Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия ранних генов вирусов папиллом человека в опухолях шейки матки

На правах рукописи.

Федорова Мария Дмитриевна

005002631

Экспрессия ранних генов вирусов папиллом человека в опухолях

шеики матки

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени ? ^ НОЯ 2011 кандидата биологических наук

Москва 2011

005002631

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Э. Гурцевич доктор биологических наук, профессор Г.Е. Сулимова

Ведущая организация:

ФГБУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского.

Защита диссертации состоится »^¿¡¿¿¿с'^Я 2011 г. в /О часов на заседании Диссертационного совета (Д.001.017.02) при РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН

(Москва, 115478, Каширское шоссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН

Автореферат разослан «/У>> р/с/гЦ^ьЯ2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН.

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место по частоте смертности среди онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором РШМ признаны вирусы папиллом из так называемой группы высокого риска заболевания (HR-HPV, от англ. high-risk human papillomaviruses). Наиболее распространенными среди них являются два онкогенных HPV (типы 16 и 18), совместно на их долю приходится более чем 70 % случаев РШМ в мире.

Инфекции HR-HPV передаются половым путем, в большинстве своем они являются бессимптомными и транзиторными. Приблизительно в 90% случаев происходит избавление от инфекции в период от 1 года до 2 лет благодаря иммунному ответу организма. У части пациентов наблюдается длительная инфекция (более 2 лет), во время которой инфицированные клетки могут прогрессировать в предраковые поражения (CIN от англ. cervical intraepithelial neoplasia) и/или инвазивный РШМ [Цур Хаузен Г., 2008; Kisseljov et al, 2008; Frazer 2009]. В настоящее время созданы две профилактические вакцины, которые успешно предотвращают развитие инфекции четырьмя типами HPV, в том числе HR-HPV 16 и 18. Однако их эффективность в борьбе с персистирующей инфекцией и предраковыми поражениями существенно ниже [Цур Хаузен Г., 2008, Paavonen, 2011]. В связи с этим продолжаются попытки создания антивирусных препаратов и лечебных вакцин для борьбы с персистирующей инфекцией и раком шейки матки разных стадий.

Исследование механизмов, приводящих к длительной инфекции, нарушению жизненного цикла вируса и злокачественной трансформации, поиск клеточных генов, изменение экспрессии или структуры которых позволяло бы отличить инфицированную клетку от трансформированной клетки с нарушенным жизненным циклом вируса, являются важными задачами. Эти исследования необходимы для определения групп риска развития рака среди инфицированных больных, обнаружения мишеней для антивирусной терапии, определения тактики лечения. Решение этих задач невозможно без знаний структуры, функций и регуляции экспрессии генов HR-HPV. Основную роль в злокачественной трансформации играют не структурные белки HR-HPV, а регуляторные - продукты так называемых ранних генов (от Е1 до Е7, от англ. early), с экспрессии которых в клетке начинается

жизненный цикл вирусов. Учитывая вышесказанное, исследование экспрессии ранних генов НЯ-НРУ в опухолях шейки матки представляется актуальным.

Два ранних вирусных гена Е6 и Е7 обладают свойствами онкогенов и всегда экспрессируютсяв опухолях, независимо от формы персистенции генома Н11-НРУ. В части НРУ-позитивных опухолей полностью сохраняется кольцевой вирусный геном, функционирующий в виде минихромосомы (эписомы), в другой происходит интеграция ДНК НРУ в геном клетки, которая сопровождается утратой некоторых областей вирусного генома, в том числе ранних генов Е1 и Е2. Белки Е1 и Е2 необходимы для репликации кольцевой вирусной ДНК и регуляции транскрипции вирусных генов. Они взаимодействуют также с множеством клеточных белков, как было установлено в экспериментах на модельных клеточных системах. Очевидно, что опухоли, экспрессирующие и не экспрессирующие белки Е1 и Е2, несмотря на общий этиологический фактор (Ш-НРУ), могут существенно различаться между собой по своим свойствам.Проявление функций Е1 и Е2, которые могут быть существенными в процессе канцерогенеза, практически не было исследовано в опухолях в отличие от модельных систем. До сих пор многочисленные попытки обнаружить мРНК гена Е1 в опухолях не увенчались успехом.

Исследование экспрессии и функций Е1 и Е2 в опухолях необходимо для понимания механизмов вирусного канцерогенеза и определения возможностей применения противовирусной терапии.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в исследовании экспрессии двух ранних генов Е1 и Е2 вируса папиллом человека типа 16 и их влияния на экспрессию клеточных генов в опухолях шейки матки.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. отобрать группу опухолей шейки матки, позитивных по НРУ16 и охарактеризовать форму персистенции вирусного генома (эписомная, интегрированная);

2. провести поиск мРНК с кодирующим потенциалом для раннего гена Е1 в опухолях шейки матки с эписомной формой генома НРУ;

3. определить первичную структуру мРНК Е1 и старт транскрипции;

4. исследовать возможность влияния экспрессии раннего гена Е2 НРУ на активацию транскрипции клеточного гена матриксной металлопротеиназы 9, ассоциированного с опухолевой прогрессией, в опухолях шейки матки.

Нуачная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

Впервые обнаружено, что инициация мРНК ранних генов НРУ 16 может происходиьт с промотора Р14, который функционирует на всех стадиях прогрессии РШМ. Впервые показано, что в карциномах шейки матки присутствует мРНК с кодирующим потенциалом для гена Е1 НРУ 16, которая иницируется с промотора Р14 и существует в форме полиаденилированных полицистронных мРНК, сплайсированных в районе гене Е6. Показано, что потенциальная способность Е2 активировать транскрипцию ММР-9, обнаруженная в модельных системах, не реализуется в опухолях шейки матки.

Теоретическое значение работы заключается в обнаружении мРНК с кодирующим потенциалом для гена Е1 НРУ16 и установлении ее первичной структуры. Эти данные могут быть использованы при разработке и тестировании антивирусных препаратов и лечебных вакцин.

Лпробаиия результатов работы.

Работа прошла апробацию 3 июня 2011 года на совместной конференции лабораторий молекулярной биологии вирусов, онкогеномики, биохимии опухолей, вирусного канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, методов скрининга канцерогенов, молекулярной эндокринологии НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Основные результаты работы были представлены на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург 2010)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список использованной литературы. Работа изложена на 101 странице машинопистного текста, включает 10 таблиц и 9 рисунков. Список литературы содержит 151 источник.

Обзоу литературы.

