фиксированных ГА эритроцитов.

Одним из известных свойств ИЛ-2 является его способность усиливать активность ЕК-клеток (Нозепсеге э1. 3985). Поэтому

ш исследовали влияние орЙЛ-2-ГА'ка активность этих клеток. Для этого МНК человека инкубировали без или в присутствии 8р-ГД или Вр'ЛЛ-2-ГЛ в тг-че.ние 48 часов и исследовали цитолитичсскую активность такх-х члзток. Иг преьсташгегошх данных (Рис.7) видно, что цнтолитичйская активность МНК, иккубирокашшх с чо11Л-2-ГА. .существенно важе, чем ь контроле л вайе чем ЕК активность ИНК, инкубированных с ЭиГА. Кроме тсго, былс показано, что ЭрИ12-1'А обладали также способностью усиливать пролифератишшй ответ на митсгыш клеток селезенки к тимуса иымей.

40

to

a

•to

V.20

СИЗ -к

EZ3 -Эр

ESS -2р№

П

7-70

1 '20

Рис.7 Действие ЭР;1Л2 ка ЕК-активнооть МНК человека.

По оси абсцисс - соотношение клелчк-'.игасии М01.Т-4:МНК. По оси ординат - уровень ЕК-актизности в процентах свободной радиоактивной метки в клеточном супорнатаите к обпей радиоактивности кулоток-мишеней.. На А и Б - данные, полученные аа 2 здоровых донорах. Нг рисунке-указаны уровш! ЕК-актквности УЛК преинкубироваш. х 48 часов (темные сто л бита), преинкубированкне о контрольны!.® эритроцитами (штрихованные столбики) или с нагруяешплк КЛ2 ерктроцвтами (свут-лжз столбики) в соотношении 1:10. Ззеэдочками отмечены данные с р<0,05 (*) или с р<0,01 (**).

Т.о., проведенные нами исследования ш^уномодулирум^ей активности Фиксированного на эритроцитах ИЛ2 убедительно свидетельствуют о том, что Фиксация не изменяет Функциональных свойств медиатора и не препятствуя? проявлению его активности. Вместе с тем, подобный тип ишукомэдулир^щих препаратов обладает целым рядом особенностей, отличающих его от традиционных иммуко-тронных лекарственных соединений. Так, Фиксация на корнуcr.y-¿уьси носителя препятствует рассеиванию препаратов по всему органис-ау и удлиняет период существования ь организме молекул медна-с-а в чктизиой Форме. Метод позволяет мкидаизиронать испсл^уз.'-ъ'о

количества препаратов за счет улучшения их презентации и возможности последовательной активации одним орпускулом с Фиксированными на hiím медиаторами последовательно иммучокомпетентных клеток. Метод позволяет рассчитывать на создание комбинированных препаратов путем одновременной фиксации на корпускулах нескольких разных медиаторов и повышения избирательности действия за счет присоединения йа '"зпрускулы помимо медиаторов векторных молекул, в качестве которых могут выступать антитела той или иной специфичности. ГИСТАМЙНВЫСВОБОВДАЩАЯ АКТИВНОСТЬ МШ БОЛЬНЫХ АЛЛЕРГИЕЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЕ КОНТРОЛЯ ПРИ ПОМОЩИ ФАРМАКОЛГИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИММУНОЦИТОВ.

Известно, что стимулированные антигеном или митогенои МНК ьериферической крови человека продуцируют гистаминвксвсбовдающие Факторы. Оти Факторы при действии in vitro на тучные клетки, баэоФилы и макрофаги вызывают высвобождение медиаторов воспаления, при введении in vivo - кожные и бронхиальные реакции (Alain R. et al. 1985,1986?. В сеязи с этим можно было предположить, что не только сам гистаминвысвсбоздающий Фактор , но и секретирутацие его клетки способны непосредственно участвовать в патогенезе аллергических заболеваний. Доказательством этого предположения могут быть результаты сопоставления уровня прямого гистаминвысво-бождающего действия (ГВД) МНК с активностью заболевания.

Обследоваьо 29 больных атоническим дерматитом <АД) ь возрасте 18-43 лет с длительностью заболевания от 3 до 14 лет с поливалентной сенсибилизацией, включающей аллергены домашней пыли, 8 больных бронхиальной астмой (ЕА) в возрасте 24-46 лет г длительностью заболевания 4-10 лет, один больной с аллергией к ужалеижо пчелой, один больной с полл>чноэом и 4 здоровах донора. Больные ДД и FA оЬслодошлись в период ремиссии м обострения заболевания. В течэние 7 дней до взятия крови больны? не получали гормональных, №1муносуп,,ессискых или антигистгшинных препаратов.

