Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Экстракорпоральная и корпоральная иммуно-аффинная сорбция при экспериментальном разлитом остром перитоните

1 Э'З?

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

УДК 616.381-002-036.1 1:616-006:615.37:612.4.:577.1

БОЛЬШАКОВ Игорь Николаевич

ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНАЯ И КОРПОРАЛЬНАЯ ИММУНО-АФФИННАЯ СОРБЦИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ РАЗЛИТОМ ОСТРОМ ПЕРИТОНИТЕ

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени локтора медицинских наук

На правах рукописи

МОСКВА * 1992

Работа выполнена в НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ,

Лауреат Государственных премий СССР и РСФСР, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ю.М.ЛОПУХИН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент Р \ТНН, доктор медицинских наук, профессор

Е.А.ЛУЖНИКОВ

академик РАЕН, док юр медицинских наук, профессор

А.Н.ЧЕРЕДЕЕВ

доктор медицинских наук, профессор

Л.Л.ДМИТРИЕВ

Ведущая организация:

МОСКОВСКИЙ ОБЛАСТНОЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ КЛИНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ М.Ф.ВЛАДИМИРСКОГО ( МОНИКИ )

Защита состоится " " 1993 г. в час.

на заседании специализированного Совета Д.084.66.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ Российской Федерации ( 119828, Москва, ул. Малая Пироговская, д. I а ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации. Автореферат разослан " " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Л.Л.ВАСИЛЬЕВА

Г—Г--------^

ВВЕДЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Научные направления, раскрывающие проблему лечения перитонита, характеризуются попытками расшифровать суть интоксикационного синдрома на уровне продуктов жизнедеятельности микробов, вторичные механизмы каскадных патофизиологических реакций и на этой основе предложить интенсивные методы лечения (Владыка A.C. с соавт.,1987, Utili, Abernathy,1977).

Известно, что массивная антибиотикотерапия, проводимая при разлитых формах перитонита, может создавать состояние неуправляемой зндотоксемии (Кригер А.Г..Чугунов А.О.,1987, Wilkinson,197Т) как в результате массовой гибели микробных тел, так и по причине резкой активизации микробной флоры в просвете желудочно-кишечного тракта ( Caroli, Plat teborse, 1958, Elln, Wolil, 1976 ).

Эндотоксины грамотрицателъной микрофлоры легко проникают в кровь и лимфу, сецернируют с тканевой жидкостью через стенки паралитической кишечной трубки в свободную брюшную полость и обратно (Hecht et al.,1975,Jacob et al.,1977), резко повышают концентрацию бактериальных липополисахаридов в системе воротной вены (Drivas et al.,1976,UtIii,Abernathy,1977) , создают синдром тотальной эндотоксемии. Очень важным обстоятельством при интоксикационном синдроме является значительное накопление эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры в тканевых структурах и ликворной системе головного мозга (Berman et al.,1976,Severin,1972). Длительности циркуляции и опсонизации токсинами мозга является решающим в выживании пациентов (Бобкова Е.Д., Шалыгина Н.Б.,1988).

Значительные успехи в области аффинной хроматографии и химии полимеров позволили разработать ряд тонких технологий получения композиционных сорбционных материалов для извлечения из растворов и биологических жидкостей строго целевых продуктов (Кулаев Д.В. с соавт.,1989, Лопаткин H.A.,Лопухин D.M. ,"1989, Gendtrlch, Holleimn,1985). С этих позиций практический интерес представляют разработки аффинных сорбентов для извлечения бактериальных экзо- и эндотоксинов (Мороз А.Ф. с соавт.,1988, Джавец Э. с соавт.,1982) из крови (Hanasawa et al., 1983), плазмы (Endo et al, 1955, Напавада et al.,1988), ликвора, инфицированной брюшной полости (Беляков H.A. с соавт.,1988) , просвета желудочно-кишечного тракта (Allan et al.,1984, Itoi et al.,1985).

Сложности успешного извлечения бактериальных токсинов из

биологических жидкостей человека заключаются в их макромолекулярной структуре, гидрофобных взаимодействиях с практически любыми клетками и тканями с высокой константной связывания. Классические методы санации крови, брюшной полости и просвета кишки при разлитом перитоните далеко не обеспечивают связывание бактериальных продуктов и направлены в целом на элиминацию низкомолекулярных веществ (Лопухин D.M., Молоденков М.Н.,1985 Филшщев П.Я., Кирхыан В.В.,1987). Высокая молекулярная масса бактериальных комплексов создает сложности при их извлечении уже известными углеродсодержащими, ионообменными и другими сорбентами. Структура макропористых углей, применяемых в гемосорбции , не позв; чет полноценно абсорбировать крупные молекулы. Поэтому механизм шлечения основывается на физической адсорбции. Увеличение диаметра ор углей приводит к падению емкости по целевым продуктам, так как пористая структура начинав* выполнять роль транспортных каналов. В этой связи особую практическую значимость приобретают комплементарные межмолекулярные взаимодействия. Таким образом, стало очевидным получение, испытание и внедрение в эфферентную хирургию высокоаффинных к бактериальным токсинам сорбентов.

Высокая летальность пациентов с разлитым перитонитом, обусловленная печеночной и мозговой комами, создает проблему разработки методов глубокой детоксикации органов. Сложность хирургических манипуляций, связанных с защитой головного мозга и печени при высокой эндотоксемии, очисткой ликвора, регионарной гемосорбцией головы, может быть оправдана с трех позиций: безнадежностью пациентов (Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н.,1978, Berk,1980,Schenker et al.,1974, Sato et al.,1983), высоким уровнем извлечения токсинов и известными фактами ретроградной динамики нарушений функций мозга, печени и почек в случае выздоровления (KarvountziB et al.,1974). Следовательно, изолированная гемосорбция при перитоните может занять достойное место в научной программе детоксикации головного мозга.

Установлено, что важное место в интоксикационном синдроме при разлитом перитоните занимает интестинальная фаза (Кригер Д.Г., Чугунов Л.О.,1987, Hecbt et al., 1975). Массивное освобождение в просвете желудочно-кишечного тракта бактериальных продуктов распада приводит к паралитической кишечной непроходимости (Беляков Н.Л.,1991, Белов В.А..Шестопалов А.Е.,1985). В этой связи разгрузка кишечной трубки от содержимого (назо-интестинальная интубация) создает положительный эффект лечения(Кригер А.Г., Мельник И.П. ,1987, Попов В.А.,1985, Шуркалш Б.К. с соавт.,1987). Совершенно очевидно, что разработка и применение в такой ситуации ентеросорбцИонных материалов направлены на

улучшение конечных результатов дренирования. Существующие метода энтеросорбции при перитоните только начинают внедряться в клиническую " практику в связи с получением перспективных сорбционных материалов (Беляков H.A.,1991, Зеысков B.C. с соавт.,1987, Павлов Ф.А. с соавт.,1988, Терновой К.С. с соавт., 1985). Особое место в разработке должны занимать нетоксичные природные полимеры, обладающие высоким сродством к бактериальным токсинам.

Хирургические методы санации инфицированной брюшной полости занимают первостепенное место. Практического разрешения требуют вопросы эффективного перитонеального лаважа.. В этой связи разработка гелевых ( жидких ) сорбционных материалов, обладающих высокой текучестью, прочным связыванием с бактериальными токсинами как в экссудате, так и на поверхности брюшинного покрова, представляется весьма важной проблемой. От ее решения во многом зависит эффективность классического лаважа брюшной полости. Экспериментального обоснования и внедрения результатов в клинику требуют комбинированные методы лечения, представляющие суть одновременной детоксикации крови, желудочно-кишечного тракта и свободной брюшной полости. Цель таких манипуляций - получение эффекта глубокой детоксикации.

В связи с широким внедрением эфферентных методов терапии в хирургию перитонита установлены факты иммунокоррекции при контакте крови или плазмы с поверхностью гранул сорбентов (Лопухин D.M. с соавт.,1986, Кашшн H.H. с соавт.,1980, Berger, Blanden, 1981 ). В ряде случаев гемосорбция может создавать эффекты иммуносупрессии или стимуляции (Исхакова Х.И., Глейзер Л.С.,1984, Хегулевцева А.П. с соавт.,1984, Пашутин с соавт., 1984). Необходимость расшифровки иммунологических эффектов сорбции очевидна, так как связана с функцией рецепторов клеток, взаимоотношением рецепторов и бактериальных токсинов, возможностями делигандизации поверхности иммунокомпетентных клеток.

Связывание токсинов в просвете желудочно-кишечного тракта и в брюшной полости, их элиминация предполагают снижение .бактериальной опсонизации в крови и лимфе клеток иммунной системы и сохранение , таким образом, функций рецепторного аппарата. В этой связи первостепенное значение приобретают разработки методов точного контроля бактериальных токсинов, функций рецепторов иммунокомпетентных клеток.

Проблема эфферентных методов иммунокоррекции при перитоните органично связана с возможностями афферентной иммуноре анимации. Возможности разработки фармакологической иммунокоррекции при перитоните были значительно расширены в связи с получением в первой

половине 70-х годов и широким внедрением препаратов, возмещающих утраченные функции тимуса и костного мозга. Было установлено, что препараты вилочковой железы (Тактивин) способны осуществлять не только иммунологический (Арион В.Я. ,1989, Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я. ,1979, Levai, Utermohlen,1983) , но и биохимический надзор (Арион В.Я.,1989,1990, Ефремова O.K. с соавт.,1982, Скрипник А.Ю. с соавт.,1984). При ряде онкологических, аутоиммунных, вирусных заболеваний полипептидные продукты тимуса оказывают иммуномодулирупций аффект (Арион В.Я.,1989,1990) и должны использоваться в зависимости от функционального поражения тимуса (Арион В.Я.,1990, Arion, 1989). В то же время, известно, что благодаря полипептидной природе Оиорвгуляторных молекул, вырабатываемых вилочковой железой, возможна их быстрая деградация в системе циркуляции. Поэтому представляется важной разработка путей и доз введения препаратов, точек приложения их в иммунной системе, внедрение результатов исследований в клиническую практику лечения перитонитов.

Цель настоящей работы: Разработать методы экстракорпоральной и корпоральной детоксикации и иммунокоррекции крови при разлитом перитоните с помощью аффинных к бактериальным токсинам сорбентов на твердых и жидких матрицах. Внедрить результаты исследований в клиническую практику. Разработать вариант интенсивной иммунокоррекции с помощью Тактивина и внедрить его в клиническую практику.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи:

1. Выбрать технологию химического синтеза противомикробных антитоксических сорбентов на основе кремнеземных матриц для плазма-гемосорбции и провести экспериментальные испытания их эффективности.

2. Разработать технологию химического синтеза и способ применения противомикробных сорбентов на жидких матрицах, пригодных для лаважа инфицированной брюшной полости.

3. Выбрать технологию химического синтеза и провести испытания противомикробных сорбентов на основе твердых и гелевых форм хитозана с целью энтеросорбции. Внедрить результаты исследований в клиническую практику лечения перитонита.

4. Разработать способ моделирования разлитого острого перитонита у крыс.

5. Разработать экспериментальные способы иммунологического контроля эффективности эфферентных методов лечения разлитого перитонита.

6. Разработать способ твердофазного иммуноферментного анализа бактериального липополисахарида (ЛПС) грамотрицательной микрофлоры.

7. Изучить кинетику ЛПС при разлитом перитоните и определить эффективность детоксикации крови сорбентами на твердых и жидких основах.

8. Разработать модель изолированной гемосорбции головного мозга у крыс и определить принципиальную возможность его эффективной детоксикации с помощью аффинных сорбентов.

9. Определить возможность экстракорпоральной сорбционной коррекции фенотипа клеточной поверхности лимфоцитов человека в условиях эндотоксемии.

10. Определить возможность корпоральной сорбционной коррекции фенотипа клеток белой крови в условиях разлитого перитонита.

11. Определить иммунокорригирупцие возможности препарата тимуса Тактивина при его эндолимфатической инфузии и эффективность в условиях высокой эндотоксемии при перитоните у человека.

12. Передать технологию химического синтеза противомикробных сорбентов на основе сшитых декстранов в опытное производство и внедрить в клиническую практику с целью перитонеалыюго лаважа.

Основные положения, выиосиоде на защиту:

1. Определена технология химического синтеза противомикробных сорбентов на основе силохрома и силикагеля и установлена высокая эффективность извлечения ими микробных токсинов из цельной крови, плазмы и поверхности клеток.

2. Доказана принципиальная возможность эффективной детоксикации головного мозга при высокой степени эндотоксемии с помощью аффинных сорбентов.

3. Установлено, что нарушения экспрессии рецепторов на иммунокомпетентных клетках любой локализации при перитоните связаны с опсо1шзацией микробными токсинами клеточной мембраны.

4. Определена технология синтеза и эффективность жидких сорбентов на полисахаридных основах, повышающих качество перитонеального лаважа.

Б. Доказана необходимость комбинированного применения энтеросорбции и перитонеального лаважа при разлитом перитоните.

6. Разработан вариант иммунореанимации при перитоните, основанный на эвдолимфатических инфузиях Тактивина и доказана необходимость его применения в любой стадии развития заболевания.

Научная новизна. Впервые синтезированы аффинные сорбенты на основе кремнеземных матриц, эффективно извлекающие бактериальные эндотоксины

грамотрицательной микрофлоры при гемо-плазмасорбции.

В результате детоксикации плазмы такими сорбентами обнаружено полное сохранение функции ряда рецепторов на лимфоцитах человека и животных. При контакте клеток иммунной системы с аффинными про тивомикробными сорбентами обнаружен дифференцированный аффект делигандизации клеточной поверхности; высокая эффективность цитосорбции лимфоцитов и низкая - нейтрофилов.

Впервые синтезированы жидкие аффинные к бактериальным токсинам сорбенты с комбинированным действием, повышающие качество классического перитонеального лаважа при разлитом перитоните.

Впервые определена ценность использования в качестве энтеросорбентов при перитоните гелевых форм хитозана.

Впервые показана принципиальная возможность эффективного снижения концентрации бактериального эндотоксина в крови головного мозга при его изолированной гемосорбции иммуно-аффинными сорбентами в условиях высокой эндотоксемии.

Впервые предложены иммунологические методы контроля у крыс, основанные на определении фенотипа клеточной поверхности и получении монослоя клеток.

Впервые предложена удовлетворительная модель разлитого перитонита у крыс, позволяющая осуществлять иммунологический и бактериальный мониторинг.

На основании экспериментальной разработки путей, времени и доз введения препарата вилочковой железы Тактивина определена высокая эффективность его эндолимфатических инфузий в комплексной терапии разлитого перитонита, возможности иммунокоррекции и перспективы использования.