Обзор литературы посвящен структуре, экспрессии и функциям ранних генов HR-HPV, продукты которых играют основную роль в злокачественной трансформации. Основное внимание уделено генам El и Е2, исследованию которых в опухолях шейки матки посвящена работа.

Материалы и методы.

Образцы опухолей были получены из операционного материала от больных Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Коллекция исследованных образцов состояла из 41-ой плоскоклеточной карциномы I, II, III стадий (по классификации международного союза гинекологов и акушеров, FIGO). Биопсийный материал цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) был любезно предоставлен к.м.н. Л.И.Короленковой (РОНЦ им. Н.Н.Блохина). Присутствие в образцах ДНК HR-HPV различных типов определяли с помощью полимеразной цепной реакции. В работе использовали только HPV 16-позитивные опухоли (35 образцов), а также клеточные линии, полученные из опухолей шейки матки SiHa и CaSki,содержащие геном HPV16 (American Туре Culture Collection, Rockville, MD). В работе были использованы следующие методы исследования: выделение ДНК и РНК из образцов тканей и клеточных культур гуанидинизотиоцианатным методом, электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле, блот-гибридизация по Саузерну, получение радиоактивно-меченых зондов, гибридизация с меченым зондом, метод полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), клонирование продуктов ПЦР, определение нуклеотидной последовательности ДНК, метод сдвига подвижностей олигонуклеотидов в полиакриламидном геле при взаимодействии их с белками.

Результаты и обсуждение.

1. Выявление транскриптов генов Е1 и Е2 НРУ16 в карциномах шейки

матки.

1.1.Анализ форм персистенции генома НРУ16 методом ПЦР.

На первом этапе работы был проведен отбор опухолей шейки матки, в ДНК которых содержатся полноразмерные открытые рамки считывания (ОРС) генов Е1 и Е2,методом ПЦР с праймерами к 5' и 3' концам генов Е1 и Е2 НРУ16 (рис.1, ! таблица!).

562 858/865

3358 3620

7906/1 [*"'

р»

г

Е4

Poty-A

г

880

3358

4215

226

409

526

Я §

S И

<

2709

2582

V

Рисунок 1. Схема регуляторной области генома HPV16 и мРНК.

IURR - регуляторный район (upstream regulatory region); Р97 - промотор для транскрипции ранних генов; Р670 - промотор для транскрипции поздних генов; Poly-А - сигнал полиаденилирования для ранних генов. Представлена часть вариантов сплайсированных мРНК.

В 17 из 35 карцином ШМ (48,6 %) было выявлено сохранение полноразмерных копий ДНК HPV16 (таблица 1). В остальных 18 опухолях наблюдались разрывы/делеции в гене Е1 или Е2, или одновременно в двух генах, что соответствует интегрированной форме ДНК HPV16.

Таблица 1. Анализ форм персистенции ДНК НРУ16 в карциномах шейки матки методом ПЦР.

Номер кол-во ДНК Форма персистенции и

группы образцов El Е2 сохранность ДНК HPV 16

1 17 + + Ер; Ер + Int *

2 5 + - Int (разрыв/делеция Е2)

3 7 - + Int (разрыв/делеция El)

4 6 - - Int (разрыв/делеция El и Е2)

итого 35

* - в части карцином возможно одновременное присутствие копий с разрывом/делецией (смешанный вариант), т.к. метод не позволяет обнаружить утрату | Е1/Е2 в присутствии эписомы. Ер - эписома, Ы - интегрированный геном вируса

1.2. Анализ транскрипции генов Е1 и Е2 в карциномах шейки матки методом ОТ-ПЦР.

В опухолях, содержащих полноразмерные копии НРУ16, исследовали транскрипцию ранней области вирусного генома методом ОТ-ПЦР, который позволяет не только обнаружить мРНК, но и установить с какой физической формы ДНК НРУ происходит ее считывание. Метод основан на том, что транскрипция кольцевой вирусной ДНК инициируется в регуляторной области ШК, и терминируется в конце всего раннего участка генома в сайте полиаденилирования (рис. 1). При этом формируется несколько альтернативно сплайсированных вариантов РНК, большинство из которых не содержит полноразмерного Е1, и только часть из них содержит полноразмерный Е2. В случае интеграции вирусного генома в геном -клетки не образуются многие сплайсированные варианты вирусной РНК из-за разрыва/делеции области Е1/Е2 и появляются химерные (вирусно-клеточные) РНК, которые терминируется в клеточном полиА-сайте. Размер этих РНК варьирует в зависимости от сайта интеграции.

Для обнаружения полиаденилированных транскриптов, содержащих полноразмерные ОРС Е1 и Е2, получали кДНК, используя комбинированный праймер, содержащий олиго-с!Т и случайную адаптерную последовательность нуклеотидов на 5' конце. Эту кДНК затем использовали в качестве матрицы в ПЦР с праймером, расположенным в 3' половине гена Е7, который всегда присутствует и экспрессируется в опухолях, и обратным праймером, комплементарным адаптерной

части комбинированного олиго-с1Т праймера. Результаты типичного эксперимента представлены на рис.2, А.

1 2 3 4 6

' V 1

- «... ..., ; .....- «.1050 п.и.

►1500 п.н.

Ген Е7

М-

3500 П.Н.

_1000 п.н.

Ген Е2

Ген Е1

¥2-

] поли-А

-Я2

Зонд1 3онд 2

■880 ' 880 . 880

Зонд 3

3358 —

2709*

2582

Рисунок 2. Анализ мРНК Е1 и Е2 в опухолях шейки матки методами ОТ-ПЦР и Саузерн-блотинга.

А. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР с праймерами к полицистронной мРНК Е1-Е2 (Р-Я). Цифрами над дорожками обозначены опухоли; дорожки: 1-4 - образцы с эписомной формой генома НРУ16; 5 - образец с эписомной и интегрированной формой генома НРУ16; 6 - образец с интегрированной формой генома НРУ16. М1- маркер, размер фрагментов в т.п.н.; Б. Гибридизации по Саузерну продуктов ПЦР после переноса на мембрану. Нумерация дорожек, как в пункте А. М2- маркер, размер фрагментов в т.п.н.; гибридизация с Р32-мечеными зондами: дорожки 1,2, 3,5 - зонд 1, дорожки 4, 6 -зонд 2. В. Схема расположения зондов для гибридизации продуктов ПЦР по Саузерну и локализация праймеров.