'31.

Для оценки ГВД добазляли различное количество преинкубировак-ных и отмытых МНК больных непосредственно к взвеси свежевыдеяенных аутологичных клеток, обогащенных базофилами, и после инкубации определяли уровень высвобождения из последних гистамина.

Было показано, что культивированные 18 ч.'МНК больных АД и ВА в стадии обострения были способна высвобождать гистамин из аутологичных базофилов. МНК всех 29 больных АД (п=29) вызывали высвобождение в среднем 21,37 г 1,32 % , а МНК больных БА (п=8) -19,65 t 1,46 % гистамина. Интересно, что полученные в стадии обострения заболевания инкубированные клетки больного АД вызывали высвобождение гистамина не только из аутологичных, но и из аллоген-ных базофилов здорового донора ( 12,6 и 12,9 X соответственно) и, напротиз, преинкубированные KHK здорового донора подобной активностью не обладали как в аутологичной, так и в аллсгенной с к с э)/е базофилов больного АД.

Эффект МНК больных Cn=i2) был дозозависиным и 50 % максимального уровня гистамина высвобождалось спустя 10 мин. после качала инкубации, а плато реакция достигала спустя 40 мин. Исключение аэробного и анаэробного 'гликолиза продемонстрировало энергозависимость процесса высвобождения гистамина, индуцированного МКК.

В период ремиссии заболевания гисталаптысвобожг.ающая актки-ность супернатантоз и самих инкубированных "ШК больных АД и ЕЛ (п-7) не выявлялась.

Можно было предположить, чтс появление ГВД у МНК больных в период обострения обусловлено действием специфического аллергена, запускающего механизм ГВД МНК. Для моделирования такой ситуации больным в ремиссии прозодз:ли скарификац/онку» пробу со специфическим аллергеном и оценивали до и s разные сроки посла пробы наличие ГВД у свежовыделенных и преинхубиро.чаниых МКК. Покапано, что МНК, полученные перед скэриЁикгционнок пробой, не зысеобсхдалл гистамин из аутологичных базсфилов. Не обладала ГВД л сгедавзвз-

ленные МНК, полученные спустя 1 и 3 часа после введения антигена. Инкубация этих же клеток в течение 18 ч. индуцировала появление у них ГВД. У 1-го больного МНК, полученные спустя 1 и 3 часа после кожной пробы вызывали высвобождение сответственно?10,5 и 14,7 %, а у 2-го больного - 12 и 12,3 % гистамина.

Наличие ГБД ЫНК больных в период обострения и отсутствие этой акта юсти в период ремиссии заболевания, а также возможность индукции этой активности in vivo путем скарификациошшх проб со специфическим аллергеном, свидетельствуют о возможном участии акттированш/х МНК в патогенезе атопического дерматита и гормоно-зависимой атонической бронхиальной астмы. Очевидно, что выявление возможностей Фармакологического контроля уроЕЧЯ ГВД МНК помогло бы не только прояснить механизм их действия на клетки-мишение аллергии, но к разработать принципиально новые подходы к'лечению аллергических заболеваний.

В связи с этим нами было проведено исследование действия некоторых препаратов и их комбинаций на выраженность ГВД МНК больных АД и БА. В этих экспериментах МНК инкубировались 3 часа с препарата««) в среде 199 к после 3-х кратной отмывки культивировались еще 18 ч. в отсутствии препаратов в среде 199 или RPMI-1640. После этого МНК ценгриФугироваяи, отбирали надосадсчку» жидкость, однократно отмывали и испытывали их ГВД. Из всего набора испытанных препаратов и их комбинаций только сочетанная обработка МНК больных преднизолоном (30 мкг/мл) и витамином S12 (1 ыкг/мл) приводила к торможен™ или полной отмене ГБД клеток. .

На следующем этапе мсследолвилий попыгалкс: .ответить на вопрос, является лк у'.фусжегле П.<Д при обработке клеток преднизолсиом и цианкобал1мииом результатом прямого эффекта препаратов или око обусловлено активацией 'каких-либо ¡следок-регуляторов. С этой целью мы смешивали овсжевыделешше интактные аутелогичные f!(Ж больных с о б р ч б о та и н i IjMi-1 пренг.ратчми МНК в соотношении 1:1. гакубчровали

эту смесь 18 часов и оценивали затем их ГВД. Показано, что МНК, обработанные комбинацией преднизалона и витамина В12 достоверно тормозили ГВД этой смеси. Клетки, обработанные другими препаратами или их комбинациями подобной активностью в использованной тест-системе не обладали.