Практическая ценность работы и внедрение результатов

исследования.

1. Разработана модель бактериальной эндотоксемии у крыс (авторское свидетельство СССР * 1424582).

2. Разработан способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований (авторское свидетельство СССР * 1756822).

3. Разработаны способы выявления розеткообразупцих клеток крыс ( авторское свидетельство СССР X 1501723, положительные решения на изобретения *К 4117625/28-14, 4139052/28-14, 4125801/28-14, 4118860/28-14, 4131452/28-14, 4122448/28-14 ).

4. Разработан и запатентован способ получения аффинных сорбентов

на основе сшитых декстранов для лаважа инфицированной брюшной полости ( патент ГФ * Гос. регистрации 5032101 ).

5. Разработан и запатентован способ сорбционной норпоральной детоксикации (патент РФ * Гос. регистрации 5032220 ).

6. Технология получения противомикробных сорбентов на основе сшитых декстранов внедрена в опытное производство в 1992 году на Одном предприятии г. Москвы.

7. Гелевая форма крабового хитоэана в качестве энтеросорбента внедрена в хирургической клинике и кафедре факультетской хирургии им.С.И.Спасокукоцкого РГМУ им.Н.И.Пирогова (г. Москва).

Апробация работы. Результаты исследования доложены на I Всесоюзном иммунологическом съезде в г. Сочи (1989), Всероссийской конференции " Эфферентные методы в медицине" в г. Анапа (1992). Апробация основных положений диссертации проведена на объединенных конференциях НИИ физико-химической медицины МЗ РСФСР (1990, 1991, 1992), Российского государственного медицинского университета им.Н.И.Пирогова (1990), НИИ Уха, Горла, Носа МЗ РСФСР (1991).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 22 работах ( все - в центральной печати). Данная работа выполнялась по заданию ГКНТ (0.69.07).

Совместные работы проводились с сотрудниками лабораторий синтеза и испытания сорбентов, экспериментальной гемосорбции и окислительных методов детоксикации, прикладной иммунохимиии, молекулярной иммунологии, биохимии и автоанализа, цитологии НИИ ФХМ МЗ РФ, ряда лабораторий и хирургических кафедр РГМУ им.Н.И.Пирогова, Красноярского государственного медицинского института, НИИ биофизики РАН (Красноярск), НИИ вакцин и сывороток им.Г.Н.Габричевского, НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова, НИИ вакцин и сывороток им.Н.Ф.Гамалеи, НИИ питания РАН (Москва).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗУИЫВ В РАБОТЕ.

1.1.Противоыикробгше сорбенты на твердых матрицах.

Химический синтез противостафилококкового и

поликиксинового аффинных сорбентов на основе силохроыа.

Для синтеза иммуносорбента взята матрица силохрома со следующей характеристикой: удельный вес 0,29 г/смэ, удельный объем 1,52 смя/г, удельная площадь пор 33-35 м2/г, диаметр пор 200 нм, размер гранул 0,5-1,0 мм. Модификация матрицы силохрома (вминирование) и коввлентная

привязка козьего противостафилококкового 7-глобулина и полиыиксина В осуществлялась по методу Кулаева Д.В. с соавт.(1986).

.Химический синтез анти-ЛПС иммуносорбента на основе силикагеля.

В исследованиях использован аминопропиловый силикагель MCA-I500 с удельной поверхностью пор 15-25 м2/г, диаметром пор 150нм, размером гранул 0,5-1,0 мм, удельным объемом пор 0,5 см'/г. Химическая модификация силикагеля осуществлялась идентично силохрому. В качестве специфического лиганда использованы антитела, полученные в результате 3-х кратной иммунизации морских свинок бактериальным аффшноочищенным ЛПС Salmonella minnesota R-мутантного штамма 595 (НИИВиС им.Г.Н.Габричевского, Москва) в комплексе с агарозой-полимиксином В (Karol, Ryan,1988).

Химический синтез противостолбнячного шшуносорбента на основе

силохроиа.

Противостолбнячный иммуносорбент использовался в исследованиях как контрольной на специфичность сорбции бактериальных токсинов. Матрица силохрома m технология синтеза идентичны предыдущим образцам. В качестве лиганда использован столбнячный антитоксин (1,9 мл содержал 3000 ME или 100 мг/мл). В результате синтеза на I г матрицы иммобилизовано 20,7 мг белка (13,62 мг/см").

Химический синтез хитозановых сорбентов.

Мелкогранулированные (100-200 мкм) и крупногранулированные (более 200 мкм) сорбенты получа.ш на основе хлоргидрата крилевого хитозана по методу С.У.Насибова (1990).

Химический синтез полимиксинового сорбента на основе хитозана.

Хитозан 5г активировали раствором глютарового альдегида и смешивали с раствором полимиксина В.( на 1г хитозана 200 мг полимиксина В) Количество полимиксина В на носителе составляло 27 мг на 1г носителя ( или 9 мг на I мл носителя).

1.2. Противомикробные сорбенты на гелевых матрицах.

Химический синтез противостафилококкового и полимиксинового сорбентов на основе сефадекса G-200, BrGN-активированной агарозы.

В качестве гелевой матрицы использован сефадекс G-200 (Pharmaoia fine ohemioalB,Sweden) и CNBr-активированная агароза производства "Кемотех", Латвия.. За основу технологии синтеза взяты методы Whistler, Wolirom (1967), Дин с соавт.(1988).

Химический синтез протпвостафилококкового и полимиксинового сорбентов на основе спитых декстранов.

Способ получения сорбентов на основе сшитых декстранов разработан в ИНЭОС РАН и НИИ ФХМ МЗ РФ (Дятлов В.А. с соавт.,1992).

Химический синтез полимиксин-террилитинового сорбента на основе сшитого декстрана.

Технология получения бислойного сорбента разработана Дятловый В.А. с соавт. (1992)( ИНЭОС им. А.Н.Несмеянова РАН и НИИ ФХМ МЗ РФ, г. Москва).

Новизна сорбента заключается в его бифункциональноста. Сорбент на основе сшитого эпихлоргидрином декстрана содержит послойно ковалентно связанные антибиотик полимиксин В и протеолитический фермент террилитин.

Химический синтез гелевых форм хитозана.

Синтез выполнен по методу С.М.Насибова (1990) с целью получения мелкодисперсной и хлопьевидной форм хитозана, а также гелеобразной формы глутамата хитозана.

Общая схема синтезированных и использованных сорбентов с целью детоксикации и иммунокоррекции представлена в табл.1.

1.3. Способ получения разлитого острого перитонита у крыс.

Способ разработан Большаковым И.Н. с соавт.(1985).

1.4.Определение сорбционной активности аффинных сорбентов и иммуносорбентов на гелевых носителях.

Сорбционная активность сефадексных и агарозных антитоксических сорбентов определялась в реакциях пассивной гемаглютинации (РПГА) реакции торможения гемаглютинации (РТГА) и модифицированной реакции связывания комплемента (мРСК) с использованием плазмы и эритроцитов больных односуточным разлитым перитонитом крыс (токсичные образцы). В качестве контролей использованы плазма и эритроциты интактных животных. В ряде постановочных реакций ПГА использованы эритроциты быка.

В тестирование включены противостафилококковый и полимиксиновый сорбенты на основе сефадэкса а-200 и см Вг-активированной агарозы. В качестве контрольных матриц использованы сефадекс а-200 и неактивированная агароза. В качестве антител или аффината также

использованы разведения козьего противостафилококкового 7-глобулина 1:1-1:8192 и полимиксина В сульфата 1:1-1:8192. Реакции ТГА

ставились аналогично РПГА, но в отличие от них использовались эритроциты больных крыс.

ТВЕРДЫЕ И ГЕЛЕВЫЕ СОРБЕНТЫ, СИНТЕЗИРОВАННЫЕ И ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ С ЦЕЛЬЮ ДЕТОКСИКАЦИИ И ИММУНОКОРРЕКВДИ ПРИ РАЗЛИТОМ ПЕРИТОНИТЕ

I

ГЕМОСОРБЦИЯ ПЛАЗМАСОРБЦИЯ

противоста-

(&1ЛОКОККОВЫЙ

СКН-4М

противостолбнячный

СКН-плацебо

полимиксиновый

ИГИ-01

анти-ЛПС антительный

СКТ-6А

гранулированный сшитый хитозан

полимиксиновый

конъюгат

хитозана

ЭНТЕРОСОРБЦИЯ

КРЕМНИИ -ОРГАНИЧЕСКИЕ МАТРИЦЫ УГЛЕРОД- СОДЕРЖАЩИЕ СОРБЕНТЫ

КОРПОРАЛЬНЫИ ЛАВАЖ БРПШОЙ ПОЛОСТИ

водонерастворимые формы крабового и крилевого хитозана

водорастворимые гелевые формы хитозана

мелкокристаллическая целлюлоза

аффинные сорбенты на основе сефадекса

аффинные сорбенты на основе агарозы

аффинные сорбенты на основе сшитого декстрана

ртуа

сорбенты на основе гелевого хитозана

В модифицированной РСК использованы разведения токсичной плазмы 1:1-1:8192 или такие же разведения гранул сорбента, комплемент морской свинки 1:10 и эритроциты быка, нагруженные специфическим igG в разведении 1:10000.

Активность сорбентов оценивалась по сдвигу титра аглютинации при сравнении с контрольными реакциями.

1.4.1.Брппная полость. Техника лаважа.

У крыс популяции wietar массой 200 г моделировался разлитой стафилококко-синегнойный перитонит. Через 24 часа в брюшную полость в асептических условиях путем инъекции вводились противостафилококковый или полимиксиновый сорбенты на основе сефадекса G-200 или CN Бг-активированной агарозы в объеме 6 мл. Оценка антитоксической активности аффинных и иммунных сорбентов в РТГА и мРСК производилась после извлечения последних из брюшной полости через каждые 15 мин в течение 1 часа.

Исследования проведены на ряде серий животных.

1. Иммуносорбент противостафилококковый на основе сефадекса G-200: а/ лаваж инфицированной неотмытой брюшной полости (5 животных), б/ лаваж инфицированной предварительно тщательно отмытой брюшной полости (5 животных), в/ лаваж стерильной неотмытой брюшной полости (5 животных), г/ лаваж стерильной тщательно отмытой физраствором брюшной полости (5 животных).

В качестве контролей в мРСК и РПГА брался сорбент, не использованный в лаваже и смешивался с токсичной и интактной плазмами.

2. Идентичные серии экспериментов проведены у крыс с использованием противостафилококкового иммуносорбента на основе агарозы и полимиксинового сорбента на основе сефадекса G-200 и агарозы. В каждую серию опытов включалось 5 животных.

3. С целью выявления неспецифической сорбции в брюшной полости гелевых матриц с ними проведены идентичные серии лаважей с последующей постановкой мРСК и РТГА. Число крыс в каждой серии составило 5. В качестве контролей использованы гелевые матрицы, не участвовавшие в лаваже, и постановка РПГА я мРСК производилась с ийтактной и токсичной плазмами.

4. йлкость полимиксинового сорбента на основе сефадекса G-200 и агарозы оценивалась в многократных лаважах . Внутрибрюшинно вводились последовательно 4 свежие порции полимиксинового сорбента в объеме по 6 мл с экспозицией по I часу. Каждые 15 минут в течение 4 часов осуществлялось извлечение сорбента, постановка РТГА и мРСК. Число

экспериментов с кавдой матрицей составило 5. В качестве контроля использовался сорбент, не участвовавший в лаважах.

б. Неспещфмеская сорбция матриц сефадекса и агарозы оценивалась также в многократных лаважах идентично полимиксиновому сорбенту. Число опытов составило 5 для каждой матрицы. В качестве контроля использованы матрицы, не участвовавшие в многократных лаважах.

1.4.2. Эритроциты.

Контроль делигандизации эритроцитов в результате афишной или иммунной сорбции осуществлялся в постановке РПГА и РТА с участием и без участия компдемента морской свинки. 1. Интактные эритроциты, сенсибилизированные токсичной плазмой (РПГА) или эритроциты больных перитонитом крыс (РТА) смешивались с противостафилококковым или полимиксиновым сорбентами на основе сефадекса G-200 или агарозы в соотношении 1:1 и инкубировались при 20°С от 15 до 60 минут. После каждых 15 минут сорбции эритроциты извлекались и осуществлялись реакции РПГА с разведениями козьей противостафилококковой сыворотки или полимиксина В 1:1-1:8192. В качестве контролей РТА использовались несорбировэнные токсичные эритроциты (отмытые и неотмытые от плазмы), а также несорбированные эритроциты, сенсибилизированные токсичной плазмой (РПГА). Реакции ставились в 96-ячеечных круглодонных планшетах при 37°С в течение I часа. Количество опытов в каждой серии составило Б.

2. Неспецифическая сорбция бактериальных токсинов с поверхности эритроцитов оценивалась после инкубации клеток с нефункциональными Матрицами сефадекса G-200 и агарозы.Количество наблюдений в каждой серии составило 5.

1.5. Определение бактериального липополисахарида (ЛПС) на клетках крови при экстракорпоральной геыосорбции.

При определении ЛПС на мазках крови использованы антитела морской свинки и кролика к ЛПС E.ooli 0111:В4 (Sigma, USA), E.ooli 055:Б5 (Sigma, USA), Salm.minnesota Re mutant 595 ( НИИВиС ИМ.Г.Н. Габричевского, Москва).

Кровь больных перитонитом крыс перфузировалась через колонки из органического стекла объемом 0,5 мл со скоростью 1,5 мл/мин в течение I часа. Возврат крови после колонки осуществлялся в тот же флакон.

С целью извлечения бактериального ЛПС из крови использованы следующие сорбенты: 1. Анти-ЛПС антительный сорбент на основе силикагеля с диаметром пор 150 нм. 2. Анти-ЛПС полимиксиновый аффинный сорбент на основе силикагеля. 3. Антистафилококковый антительный сорбент на основе силохрома с диаметром пор 200 нм.

4. Углеродсодержащий СКН-4М сорбент. 5. Углеродсодержащий скн-плацебо сорбент. 6. Немодифицированная матрица силикагеля с диаметром пор 150 нм.

Мазок крови на предметном стекле последовательно обрабатывался кроличьими антителами против ЛПС, антикроличьими антиантителами с коныогированной пероксидазой хрена и субстратом для фермента -диаминобензидином тетрагидрохлоридом (даб). Количество гранул выпавшего в осадок водонерастворимого субстрата измерялось на автоматизированной системе анализа изображения ibas-2 (Germany) (лаборатория цитологии НИИ ФХМ МЗ РФ), с целью вычисления количеств бактериального эндотоксина, используя площади поглощения зернами даб при микроскопии, проведено титрование ЛПС. Приготавливались разведения ЛПС Б.coli 026:В6 ( sigma usa ) на апирогенном физрастворе по 0,5 мл с 4% содержанием бычьего сывороточного альбумина ( bsa, Serva): 50; 25; 12,75; 6,4; 3,2; 1,6; 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 мкг; б; 3; 1,5; 0,75; 0,38; 0,18; 0,09 нг; 46; 23; 11.5; 5,7; 2,8 пг.