Во всех дорожках (кроме 6) присутствует продукт размером = 1050 п.н. Этот продукт соответствует мажорному варианту сплайсированной мРНК НРУ16 (сайты сплайсинга 880-3358 п.н.), с которой транслируются гены Е6 и Е7. Отсутствие рамки Е1 и части рамки Е2 в них было подтверждено сиквенированием. Образование такого продукта возможно только с полноценной копии ДНК НРУ16. Отсутствие каких-либо

полос кроме полосы ~ 1050 п.н., означает, что считывание ранней области происходит только с эписомной формы ДНК. Появление полос разных размеров и отсутствие полосы = 1050 п.н. говорит о транскрипции РНК с интегрированных копий вирусного генома с сайтом полиаденилирования в клеточной ДНК (рис.2, А, дорожка 6). Одновременное присутствие продукта размером = 1050 п.н. и дополнительных полос другого размера говорит о смешанной форме персистенции вирусной ДНК, т.е. о присутствии полноценных и делецированных копий одновременно (рис. 2, А, дорожка 5).

Этот анализ транскриптов НРУ16 позволил различить опухоли с чисто эписомной и смешанными формами персистенции НРУ16 (Таблица 2). Таким образом, 5 из 17 (29 %) опухолей с эписомной формой содержат одновременно и интегиророваные копии НРУ16. Ни в одной из 17 опухолей с полноценными копиями НРУ16 не удалось выявить продукт размером 3514 п.н., соответствующий мРНК, имеющим ОРС Е1 и Е2. Полноразмерная ОРС Е2 должна входить в состав как полицистронной мРНК для трансляции Е1, так и в состав полицистронной мРНК для трансляции Е2, в которой ген Е1 удален сплайсингом (сайты сплайсинга880 и 2582 или 2709 п.н). Такие транскрипты Е2 (1699 и 1826 п.н.) также не были выявлены.

Эти данные указывают на очень низкий уровень мРНК Е1 и Е2 в опухолевых клетках с полноценными копиями ДНК НРУ16.

Для обнаружения полиаденилированных мРНК Е1 продукты ПЦР переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с зондами к гену Е1. Только в нескольких опухолях удалось обнаружить продукт, размером = 3500 п.н., соответствующий полиаденилированному продукту ПЦР, содержащему полноразмерную рамку Е1(рис. 2, Б, дорожки 2 и 4). Однако клонировать и сиквенировать этот продукт нам не удалось. Полученные данные подтвердили предположение о крайне низкой концентрации в опухолях полицистронной мРНК НРУ16, необходимой для трансляции Е1.

На следующем этапе была сделана попытка обнаружить полиаденилированные транскрипты Е1 в продуктах ПЦР, представленных на рис. 3,А с помощью второго раунда ПЦР с праймерами для коротких перекрывающих друг друга фрагментов ДНК внутри рамки Е1.

л.

Е7 Е1 Е4 Е5

иш* Е6 Е2

7904/0 1-й раунд ПЦР ЮОО

-1-

2000

3000

2-й раунд ПЦР 1

Б

2582

Ро1у-Л

4000

5000

Е1

506 Т

ят-

588 Т

ят-

Е2 М1

_

вш®гг •

375 295 741 545 290

| Варианты иэтлайсинга мРНК

ранних генов

1000 п.н. ^500 п.н.

- 1000 п.н. ~500 п.н.

-1000 п.н. "500 п.н.

1000 п.н. 500 п.н.

1026

В.

Е1

519 Т Щ-

520 Т ЯТ-

Е2 М1

375 295 741 545 290

_1 ООО п.н. 500 п.н.

1000 п.н. 500 п.н.

1000 п.н. 500 п.н.

1000 п.н. 500 п.н.

1026

Е1 1 2 3 4 5

421Т "*— ЯТ-

742 Т ЯТ-

:.:■ ■■■ ..

ШШ

Е2 М1

_1000 п.н.

- 500 п.н.

-1000 п.н. ' 500 п.н.

1000 п.н. 500 п.н.

1000 п.н. 500 п.н.

375 295 741 545 290 1026

Рисунок 3. Анализ мРНК генов Е1 и Е2 в опухолях шейки матки методом ОТ-ПЦР.

A. Схема ранней области генома НРУ16. Горизонтальными линиями под шкалой обозначены участки мРНК, по концам которых расположены праймеры для двух раундов ПЦР; числа под электрофореграммой соответствуют размеру ПЦР-продукта; М1 - маркер. Б, В, Г- кДНК получены с олиго-с!Т праймером;

Б. образцы содержат эписомальную форму вирусного генома;

B. образцы содержат смешанную форму персистенции вирусного генома;

Г. образцы содержат интегрированный вирусный геном с разрывом рамки Е2; ЯТ- контроль на присутствие ДНК в пробах РНК, реакция проведена без добавления обратной транскрнптазы.

На рис. 3 представлены типичные результаты второго раунда ПЦР для опухолей с эписомной (Б), смешанной (В) и интегрированной формами ДНК НР\Н6 (Г). Во всех образцах с полноценными копиями НРУ16 присутствуют продукты ПЦР для всех пяти районов гена Е1 и для полноразмерного гена Е2. Для двух опухолей (506Т и 588Т) продукты ПЦР всех пяти районов были клонированы и сиквенированы. Степень гомологии продуктов ПЦР гену Е1 (ОепеВапкК02718.1) составила 98-99 %. Таким образом, в опухолях с эписомной и смешанной формой ДНК ИРУ 16 (17 образцов) впервые были обнаружены полиаденилированные транскрипты, содержащие ген Е1 (таблица 2).

Форма персистенции генома № п/п № опухоли Клиническая стадия Транскрипт Е1 Транскрипт Е2 1026п.н

Р-н 1 Р-н 2 Р-н 3 Р-н 4 Р-н 5

Эписомная 1 432 2 + + + + + +

2 458 1 + + + + + +

3 483 1 + + + + + +

4 486 2 + + + + + +

5 504 3 + + + + + +

6 506 1 + + + + + +

7 507 1 + + + + + +

8 515 1 + + + + + +

9 575 2 + + + + + +

10 583 2 + + + + + +

11 588 1 + + + + + +

12 727 1 + + + + + +

Смешанная (эписомная и интегрированная) 1 436 1 + + + + + +

2 519 2 + + + + + +

3 520 3 + + + + + -

4 499 2 + + + + + +

5 726 3 + + + + + +

Интегрированная (с сохранением генаЕ!) 1 421 1 + + + + + -

2 489 3 + + + - - -

3 721 1 - - - - - -

4 735 1 + + + - - -

5 742 1 + + + + + -

Обнаруженные транскрипты, помимо Е1, содержат еще по крайней мере участки Е7 и Е2, т. к. для их получения были использованы праймеры, специфичные для этих генов. Кроме того, они должны содержать также ОРС для генов Е4 и Е5, так как единственный сигнал полиаденилирования в ранней области НРУ16 находится после гена Е5. Они должны также содержать ОРС Е6 (полноразмерный или сплайснрованный вариант), так как известные старты транскрипции ранней области НРУ16 находятся перед геном Е6. Такие полиаденилированные полицистронные транскрипты удалось выявить только с помощью двух раундов ПЦР, что подтверждает их присутствие в опухолевых клетках в крайне низкой концентрации.