Т.о., полученные результаты свидетельствуют о возможности фармакологического контроля ГВД МНК путем обработки клеток лредни-золоном в комбинации с В12. По всей видимости, действие препаратов обусловлено индукцией клеток регуляторов, способных уже в отсутствие препаратов блокировать эти процессы.

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ МЕТОДА ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ 1ВДШОФАРШЮТЕРАПШ С ВВЕДЕНИЕМ 1ШГГОК-РЕГУЛЯТОРОВ, СТИМУЛИРОВА1ШЫХ ВНЕ ОРГАНИЗМА ДИУЩЙСШ».

Полученные данные в модельных системах in vitro и in v vo вплотную.приблизили нас к клинической апробации метода Э'/ФТ с введением больным стимулированных вне срга}щзма диуцпФоном клеток-прсдуцентов Ш12. При подборе групп больных мы руководствовались жесткими требования}®. Прежде всего - это наличие характерны;! клинических признаков вторичного иммуксдефицитного состояния, возможность эффективно г о контроля за течением патологического процесса а также неэффективность у данной группы больных традиционных терапевтических приемов. В число заболеваний, удовлетворявших даннил условия).- вошли тяжелый атопический синдром, синдром Лайела и хронический гнойный хол-.':гит. Все клинические испытания проводились на базе отделения общей аллергии (зав.- канд. медицинских наук Ю.А.Поропиша) и отделения реанимации (зав.-кандитат медицин, ких наук Т.В.Латшевг) Института иумунологии Минздрава СССР.

ЭИФ'Г при тяжелом атоническом синдром*» fTAC). TAC отьссится к заболеваниям с длительней утратой трудосг»особкссг»т, нередко приводяаен.к инвалидности. В настоящее время ке oy-íjeстну<="/

эффективных радикальных методов терапии больных TAC.

Клиническое течение TAC с частыми & .цидивами гшодермии и очагов хронической инфекции позволяет предположить, что у этой группы больных имеется сочетание иммунодефицита и аллергии. В пользу этого свидетель ствует целый ряд данных (Cooper J. et al. 1983; Lobitz S.V. et al. 1972). Однако, попытки назначения в связи с этим имму-омодуляторов оказались неудачными (White С. et al. 1978). Вместе с тем, очевидно, что эта категория больных нуждается в проведении шмунокоррегируотдах мероприятий.

Для проведения процедур ЭИФТ с диуцифоном нами была отобрана группа из 15 больных TAC в возрасте 18-29 лет в стадии обострения, характеризовавшегося экяематизацией, инфильтрацией и лихинизацией кчккых покровов с диффузными высыпаниями папулезно-везикулезного характера и пиодермией, резистентной к антибактериальной терапии. Для больных было характерно крайне тяжелое течение пиодермии, распротракекие процесса на большую поверхность кожи, лихорадка, увеличение регчонарных лимфатических узлов. Пиодермия, вместе с тем, косила поверхностный характер Фурункулез и абсцесса на коже больных встречались относительно редко.

Процедуры ЭИФТ проводили больным в соответствии с разработанной технологий. Во время процедуры цитафереза на аппарате IBM-2897 у больных выделяли лейкоцитарную взвесь, в которую добавляли диуцифон в конечной когп?ентрации 50-100 мкг/мл, и шпсублровали смесь в течение 3 ч. при 37"с. По скончании культивирования /, лейкоциты трижды отмывали г. после подсчета вводили 1,5-5 млрд мононуклеарных клеток в/в капельно тем же мщам 1 каждому больному било проведено от 1 до 3 сеансов.

Эффективность процедуры на течение пиодершм, атопическогс ° дерматита и респираторных проявлении атопчи оценивалась по 4-х бальной икале. РФ^ктиьность ЭИФТ у больных в отношении пиодермии составила з среднем 3,7 í 0,3, в отношении атонического дерматита -

2,6 ± 0,4 и в отношении реошфаторных проявлений - 1,3 ± 0,4. Ни у одного больного не было зарегистрировано негативного действия процедур ЭИФТ на какие-либо из указшшых процессов. Длительность ремиссии у большинства больных составляла 3-5 лет (срок наблюдетм).

Через 7-10 дней после процедуры ЭЙ$Т Увеличивалось процентное содержание лимфоцитов, ЕДС-РОК. Отмечена тенденция к увеличению процентного содержания Е-РОК. Тенденция к повышению уровня, общего имела место на 3-5, а общего - на 10-20 сутки после проведения ЭКФТ. Через 1-3 месяца после проведения процедуры отмечено достоверное сниженне уровня общего 1еЕ.