База данных морфометрических параметров была создана на основе пакета прикладных программ DBASE 3 PLUS.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ statgraphe.

1.6. Определение бактериального ЛПС на иазках крови при изолированной гемосорбции головного мозга.

Для исследования взыты беспородные крысы массой 250-300 г по 5 животных в серии опытов, у которых моделировалась эндотоксемия внутриартериальным введением ЛПС E.ooli 026:В6 в расчете I мг/кг массы. Под нейролептанальгезией (калипсол 10 мг/кг+ дроотридол 0,5 мг/кг+ гексенал 100 мг/кг) у крыс обнажались и последовательно канюлировались правая и левая общая сонные артерии. Осуществлялась перфузия со скоростью 3 мл/мин в течение 30 мин.. Перфузиошая система состояла из колонки с сорбентом объемом 0,5 см3, воздушной ловушки, силиконовых магистралей и насоса марки " Zalimp " (Чехословакия). По окончании гемосорбции - иммуноферментный анализ ЛПС на мазках крови головного мозга, полости сердца и воротной вены. В исследованиях использованы силикагели с диаметром пор 150 нм с ковалентно иммобилизованными IgG к ЛПС S.minneBota Re 595 ( 3 мг/г)( 6 животных) и полимиксином В ( 5 мг/г)( 5 животных). В качестве контрольного сорбента использован макропористый уголь СКТ-6А ( 5 животных ).

Контрольным животным, не подвергнутым сорбции, после обнажения и перевязки правой общей сонной артерии и гепаринизации инъецировался внутриартериально ЛПС ( 5 животных) или физраствор ( 5 животных).

1.7. Определение бактериального ЛПС в крови при внтеросорбции гелевой формой хитозана.

Крысам массой 160 г с разлитым каловым перитонитом через желудочный зонд вводился 1% раствор глутамата хитозана в объеме 2 мл через каждые три часа в течение 6 часов ( три введения у 5 животных). Контрольные крысы получали 1% взвесь мелкокристаллической целлюлозы в. том же временном и объемном режиме ( Б животных). Нелеченные крысы получали через зонд по 2 мл физраствора ( 5 животных ). Четыре крысы составили группу разлитого калового перитонита без последующего какого-либо лечения. Пять животных составили интактную группу. Через 6 часов энтеросорбцш производился забор крови из полости сердца и воротной вены для иммуноферментного анализа ЛПС на мазках крови.

1.8. Автоматизированный микробиологический анализ.

Исследования влияния сорбентов на микрофлору проведены с помощью Abbott microbiology Bystem with identification oartridgee ( Abbott Laboratories Diagnostio Divieion, Irving, USA).

В стендовых опытах определялось воздействие твердых и жидких сорбентов на культуры золотистого стафилококка, синегнойной палочки и кишечного содержимого крыс ( лаборатория микробиологического автоанализа кафедры факультетской хирургии им. С.И.Спасокукоцкого, РШУ им.Н.И.Пирогова).

В качестве опытных сорбентов были взяты агароза с иммобилизованным полимиксином В (5 мг/мл), гелевая линейная форма хитозана на основе крабового и крилевого хитина, гелевая сшитая форма хитозана с иммобилизованным полимиксином В (3,5 мг/мл), гранулированная (0,5-1,0 мм) форма хитозана с иммобилизованным полимиксином В (9 мг/г), мелкогранулированная (01-0,2 мм) форма хитозана, силохром с диаметром пор 200 им с ковалентно иммобилизованным полимиксином В (21,4 мг/г),сшитый декстран с иммобилизованным козьим противостафилококковым 7-глобулином (200 мг/г), сшитый декстран с иммобилизованным полимиксином В (50 мг/г сухого полимера). В' качестве контроля использованы матрицы

сефадекса G-200 и неактивированной агарозы. Результаты сорбции микрофлоры сравнивались с характеристикой несорбированных микробов. Количество проб для каждой серии составило 5.

После посева на питательную среду (мясо-пептонный агар) подсчитывалось количество колоний на I см2, определялась чувствительность синегнойной палочки к амикацину, азлоциллину,

карбенициллину, цефамандолу, ацтреонаму, цетотаксиму, колистину, гентамицину, канамицину и сульфатриметоксину. Чувствительность

золотистого стафилококка -к ампициллину, цефалотину, мезлоциллину, эритромицину, триметоприму, канамицину,.хлорамфениколу, пенициллину, тетрациклину и оксациллину.

Кишечное содержимое дистального отдела подвздошной кишки (10% фильтрат на физрастворе) от интактных и больных односуточным разлитым стафилококко-синегнойным перитонитом крыс смешивалось с гелевой линейной формой водонерастворимого хитозана в соотношениях 1:1 и 2,5:1. Смесь инкубировалась в течение 2, 4, 6 и 16 часов при температуре 4°С. Контрольные образцы кишечного фильтрата от интактных и больных крыс не смешивались с сорбентом и инкубировались идентично.

При анализе производилась автоматизированная идентификация активных штаммов кишечного содержимого с определением их процентного состава в единице объема.

1.9. Биохимическое тестирование функций печени.

Исследования проведены на крысах популяции wiBtar массой 200 г У крыс моделировался разлитой стафилококко-синегнойный перитонит, в брюшную полость вводились сорбенты на I час и 24 часа. В качестве опытных сорбентов были использованы: I. Хитозан крабовый в линейной полимерной форме (4 животных). 2. Хитозан крабовый с ковалентно иммобилизованным полимиксином В ( 9 мг/мл)(7 животных). 3. Агароза с ковалентно иммобилизованным полимиксином В (13 мг/мл)(3 животных). 4. Агароза с ковалентно иммобилизованным козьим противостафилококковым 7-глобулином (17,4 мг/мл)( 5 животных ). 5. Сшитый декстран с иммобилизованным полимиксином В ( 6% от сухого веса матрицы)( 4 животных). 6. Сшитый декстран с иммобилизованным террилитином (100 ПЕ на I г сорбента)( 5 животных). 7. Комбинация двух предыдущих сшитых декстранов ( 5 животных ). В качестве контрольных матриц использованы свободная агароза (4 животных) и сефадекс G-200 (3 животных). В качестве контрольных групп животных взяты: I. крысы интактные (10 животных) .2. крысы с односуточным разлитым перитонитом (9 животных ). 3. крысы с двухсуточным разлитым перитонитом (5 животных). 4. крысы после лаважа брюшной полости физраствором (перитонит 48 часов, 5 животных).

Тестирование биохимических показателей сыворотки осуществлялось на клиническом анализаторе " Speotrum Abbott Laboratories Diagnostic Divieion USA Определялись холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глобулины, альбумин-глобулиновый индекс, креатинин, мочевина, мочевая кислота, общий и прямой билирубины, АЛТ, ACT,

щелочная фосфатаза, а-амилаза, кальций, фосфор, магний, калий, натрий и хлор.(лаборатория биохимии и автоанализа НИИ ФХМ ИЗ РФ и НИИ питания РАН).

1.10.Способы выявления спонтанных розеткообразуиких клеток периферической крови и органов иммунной принадлежности крыс.

Способы разработаны Большаковым И.Н. с соавт (1986) с целью повышения выхода спонтанных розеткообразуицих лимфоцитов у крыс при использовании тимоцитов , спленоцитов, клеток лимфатических узлов и периферической крови.

Исследования спонтанного розеткообраэования и К-клеточной активности проведены с лимфоцитами тимуса, селезенки, лимфатических узлов и периферической крови крыс массой 200г при разлитом односуточном каловом перитоните. Выделенные мононуклеарные клетки органов (2 х Ю"кл/мл) и периферической крови (1,0 х 100кл/мл) в объеме по 6 мл, от 5 животных подвергали перфузии через пластиковые колонки объемом 0,5 мл с сорбентами со скоростью 1,5 мл/мин. , В качестве опытных твердых сорбентов использовалисьг

1. антительный иммуносорбент к бактериальному ЛПС Salmonella minneBota Re 595 на основе силикагеля с диаметром пор 150 нм (количество белка 4,3 мг/г). 2. противостафшококковый иммуносорбент на основе силохрома (количество белка 32,1мг/г). 3. полимиксиновый сорбент на основе силикагеля (иммобилизация полипептида составила 2,8 мг/г).

В качестве контрольного сорбента использовался макропористый уголь СКТ-6А. Контрольные группы составили образцы клеток от интактных и больных перитонитом животных( по 5 образцов).

При исследовании гелевых форм сорбентов последние вводились в брюшную полость через 6 часов после моделирования разлитого перитонита с экспозицией 18 часов.

В качестве опытных сорбентов использовались полимиксиновый и террилитиновый сорбенты на основе сшитого декстрана в комбинации 1:1 (5 животных). В качестве контрольной матрицы применялся сефадекс G-200 (5 животных).

Группу из пяти животных составили исследования эффекта иммунокоррекции при энтеросорбции. Животным через 6 часов после моделирования разлитого калового перитонита через каждые 3 часа через желудочный зонд вводилась гелевая форма водонерастворимого низкомолекулярного крабового хитозана в объеме 2 мл в течение 18 часов.

У 5 животных одноразовая инъекция в инфицированную брюшную полость

комбинированного декстранового сорбента в объеме 6 мл сочеталась с введением хитозана через желудочный зонд в объеме 2 мл с периодичностью 3 часа в течение 18 часов (5 животных).

В качестве контрольной группы использованы крысы, получавшие в тех же режимах гель сефадекса с-200 (внутрибршинно) и 1% взвесь мелкокристаллической целлюлозы ( в желудок ) (5 животных). Через 24 часа от начала заболевания определялась розеткообразущая и К-клеточная активность лимфоцитов тимуса, селезенки, брыжеечных лимфатических узлов и периферической крови.

К-клеточная активность селезенки определялась на эритроцитарном монослое согласно методу Лескова с соавт.(1980). Исследование эффекта иммунокоррекции (Е-рецептор и К-клеточная активность) при энтеросорбции проведено на 5 крысах массой 200г. Животным в течение 18 часов через каждые 3 часа через желудочный зонд вводилась гелевая форма низкомолекулярного водонерастворимого крабового хитозана в объеме по 2 мл.

Сеансы корпоральной и интестинальной сорбции: через желудочный зонд- гелевую форму низкомолекулярного хитозана ( в контроле - взвесь мелкокристаллической целлюлозы), в брюшную полость полимиксин-террилитиновый сорбент на основе сшитого декстрана ( в контроле гель сефадекса 0-200) проведены на 5 животных в течение 18 часов

1.11. Тестирование Т- и В- систем иммунитета у человека.

Определялся общий пул Т-клеток с эритроцитами барана (ЭБ) в одночасовом (Е-РОК) и 5-минутном (Еа-РОК) режимах (.1огк1а1,1976), общий пул В-клеток с эритроцитами быка (ЭБк), сенсибилизированными противобычьим и мышиным комплементом (свежевыделенная сыворотка

1:10) (ЕАС-РОК) (ЛояеИ е! а1.,1976). Ро7И на Т-лимфоцитах тестировался с помощью эритроцитов быка, сенсибилизированных противобычьими антителами класса 1^0 (ЕА1^-Р0К) [Реггаг1п1 ег а1.,1975) , Роци на Т-лимфоцитах с помощью эритроцитов быка, нагруженных антителами класса 1§м (ЕА1§М-Р0К) (Монета е1 а1.,1975) в модификации (Черемушкина Л.А. с соавт.,1980), Роад на Т-лимфоцитах (ЕА1|»А-Р0К)- по методу (Ьуйуагй, Рапвег,1981). Популяция В-клеток, экспрессирующих рецепторы к эритроцитам мыши (Ем-РОК) определялась по методу (Новиков Д.К..Новикова В.И.,1979). В исследованиях использованы противостафилококковый и полимиксиновый аффинные сорбенты, синтезированные на основе активированной матрицы силохрома Количество связавшегося с матрицей козьего противостафилококкового 7-глобулина составило 15,3 мг/смэ, полимиксина В - 7,7 мг/смэ.

В качестве контрольных сорбентов были использованы противостолбнячный иммуносорбент (7 мг/см9 столбнячного антитоксина), немодифицированная и аминированная матрицы силохрома с идентичными исходными характеристиками, углеродсодержащие сорбенты марок СКТ-6А, ГС(01)ИГИ, СКН-4М с физически адсорбированным элементарным йодом ( в качестве окислителя).

Опытные и контрольные сорбенты смешивались In vitro с плазмой больных животных в соотношении 1:10 по объему. Сорбция проводилась в течение 15 и 30 мин при 37°С. Общий пул лимфоцитов и Т-клетки каадого донора (2 х Юа/мл) смешивались с плазмой здоровых и больных крыс, а также с "сорбированными в течение 15 и 30 мин опытными и контрольными образцами токсичной плазмы. Соотношение лимфоцитов и плазмы составляло 1:1 по объему. Клетки инкубировались в течение 45 мин при 22°С, отмывались от плазмы.

Для определения влияния стафилотоксина на экспрессию рецепторов лимфоцитов человека был использован препарат ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, серия 44-1, Lh-0,16 мл в разведениях среды 199 1:20; 1:80; 1:320; 1:1280; 1:5120; 1:20480. Для выявления эффекта извлечения стафилотоксина из раствора с помощью противостафилококкового иммуносорбента препарат подвергался сорбции в разведении 1:20 в течение 15 и 30 мин и смешивался с общим и Т-пулами лимфоцитов человека.

1.12. Дозы и пути введения Тактивина. Контроль первичного иммунного ответа в индуктивную и продуктивную фазы.

Исследование эффективности путей введения Тактивина проведено на 193 крысах-самцах популяции Wietar массой 200г. Использовался препарат серии 119 (лаборатория молекулярной иммунологии НИИ ФХМ МЗ РФ). Тактивин вводился подкожно (п/к), внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в), внутрибрюшинно (в/бр) и эндолимфально (э/л) в дозах 0,6 и 1,0 мкг в 0,5 мл бидистиллированной воды на крысу. Эндолимфатическая инфузия препарата осуществлялась в лимфатические узлы илеоцекального угла брюшной полости с помощью силиконовых катетеров диаметром 0,25 мм после предварительной подачи эфирного наркоза в течение 15 мин и выполненной лапаротомии.