Таким образом, впервые показано существование в карциномах шейки матки полиаденилированных полицистронных транскриптов с кодирующим потенциалом для белка E1HPV16.

1.3. Анализ старта транскрипции мРНК ранних генов в карциномах шейки

матки.

До недавнего времени в URR всех онкогенных типов HPV был известен только один старт транскрипции (для HPV 16 - Р97), с которого инициируются все ранние мРНК.

Уже во время выполнения этой работы было показано, что амплификация кольцевого генома HPV16 при транзиентной трансфекции его в клетки происходит только при наличие в геноме интактного неизвестного ранее старта транскрипции в позиции 14 п.н. (Р14), интактных сайтов сплайсинга в гене Е6 (226 и 409 п.н.) и интактных ОРС Е7, El, Е2 (рис.4, A) [Lace et al., 2008]. На основании этих данных, полученных на модельной системе, авторы предполагают, что in vivo на начальных этапах вирусной инфекции для экспрессии El необходима полицистронная мРНК, сплайсированная в районе Е6, транскрибируемая с промотора Р14, а не с промотора Р97. Однако, о существовании ранних мРНК, считываемых с промотора Р14, в естественных условиях ничего не было известно. В связи с этим мы попытались определить существуют ли такие мРНК (иными словами, функционирует ли промотор Р14) на разных стадиях прогрессии РШМ.

Для анализа мРНК, содержащих последовательности между двумя стартами транскрипции Р14 и Р97, методом ОТ-ПЦР, использовали прямой праймер, расположенный в позиции 16-37 п.н. генома, а в качестве обратного - Е1-специфический праймер (рис. 4, А, праймеры F2, R2). В качестве негативного контроля использовали праймер F1, расположенный перед ТАТАА-боксом в позиции 7890 п.н. Для этих опытов кДНК получали с El-специфического праймера RI, а РНК для ее приготовления предварительно обрабатывали ДНК-азой. Во всех опухолях с эписомной формой персистенции генома HPV 16 присутствовал продукт ПЦР, соответствующий по размеру транскрипту со сплайсингом в гене Е6 (226 л 409 п.н., рис. 4, Б). Продукты ПЦР с контрольным праймером F1 не были выявлены ни в одном из образцов (данные не представлены). В некоторых опухолях присутствовали также другие продукты ПЦР, соответствующие несплайсированному в области Е6

транскрипту и/или транскрипту со сплайсингом в позиции 226 л 526 п.н.

14

Идентичность всех обнаруженных транскриптов была подтверждена клонированием с последующим сиквенированием. А.

URR Еб Е7

Е2 Е4

_„Р14

Poly-А.

v'l

looo

R2 <-R1

4000 5000

Б. 507T 583T 506T 588T K+ M

о^ A ~~~ Я,

В. 507 730 734* 489 К+ М 33 _6_ .62. 44 42 TNTNTNT CNCCCNCN

НК ... .... ... : . - "

Р14 iiiWf ' ...... =

Р97** .......Id V— Ш ■A- / ► Iii

Рисунок 4. Анализ транскрипции генома HPV16 с ранних промоторов в образцах ткани шейки матки

A. Схема ранней области генома HPV16. Стрелки показывают локализацию используемых праймеров; (W, О - варианты сплайсинга мРНК ранних генов; Б и

B. Электрофорез в агарозном геле продуктов ОТ-ПЦР. Б. ОТ-ПЦР с праймерами F2-R2; кДНК синтезирована с El-специфичного праймера R1; В. кДНК синтезирована с гексапраймерами; Р14 -ОТ-ПЦР с праймерами F2 - R2, Р97 -ОТ-ПЦР с праймерами F3-R2; НК - негативный контроль, ОТ-ПЦР с праймерами Fl и R2; К+ -положительный контроль, ДНК клеточной линии Caski.; М - маркер 100 п.н.; * образец содержит интегрированную форму HPV 16; ** Метод ОТ-ПЦР позволяет определить инициацию мРНК с промотора Р97 только в отсутствии мРНК PI4. Т-опухоль; N-морфологически неизмененная ткань, прилегающая к опухоли или CIN; С- CIN (образцы: 33 - CIN II; 6, 62, 44, 42 - CIN III)

Таким образом, впервые показано существование в опухолях ШМ полицистронных мРНК, специфичных для El, инициируемых с раннего промотора Р14 и сплайсированных в гене Е6. Наличие продуктов ПЦР с разными вариантами сплайсинга в гене Е6 говорит о том, что мРНК с различным кодирующим потенциалом (Е6, Е7, Е5 и другие,), по-видимому, также могут инициироваться с промотора Р14 и подвергаться такому же сплайсингу, как мРНК, инициируемые с промотора Р97.

Для выяснения вопроса о том, функционирует ли промотор Р14 в клетках, содержащих геном HPV 16, на разных стадиях канцерогенеза, этим же методом исследовали мРНК из CIN и карцином разных стадий, а также HPV-позитивных морфологически нормальных тканей шейки матки (рис. 4, В, Таблица 3).

Таблица 3. Частота транскрипции генома 11РУ16 с ранних промоторов Р14 п Р97 в образцах ткани шейки матки.

Образцы Форма персистенции генома Р14 ПЦР-продукт Р97* ПЦР-продукт

нормальная ткань** н/т 1/15 (6,7%) 4/14 (28,5%)

CIN "* н/т 18/28 (64%) 4/10(40%)

опухоли Эписомная 13/13 (100%) н/т

Интегрированная 8/9 (89%) 1/1

* Метод ОТ-ПЦР позволяет определить инициацию мРНК с промотора Р97 только в отсутствии мРНКР14.