3!'ФТ с обработ)сой клеток дкуииФоном у больших с острыми токсч-ко-аллергическим!: реакш^ч; (синдром Лайела-СЛ). СЛ представляет собой один из саши тяжелых, вариантов течения лекарственной аллер-гни (Владовский Б.А. и др. 1383, Латышева Т.В. 1990). Б последние; годи отмечается увеличе1ше чу.сла болышх СЛ (Довтансгатй С.И. г. др. 1087). Данлоо забслезашю характеризуется, прежде всего, тлхе.по-Ллталл порахетаями кожных покровов в Форме нножостеенных сл/п-ных булл с с-эрозно-гзмсррагг.чесют гнойтал содерпсип:«. эп-.С'р-мальчого некролпэа., яззенно-некрстнческого поражен;:,; слизистых оболочек (Измайлов Г.А. и др. 2!У79). Тяжесть заболевания и, всего, присоединение гнойной даФегани, ведущей к быстрой гибели больных, обусловлена Формированием вторичного ^.олунодьФицитного состояния на Фоне сильнейшей интоксикации л пр;1менен::л массивных доз ГКС. Применение у больных ¡п.муномсдул15руюсей терапии абсолютно показано. Однако, традиционные кетоди, основанные па прямом введении препаратов в организм, малоэффективны из-за гогмунодепреа-.■-сорного влияния эндогенных токсинов в экзогенно вводимых ГКС. Поэтому ЭИФТ представляется сигнальной форуой иммуноспзсудкруюцой процедуры у больных СЛ в силу своих особенностей, исключающих тормозящее влияние на активацию И'й белков острой Фазы, ГКС и

различных медиаторов.

8КФТ с диуцифоном по традиционней семе была проведена 6 больным с СЛ. Количество процедур было индивидуальным и колебалось от 1 до 3 и определялось в первую очередь клинической картиной заболевания. У 5 из 6 больных проведение процедур позволило полностью купировать развитие гнойного процесса, а у 2-х из них дальнейшее лечение осуществлялось дахе без антибактериальной терапии. На фоне проводимой терапии у больных происходила быстрая нормализация сниженного количества Т-клеток (Рис.8).

5 во

8 во-

1 К

| АО

Ь

0

8 *<Н

1

I I

4 0\

О } 2

5 7 С У

0\ * ! т « и

х.7©

9 и Ь 20

РИС.. 3 Динаммка изменения содеожаиия в периферической крови больных синдромом Лайела ТЗ, Т4 и Т8 клеток пссле проведения ЭИФТ о диуцифоном.'

По оси абсцисс - сутки поело начала наблюдения. Стрелками отме-чя(»и дни пров оде пин йИФ'Г. По сой ординат - процентное содержание Т2, 'Г4 и То клеток среди лимфоцитов периферической крови.

Пр1менош:а ЦИФТ с введением клеток, обработанных дидофоном¡_

для лечания больных с хроническими гнойными' хслаигитами. В нэстоя-

п^-и врамл во всем мире отмечается увеличение «аототы возникновения

хронических гнойных холангитэв (ХГХ) как результат осложнений при лечении желчекаыенной болезни, частых ятрогетгых повреждений желчевыводящих путей и снижения эффективности антибактераилькой терапии (Гальперин Э.И. и др. 1988). В условиях хронического воспалительного процесса,нарушения Функции печени, длительной холемии у больных с ХГХ отмечаются значительные изменения в иммунном статусе, что служит основанием для включения в комплекс лечения ХГХ помимо традиционных методов иммуиокдррегируюцих приемов (Гальперин Э.И. к др. 1987).

Однако, неэффективность применения иммуяомодуляторов и снижение под действием сыворотки больных чувствительности ИКК к стимулирующим агентам дает основание для предположения о том, что длительный эндэто::сикоз является условием, способствующим подавлению активности иммунной системы и снижению эффективности иммуко-модуляторов, вводимых ln vivo, у больных ХГХ (Вельбри С.К. и др. 1986).Все это обусловливает поиск и применение у тати больных, так же как и у больных TAC и СЛ новых нетрадиционных методов воздействия на иммунную систему в целях ее коррекции.

С января 1988 г. по'май 1990 г. ЭК5Т с диуцифоном была проведена 8 пациентам, страдающим ХГ/. в течение последних 0,6-6 лет.

о

Возраст больных колебался от 33 до 65 лет, из них - 7 женчин и 1 мужчина. У 7 человек ХГХ явился осложнением после хслецистэктоиии по псводу желчекаменной болезни и у 1-го - после резекции желудка по Бильрот-2 по поводу язвенной болезни и кровотечения. В клинической картине у всех больных отмечалась слабость, быстрая утомляемость, желтуха, периодические ознобы о подъемом температуры к последующим усилением желтухи. Больше, как правило, были нетрудоспособны.