Оценка эффективности действия Тактивина производилась по количеству антителообразующих клеток селезенки и брыжеечных лимфатических узлов (АОК) в ответ на введение тимусзависимого антигена методом локального гемолиза в жидкой среде (Cunningham,1965).

Влияние Тактивина на АОК селезенки в индуктивную и продуктивную фазы первичного иммунного ответа определялось через 24 и 72 часа после в/бр иммунизации ЭБ.

Дозозависимый эффект Тактивина исследован на 140 крысах популяции wiвtaг массой 200г. Использованы два ряда разведений препарата. Первый ряд: 0,01 мкг;0,05 мкг;0,1 мкг;0,25 мкг;0,5 мкг на одно животное в 0,2-0,3 мл объема. Второй ряд: I мкг; 2 мкг; 5 мкг;10 мкг;20 мкг на одно животное в 0,2-0,3 мл объема.

Тактивин вводился в стерильных условиях в брыжеечные лимфатические узлы на фоне эфирного наркоза и срединной лапаротомии. Препарат в указанных дозах инъецировался как в индуктивную (80 крыс), так и в продуктивную (60 крыс) фазы первичного иммунного ответа. Оценка эффективности производилась по числу АОК селезенки.

С помощью компьютерного регрессионного анализа рассчитывалась линейная регрессия для каждого ряда разведений и для каждой фазы первичного иммунного ответа для установления характера дозозависимого эффекта Тактивина. Статистический анализ результатов производился в соответствии с критерием Фишера-Стыодента.

1.13.Эядолиифатическое введение Тактивина пациентам в клинике.

Иммунокоррекция Тактивином пациентам с острым гнойным перитонитом осуществлялась в брыжеечные лимфатические узлы во время санации брюшной полости. За однократной инфузией препарата следовали инъекции в паховые лимфатические узлы в послеоперационном периоде в виде 1-3 курсов по три инъекции в дозе 70-100 мкг каждая. Тактивин подключался на протяжении в среднем двух месяцев с момента госпитализации. Препарат назначался в составе современных методов детоксикации. Комплекс лечения включал массивные дозы антибиотиков, сухую и нативную плазму, цельную кровь, человеческий -у-глобулин, сеансы гипербарической оксигенации, УФ-облучение крови, плазмаферез, экстракорпоральную гемосорбцию через активированные угли по вено-венозному типу.

Лечение проведено у 40 пациентов с разлитыми и ограничешшми формами перитонита, возраст которых составил от 15 до 60 лет.

Причинами возникновения воспалительного процесса явились гангренозный перфоративный аппендицит, перфоративная язва желудка, острая кишечная непроходимость, послеоперационная несостоятельность швов анастомоза, огнестрельное ранение органов брюшной полости.

Эндолимфатические инфузии Тактивина производились 26 пациентам, начиная с тяжелой реактивно-токсической фазы заболевания. Количество наблюдений за 40 больными в динамике составило 281. Регистрировались клеточный и биохимический состав периферической крови, нь, Н^ СОЕ, тесты свертывающей системы крови, анализ мочи, центральное венозное

давление, иммуноре гуляторные клетки Т- и В- системы иммунитета.

Иммунологический анализ у каждого пациента проводился один раз в неделю. Тестировались общее количество лейкоцитов, процентные и абсолютные значения лимфоцитов, Т-клеток иммунитета (Т-общие -Е-РОК, Т-активные- Еа-РОК, Тр. - EAlgM-POK, Т7 - EAlgG-POK, Та - EAlgA-POK), В-клеток иммунитета (В-общие- ЕАС-РОК, В-мышиные - Еш-РОК, Вц -EAIgUa-C-POK, В7 -EAlgGa-C-POK, Ba-EAIgAa-C-POK) (Nowell et al.,1976). сывороточные иммуноглобулины классов igM, igG и igA (Uanclnl,1965), Группу здоровых доноров составили 72 человека, у которых проведен иммунологический айализ.

Результаты всех исследований (353 наблюдения по 102 критериям) составили компьютерную базу данных, которая позволила анализировать все тесты у групп пациентов:

1. с разлитой и ограниченной формами перитонита.

2. у здоровых и больных доноров.

3. с различной частотой санационных лапаротомий.

4. с наличием или отсутствием послеоперационных осложнений в виде кишечного свища или авентрации.

5.с наличием различной величины интегрального показателя токсичности крови (лейкоцитарным индексом интоксикации, ЛИИ).

6. при различной оценке тяжести общего клинического состояния.

2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.1. Эффективность лаважа гелевыми сорбентами инфицированной брюшной полости по результатам мРСК, РПГА и РТГА.

Введение противостафилококкового иммуносорбента на основе софадекса G-200 в инфицированную брюшную полость (односуточный разлитой стафилококко-синегнойный перитонит) приводит к очень быстрой потере активности гранул. Тщательный предварительный лаваж гнойной брюшной полости физраствором резко снижает концентрацию стафилококковых антигенов и сохраняет полную активность сорбента в полости в течение 30 минут. Последующая полная потеря активности гранул ( отсутствие титра в мРСК через 1 час лаважа) указывает на дополнительную элюцию стафилококковых антигенов с поверхности брюшины. Снижение специфической активности сорбента составляет 4000-8000 раз в мРСК и 8-16 раз в РТГА.

Таким образом, противостафилококковый иммуносорбент на основе сефадекса G-200 целесообразно применять после тщательного отмывания

брюшной полости от гнойного содержимого, что повышает качество перитонеального лаважа. Более яркая картина сорбции

стафилококковых токсинов демонстрируется при использовании иммуносорбента на основе активированной агарозы. Возможность

делигандизации стафилококковых токсинов или токсинов, аффинных к полимиксину В, может быть продемонстрирована в случав полного удаления свободно плавающих антигенов из инфицированной брюшной полости. Лаваж брюшной полости полимиксиновым сорбентом у крыс с односуточным разлитым перитонитом выявляет высокую связывающую активность с токсинами грамотрицательной микрофлоры (липополисахаридом.ЛПС). В тестах мРСК и РТГА происходит быстрая ( в течение 15 мин) и полная отмена активности гранул. Тщательное предварительное санирование гнойной полости у крыс сохраняет активность сорбента только первые 15 минут. Последующая экспозиция сорбента с потерей его активности связана с адсорбцией токсинов, фиксированных к брюшинному покрову. Контрольные серии опытов подтверждают специфичность сорбции, поскольку в стерильной полости сохраняется полная активность.

Практический интерес представляет конкретное число лаважей, способных полностью сохранить активность сорбентов в иммунологических тестах.

Результаты показывают, что длительный лаваж отмытой инфицированной брюшной полости (4 часа) четыремя свежими порциями полимиксшювого сорбента на основе сефадекса с-200 сохраняет его активность уже на втором часовом лаваже (табл.2). Подобные результаты получены при использовании агарозного сорбента.

Таким образом, высокая концентрация бактериальных токсинов в брюшной полости ставит задачу их специфического связывания и удаления при лаваже, как первичном методе санации. Гелевые сорбенты способны создавать полный контакт с инфицированной поверхностью и осуществлять комплементарные взаимодействия токсин-антитоксин.

2.2. Результаты сорбции взвеси клеток голевыми сорбентами.

Результаты десорбции микробных антигенов с поверхности эритроцитов крыс противостафилококковым и полимиксиновым сорбентами на основе агарозы представлены в таблице 3. Реакция ПГЛ указывает на возможность значительной десорбции с поверхности клеток антигенов, комплементарных как к козьей антистафилококковой сыворотке, так и к полимиксину В. Титры стафилококковых токсинов после I часа сорбции токсичных эритроцитов снижаются практически до О. Полная десорбция проявляется уже через 15 минут контакта. Такой эффект наблюдается

независимо от времени сенсибилизации клеток ( 45 мин in vitro или 24 часа in vivo).

Полимиксиновый сорбент способен снимать с поверхности сенсибилизированных в течение 45 мин эритроцитов антигены, понижая титры в 4 раза. При этом время сорбции имеет линейное значение (1:256 против I-.I024). Схожая закономерность проявляется и при сорбции эритроцитов, сенсибилизированных в течение 24 часов.

2.3.Результаты детоксикации крови при гемосорбции на твердых матрицах (динамические стендовые испытания).

Калибрование бактериального липополисахарида (ЛПС) на мазках периферической крови показало, что нижняя граница чувствительности метода составляет 350 нг ( 736 пикселей - точек экрана на автоматизированной системе анализа изображения ibas-2).

Если принять единицу площади, занятую эндотоксином при заболевании, за 100%, то у интактных животных она составляет (4,60,9%). При этом концентрация токсина в воротной вене составляет 6,62,00%. Таким образом, в системе циркуляции крови при разлитом каловом перитоните характерен высокий уровень эндотоксемии.

Перфузирование периферической крови больного животного в стенде через колонки с противос тафилококкоbum иммуносорбентом на основе силохрома 200 приводит к снижению концентрации эндотоксина в среднем на 57%. Если концентрация ЛПС на единицу площади до гемосорбции составляла 3256- 889 пикселей (100± 30% или 1,86 мкг/мл), то через 30 мин перфузии площадь поражения составляет 1504- 69 пикселей (46- 8% или 0,86 мкг/мл), а через I час сорбции - I4II± 51 пикселей (43± 6% или 0,81 мкг/мл).

Слабое извлечение эндотоксина в точение последующих 30 мин указывает на насыщение противостафилококкового сорбента. Вполне вероятно, что основная доля ЛПС извлекается за счет неспецифической сорбции благодаря пористой структуре матрицы. Не исключено, что противостафилококковие антитела могут иметь частично комплементарные сайты связывания с эндотоксином грамотрицательной микрофлоры. Анализ клеток белой крови на присутствие бактериального ЛПС показал, что у интактных животных 12,8^ 1,40% нейтрофилов и 13,2^2,73% лимфоцитов несут на своей поверхности молекулы эндотоксина. Чистый контроль (иммуноферментный анализ с интактной сывороткой кролика) выявляет в среднем 7,5- 0,72% клеток, нагруженных ЛПС. Разлитой

каловый перитонит создает мощную опсонизацию клеток белой крови и

эритроцитов эндотоксином, поражая 47,5- 4,70% лимфоцитов и 77,8- 3,44% нейтрофилов. Перфузия этой же крови через противо с т офилококковый иммуносорбент приводит не к эффекту сорбции ЛПС, а к существенному повышению его выявления. Через 30 минут перфузии крови через сорбент присутствие эндотоксина выявляется уже на 72,0^ 3,98% лимфоцитов и 93,0- 1,81% нейтрофилов. Последующие 30 мин перфузии практически не меняют картину опсонизации мембран клеток (лимфоциты - 74,3- 3,80%, нейтрофилы- 90,5- 0,36%).

Перфузия периферической крови больного животного через конъюгат силикагеля с полимиксином В приводит через 30 мин к снижению концентрации эндотоксина на 76%, а через I час сорбции - на 89%. Если до гемоперфузии в периферической крови содержалось 11774- 189 пикселей ЛПС (100^ 2% или 89,1 мкг/мл), то в результате 30 мин перфузии крови концентрация эндотоксина снижается до 1889± 171 пикселей (24- 2% или 1,9 мкг/мл), а через I час сорбции- до 1305^ 83 пикселей (ц£ 1% или 0,75 мкг/мл). Таким образом, в результате одночасовой гемосорбции цельной крови через аффинный сорбент концентрация бактериального эндотоксина снижается в среднем в 119 раз.

В результате гемосорбции наблюдается эффект существенной делигандизации мембраны лимфоцитов. Если до гемосорбции в периферической крови от больных крыс было опсонизировано токсином 81,8- 4,52% лимфоцитов, то через 30 мин перфузии через полимиксиновый конъюгат только 18,0± 1,54 клеток несут на своей мембране ЛПС, что соответствует картине у интактшх животных. Дальнейшая перфузия через этот сорбент не меняет характеристику клеток (19,0^ 2,01%).

Исследование клеток гранулоцитарного ряда показало, что эффекта десорбции эндотоксина с мембраны нейтрофилов получить не удается.

Перфузия токсичной крови через матрицу силикагеля с диаметром пор 150 нм с конъюгированными универсальными кроличьими антителами к бактериальному ЛПС приводит к значительному удалению эндотоксина. В этой серии опытов токсичная кровь крыс с разлитым перитонитом содержала суммарную площадь поражения 11158- 2203 пикселей (100- 20%). В результате гемосорбции через 30 мин извлекается 24% ЛПС. Площадь поражения составляет 8539- 168 пикселей или 76- 2% от первоначального уровня. Через I час перфузии площадь поражения уменьшается до 6198987 пикселей (46,9 мкг/мл) и составляет 47- 13% от первоначального уровня. Увеличение времени гемосорбции приводит к линейному снижению уровня эндотоксина. Через 1,5 часа перфузии антительный сорбент оставляет в крови 10± 3% ЛПС (Н56± 387 пикселей или 0,66 мкг/мл).

Анализ клеток белой крови, подвергнутых перфузии через анти-ЛПС антительный сорбент, показывает, что эндотоксин может существенно

извлекаться с клеточной поверхности лимфоцитов. До стендовой гемосорбции периферическая кровь этой серии опытов содержала 40,2^ 2,55% опсонизированных ЛПС лимфоцитов и 56,7- 2,85% опсонизированных нейтрофилов. В результате гемоперфузии в течение 1,5 часов около 47% лимфоцитов теряют адсорбированный эндотоксин.

Таким образом, при использованиие комплементарных связей при контакте крови аффинными сорбентами проявляется аффект существенного извлечения эндотоксина не только в виде свободно циркулирующих комплексов в плазме, но и связанного с клеточной мембраной. Основная доля эндотоксина участвует в опсонизации вритроцитарной массы, но может прикрепляться и к подавляющей части клеток белой крови. Аффинные к ЛПС сорбенты способны проявлять избирательность десорбции токсина, что , вероятно, зависит от природы химических связей клетки с ЛПС.

Контрольные матрицы вызывают эффект деэкранирования (обнажения) молекул эндотоксина и повышение, таким образом, их выявляемости с помощью иммуноферментного анализа.

Связывание модуля циркуляции крови в сердце с сосудистым модулем головного мозга через колонку с сорбентом может искусственно увеличивать разницу уровней эндотоксемии до и после колонки. Результаты 30 минутной изолированной гемосорбции головного мозга через колонки с контрольными и опытными сорбентами при условии внутриартериального (в/а) введения бактериального ЛПС показали, что максимальный эффект детоксикации способны оказывать аффинные к ЛПС сорбенты. Очень важным результатом является получение достоверно высокой разницы в уровнях эндотоксемии головного мозга и сердца, головного мозга и воротной вены (в 13,5 раз- полимиксиновый сорбент).