** Морфологически не измененная ткань шейки матки, прилегающая к CIN или опухоли;

*** CIN: CIN I - 1 образец, CIN II - 4 образца, CIN Ill/CIS - 23 образца, н/т - не тестировали

В этой серии опытов использовали кДНК, синтезированную с гексапраймерами, для учета мРНК с кодирующим потенциалом для всех ранних генов (не только для гена El). Транскрипты, инициируемые с промотора Р14, были обнаружены во всех опухолях, кроме одной, с интегративной формой генома (образец 734). В этом образце транскрипция осуществлялась с промотора Р97. Соотношение мРНК с различными формами сплайсинга варьирует в разных образцах. В образцах всех стадий CIN также присутствовали транскрипты с промотора PI4. Использованный

16

метод обнаружения мРНК, инициируемых с промотора Р14, не позволяет ответить на вопрос, одновременно или поочередно функционируют промоторы Р14 и Р97. Этот вопрос требует отдельного исследования. Таким образом, инициация мРНК ранних генов HPV 16 с промотора Р14 может происходить на всех стадиях прогрессии РШМ.

2. Анализ транскрипции Е2 и структуры сайта интеграции в НРУ16-позитивной опухоли

В одной из опухолей, сохранивших ОРС Е2 при интеграции HPVI6 в геном клетки, был обнаружен транскрипт Е2. Для исключения возможности присутствия единичных копий эписомной формы HPV16 и возможность транскрипции с них как Е2, так и Е1. В связи с этим была предпринята предпринята попытка определить с клеточного или вирусного старта транскрипции инициируется мРНК Е2 методом синтеза кДНК, комплементарной 5' концу РНК (метод SMART, «Clontech»). В результате этого анализа была обнаружена полиаденилированная химерная мРНК, содержащая часть 14-го и 15-ый экзон гена МАР4 (от. англ. microtubule-associated protein 4), маленький фрагмент У конца гена Е1 с известным сайтом сплайсинга (2709 п.н.) и ген Е2 (рис.5). Промотор, с которого инициируется эта мРНК, расположен в клеточной последовательности. Анализ химерных транскриптов в сайтах интеграции позволяет судить о его структуре. Интеграция фрагмента генома HPV 16, содержащего гены Е1 и Е2 произошла в экзон 14 гена МАР4. Ранее для этой опухоли была показана интеграция Е1-Е7 фрагмента HPV 16 в интрон между 11 и 12 экзонами МАР4 при анализе геномной ДНК опухоли (Винокурова, неопубликованные данные). Сопоставление этих данных предполагало два варианта структуры сайта интеграции: а) фрагментация генома HPV 16 и встраивание в два разных участка гена МАР4 и б) сохранение единого фрагмента HPV 16 и перестройка структуры гена МАР4 с изменением порядка следования экзонов. Результаты анализа целостности ДНК HPV 16 методом ПЦР на участке от гена Е2 до гена Е6 представлены на рисунке 5 (участок CD).

Присутствие продуктов ПЦР для всех девяти анализируемых фрагментов ДНК позволило сделать вывод о том, что интеграция произошла с единственным разрывом в геноме HPV16 в районе гена Е1 и перестройкой гена МАР4 с изменением порядка расположения экзонов.

А.

МАР4

HPV16

МАР4

R2

R1

♦-R3

ДНК кДНК М 1 2 3 4 5 б 7 8 9 М

565Т ДНК — w km — — — « — 22! 4- 500 п.и.

472 ПН. —» 500 п.н.

К+— «щ» _ «и» " ^_5ооп.н.

К. Ш 4-500п.н

535 498 543 462 607 556 593 674 669

Рисунок 5. Анализ структуры и транскрипции сайта интеграции в опухоли 565Т.

A. Схема сайта интеграции HPV16 в клеточную ДНК. 2709, 880 п.н. - позиции сайтов сплайсинга HPV16; 1657 п.н. - позиция HPV16, в которой произошел разрыв (ген Е1); места разрыва ДНК показаны волнистой вертикальной линией; R1 - праймер к гену Е2 (3563R), использовали для синтеза кДНК и 1-го раунда ПЦР; R2 - праймер к гену Е2 (3540R), использовали для 2-го раунда ПЦР; R3 - праймер к гену Е2 (3123R); F1 и F2- универсальные праймеры, метод SMART «Clontech»; F3- праймер к экзону 15 гена МАР4; F4 - праймер к гену Е7 (701F); цифры в скобках обозначают позицию праймеров (см. «методы», таб. праймеры); ex. -экзон.

Б. Электрофореграмма продукта ПЦР с праймерами к ДНК гена МАР4 (F3) и гену Е2 (R3). М- маркер с шагом 100 п.н.

B. Электрофореграмма продукта ПЦР с праймерами к району CD. CD - участок генома HPV16 был разбит на 9 перекрывающихся районов (цифры над электрофореграммой) для анализа его целостности (праймеры см. в таблице); К+ -положительный контроль, образец опухоли (506Т), содержащий эписому HPV16; К- -отрицательный контроль (без ДНК); числа под электрофореграммой соответствуют размеру ПЦР-продукта (п.н.).

Такая структура сайта интеграции означает невозможность экспрессии с этого аллеля полноценного белка МАР4. Белок МАР4 экспрессируется во многих типах тканей взрослого организма, в том числе и в тканях эпителиального происхождения.

Этот белок способствует сборке микротрубочек и считается негативным регулятором их деполимеризации. Фосфолирирование белка в митозе инактивирует его и способствует завершению митоза. Предполагают, что снижение уровня МАР4 способствует более быстрой прогрессии клеточного цикла. [Dehmelt and Halpain, 2004; Poruchynsky et al., 2001]. Сложная структура сайта интеграции HPV16 в ген МАР4 является одним из немногочисленных пока примеров, указывающих на сложность процессов интеграции, а также на нарушение функционирования генов, ассоциированных с канцерогенезом. Таким образом, учитывая свойства МАР4, интеграцию HPV16 в этой опухоли можно рассматривать как случай инсерционного мутагенеза, который по общепринятым представлениям не характерен для РШМ [см. обзор Wentzensen et al., 2004]. По-видимому, такая структура сайта интеграции является также косвенным подтверждением существования в опухолях описанного для клеточных линий механизма дестабилизации генома клетки, связанного со способностью Е1 и Е2 индуцировать множественную репликацию вирусной и клеточной ДНК в сайте интеграции с последующей активацией клеточных систем репарации и рекомбинации ДНК [Kadaja et al 2009].