Каждому Сольному было проведено по 2. - 3 процедуры о/ЛТ с перерывами в 3 - 4 дня. Количество возвращаемых больным акт'/Е^ро • ванных диушФоном МНИ колебалось от 3 до Б млрд. 3 случае н<К'5ходи -

мости проводились повторные курсы Э1ЛФТ.

В результате проведения ЭИФТ у 8 бо ьных ХГХ в клинической картине течения заболевания отмечены следующие положительные изменения. У одного больного полностью прекратились приступы холангита, у 3-х отмечена ремиссия в течение 0,5 года. Трое больных после ЭИФТ успешно перенесли реконструктивные операции на желчных путя". Послеоперационный период у них протекал без септических осложнений. У 2-х из них во время операции диагностированы злокачественные новообразования и в дальнейшем эти больные не наблюдались. У одного больного положительной динамики после проведения курса Ш$Т отмечено не было.

При иммунологическом обследовании после ЭШТ у большинства больных отмечалось приближение сниженного числа 0КТ-4+ и 0КТ-8+ к Физиологической корме, что обусловливало нормализацию 0КТ-4+/0КТ8+ соотноиения и нормализацию абсолютного количества лимфоцитов. В результате ЭИФТ исходно патологически измененные показатели иммунограммы в большинстве случаев приближались к Физиологической норме. Унаследование Функциональной активности иммунокомпегентных клеток в тесте пролиферативкого ответа на ФГА показало, что уровень пролиферации МНК больных, полученных через 2-3 суток после 3-ей процедуры был, достоверно выше уровня пролиферации МНХ, полученных до начала проведения ЗИФТ.

ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНАЯ ШК/НОФАРМАКОТЕРАПИЯ С ВВЕДЕНИЕМ КЛЕТОК..

0£РАБ0ТД!СШ ПРЕДНИЗОЛОПОМ И ЦШШКОБОЛАКИНОМ (ВИТАМИН BIß). Ранее показано, что'ИНК болмшх АД и БА обладают в период обострения заболевания гистаминзысвобождгюдей активности в отношении собсгЕеккых клеток-мишеней аллергии (бгзофили) in vitro и что данная актиьность отменяется как в случае обработки клеток - комбинацией преднизолона и витамина В12 (П.Ц812), так и при добавлении таких Фармакологически модифицированных JJHK к интактнш (.•вежевыделечныи WIK. Принимая но внимание тот факт, что гистамчн-

вцсвобовдавдее действие МНК может играть определенную роль в патогенезе обострения TÁC и БА, можно било ожидать, что введение в организм бального аутологичных обработанных ПдВ12 клеток, способных тормозить гистаиинвысвобоадающую активность МНК in vitro, окажет подобное же действие и in vivo и приведет к регрессии клинических признаков заболевания.

Процедура ЭИФТ с обработкой клеток ПдВ12 была проведена 13 больным АД и 10 больным с ВА. Всё больные нуждались в постоянном (15 человек) или периодическом (7 человек) контроле ГКС в связи с неэффективностью традиционных методов лечения, причем у больных, получаввих ГКС периодически, суточная терапевтическая доза имела тенденцию к увеличению.

Клинически кожные поражения у 13 больных АЛ характеризовались яапулезно-везикулезньши высыпаниями диффузного характера, инфиль-грацией с участками мокнутия, гиперемией, отечностью кожи, яихенификацией, мелкоотрубевиднкм или ыелкопластинчатыы шелушением, тожественными экскориациями, что субъективно сопровождалось юстояшшы мучительным кожным зудом, ограничением движений, болью. ! этих больных достигнуть.'ремисси традиционным* методами не удава-юсь в течение 3 и более лет. Из 13 больных АЛ двое получали ГКС в •ечение последних 6 месяцев (4-8 мг дексазона в сутки), 6 - в ■ечение 1 года (8 мг/сутки) и Б больных - в течение последних 3 -2 лет (4-8 мг/сутки). Эт i дозы ГКС не всегда контролировали остояние больных. В некоторых случаях дозу препаратов приходилось велячивать до 16 - 32 мг/сутки.

При аллергологическом обследовании у всех больных АД была ыявлена сенсибилизация к аллергенам домашней пыли, клецаы рода ermatophagoldes, перу подушки и яеоста домалмих животных. У 10 ольных обнаружена сенсибилизация к пыльце злаковых трав, у 6-ти -пыльцо сорных трав, у 4-х - к пыльце деревьев. У S больных аявлека непереносимость анальгина и препаратов ацетилсалициловой

кислоты. У 11 больных выявлена пищевая аллергия.