Анализ опсонизации клеток крови бактериальным эндотоксином в условиях изолированной гемосорбции головного мозга показал, что внутриартериальное введение ЛПС в дозе 250 мкг на крысу приводит к очень быстрой сенсибилизации клеточной поверхности. По сравнению с группой интактных животных у опытных крыс через 30 мин циркуляции ЛПС опсонизация нейтрофилов возрастает в 4 раза, а лимфоцитов в 1,3 раза. Подобная закономерность характерна и для крови головного мозга, и воротной вены.

Использование аффинных к ЛПС сорбентов (антительный и полимиксиновый) приводит к значительной делигандизации мембраны лимфоцитов. Так после в/а инфузии ЛПС в дозе 250 мкг на крысу через 30 мин в головной мозг попадает 21,6- 3,06% нагру^^иАх. токсином лимфоцитов. Через 30 минут сорбции через полимиксиновый сорбент процент опсонизированных лимфоцитов составляет только 7,0± 1,87, а при гемосорбции через антительный сорбент - II,0± 2,00%

Результаты детоксикации крови в результате энтеросорбции

показывают, что любое связывание и задержка в просвете кишки бактериальных токсинов уменьшает его распространение по сосудистой системе и формирует эффект детоксикации.

Иммуноферментный анализ мазков крови после 6-часовой энтеросорбции показал, что как в контрольных, так и в опытных группах животных выявляется эффект детоксикации. Полимер глутамата хитозана способен снижать уровень интоксикации крови почти в 4 раза. Степень опсонизации лимфоцитов эндотоксином снижается почти в два раза и составляет в полости сердца 17,4- 1,55% и воротной вене 17,0- 2,00% против 27,3- 1,42%, 32,0^ 4,51%, соответственно. Цена эффекта

детоксикации путем энтеросорбции может быть значительно выше при условии дренирования закрытой инфицированной брюшной полости или сочетания корпорального (внутрибрюшного) лаважа и энтеросорбции аффинными к токсинам сорбентами.

Таким образом, активная энтеросорбция с помощью голевого хитозана у животных с разлитым каловым перитонитом должна являться прямым показанием к использованию, так как способна создавать существенный детоксикациошшй эффект и уменьшать антигенную нагрузку на иммунокомпетентные клетки крови.

Микробиологический анализ инкубации аффинных сорбентов с культурами золотистого стафилококка или синегнойной палочки подтверждает механизм не антимикробного, а антитоксического действия. Специфические сорбенты слабо влияют на характер размножения микрофлоры, но способны повышать чувствительность микробов к действию современных антибиотиков.

Присутствие в кишечной взвеси интактных животных водонерастворимого крилевого хитозана в объемных соотношениях 2,5:1 в целом сохраняет видовую характеристику микрофлоры. В кишечном содержимом больных животных в течение всего периода инкубации с сорбентом происходит полная смена видов активных штаммов с преобладанием Aoinetobaoteг оа1ооаое1;1оив (99,9%)- С увеличением доли хитозана в кишечной взвеси (1:1) у интактных животных активируется СзЛгоЬас^ег ата1опаНоив (61,8%) после 4 часов инкубации с последующим восстановлением как у контрольного образца. Важным результатом является полное восстановление активности нормального микробного пейзажа у больных животных практически через 2 часа контакта с сорбентом.

2.4. Результаты корпоральной сорбции шшуно-»Мшошш сорбентами на основе сшитых декстранов.

Применение сорбентов на основе сшитых декстранов демонстрирует их пригодность для лаважа инфицированной брюшной полости. Одночасовая экспозиция ферментного, полимиксинового и комбинированного коныогатов в брюшной полости приводит к снижению в 2,8-7 раз мочевой кислоты, умеренному снижению или полному сохранению активности печеночных ферментов, отсутствию высокой билирубинемии. Картина детоксикации крови после лаважа сочетается с полным сохранением баланса общего белка и отсутствием прогрессирующей потери альбуминовой фракции. Восстановление большинства нарушенных уровней инградиентов плазмы характерно для комбинированного сорбента. Функция двухслойного сорбента рассчитана на ферментативный отрыв бактериального токсина от поверхности брюшины при контакте с поверхностью гранул и связывание с аффинным лигандом- полимиксином В при адсорбции свободных молекулярных структур. Кратковременный лаваж таким сорбентом усиливает в 7 раз утилизацию мочевой кислоты (2,0± 0,18 мкМ/л против 14,0± 4,15 в интактном контроле), способствует полному сохранению уровня общего белка и высокого значения альбумин-глобулинового индекса, нормальной утилизации печенью связанного билирубина. Использование в таких условиях комбинированного декстрана приводит к частичному сохранению уровней, по крайней мере, четырех инградиентов плазмы: АСТ (45,6 -11,80 МЕ/л против 48,0- 15,20 МЕ/л; Р> 0,05)), щелочной фосфатазы (51± 10 МЕ/л против 138- 36; Р< 0,05), а-амилазы (1070± 175 МЕ/л против 1188- 88 МЕ/л; Р>0,05) и прямой формы билирубина (0,3± 0,10 мкМ/л против 0,2± 0,05 мкМ/л; Р> 0,05).

Таким образом, удовлетворительные физические характеристики сорбента, стабильность химической структуры полисахарида, наличие ковалентносвязанных комплементарных к токсинам лигандов,

комбинированность их функций являются серьезной заявкой к разработке метода лечения в клинических условиях.

2.5.Иммунологический скрининг периферической крови и органов иммунной принадлежности у крыс с перитонитом при экстракорпоральной сорбции (динамические стендовые исследования).

Итак, результаты, изложенные выше, показали, что существует прямое отношение молекул бактериальных токсинов к опсонизации клеточных мембран крови. Антигенная сенсибилизация клеток происходит довольно быстро. Механизмы прикрепления эндотоксина ЛПС к клеткам

разной функциональной принадлежности различаются между собой. Испытание аффинных к бактериальным токсинам сорбентов показало принципиальную возможность удаления антигенов с клеточной поверхности. Освобождение клеточной поверхности лимфоцитов от токсинов в результате прямого контакта клеток с поверхностью аффинных сорбентов предполагает деэкранирование функциональных маркеров. Сохранение высокой функциональной : активности иммунокомпетентных кльток при прогрессировании интоксикации имеет исключительно важное значение. Это связано с уровнем защиты при массивной бактериальной контаминации.

Развитие разлитого воспаления брппины в течение 24 часов у крыс подавляет экспрессию Е-рецептора (Е-И) на тимоцитах в 4,7 раза, на спленоцитах в 7,2 раза, на лимфоцитах брыжеечных лимфатических узлов в 3,2 раза, на лимфоцитах периферической крови в 5 раз. Бактериальная интоксикация резко понижает и функциональную активность киллерных клеток селезенки,! вероятно, в результате антигенной опсонизации Р07 сайтов связывания на мембране лимфоцитов. Если у интактных животных К-клеточная активность спленоцитов составляла 47,0- 0,50 бляшкообразующих клеток на 100 полей зрения эритроцитарного монослоя (БОК), то при разлитом перитоните киллерная активность снижается в 1,8 раза и составляет 25,8± 2,66 БОК (Р < 0,05).

Формирование диссеминированного юлмунодефицитного состояния указывает на тотальную эндотоксемию.

Прямая стендовая перфузия клеток тимуса, селезенки, лимфатических узлов и периферической крови через противостафилйкокковый антительный сорбент частично восстанавливает розеткообразувдую активность тимоцитов (в 2,4 раза), спленоцитов (в 3,1 раза), лимфоцитов брыжеечных лимфатических узлов (в 3,8 раза) и лимфоцитов периферической крови ( в 3,5 раза). Полное восстановление реакции регистрируется в брыжеечных лимфатических узлах, где антигенная нагрузка при перитоните у этих лимфоцитов должна быть максимально выраженной. Очевидно, что прямой контакт опсонизированных клеток с антительным сорбентом приводит к извлечению стафилококковых токсинов, экранирующих Е-рецептор на Т-клетках. При этом характер комплементарных взаимодействий распространяется и на те молекулы токсинов, которые супрессируют другие клеточные маркеры, например, Ро7И. Перфузия спленоцитов приводит к полному восстановлению подавленной К-клеточной активности и составляет 41,2- 5,10 БОК против 47,0^ 0,50 БОК у интактных крыс (Р> 0,05). Непосредственный контакт лимфоцитов с анти-ЛПС антительным сорбентом более эффективно вызывал делигандизацию клеточной поверхности, чем антистафилококковый сорбент, и полностью восстанавливал функцию Е-и на

Таблица 2.

Активность полиыиксинового сорбента на основе в-200 в РПГА с сенсибилизированными токсичной плазмой эритроцитами быка при множественном лаваже инфицированной бршной полости

Число Сорбент Сорбент,участвовавший Матрица __ Матрица,участвовавшая. _ лаважей интактный в лаваже (мин) интактная в лаваже(мин)(контроль2)

(контроль 1)- (контроль 3) -

15 30 45 60 15 30 45 60

8192 О

1 8192 2 2 2 0 0 0 0

2 8192 8192 8192 8192 0 0 0 0

3 8192 8192 8192 8192 0 0 0 0

4 8192 8192 8192 8192 0 0 0 0

п 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Таблица 3.

Титры противостафилококковой козьей сыворотки и полшшксива в РПГА с эритроцитаии крыс, сорбированными иммунным и аффинный сорбентами на основе агарозы

серии опытов сенсибилизированные интактные эритроциты время сорбции 11 о | 30 | 45 | 60 эритроциты больных животных время сорбции |15 I 30 |45 |60 интактные эритроциты „с время сорбции ло| 15 | 30 | 45 60

К1 К1 Противо-стаф.сорб Полимикс. сорбент 0 0 0 0 0 0 0 0

К2 К2 Козья сыворотка Полимик-син 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192 8192

КЗ КЗ Козья сыворотка Полимик-син 0 0 0 0 0 0 0 0

Иротиво-стаф.сорб 0 0 0 1 8192 ООО

Полимикс. сорбент 8192 1024 512 256 2048 1024 512 512

Козья сыворотка 8192 8192 0

110ЛИМИК- син 1024 2048 0

п 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Ь 5 ь ь ь

Обозначения к таблице 3.

К1- контрольное смешивание сорбентов с интактными эритроцитами. К2- контрольное смешивание матрицы агарозы с токсичными эритроцитами. КЗ- контрольное смешивание матрицы агарозы с интактными эритроцитами. К4- контрольные титры с несорбированными токсичными эритроцитами. К5- контрольные титры с несорбированными интактными эритроцитами.

тимоцитах и лимфоцитах периферической крови, восстанавливал и дополнительно активизировал клетки брыжеечных лимфатических узлов. В результате цитосорбции спленоцитов активизируется экспрессия Го7й, что характеризуется высокой функцией К-клеток (84,2- 10,93 БОК против 25,8- 2,66 при перитоните и 47,0- 0,50 БОК у интактных животных.

Восстановление функциональной активности лимфоцитов любой локализации указывает на идентичный характер прямой адсорбции эндотоксина.

Перфузия клеток через полимиксиновый сорбент приводит к аналогичному восстановлению функции лимфоцитаршх маркеров с еще более высокой активизацией Е-и на клетках брыжеечных лимфатических узлов. После цитосорбции восстанавливается киллерная активность спленоцитов (38,1- 4,17 против 47,0- 0,50 БОК у интактных животнйх (Р> 0,05).

Таким образом, использование аффинных сорбентов к бактериальным токсинам грамположительной и грамотрицательной микрофлоры с целью цитосорбции лимфоцитов приводит к немедленному восстановлению функции мембранных маркеров. Это указывает на диссоциацию бактериальных комплексов с клеточной мембраной и обнажение рецепторных структур.

2.6. Иымунологиче ский скрининг периферической крови и органов иммунной принадлежности у крыс при лаваже инфицированной брппной полости и энтеросорбции.

Принципиальная возможность извлечения бактериальных токсинов с клеточной поверхности лимфоцитов и восстановление функции мембранных маркеров в результате прямой цитосорбции, детоксикации плазмы открывает возможности непрямой иммунокоррекции. Связывание и задержка бактериальных токсинов 1п вИ;и с помощью гелевых сорбентов существенно снижает антигенную нагрузку на сосудистую и лимфатическую системы сердца, головного мозга и воротной системы печени и, тем самым, сохраняет функциональную активность клеточных маркеров. Например, в результате корпорального лаважа инфицированной ;брюшной полости

полимиксин-терршштиновым сорбентом на основе сшитого декстрана частично сохраняется функция E-R на спленоцитах (16,6± 3,21% против 4,0- 0,50%; Р< 0,05). Первым признаком детоксикации и иммунокоррекции является полное сохранение функциональной активности лимфоцитов периферической крови.

Интенсивная энтеросорбция желудочно-кишечного тракта в течение 18 часов низкомолекулярной формой гелэвого хитозана приводит к полному сохранению функциональной активности E-R на лимфоцитах брыжеечных лимфатических Iузлов и периферической крови, значительно больше (в 3,2 раза) спленоцитов образуют спонтанные розетки с эритроцитами морской свинки. При этом функциональная активность тимоцитов остается чрезвычайно низкой (5,8± 1,60% РОК против 4,2± 0,20% при нелеченном перитоните, Р>0,05).

Исследование К-клеточной активности спленоцитов выявляет полную сохранность функции F07R и высокую киллерную активность (56,2- 5,86 БОК против 5,2- 1,60 БОК у крыс, кормленных целлюлозой, против 25,82,66 БОК при нелеченном перитоните и против 47,0^ 0,50 БОК у интактннх животных). I

Таким, образом, использование желудочно-кишечного тракта с целью бактериальной детоксикации при разлитом перитоните является чрезвычайно важной манипуляцией. В результате интенсивной энтеросорбции происходит существенное сохранение функции рецепторного аппарата лимфоцитов, хотя полного восстановления функциональной активности нет.1

В результате реализации идеи одновременного связывания бактериальных токсинов в брюшной полости и в просвете желудочно-кишечного тракта при разлитом каловом перитоните выявляется глубокая детоксикация, затрагивающая и клетки периферической крови, и клетки селезенки, лимфатических узлов, и клетки вилочковой железы. Сочетание интенсивной энтеросорбции низкомолекулярным хитозаном и внутрибрюшного лаважа комбинированным декстрановым сорбентом приводит к весьма значительной иммобилизации in situ бактериальных токсинов, что полностью сохраняет и даже активизирует функциональную активность клеток иммунной системы.

Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности спленоцитов подтверждает результаты Е-розеткообразования (39,2- 5,29 БОК против 5,8^ 0,90 БОК у животных с комбинированной контрольной сорбцией, против 25,2,66 БОК при нелеченном перитоните и против 47,0- 0,50 БОК у группы интактных крыс).