3. Ген Е2 HPV16 и экспрессия матриксной металлопротеиназы- 9

Известно, что в модельных системах белки Е2 разных типов HR-HPV, в том числе и HPV16, индуцируют экспрессию матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9) через стимулирование МАР-киназного каскада и активацию транскрипционного фактора API. Матриксная металлопретеиназа 9 (ММР-9) не только гидролизует коллаген IV типа, который составляет основу базальных мембран, но и модулирует опухоль-ассоциированный ангиогенез. Помимо API транскрипция ММР-9 может быть активирована в карциномах шейки матки при активации NF-kB [Smola-Hess et al., 2001]. Таким образом, и Е2 и NF-kB могут позитивно влиять на индукцию экспрессии ММР-9. NF-kB локализуется в цитоплазме в комплексе с его ингибитором IkB, активируется и перемещается в ядро в ответ на различные стрессорные воздействия в нормальных клетках, но может быть постоянно активен во многих эпителиальных опухолях, в том числе и в опухолях шейки матки [Karin et al., 2002; Nair et al., 2003]. Известно, что трансфекция онкогенов Е6 и Е7 HPV16 в клетки модулирует активность NF-kB [Nees et al., 2001]. Таким образом, исходя из данных,

полученных на клеточных линиях, индукция экспрессии ММР-9 в опухолях может быть как следствием активности Е2, так и следствием активации №-кВ по механизмам, связанным с другими генами НРУ16. Для выяснения вопроса о том, участвует ли Е2 в индукции транскрипции ММР-9 в опухолях, способствуя таким образом их прогрессии, или её индукция осуществляется за счет других механизмов, исследовали активацию транскрипции ММР-9 и активность М^-кВ в опухолях, экспрессирующих и не экспрессирующих мРНК Е2 (Таблица 4, из выборки исключены образцы, в которых мРНК Е2 считывается с интегрированной формы НРУ16). Результаты типичного опыта по исследованию связывания ЫР-кВ из клеточных лизатов с олигонуклеотидом, содержащим его консенснусный сайт узнавания, методом сдвига подвижности в геле представлены на рис. 6 Б. В опухолевых образцах 579, 730 и 458 наблюдается связывание с белками Р32-меченого олигонуклеотида, специфичного для №-кВ, в отличие от соответствующих условно нормальных тканей. Транскрипционный фактор ОТ-кВ, активирующий транскрипцию, представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц: р50 и р65, при этом гомодимер, состоящий из двух субъединиц р50, подавляет транскрипцию.

Присутствие субъединицы р65 было подтверждено увеличением молекулярной массы белкового комплекса (дополнительный сдвиг) в результате преинкубации с антителами к р65 (рис.6, Б, две дорожки слева). Количество белковых лизатов в реакции связывания с олигонуклеотидом контролировали по общему содержанию белка и по интенсивности связывания транскрипционного фактора ОсП (рис.6,В). Активация ОТ-кВ наблюдалась в 15 из 20 (75%) опухолей (Таблица 4). Активацию транскрипции ММР-9 исследовали, определяя уровень мРНК методом ОТ-ПЦР в тех же образцах. Результаты типичного опыта представлены на рис 6,А. Увеличение уровня мРНК в 2 и более раза по сравнению с условно нормальными тканями было обнаружено в 9 из 20 (45%) опухолей.

Рисунок 6. Анализ активации транскрипции ММР-9 и активности ОТ-кВ в опухолях шеики матки.

I Т- опухоль; N - прилегающая к опухоли морфологически неизмененная ткань;

A. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР ММР-9; М- маркер с шагом 100 п.н.; контроль количества кДНК проводили по ПЦР с праймерами к НРКТ.

Б. Анализ активности ОТ-кВ проводили методом связывания №-кВ с консенсусным меченым 32Р-олигонуклеотидом; р65 ат - изменение подвижности белкового комплекса при инкубации с антителами к субъединице р65; стрелками показаны позиции связывание ОТ-кВ комплексов.

B. Контроль - реакция связывания с транскрипционным фактором ОсП.

Далее определяли, существует ли корреляция между экспрессией Е2, ОТ-кВ и ММР-9 (Таблица 4). В двух группах опухолей, экспрессирующих (10 образцов) и не экспрессирующих (10 образцов) мРНК Е2, количество образцов, в которых наблюдается индукция транскрипции ММР-9, различается несущественно. Таким образом корреляция между экспрессией Е2 и активацией транскрипции ММР-9 отсутствует ( Р » 0,05). С другой стороны, в 75% (15/20) опухолей наблюдалась

, активация ОТ-кВ. Во всех опухолях с неактивным ЫР-кВ отсутствовала активация

|

транскрипции ММР-9, а в группе опухолей с активным NF-kB в 60 % (9/15) случаев активирована транскрипция ММР-9.

Различия между двумя группами по частоте индукции транскрипции ММР-9 статистически достоверны (Р = 0,04). Эти данные свидетельствуют об участии NF-kB в активации транскрипции ММР-9 и, в тоже время, указывают на существование механизмов, интерфирирующих с активирующим влиянием NF-kB на транскрипцию ММР-9 в опухолях, т.к. в 40 % (6/15) случаев с активным NF-kB не наблюдалось активации ММР-9 . В модельных экспериментах на клеточных линиях было показано, что онкогены Е6 и Е7 могут активировать NF-kB с одной стороны, а с другой стороны подавлять транскрипционную активностью NF-kB, тормозя деградацию его ингибитора IkB и его транслокацию в ядро [Nees et al., 2001; James et al.,. 2006; Xu et al., 2010; Spitkovsky et al., 2002; Li H. et al., 2009]. По- видимому, баланс между двумя механизмами, с помощью которых онкогены Е6 и Е7 модулируют активность NF-kB, по-разному решается в разных опухолях, хотя нельзя исключить существование других механизмов регуляции NF-kB.

Таким образом, в опухолях шейки матки белок Е2 не является важным фактором активации ММР-9.

Таблица 4. Активация транскрипции ММР-9 в группах опухолей с разным статусом Е2 и NF-kB.

мРНК Е2 Количество опухолей с

увеличением уровня мРНК ММР-9

Есть 10 • 5

Нет 10 4

Итого (ММР-9 активирована) 9/20 (45%) Р=1

Статус NF-kB

Активен 15 9

Неактивен 5 0

Итого NF-kB активен 15/20 (75%)

р=0,04

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показано, что инициация мРНК ранних генов НРУ 16 может происходить с промотора Р14, который функционирует на всех стадиях прогрессии РШМ.