У 10 больных БА без проявлений атсг тческого дерматита выявлена сенсибилизация к домашней пыли и клещам рода Dermatophago-ldes, у 6 больных - сенсибилизация к пыльце злаков, деревьев и сложноцветных. У 2 больных БА выявлена непереносимость препаратов пиразолонового ряда и ацетилсалициловой кислоты, а также рецидивирующий полипоз носа. ГКГ, принимали постоянно в течение 7 лет - 1 больной (суточная поддерживающая доза 4 мг дексазона в сутки), в течение 4-х лет - 1 больной (4 мг/сутки), в течение 1 года - 4 больных (4 мг/сутки). Двое больных постоянно в течение последних 2 лот принимали препараты АКТТ (синактен депо) 1 раз в 2-3 недели, а двое других больных нуждались в ГКС-коктроле только в период пучения злаков (июнь-июль) и размножения клещей Dermatophagoides (сентябрь-ноябрь) к которым были сенсибилизированы.

Процедура ЭЙФТ с обработкой клеток ПдВ12 проводилась в соот ветствии с ранее описанной методикой. Лреднизолон был использован в концентрации 30 мкг/мл, витамин В12 - 1 мкг/мл. Кавдому больному проводилось в среднем по 2 процедуры с реинфузией 2,5-5 млрд. обработанных мононуклеарных клеток. Ки в одном из случаев не наблюдали каких-либо побочных эффектов процедур.

После проведения курса ЭИФТ у больных АД имела место регрессия дерматита, проявлений ринита, снижалась потребность в антигистаыи-никах и ГКС. У некоторых больных удалось полностью отменить гормональные препараты. На этом фоне у больных снижались в периферической крови количество эозино&илов и уровень общего IgE (в среднем ь 3-3,5 рг.за) и существенно iß среднем в 3 раза) выростал уровень корткзола.

Хорошие результат пример с-кия Й№Т с ИдВ12 получены и у » Солышх БА. У больных, отмечалось снижение после процедур потребности в ингзллцил;; сшпатомиметиков, приеме эуФиллина и гормонов. У 6 из 10 больных была возможна полная.отмена ГКО. Имело

место улучшение общего состояния больных на фоне положительной динамики легочных Функщтоналышх тестов и снижения чувствительности тканей к действию медиаторов воспаления - ги с у амина (колоше prick-тесты) и ацетилхолииа (бронхиальные провокационные тесты). Так же, как и у больных АД, у больных БА ЭИФТ приводила к существенному снижению эозин оФымн и уровня общего IgE, а также к возрастанию содержания в сыворотке кортизсла. По всей видимости, такое сходство эффектов ЭИФТ у больных из обеих групп может быть связано со сходством Фундаментальных механизмов, пригашающих участие в патогенезе АД и ЗА.

вывода.

1. Иммуностимулятор диуцифон индуцирует в условиях in vitro накопление клеток-регуляторов иммунного ответа, опосредующих свою активность при помощи иктерлейкина Z. Оптимальными условиями икдук- . ции клеток-продуцентов интерлейюша 2 диуцифоном является сокульти-вация иммунокошетентных клеток с препаратом в концентрации 20-100 мкг/ш! в течение 3-6 часов.

2. Активированные диуцифоном клетки-продуценты интерлейкика-2 способны усиливать ЕК-активносгь аутологичиых инташтных лимфоцитов in vitro и иммунный ответ in vivo, а также окэуивают выраженное лечебное действие в условиях адоптивного переноса у мыжей,подвергнутых ожоговой травме, осложненной егаегнойной инфекцией, и у мышей о острой гриппозной инфекцией.

3. Иммуисмодудируювдая активность стимулированных диуцифоном •слеклеток-продуцэнтоа интерлейкина 2 обусловлена как продукцией эастворимой Форш мнтерлейкина 2, так и экспрессией медиатора на «ембране стимулированных клеток.

4. Обработка иммунокомпетентных клеток циклогексимидом кндуцк-■ует накоглекие клеток-усилителей, способных модулировать га/мунсло-ические реакции in vitro и in vivo.

5. Обработанные рекомбинантшм иятерФероном-альФа ыокоиуклва::-

ныв клетки человека приобретают способность индуцировать синтез IgE in vitro интактныии лимфоцитами.

6. Тучше клетки крыс усиливают спонтанный и митогеииндуциро-ванный пролиферативный ответ иммунокомпетентных клеток из селезенки, лимфоузлов и тимуса.