Таким образом, практически значимая иммунокоррекция при разлитом перитоните может быть достигнута как иммобилизацией бактериальных

токсинов с помощью комбинированного применения энтеросорбции и внутрибрппного лаважа гелевыми сорбентами, так и "существенной делигандизацией лимфоцитов в результате цитосорбции взвеси клеток или цельной крови.

2.7. Защитное действие сорбентов при плазмасорбции на фенотип клеточной поверхности лимфоцитов человека.

Результаты обработки лимфоцитов здоровых доноров человека токсичной плазмой показывают, что плазма животных с односуточным стаЯилококко-синегнойным перитонитом обладает выраженным иммуносупрессивным эффектом практически на все тестируемые рецепторы как в процентном, так и в абсолютном выражении. Экспрессия Е-рецептора на Т-клетках блокирована на 69-72% , Сэ-рецептора на B-клетках- на 67-54%, F07R на Т-клетках - на 46-67%, Fo^iR - на 71%, FoaR - на 51-63%.

Рецепторы, характеризующие клетки как общий пул (Е-, Еа-, ЕАС-, EM-РОК), сравнительно более стабильны, чем рецепторы, характеризующие субпопуляции. При сорбции токсичной плазмы противостафилококковым иммуносорбентом имеет место существенное иммунокорригирующее воздействие на лимфоциты человека, что выражается в частичной защите экспрессии рецепторов, характеризующих общие популяции лимфоцитов, и полной защите иммунорегуляторных Т-субпопуляций. Более того, у плазмы, обработанной этим сорбентом, проявляется свойство дополнительной стимуляции экспрессии Tp.R в 1,7 раза выше, чем в контроле. Эффективность восстановления экспрессии рецепторов была выражена индексами:

T7R % (СП-30) T7R абс.(СП-30)

Ind - = 0,66 (66%) Ind -г = 0,85 (85%)

T7R % (БП) T7R абс.(БП) :

tj1r % (СП-30) tur абс.(СП-30)

Ind - = 1,39 (139%) Ind--1,71 (171%)

oyir % (БП) tpr абс. (БП)

TOR X (СП-30) tar абс.(СП-30)

Ind - = 1,03 (103%) Ind - = 1,37 (137%)

tar % (БП) tar абс.(БП)

Таким образом, иммуносорбент на основе кремнеземной матрицы силохрома с удельной поверхностью 35 м2/г, диаметром гранул 0,5-1 мм, диаметром пор 200нм и ковалентно связанного противостафилококкового

7~глобулина (15,3 мг/смэ) способен специфически извлекать из плазмы микробные токсины и полностью сохранять экспрессию FoctR и FofiR на Т-клетках человека (табл.4).

Сорбция токсичной плазмы полимиксиновым сорбентом в течение 30 минут и обработка ею суспензий лимфоцитов приводит к полному сохранению процентного состава двух субпопуляций Т-клеток, экспрессирующих FoR к IgM и IgA.

Характер защиты рецепции на иммунорегуляторных Т-субпопуляциях с помощью противостолбнячного иммуносорбента свидетельствует о слабом неспецифическом эффекте сорбции. Плазма, обработанная этим иммуносорбентом, сохраняет в полной мере иммуносупрессивные свойства. Эффективность защиты поверхностных маркеров выражена индексами:

T7R % (СП-30) T7R абс.(СП-ЗО) Ind --■ = 0,42 (42%) Ind - = 0,41 (41%)

T7R % (БП) T7R абс.(БП)

TjiR % (СП-30) T|i,R абс. (СП-30)

Ind -:— = 0,38 (38%) Ind - = 0,38 (38%)

ТЦН % (БП) T)i,R абс. (БП)

тад % (СП-30) таи абс.(СП-30)

Ind - = 0,66 (66%) Ind - = 0,60 (60%)

TaR % (БП) TaR абс.(БП)

Таким образом, соотношение индексов показало, что эффективность защиты поверхностных маркеров в процентном и абсолютном выражении ниже у противостолбнячного иммуносорбента, чем у противостафилококкового на Тц клетках в 3,7-4,5 раза, на Т7 клетках в 1,6-2,1 раза, на Та клетках в 1,6-2,3 раза.

Использование в исследованиях мелкопористого угля СКН-4М, насыщенного элементарным йодом, рассчитано, помимо сорбции, на активное окисление токсичных ингредиентов плазмы больных животных (лаборатория экспериментальной геиосорбции НИИ ФХМ МЗ РФ).

При насыщении угля йодом путем физической адсорбции существует опасность его десорбции в плазму по градиенту концентраций и оказание токсического эффекта. Результаты инкубирования Т-лимфоцитов

человека с сорбированными СКТ-6А и CKH-4M+Iz образцами плазмы показали непосредственный иммуносупрессирующий эффект практически на все тестируемые маркеры клеточной поверхности. Контакт СКТ-6А с плазмой в течение 15-30 минут подавляет относительную экспрессию E-R, соответственно в 1,6 и 1,4 раза. Такая же величина супрессии наблюдается и в абсолютном составе клеток. Инградиенты токсичной плазмы, иницирующие резкое подавление процентного содержания популяций

Таблица 4.

Фенотип клеточной поверхности лимфоцитов человека при воздействии токсичной плазмы, обработанной противостафилококковыы иммуносорбентом

( М± т; п = 10)

Рецепторы лимфоцитов БП ИП ТП СП-15 СП-30

X, абс. X, абс. X, абс. X, абс. X, абс.

Е-И Еа-И

53,5- 4,46 1067* 83

49,2- 6,96

42,0* 4,00 +

13,3- 5,69 +

909 - 242 255 - 102 33,8- 6,02 34,3* 4,54

967

116

ЕАС-Н 22 «2| 4,22

65

432 *

Вп-И Т7-И ТЦ-И та-и

25,7* 4,70 522 * 122

12,4- 2,20 129 * 23

33,4* 1,04 357 - 35

13,8* 1,91 142 * 12

734 - 182

20,О* 4,84 364 * 54

13,3* 2,30 288 -

714

132

8,7 * 2,56 +

168

45

11,0* 1,61 69 234 * 50

8,8 * 1,24 4,8 * 0,77 101 * 18 34 * 6

31,2* 8,00 9,2 * 1,08

248

69 72 -

12

10,7* 1,38 5,3 * 0,69

III ±

21 42

23,3* 1,73 472 * 46

46,0* 4.57 931 * НО

19,7* 5,30 369 * 75

14,0* 2,66 296 * 69

9,1 * 1,56 89 * ; 17

29,2* 1,88 300 * 38

11,6* 3,44 ИЗ * 29

32,5659 *

66,3* 1365*

18,0* 357 *

10,0* 198 *

8,2 * НО *

46,5* 612 *

14,2* 194 *

4,01 103

2,89 151

4,68 83

0,82 "12

1,05 II

5,94

97

2,33 24

Р«Х

Е-И < 0,001

Еа-И > 0,05 ЕАС-И =0,05

Вп-Н > 0,05

Т7-11 <0,05

ТЦ-И < 0,05

та-я < 0,005

>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05

Рэ%

>0,05

<0,001

>0,05

>0,05

<0,05

Р» абс. Р2 абс. Рэ абс.

<0,001 <0,001 >0,05 <0,005

< 0,05

> 0,05

< 0,05

> 0,05

< 0,005

< 0,05

< 0,01

> 0,05

> 0,05

< 0,05

> 0,05

< 0,01

> 0,05

< 0,005 = 0,06

> 0,05

< 0,001

< 0,001 < 0,001 < 0,05 < 0,001

Обозначения к таблице 4.

БП- лимфоциты без присутствия плазмы; ИП- лимфоциты в

присутствии интактной плазмы; ТП-лимфоциты в присутствии токсичной плазмы; СП-15 - лимфоциты в присутствии сорбированной в течение

15 мин токсичной плазмы;СП-30 - лимфоциты в присутствии сорбированной в течение 30 мин токсичной плазмы.

Р*(Ж,абс.) - достоверность различий в процентном и абсолютном выражениях между ИП и ТП.

Рг(%,ибо.) - достоверность различий в процентном и абсолютном

выражениях между ТП и СП-15. Рэ(%,аСс.) - достоверность различий в процентном и абсолютном выражениях между ТП и СП-30.

Тц- и та-лимфоцитов, соответственно в 3,5 и 2 раза, а абсолютного содержания в 5,11 и 2,6 раза, продолжают еще более усугублять картину иммуносупрессии после контакта с СКТ-6А в течение 15-30 минут. Плазма, обработанная этим сорбентом, оказывает супрессирующгй эффект на Сэ маркер В-лимфоцитов (подавление в 2,4-2,1 раза). Обработка

токсичной плазмы СКН-4М+ 1г приводит к резкому повышению ее токсических свойств при контакте с пулами клеток. Экспрессия маркеров Е-И и Еа-н подавляется в 2,8 и 4,4 раза. Несмотря на, казалось бы, благополучную картину восстановления процентного состава Т7- и Та-клеток, незначительное повышение числа Т(д-лимфоцитов, их абсолютный состав продолжает снижаться. Это обусловлено, прежде всего, супрессией общего пула Т-клеток.

Таким образом, эффект иммуносупрессии плазмы, обработанной угольными сорбентами, подтверждает результаты клинических исследований. Снижение экспрессии ряда рецепторов у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями наблюдается непосредствешю после сеансов гемосорбции.

Иммобилизация окислителей на углях требует строгого дозирования и, вероятно, использования технологии получения более прочных связей (например, ковалентной) для исключения десорбции веществ в свободную жидкую среду.

Таким образом использование в эфферентной терапии перитонита комплементарных межмолекулярных связей оказывает существенный эффект как в смысле детоксикации, так и иммунокоррекции. Результаты исследований показывают, что ни один из примененных контрольных сорбентов или матриц в силу своей неспецифичности не может конкурировать с иммуно-аффинной сорбцией. Это обусловлено тем, что извлечение экзо- и эндотоксинов происходит как по механизмам адсорбции, так и абсорбции. Макропористая структура кремнеземных матриц позволяет осуществлять комплементарные взаимодействия лиганда и токсина как наружной, так и внутренней поверхностью гранул.

Эффект сенсибилизации клетки продуктами микробной флоры происходит так быстро, как только клетка с ними контактирует. Время сенсибилизации Клеточной поверхности стафилококковыми антигенами

практически не влияет на эффективность иммуносорбции. Антигены удаляются одинаково хорошо как при пассивном нагружении клетки в течение 45 минут, так и сенсибилизированные in vivo при прогрессировал™ разлитого перитонита. Вероятно, существенный эффект деблокирования рецепторных сайтов при обработке сорбентом клеточной поверхности заключается в непрочности сцепления стафилококковых токсинов с мембраной наряду с его высокой тропностью.

Гидрофобные взаимоотношения токсинов грамотрицательной

микрофлоры с клеткой, очевидно, более прочные, чем стафилококковых, поскольку при длительной сенсибилизации клеток in vivo эффект делигандизации неполный. Более того, при использовании неспецифических контрольных сорбентов такой эффект вовсе отсутствует. Прочность лиганд-рецепторных связей в этой ситуации зависит от степени встраивания бактериальных липополисахаридов в билипидный слой мембраны и превращения их в единицу его структуры. Прочность при таком взаимодействии зависит от времени контакта.

Таким образом, антитоксическая гемоплазмасорбция с помощью аффинных сорбентов является мощным методом воздействия на иммунную систему, подготавливающим клетки к восприятию фармакологических иммунокорректоров. Поэтому в комплексной терапии разлитого перитонита эфферентные методы детоксикации должны сочетаться с фармакологической иммунокоррекцией. Перспективным направлением является использование гормонов и медиаторов иммунной системы. Особый интерес представляет эндолимфатический путь введения препаратов.

Экспериментальный раздел.

2.8. Сравнительная эффективность путей введения Тактивина в индуктивную фазу первичного иммунного ответа.

Высокая чувствительность эндолимфатического пути введения препарата была подтверждена в сериях опытов с его введением в дозе I мкг на крысу (табл.5). При снижении дозы препарата в 2 раза (0,5 мкг на крысу) и при введении его э/л повышается количество АОК в селезенке в 2,6 раза (2217± 157 против 850- 145, Р<0,001). При этом стимулирующий эффект по сравнению с контрольными сериями, где соответствующими путями вводился физраствор, четко прослеживается только при э/л инфузии препарата. Отмечено возрастание АОК селезенки более, чем в 4 раза по сравнению с контролем ( физраствором).

В продуктивную фазу первичного иммунного ответа наркоз и лапаротомия у крыс активно супрессируют образование АОК селезенки. Если при введении Тактивина в дозе 0,5 мкг на крысу в брыжеечные лимфатические узлы число АОК в селезенке составляет 837- 18 х 10е, то

Таблица 5.

Количество АОК селезенки (х 10аклеток) крыс в ответ на в/в, в/и, в/бр, г/л и п/к введение Тактивина в дозе 1 мкг через 24 часа после иммунизации ЭБ

Путь введения Количество АОК п Р

э/л 850± 145 10

в/бр 474± 87 * 7 < 0,05

в/м 462^ 80 * 7 < 0,05

в/в 315± 73 ★ 7 < 0,05

п/к 187± 10 * 7 < 0,05

Всего 38

* - Достоверность различий при сравнении с э/л путем введения

инфузии препарата в/в и в/бр оказываются эффективнее, чем э/л путь, соответственно 8,1,5 и 2,1 раза. В то же время, п/к пул> введения Тактивина у крыс при условии выполнения лапаротомии и наркоза в 4,4 раза менее эффективен, чем эндолим^атический.

Сопоставление результатов стимуляции Тактивином в обеих фазах первичного иммунного ответа показало преимущество индуктивной фазы, где антителообразование значительно выше при э/л, в/м и в/бр путях введения (табл.6). Вне конкуренции оказывается э/л путь инфузии (850± 145 против Ю9± 24, Р< 0,001).

Таблица 6.

Стимуляция АОК селезенки крыс Тактивиноы в индуктивную и продуктивную фазы первичного иммунного ответа

наркоз + лапаро- томия Доза Тактивина (мкг) Путь введения АОК селезенки х 10° клеток

индуктивная фаза ПИО п продуктивная фаза ПИО п Р

+ 0,5 э/л 2217- 157 6 837± 18 3 <0,001

- 0,5 ' в/в 1354± 369 7 1220± 80 6 >0,05

- 0,5 в/м 826- 139 6 575± 34 5 >0,05

- 0,5 в/бр 980- 201 5 1831± 255 7 <0,05

+ 1.0 э/л 850± 145 10 Ю9± 24 7 <0,001

+ 1,0 в/в 315± 73 7 277- 64 8 >0,05

+ 1,0 в/м 462± 80 7 141- 38 8 <0,01

+ 1.0 , в/бр 474- 87 7 229± 58 6 <0,05

Изучение зависимости величины эффекта препарата от дозы показало, что при эндолимфатическом пути введения 1 Тактивина предпочтительнее использовать более низкие дозы. Характерна параболическая зависимость в системе "доза-эффект"! При введении в лимфу классических доз Тактивина (1-2 мкг/кг массы) происходит снижение стимулирующего эффекта на антителообразующие клетки селезенки.