2. Впервые показано, что в карциномах шейки матки присутствует мРНК с кодирующим потенциалом для гена Е1 НРУ 16; мРНК Е1 иницируется с про-мотора Р14 и существует в форме полиаденилированных полицистронных мРНК, сплайсированных в районе гене Е6.

3. Обнаружение мРНК с кодирующим потенциалом для генов Е1 и Е2 НРУ 16 в опухолях шейки матки, полученных от пациентов с I - III клинической стадией заболевания, показывает, что интеграция ДНК вируса в геном клетки и утрата экспрессии генов Е1 и Е2 не являются обязательными для прогрессии опухолей.

4. Показано, что 29% опухолей с эписомной формой персистенции генома НРУ 16 содержат также интегрированные копии НРУ16 (смешанный тип персистенции генома).

5. Показана интеграция ДНК НРУ16 в одной из опухолей в клеточный ген МАР4, которая сопровождается реаранжировкой экзонов гена МАР4, что подтверждает возможность инсерционного мутагенеза в НРУ-позитивных опухолях.

6. Показаны активация транскрипционного фактора ОТкВ в 75 % и активация транскрипции матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9) в 45 % НРУ16-позитивных опухолях шейки матки.

7. Отсутствует корреляция экспрессии гена Е2 НРУ16 с активацией транскрипции ММР-9 в опухолях шейки матки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Скворцов Д.А., Гаспарьян Н.М., Рубцова М.П., Зверева М.Э., Федорова М.Д., Павлова JI.C., Богданов Ф.Ф., Донцова О.А., Киселев Ф.Л. Теломераза как потенциальный маркер для ранней диагностики рака шейки матки.// Доклады академии наук,- 2006.- Т. 408, № 4,- С. 1-4.

2. Гаспарьян А.В., Федорова М.Д., Киселев Ф.Л. Регуляция транскрипции матриксной металлопротеиназы-9 в плоскоклеточном раке шейки матки: роль экспрессии гена Е2 вируса папиллом человека и активности транскрипционного фактора NF-kB.// Биохимия. -2007. - Т. 72, № 8,- С. 1043-1049.

3. Федорова М.Д., Петренко А.А., Скворцов Д.А., Павлова Л.С., Зверева М.Э., Рубцова М.П., Донцова О.А., Киселев Ф.Л. Теломеразная активность и сплайсированные формы РНК hTERT в опухолях шейки матки.// Вопросы онкологии,- 2010. - Т. 56, № 1. - С. 29-35.

4. Федорова М.Д., Павлова Л.С., Киселева Н.П. Поиск транскриптов ранних генов El и Е2 вируса папиллом человека типа 16 в опухолях шейки матки. // Вопросы онкологии,- 2010,- Т. 56, № 2. - С. 50

5. Petrenko А.А., Korolenkova L.I., Skvortsov D.A., Fedorova M.D., Skoblov M.U., Baranova A.V., Zvereva M.E., Rubtsova M.P., Kisseljov F.L.. Cervical intraepithelial neoplasia: telomerase activity and splice pattem of hTERT mRNA. // Biochimie.- 2010.-V.92,1.12,- p. 1827-31

Подписано в печать 07.l0.ll . Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уек)Сору». Тираж 100 экз. Заказ № Отпечатано на УМТ РОЩ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место по частоте смертности среди онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором РШМ признаны вирусы папиллом из так называемой группы высокого риска заболевания (HR-HPV). Наиболее распространенными из них являются два онкогенных HPV (типы 16 и 18), совместно на их долю приходится более чем 70 % случаев РШМ в мире.

Инфекции HR-HPV передаются половым путем, в большинстве своем они являются бессимптомными- и транзиторными. Приблизительно в 90% случаев происходит избавление от инфекции-в период от 1 года до 2 лет благодаря иммунному ответу организма. У части пациентов наблюдается длительная инфекция (более 2 лет), во время1 которой инфицированные клетки могут прогрессировать в предраковые поражения (CIN) и/или инвазивный РШМ [Цур Хаузен Г., 2008; Kisseljov et al, 2008; Frazer 2009]. В настоящее время: созданы две профилактические вакцины, которые успешно предотвращают развитие инфекции«четырьмя типами iHPV, в том»числе HR-HPV 16 и 18. Однако их эффективность в борьбе с персистирующей инфекцией и предраковыми поражениями существенно ниже [Цур Хаузен1 Г., 2008, Paavonen, 2011]. В связи с этим продолжаются попытки создания антивирусных препаратов и лечебных вакцин для борьбы с персистирующей инфекцией и раком шейки матки разных стадий.

Исследование механизмов, приводящих к длительной инфекции, нарушению жизненного цикла вируса и злокачественной трансформации, поиск клеточных генов, изменение экспрессии или структуры которых позволяло бы отличить инфицированную клетку от трансформированной клетки, являются важными задачами. Эти исследования необходимы для определения групп риска развития рака среди инфицированных больных, обнаружения мишеней для антивирусной терапии, определения тактики лечения. Решение этих задач невозможно без знаний структуры, функций и регуляции экспрессии генов HR-HPV. Основную роль в злокачественной трансформации играют не структурные белки HR-HPV, а регуляторные - продукты так называемых ранних генов (от Е1 до Е7, от англ. early), с экспрессии которых в клетке начинается жизненный цикл вирусов. Учитывая вышесказанное, исследование экспрессии ранних генов HR-HPV в опухолях шейки матки представляется актуальным.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в исследовании экспрессии двух ранних генов Е1 и Е2 вируса папиллом человека типа 16 и их влияния на экспрессию клеточных генов в опухолях шейки матки.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. отобрать группу опухолей шейки матки, позитивных по HPV16 и охарактеризовать форму персистенции вирусного генома (эписомная, интегрированная);

2. провести поиск мРНК с кодирующим потенциалом для раннего гена Е1 в опухолях шейки матки с эписомной формой генома HPV;

3. определить первичную структуру мРНК Е1 и старт транскрипции;

4. исследовать возможность влияния экспрессии раннего гена Е2 HPV на активацию транскрипции клеточного гена матриксной металлопротеиназы 9, ассоциированного с опухолевой прогрессией, в опухолях шейки матки.

Выводы:

1. Впервые показано, что инициация мРНК ранних генов НРУ 16 может происходить с промотора Р14, который функционирует на всех стадиях прогрессии РШМ.

2. Впервые показано, что в карциномах шейки матки присутствует мРНК с кодирующим потенциалом для гена Е1НРУ16; мРНК Е1 иницируется с промотора Р14 и существует в форме полиаденилированных полицистронных мРНК, сплайсированных в районе гене Е6.