7. Имиуномодулирующиа свойства тучных клеток и стимулированных тклогексииисом или интерфероном-альфа иммунокопетентных клеток не зависят от продукции ими растворимых Факторов, а обусловлены мембранными структурами. Передача сигнала посредством экспрессиро-ванннх на клеточной мембране молекул-передатчиков является, возможно, универсальной формой Функционирования клеток-регуляторов иммунной системы.

8. Эритроцита с Фиксированным на них рекомбинантныи интерлей-ккнсм 2 во всех испытанных иммунологических модельных системах обладают биологической активностью сходной с таковой нативного интарлейкина 2.

8. Мононуклеарные клетки находящихся в обострении больных гормонозависимыыи Формами атопического дерматита и бронхиальной астмы обладают прямым гистаминвксвобовдающим действием на базоФшш больных и здоровых лиц in -vitro, что может свидетельствовать об . их участии в патогенезе заболеваний. .

10. Обработка мононуклсарних клеток больных атоническим дерматитом а бронхиальной астмой комбинацией преднизолона и витамина В12 приводит к торможению их гистаминвысвобоадающег« действия и к индукции клетск-регуляторов, способных блокировать гистаминьысвобождаюгцеь действие цктакткых клеток-.

11. Результаты работы экспериментально обосновываю? два принципиально новых приема иммунокоррекшш: Перваай - на основе адоптивного переноса фармакологически модифицированных клеток-регуляторов иммунной системы, к второй - на оснозе биологически "активных сординекии (медиаторов иммуачой систему), тиксированных на .

инертном биодеградируемоы корпускулярном носителе (искусственные "клетки-регуляторы").

12. Клинические испытания показали высокую эффективность лечебного применения аутологичных активированных диуцифоном клеток-регуляторов для купирования вторичных иммунодефицитных состояний у больных тянелны атопическим синдромом, синдоромоы Лайела и хроническим гнойным холангитом.

13. Продемонстрирована терапевтическая эффективность применения аутологичных экстракорпорально модифицированных прецнизолоном и витамином В12 ишуноцитов у боль,.ых атопическим дерматитом и бронхиальной астмой.

ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Использование клеток-продуцентов медиаторов иммунного ответа для для иммунокоррекции. /У Сб. трудов ЦНИШС им. ИИ. Мечникова "Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии. Москва., 1985 г., стр. 136-149.(соавт. И.С.Гущин, В.П.Лесков, В.М.Писарев).

2. Клинико-иммунологическая характеристика тяжелого атотшчес-к ■мндрома и современной возможности экстракорпоральной иммунокоррекции // Тез.. Всесоюзного симпозиума с междуна^ощим участием "Иммунодефициты и аллергия", Москва, ¿936, стр. 267. (соавт. Ю.А.Поро шина, И.С.Гуиин, Е.С.Феденко, В.П.Лесков, Л.В. Лусс, Т.В.Латшюва, В.Д.Прокопенко).

3. Роль гистаминвысвобовдсиощего действия 'лононук.леарачх клеток в патогенезе атонического дерматита. // Тез. Всесоюзного симпозиума с международным участием "Иммунодефицита и аллергия", Москвэ. 1936, стр. 283 (ссавт. З.Г.Чктаева, В.П.Лесков', 2.С.5еден-ко, Ю.А.Поросина, И. С. Гук!ин, Л. Б. Лусс).

4. Способ лечения гнойной кожной инФедат при агоническом дерматите // Авторское свидетельство на изобретение Л 1311723, 1886г. (соавт. VI С.Гущин, В.П.Лесков, Ю.А.Порошка, Е.С.Феглнко; В.Д.Прокопенко, I.В.Лусс, Т.В.Латыиезэ).

5. Возможности имыуномодуляции клетками, потенцирующими диф-Ференцировку В-лимФоцитов. // Тез. конференции "Актуальные проблемы иммунологии", Владивосток, 1987, стр. 150 (соавт. И.С.Гущин, В.М.Писарев, В.П.Лесков). ,,

6. Иммунсмодулирувдее действие обработанных in vitro диуциФо ном сингенпых клеток селезенки при экспериментальной гриппозной инфекции. // Тез. конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии", Москва, 1987, стр. 30 (соавт. Д.Л.Беляев, В.А.Зуев, В.П.Лесков).

7. Extracorporal ioiaunopharmacotherapy of recurrent pyoderma in severe atopic syndrom, // Abstr. "Tns role of bacteria in astlma bronhiaie and other allergic diseases", Zakopane, Poland, Mrrch 23-26, 1987, p. 73. (соавт. И.С.Гущин, Ю.А.Порошка, Е.С.Феденко, В.П.Лесков, Л.В.Лусс).