Клинический раздел.

2.9. Взаимоотношения степени интоксикации с экспрессией рецепторов на Т- и В-лимфоцитах и секрецией иммуноглобулинов.

Воспалительный процесс в брюшной полости независимо от причин и степени распространения, сроков госпитализации , и оперативного вмешательства, возраста и комплекса проводимой терапии характеризуется отклонениями всех тестируемых антигенных детерминант на клеточной поверхности лимфоцитов Т- и В- классов. Характерным является. не

только значительное снижение абсолютного и процентного количества лимфоцитов в периферической крови, но и глубокие инверсии субпопуляционного состава: падение численности обще!} Т-популяции и ее высокоаффинного пула (Еа-РОК), резкое угнетение экспрессии FcR на Тц-клетках, рост числа тестируемых FoR на Т7- и Та- лимфоцитах.

В-система иммунитета проявляет идентичные отклонения как в популяционной, так и в субпопуляционной градации - резкое снижение экспрессии рецепторов к Сэ -компоненту системы комплемента и эритроцитам мыши, подавление реакции розеткообразования с комплексами EAalgM-c, что подтверждает супрессию В-клеток в тесте розеткообразования с комплексом ЕАС. В то же времЬ, эритроцитарные клетки, сенсибилизированные агрегированными иммуноглобулинами классов IgG и IgA, после присоединения комплемента проявляют высокую активность в отношении В-лимфоцитов. Общие закономерности приведенных иммунологических нарушений при перитоните подтверждаются при прослеживании роста степени интоксикации.

В качестве критерия интоксикации была использована интегральная величина - лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) и общее клиническое состояние пациентов. С ростом синдрома интоксикации растет величина лейкоцитарного индекса. Динамичное тестирование показателей периферической крови при полном цикле развития разлитого перитонита выявило 4 группы величин ЛИИ: меньше 2,0 (легкая степень), от 2,1 до 7,0 (степень средней тяжести), от 7,1 до 12,0 (тяжелая степень) и

свыше 12,1 (терминальная интоксикация).

При легкой степени интоксикации картина периферической крови уже резко изменена с нарушением субпопуляционного состава Т-клеточного пула. Несмотря на то, что общая популяция Г-клеток остается стабильно высокой, в том числе, лимфоциты с высокоавидными Е-рецепторами (Еа-РОК), резко снижена экспрессия Po(j.R как в абсолютной, так и в процентной величийах. Уже на этой стадии эндотоксемии усиливается экспрессия F07R. Лимфоциты, несущие на мембране FoaR, остаются стабильными. При увеличении ЛИИ до 7,0 возникает глубокая супрессия Тр.-клеток и высокая активность Т^-клеток. Значения Т-хелперных клеток находятся на грани полного исчезновения как в процентном, так и абсолютном числе (5,7* 3,20; 129* 95, соответственно).

Т-лимфоциты, экспрессирукхцие FoaR, продолжают оставаться стабильными величинами. Однако, несмотря на глубокие инверсии в Т-субпопуляционноМ составе, общий уровень Т-клеток в тесте Е-РОК и Еа-РОК остается благополучно высоким и не отличается даже от уровней здоровых доноров (' табл.8).

Тенденции к отклонению, наметившиеся среди В-субпопуляционного состава при ЛИИ до 2,0, проявляются в полной мере у Вц- и Ва-клеток при ЛИИ от 2,1 до 7,0 (4,1* 0,31).

Известна обратная взаимозависимость экспрессии Fo-рецепторов на В-клетках и секреции этими клетками сывороточных иммуноглобулинов. Раннее снижение экспрессии Роц-рецептора на В-клетках указывает на возможный механизм реанимации Вц-клеток к продукции первичных иммуноглобулинов класса igM в условиях слабой интоксикации. Происходит постепенное усиление экспрессии FoaR на В-клетках, что может быть расценено как усиление эффекторной цитотоксической функции гуморального звена иммунитета и в отношении чужеродных, и в отношении звоих клеток. Кроме того, высокая экспрессия FoaR на Б-клетках может указывать на подавление секреции сывороточного igA. Анализ ^следований показывает четкую зависимость уровня секреции IgA, igG и [gM В-клетками от величины экспрессии этими клетками FoaR, F07R и Jo|lR.

Периферическая кровь от пациентов, находящихся в крайне тяжелом /Ouiuii состоянии при разлитой форме перитонита с величиной ЛИИ от 7,1 р 12,0, представляет по составу тяжелую степень иммунодефицита. 1еличина общего лимфоцитарного пула остается высокой, хотя резко :нижен процент в составе белых клеток периферической крови за счет начительного роста клеток гранулоцитарного ряда (нейтрофилов). всмотря на достаточно высокое содержание общего числа лимфоцитов 2,1* 0,52 х' 10е*/л), при тестировании фенотипа клеточной поверхности

выявляется его глубокая супрессия по тестам Е-РОК, Еа-РОК, ЕА1^-Р0К, ЕАЛ^-РОК, ЕА1еА-РОК, ЕАС-РОК, Епл-РОК. В этой ситуации характерным является нормальный процентный состав клеток ( за исключением Тц-лимфоцитов) и крайне низкие значения абсолютных величин. Вполне вероятно, что РоИ является сайтом не только для циркулирующих иммуноглобулинов и их комплексов с антигенами ( в том числе, токсинами) и компонентами комплемента, но и непосредственно для бактериальных токсинов. Стехиометрическое заполнение мест связывания (Рой) на Т-лимфоцитах молекулами бактериальных эндотоксинов, возможно, резко снижает их тестирование эритроцитарными диагностикумами. Инверсии в субпопуляциях лимфоцитов усугубляются общей лимфопенией.

Весьма характерными событиями в В-субпопуляционном составе является растормаживание экспрессии Рой ко всем классам иммуноглобулинов. Чем выше степень интоксикации, тем больше В-лимфоцитов экспрессируют Рой. При терминальном состоянии пациентов практически каждая клетка способна экспрессировать РоИ сразу к трем классам иммуноглобулинов. Эта крайне неблагоприятная ситуация сочетается с весьма низким содержанием сывороточных иммуноглобулинов (табл.7).

У погибающих пациентов (ЛИИ 18,7- 1,64) с низким содержанием гемоглобина ( 81 ^ 7 г/л), высоким СОЕ (52- 7), наряд]г с относительной лейкопенией и нейтропенией, характерен резкий сдвиг влево формулы белой крови (наличие молодых форм гранулоцитов). В периферической крови таких пациентов регистрируются крайне низкие абсолютные и относительные цифры общего состава лимфоцитов и всех субпопуляций. Для Т-класса клеток характерна общая глубокая супрессия субпопуляций, для В-класса клеток- резкая экспрессия Рой для всех классов иммуноглобулинов.

Циркулирующие сывороточные иммуноглобулины, вероятно, являются остаточными, крайне низкими величинами в связи с возможным прекращением их секреции.

2.10. Иыыунорегуляторный эффект Тактивина при его эндолиыфатичеокон введении.

Тяжелое иммунодефицитное состояние, возникающее при перитоните, требует включения в комплексную терапию средств иммунореанимации. Подключение в комплексную терапию эндолимфатических инфузий Тактивина создает положительный эффект за счет стабилизации роста общего пула лимфоцитов: возрастает абсолютное число Т-общих клеток, среди которых увеличивается высокоавидная их популяция (Еа-РОК). Известный механизм действия Тактивина в отношении модулирования Т-хёлперной функции

лимфоцитов проявляется даже в ситуации тяжелой эндотоксемии ( 10,33,77% против 3,0± 1,54% ; 195±100 против 19± 5 ).

При строгом отборе пациентов с целью иммунологического скрининга, соблюдения относительно равных условий между грушами эндолимфатические инъекции Тактивина в брыжеечные лимфатические узлы (начало курса лечения) и далее в паховые лимфатические узлы (основной курс) приводят |к широкому модулирующему эффекту. Иммунокорригирупцее действие препарата затрагивает практически все пулы популяций и субпопуляций лимфоцитов Т-В- классов.

Нарастание массы клеток В-системы (ЕАС-РОК) приводит к увеличению абсолютного содержания в объеме крови В-субпопуляций, экспрессирупщх For к igM, igG и igA. Параллельная нормализация процентного состава Вц-клеток (увеличение) и Ва-клеток (снижение) указнает на положительный эффект модулирования. Доказательством этого дополнительно выступает увеличение секреции сывороточных иммуноглобулинов IgA, IgG и IgM.

Динамичный, иммуномониторинг у пациентов, находящихся в удовлетворительном состоянии после перенесенного разлитого воспаления брюшины, показал, что наряду с нормальной общей массой лимфоцитов (2,1- 0,18 х Ю^кл/л) и процентным их составом (37,0±3,33%) в периферической крови продолжает сохраняться глубокий дефицит Тц-клеток (86-133 х 10вкл/мл или 10,6-14,7%). Таким образом, пациенты,

благополучно перенесшие разлитой гнойный перитонит при общем удовлетворительном состоянии, требуют высокого внимания к разбалансированной иммунной системе и назначений иммунотропных препаратов.

Прекращение эндолимфатических инфузий Тактивина у пациентов в удовлетворительном состоянии приводило к сохранению глубокого Тц-дефицита, высокой экспрессии FofR и FoaR и нестабильному восстановлению В-субпопуляционного состава.

Таким образом, результаты исследований указывают на необходимость длительного применения инъекций Тактивина у пациентов, перенесших разлитое воспаление брюшины независимо от их клинического состояния.

Результаты анализа указывают на то, что в срок 8-15 суток после последней инъекции Тактивина проявляется максимальный модулирующий эффект. Несмотря на тяжелое общее клиническое состояние больных, на 8-15 сутки после курса инфузий Тактивина резко снижается ЛИИ до 3,9± 0,92, устраняется лимфопения, нормализуется численность общих классов Т-В-лимфоцитов. Т-субпопуляционный состав клеток характеризуется повышенной численностью Т-супрессоров и Т-амплифайеров. В

рассматриваемой клинической ситуации продолжает сохраняться высокая экспрессия Вц-, В7- и Ва-лимфоцитов, что подтверждает« тяжесть процесса.

Таким образом, длительность иммунокорригирущего эффекта Тактивина регистрируется в пределах первых 10 суток после проведенных курсов. Если по истечении 3 суток эндолимфатического ведения препарата количество Т-тотальных и Т-активных лимфоцитов находится в пределах нормы, имеется четкая тенденция к увеличению содержания Т7- и Та-лимфоцитов и наблюдается относительно высокая экспрессия (2211,6%) Тр.-клеток, а к 10-м суткам восстанавливается еще и тотальная популяция В-клеток, то через 18 суток после проведенных курсов иммунокоррекции характерно повторное наступление тех же нарушений, что были до лечения препаратом.

Сочетанное применение препаратов крови и эндолимфатических инфузий Тактивина у больных с множественными абсцессами брюшной полости значительно снижает интегральный показатель токсичности крови ( ЛШ 3,7- 0,75) и сохраняет незначительную лимфопению. Однако существенно нормализовать субпопуляционный состав клеток не удаетбя. Крайне глубокая супрессия Тц-лимфоцитов (41- 12 хЮвкл/мл или 7,3± 2,25%) и резкая экспрессия F07R и FoOR на В-клетках прогнозируют неблагоприятный исход. В случае разделения групп пациентов только по признаку эндолимфатических инфузий Тактивина картина крови у больных, получавших Тактивин, существенно отличается от той, где в схеме лечения Тактивин отсутствовал. Главные отличия заключены в следующем. В группе с применением Тактивина: выше (на 37%) абсолютное число Т-клеток, выше (в 1,7-2,6 раза, на 41-62%) процентное и абсолютное количество Т-лимфоцитов, несущих высокоаффинные Е-рецепторы, выше (в 2,9-2,6 раза, на 66-62%) плотность Fop.R на Т-клетках (табл.Э)..

Сохранение функции рецепторного аппарата клеток иммунной системы в результате цитосорбции и энтеросорбции бактериальных токсинов при разлитом перитоните позволит с большой эффективностью применять иммунокорригирующие препараты. Эндолимфатическое введение иммуноактивных средств полипептидной природы строится на позиции их низкой деградации в лимфе и сокращения пути доставки в представительство иммунной системы. Возможность извлечения токсина из цельной крови специфическими сорбентами замыкает круг необходимых терапевтических пособий. Таким образом, с целью глубокой детоксикации организма при разлитом гнойном перитоните предполагается комбинирование эфферентных методов лечения (табл.10). Согласно схеме лечения перитонита для эффективного извлечения бактериальных токсинов

должна быть осуществлена одновременная сорбция крови, содержимого желудочно-кишечного тракта и свободной полости брюшины. Использование в гемо-плазмасорбции углеродсодержащих сорбентов было бы полезным как с точки зрения извлечения низко-среднемолекулярных токсических субстанций, так и с целью подготовки клеточного состава крови к контакту с аффинными сорбентами.

Интенсивная энтеросорбция, видимо, не может служить противопоказанием при разлитом перитоните и должна периодично сочетаться с постоянной назо-интестинальной интубацией.

Лаваж инфицированной брюшной полости начинается санацией классическими водными растворами, позволяющими удалять во время лапаротомии и затем по дренажам большие массы микробной флоры, их токсины, ферменты, низко-среднемолекулярные субстанции. Последующее введение одного из ряда жидких аффинных к бактериальным токсинам сорбентов, его экспозиция и дренирование рассчитано на повышение качества классического лаважа за счет дополнительного удаления токсинов с поверхности брюшины. Сочетание в одной грануле сорбента гидролитического фермента и аффината позволяет увеличивать эффект детоксикации. Как показывают исследования далеко не каждая гелевая матрица может быть пригодной для лаважа брюшной полости. Нежелательная реакция брюшинного покрова и экссудата в ответ на введение гелевых сорбентов позволила исключить некоторые носители из разряда перспективных (агароза, сефадекс).