8. Экспериментальное обоснование экстракорпоральной иммуно-фармакотерапии. // Сб. "Актуальные зопросы иммунофармакологии", Москва, 1987, птр. 71-76 (соавт. И.С.Гущин, В.П.Лесков, В.М.Писарев).

3. Острые токсико-аллергичьскио реакции на медикаменты (клиника, лечение, прсфу.лактжа). // Всесоюзные методические рекомендации, Москва, 1038 (соавт. Т.В.Латышева, Ю.А.Порокмна, И.С.Гущин, В.П.Лесков, Е.С.Феденко, С. 14. Полу актов).

10. Adoptive therapy in treatment of bronchial asthma. IJ Europ.P.esp. Journal, 1988, N 2-5, p. 339 (соавт. Е.С.Феденко^ Ю.А.Поротша, И.С.Гущин, В.П.Лесков, Э.А.Лебедин).

11. Ияшшко-иммуьологическая характеристика острых токсико-аллергических реакций на медикаменты и современные метода их лечения. // Терапевтический архив, 1988, « 10, стр. С2-87 (соавт.

• Т.В.Латышева, й.С.Гу!ЦИН, X). А.Порошила, В.П.Лесков, Е.С.Феденхо).

12. Действие клетск-регуляторов шмуьогенеза может быть опосредовано мгабрая-асесциирсЕаннши струг-турам;;. // Тез. I

Всесоюзного съезда иммунологов, 1989, Москпа, том 1, стр. 352 (соавт. В.М.Писарев, В.П.Лесков, Б.П.Георгиев).

13. Экстракорпоральная иммунофармакотералия на примере использования клеток, обработанных диуциФоноы, у больных с атолическим синдромом. // Сб. трудов 2-гс (КИШ им. Н.И.Пирогова "Механизмы иммуно регуляции и иммунная биотехнология", Москва, 1989, стр. 46-50 (соавт. И.С.Гущин, В.П.Лесков, Ю.А.Породила, Е.С.Феданко, Т.В.Латышева, Л.В.Лусс, В.Д.Прокопенко).

14. Клетки-усилители как регуляторы иммуногенеза.// Вестник АМН СССР, 1989, N 4, стр. 83-89 (соавт. В.М.Писарев, В.П.Лесков, Б.П.Георгиев, И.С.Гущин, Л.А.Певницкий).

15. Mast cells regulatory effect on lymph id cell proliferation. // Abstr. XIX Meeting of the European Histamine Research Society, Kuoplo, 1990, p. 12 (соавт. И.С.Гущин. О.А.Ямщикова).

16. Effects of monoclonal antibodies against T-cell surface antigens on IgE synthesis by mononuclear cells from allergic patients. // Abstr. Int. Symp. "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 199u, p. 56 (соавт. С.Г.Коемл»в, И.С.Гугзш, В.В.Яьдовский)-.'

17. Особенности изучения синтеза IgE in vitro мононуклиар-шжи клетками больных атоническим заболевшгия»ш. // Иммунология, 1990, N 5, стр. 41-43 (соавт. й.Б.Вьюхина, И.С.Гущин).

18. Условия индукции диуцифоном иммунорегуляторных клеток. Ч Иммунология, 19Э0, Н 6, стр.19-23 (соавт.В.П.Лесков, И.С.Гузтич).

19. Лечебное применение активированных диуцифоном иммуноштов I условиях адоптивного перекоса у мыней с ожоговой травмой, сслож-[енной синегнойной инфекцией. // ЖЭ'Л, 1991, N 1. стр.(соавт. .А.Радкевич, Б.А.Гадчанкоз.. А.Ф.Мороз, Б.П.Лесков, Й.С.Гуэдн).

20. Hast cell regulatory effect on lymphoid cell pro 1 if era-ion // Agents and Actions, 1901, v. 33, tl 1/2, p;> 133-141 (сааз?. .С.Гудин, О.А.Ямзи;:с?а, Л.З.Киселс-в).

21. Регуляторное действие обработанных диуцифоном мононуклеар-ных клеток человека может опосредоваться меибран-ассоциировашой формой интерлейкина-2. // Бюлд. экспериы. биол. и медицины, 1991, принято к печати (соавт. В.П.Лесков, И.СЛ'ущин).

22. Модулирующее влияние моноклоналышх антител к некоторый поверхностным антигенам Т-клеток на синтез IgE in vitro мононуклеарными клетками больных аллергией. // Иммунология, принято к печати (соавт. С.Г.Креылев, И.С.Гувдш, В.В.Яздовский).