Таким образом, в условиях высокой интоксикации создаются условия нормального функционирования клеток иммунной системы. Результаты исследования показывают, что при сочетании эфферентных методов лечения перитонита и иммунокоррекции у человека происходит восполнение иммунодефицита, регуляция экспрессии рецепторных сайтов, влияющих на межклеточную кооперацию и секрецию сывороточных иммуноглобулинов. Точками приложения Тактивина являются Т-клетки иммунитета и, в частности лимфоциты, несущие Роц-рецептор. Диссоциация на клеточной лембране комплексов: рецепторы - бактериальные токсины в результате гемосорбции позволяет деэкранировать Е-И, ЕАС-и, Ро-И и проявлять шмунокорригирущий эффект Тактивина.

Клиническое выздоровление пациентов, перенесших разлитое воспаление брюшины, не означает полного восстановления иммунной системы, и ранняя отмена эндолимфатических инфузий Тактивина сарактеризуется повторными инверсиями в субпопуляционном составе.

Таким образом, вполне очевидно, что бактериальные токсины при зазлитом перитоните являются одной из первопричин интоксикационного ¡индрома. Раскрытие их химической структуры - это залог выявления и

Таблица 7.

Лабораторные показатели периферической крови у пациентов с разлитой формой перитонита

(п= 212)

М± т Теста М± л

7,6- 0,52 Та-клетки /мкл 155- 16

Та-клетки % 15,9- 1,10

2,0- 0,17 То-клетки /мкл 539± 47

3,8- 0,06 То-клетки % 58,7- 2,59

136- I ЕАС-РОК /мкл 208± 28

24- I ЕАС-РОК % 11,4- 1,34

83- 2 Ет -РОК /мкл 216± 43

7,7± 0,64 Ет -РОК % 13,2± 1,62

5,9± 0,47 0-клетки /мкл 6Ю± 56

1,8- 0,07 0-клетки % 34,0± 2,27

19 ± I Вц-клетки /мкл 172- 33

941± 62 Вц-клетки % 64,3- 5,21

61,2- 9,71 В7-клетки /мкл 201- 32

768± 57 В7-клетки % 77 3± 3,67

42,8- 1,92 Ва-клетки /мкл 219± 36

96- 21 Ва-клетки % 78,7- 3,87

9,4± 1,21 г/л 1,0± 0,02

166± 23 г/л 9,1- 0,15

16,6± 1,23 1вМ г/л 0,7- 0,02

Тесты

нь г/л Ш; ед. СОЕ мм/час эритроциты х Ю12/л лейкоциты х Юр /л нейтрофилы х Юр /л

палочкояд. %

сегментояд. %

моноциты Ж

белок общий г/л

(фибриноген г/л мочевина

мМ/л билирубин общ.мкМ/л

99- 14

29-40±

4,0- 0,82 И,9±0,47 7,7-0,33

13 - I

62 - I 4,3± 0,26

66,0±Г,06 13,5±0,58 7,7-0,42 9,6-0,87

Тесты

билирубин связ.

мкМ/л билирубин свобод

мкМ/л калий мМ/л

натрий мМ/л

1ГГВ сек

пти %

Время кровотеч. мин

ЛИИ ед.

лимфоциты хЮ^/л лимфоциты % Е-РОК /мкл Е-РОК % Еа-РОК /мкл Еа-РОК % Тц-клетки /мкл Тц-клетки % Т7-клетки /мкл Т7-клетки %

Таблица 8.

Лабораторные показатели периферической крови у здоровых доноров

( п = 72 )

Тесты Ы± ш Тесты М± ш • Тесты М± т

нъ г/л 140-1Б0 ЛИИ ед. 0.9± 0 .13 0-клетки /мкл 517- 66

1ГЬ ед. - лимфоциты Х10"/л 2,2± 0 ,09 0-клетки % 20.7- 1,82

СОЕ мм/час 9-12 лимфоциты % 37 ± I Вц-клетки /мкл 365± 44

эритроциты Е-РОК /мкл 1307± 74 Вц-клетки % 78,8± 5,12

х Ю12/ л 4,5-5,0 Е-РОК % 73,1-13 .15 В7-клетки /мкл 240± 28

лейкоциты Еа-РОК /мкл П29± 67 В7-клетки % 52,6± 4,15

х 10* /л 6,1-0,24 Еа-РОК % 51,2- I .75 Ва-клетки /мкл 165± 18

нейтрофилы Т^-клетки /мкл 500- 44 Ва-клетки % 35,4- 1,86

х 10" /л 3,4- 0,20 Тц-клетки % 35,5± I .74 1бА г/л 1,1± 0,04

эозиноф.% 2-4 Т7~клетки /мкл 157- 15 г/л 9,5± 0,24

базоф. % 0-1 Т7-клетки % II,3± 0,70 г/л 0,9± 0,02

молодые % 0 Та-клетки /мкл 202± 23

юные % 0 Та-клетки % 13,8- I .21 Т(Е-рок) конт.

палочкояд. То-клетки /мкл 561± 4. 44 % Т(еас-рок) конт. 91,7± 2,55

% 0,5- 0,09 То-клетки % 42,2± 2 ,24 % 3,5± 0,78

сегментояд. ЕАС-РОК /мкл 418± 24 ТВ0(Е-рок конт.

% 57 - I ЕАС-РОК % 20,1- I ,ю % 31,1± 1,68

моноциты % 2,5± 0,28 Еш -РОК /мкл 32 ТВ0(еас-рок)к0нт

Еш -РОК % 22,4- I ,83 % 43,0± 1,96

Таблица 9.

Ишунокоррекция регуляторных клеток периферической крови эндолии{)атическиыи инъекциями Тактивина у пациентов с разлитым перитонитом .

( т )

Груша обследованных

Иммунорегуляторные

клетки

Т-обцие Т-актив-ные Т7 Та В-обцие В—мывиные

58,8-3,82 а 30,3-3,54 а 7,2 ± 2,73 25.3i7.75 20,0±6,87 15,8± 7,52 21,6^ 5,56

а 717 ± 145 (6) 58,0-3,07 а 361 - 88 (6) б 51,3-3,21 а 84 - 36 <4> б 21,2- 3,70 а 272 - 66 (3) 29,3±2,78 237 - 98 (4) 28,5-3,48 245 - 105 (6) 12,5- 2,02 а 196 ± 42 (5) 22,5- 3,49

П28± 64 (26) в 54,0-2,70 б 955 ± 75 (24) в 24,3-6,07 б 221 ± 39 (21) в 6,6 ± 2,20 313 ± 47 (22) 18,1±3,60 261 1 33 (22) 8,5 -2,53 213 - 40 (25) в 7,0 ± 2,41 404 ± НО (10) в 26,0- 2,50

872 - 198 (8) 65,1-2,23 в 406 ± .123 (7) 45,5±2,72 в 62 ± 31 (5) 38,2-' 2,69 150. ± 50 (6) 12,9±1,22 43-18 (4) 11,2-1,03 в 36 - 18 (7) 18,5- 1,86 в 191 - 58 (4) 17,1± 1,18

1280- 86 (29) 913 ± 71 (29) 414 ± 53 (19) 92 ± 13 (16) 79 ± 13 (15) < 342 ± 32 (25) 347 ± 32 (27)

Обозначения к таблице 9:

Группа I -пациенты,не получавшие Тактивина, 2 - пациенты, получавшие Тактивин, 3 - пациенты, погибшие от перитонита.

Буквенными индексами отмечена достоверность различий (Р< 0,05) между группами 1 и 4 (а), 1 и 2 (б), 3 и 4 (в).

В числителе - %, 'в знаменателе - абсолютные числа. В скобках -число

обследованных. !

|

синдрома. Раскрытие их химической структуры - это залог выявления и получения эффективных антитоксических препаратов и на их основе высокоемких сорбентов. Извлечение бактериальных токсинов с клеточной поверхности иммунокомпетентных клеток ставит эфферентные методы в разряд иммунокорригирующих способов лечения.

Таблица 10.

ЭФФЕРЕНТНАЯ АФФИННАЯ ТЕРАПИЯ РАЗЛИТОГО ГНОЙНОГО ПЕРИТОНИТА!

геыо сорбция цито сорбция плазма сорбция

1 1

неспецифические * углеродсодерхацие сорбенты

антибактериальные (антитоксические) аффинные сорбенты на основе кремнеземов

анти-ЛПС антительные

полимиксиновый

назо-интести-налъная интубация

энтеросорбция

гелевые формы водонераство-римого крабового хитозана

гелевые формы водорастворимого крабового хитозана

1

лавах и дренирование бршной полости

классические водные растворы

антибактериальные (антитоксические) аффинные гелевые сорбенты на основе сшитых декстранов

антительные

полимиксиновый

ферментные комбинированные

выводы.

1. Антибактериальные сорбенты, полученные на основе феынезешшх матриц, способны извлекать из цельной крови, плазыы и дембран форменных элементов токсины граиположительной и грамотрицательной микрофлоры, понижая их содержание при разлитой 1еритоните на 89-90%.

2. ! Геыоплазыасорбция через аффинные антибактериальные сорбенты при перитоните создает эффект освобождения рецепторных сайтов связывания на иымунорегуляторных Т-клетках человека и животных.

3. Изолированная гемосорбция головного мозга у экспериментальных животных через аффинные антибактериальные сорбенты создает эффективную детоксикацию органа, понижая концентрацию эндотоксина в среднем в 13,5 раз.

4. Разработаны технология синтеза и способ применения антитоксических сорбентов на основе сшитого декстрана, позволяющие ювысить качество классического перитонеального лаважа и детоксикацию фови. Технология синтеза передана в опытно-промышленное производство %ля ограниченных клинических испытаний.

5. Выбрана технология синтеза гелевых форы хитозана, позволяющая получать эффекты системной детоксикации и иммунокоррекции 1ри сеансах энтеросорбции в условиях разлитого перитонита. Результаты исследований внедрены в клиническую практику хирургических отделений.

6. 1 Разработаны экспериментальные способы шмунологического контроля у крыс, основанные на определении фенотипа мембран лимфоцитов и получении клеточного монослоя.

7. Разработан способ юшуноферыентного анализа в дельной крови эндотоксина грамотрицательной микрофлоры (липополисахарида).

8. Сочетание корпорального лаважа инфицированной Эрппной полости антибактериалышы аффинным сорбентом на основе спитого цекстрана с сеансами интенсивной энтеросорбции гелевой формой хитозана вызывает эффект глубокой системной детоксикации и сохранения функции шшфоцитарных маркеров в органах иммунной принадлежности.

9. Определены юшунокорригирующие возможности препарата гиыуса Т-активина при его эндолиифатической инфузии у человека в условиях коиплексного лечения разлитого перитонита.

Опубликованные работа no теие диссертации.

1. Связывание токсинов специфическим сорбентом. Исследования In vitro.//Сб.науч.тр.: Иммунобиологические препараты.-М.,1989.-С.129-132./соавторы:Кулаев Д.В., Алексейчук B.C., Павленко В.В., Силантьева О.В., Перьянова О.В.

2. Экспрессия F07,ц.а-рецепторов на иммунорегуляторных Т-клетках человека при иммуносорбции плазмы при стафилококко-синегнойном перитоните.//Тез.докл.I Всес. иммунол.съезда.- М:Сочи,1989 Т.1.-С.202.

3. Извлечение бактериального липополисахарида из цельной крови иммуно-аффинными сорбентами при разлитом перитоните.//Тез. докл.Всеросс.конф.:Эфферентные методы в медицине.- Анапа, 1992.- С.142-144. //соавторы: Бутусова H.H.,Миллер М.Е.

4. Лаваж инфицированной брюшной полости иммуно-аффинными гелевыми сорбентами на основе агарозы. // Вестн.хирургии.- 1993.- * .- С. ./ соавторы: Силантьева О.В., Насибов С.М., Кулаев Д.В., Лопухин С.Ю., Лопухин D.M.

5. Использование жидких сорбентов на основе хитозана для лечения разлитой формы перитонита.// Пат.физиол. экспер. тер.-1993.-* 6- С. ./соавторы: Насибов С.М., Кулаев Д.В., Лопухин Ю.М.

6. Иммуностимулирующие свойства стафилотоксина.//ЖЭМИ.- 1991.- * 12,- С.41-42./соавторы: Кулаев Д.В., Кулак В.Г., Лопухин Ю.М.

7. Иммунокорригирующие возможности противостафилококкового иммуносорбента при извлечении стафилотоксина.//ЖЭМИ.- 1993.* 5.- С. ./соавторы: Кулаев Д.В., Силантьева О.В., Кулак В.Г., Лопухин Ю.М.

8. Лейкоцитарный индекс интоксикации и иммунологические нарушения при разлитом гнойном перитоните.//Клин, медицина.- 1991.-Т.69.- * 6.- С.60-61./соавторы:Титовец P.E., Камзалакова Н.И., Бондарь B.C., Хороших Л.В., Швецкий А.Г., Граков B.C., Лопухин Ю.М., Арион В.Я.

9. Эндолимфатическая коррекция инверсий иммунорегуляторных клеток Тактивином у пациентов с острым перитонитом.//Иммунология.-1991.- * 3.- С.64-66./соавторы: Титовец P.E., Камзалакова Н.И., Бондарь B.C., Швецкий А.Г., Граков B.C., Арион В.Я.

10. Нарушения иммунитета и их коррекция с применением полимиксинового сорбента при разлитом стафилококко-синегнойном перитоните.//Иммунология.- 1991.- * 3.- С.40-43./соавторы: Кулаев Д.В., Силантьева О.В., Лопухин Ю.М.

11. Влияние Тактивина на антителообразупцие клетки ,селезенки крыс.// БЭБМ.- 1991.- T.CXI.- * €.- С.644-646./соавторы: Арион В.Я., Лопухин Ю.М., Хороших Л.В.

12. Протективный эффект противостафилококкового иммуносорбента на фенотип клеточной поверхности лимфоцитов при разлитом стафилококко-синегнойном перитоните.// Вестник АМН СССР.-1991.- * 7.- С.36-40./соавторы: Кулаев Д.В., Силантьева О.В., Лопухин Ю.М.

13. Ишунокорригирующая эффективность противостафшюкоккового иммуносороента.//Пат.физиол.экспер.тер.- 1993.- Ji I.- С. /соавторы: Кулаев Д.В., Силантьева О.В., Мартынов А.К., Лопухин Ю.М.

14. Антибактериальная активность сорбентов на основе хитозана.//Матер.III науч.-техн. конф.: Разработка отходов крилевого' производства.- М., 1991.- С. ./соавторы: Насибов С.М., Кулаев Д.В.

15. Аффинный лаваж брюшной полости при разлитом перитоните жидкими сорбентами на основе сшитых декстранов. //Хирургия.- 1992.- * 4.- С.23-27./соавторы: Кулаев Д.В., Дятлов В.А., Насибов С.М., Силантьева О.В., Лопухин С.Ю., Лопухин Ю.М.