3. Обнаружение мРНК с кодирующим потенциалом для генов Е1 и Е2 НРУ 16 в опухолях шейки матки, полученных от пациентов с I - III клинической стадией заболевания, показывает, что интеграция ДНК вируса в геном клетки и утрата экспрессии генов Е1 и Е2 не являются обязательными для прогрессии опухолей.

4. Показано, что 29% опухолей с эписомной формой персистенции генома НРУ 16 содержат также интегрированные копии НРУ16 (смешанный тип персистенции генома).

5. Показана интеграция ДНК НРУ 16 в одной из опухолей в клеточный ген МАР4, которая сопровождается реаранжировкой экзонов гена МАР4, что подтверждает возможность инсерционного мутагенеза в НРУ-позитивных опухолях.

6. Показаны активация транскрипционного фактора №кВ в 75 % и активация транскрипции матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9) в 45 % НРУ 16-позитивных опухолях шейки матки.

7. Отсутствует корреляция экспрессии гена Е2 НРУ 16 с активацией транскрипции ММР-9 в опухолях шейки матки.

Заключение.

Проявление функций Е1 и Е2, которые могут быть существенными в процессе канцерогенеза, практически не было исследовано в опухолях.

Очевидно, что опухоли, экспрессирующие и не экспрессирующие белки Е1 и Е2, несмотря на общий этиологический фактор (НЯ-ИРУ), могут существенно различаться между собой по своим свойствам. Исследование экспрессии и функций Е1 и Е2 в опухолях может быть полезным для понимания механизмов вирусного канцерогенеза и определения возможностей применения противовирусной терапии.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Список использованных реактивов.

ДМСО - диметилсульфоксид

ДЭПК - Диэтилпирокарбонат

1РТО - Изопропилтио-р-Б-галактозид

Х^а1 - 5-бром-4-хлор-3-индозил-Р-галактозид

ЭДТА - этилендиаминтетрацетат натрия сШТР - смесь четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в равных пропорциях.

ДНК А/-НтсШ1 - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазой НтсИП; маркер молекулярной массы ДНК

2.2. Список использованных растворов.

Буфер ТАЕ, 5 Ох трис-ацетат 2М ЭДТА 0,1МрН = 8,0

Буфер 8ТЕ, 10х

С1 1М трис - НС1 (С4НцЖ>3 • НС1) ЮОтМрН = 8,0 ЭДТА 10тМрН= 8,0

Буфер для ПЦР, 10х сульфат аммония ((МН^БС^) 0,16М трис - НС1 (С4Н„>Юз • НС1) 0,6МрН = 8,8 Т\уееп-20 (1%)

Буфер для нанесения ДНК на агарозный гель

50% глицерин 1мМ ЭДТА рН = 8,0 0,025% бромфенол голубой

Буфер ЫЕТ трис - НС1 (С4 НпИОз • НС1) 50шМ рН = 8,0-8.4 ЭДТА 10тМрН=8,0 ШС1 1М

88С, 20х, рН = 7,0 №С1 3,0М цитрат натрия 0,34М Н20 до 1 л.

Среда ЬВ ИаС1 Юг бакто-триптон Юг иами-хришин хиг бакто-дрожжевой экстракт 5 г Н20 до 1 л.

Раствор гуанидин-тиоционата рН=6-7 гуанидинизотиоционат натрия 4,2М ацетат натрия 0,02М

Раствор хлорида цезия CsCl 6,4M Рефрактометри- ЭДТА 0,01М рН=7,5 ческийиндекс 1,41 плотность (р=1,8 г/смЗ)

Буфер для гибридизации

Буфер SSPE, 20х

Связывающий буфер

Na2HP04+NaH2P04 0.5М рН=7.2 SDS 7% ЭДТА ЮмМ

NaCl 3,6М

NaH2P04 0,2М рН=7,4 ЭДТА 0,02М рН=7,4

HEPES ЮмМ (pH 7,5) KCl 80мМ ЭДТА 1мМ Глицерин 6%-ный поли(<1МС) 0,5 мкг

Буфер NEB Трис - НС120тМрН = 8,0

NaCl 400мМ MgCl2 1,5мМ NP-40 0,1%

Перед использованием в буфер добавляется: DTT 1мМ Na3V04 0,ЗмМ NaF ЮмМ

Ингибиторыпротеаз (Protease inhibitor cocktail tablets, «Roche Applied Science» (США) (1 таблетка на 10мл))

2.3. Характеристикаклинического материала.

Образцы опухолей были получены из операционного материала от больных Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Операционный материал был собран научным сотрудником лаборатории молекулярной биологии вирусов Павловой JI.C.

Банк опухолевого материала хранился в жидком азоте.

Коллекция^ исследованных образцов состояла из 41-ой плоскоклеточной, карциномы I, И, III стадий (по классификации международного союза гинекологов и акушеров, FIGO). Присутствие геномов HPV различных типов-определяли с помощью полимеразной цепной реакции (см. ниже). В работе использовали только HPV 16-позитивные образцы.

2.4.Характеристика клеточных линий.

Клетки SiHa, HeLa и CaSki- клеточные линии карцином шейки матки (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и 2мМ глютамина. Культивирование клеток было выполнено сотрудником лаборатории молекулярной биологии вирусов Александровой Н.М.

2.5. Одновременное выделение ДНК и РНК.

Одновременное выделение ДНК и РНК проводили по классической методике (Chirgwin, 1979) с модификациями (Спитковский, 1986). Замороженные в жидком азоте ткани разрушали до порошкообразного состояния в тефлоновой кювете гомогенизатора фирмы Braun в течение 15-30 секунд. Полученный порошок ресуспендировали в 4,2М гуанидинизотиоционатном буфере с помощью гомогенизатора Даунса (Wheaton). Суспензию прогревали 10 мин при 65°С,-центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин, наслаивали на 6,4M раствор CsCl в 0,01М ЭДТА рН=7,5 и центрифугировали при 30 000 об/мин 14-16 часов при 18°С. ДНК, извлеченную из интерфазного слоя, растворяли в 5 объемах смеси 1 STE с 1% SDS, прогревали на водяной бане в течении 5 мин при 65 °С, депротеинизировали смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали 2 объемами холодного 96% этанола, трижды промывали в 70% этаноле на STE, подсушивали, растворяли в 100-300 мкл бидистиллированной воды при +4°С 24-48 часов. Образцы ДНК хранились при -20° С.

Осадок РНК после удаления ДНК и слоя CsCl растворяли в 200мкл бидистиллированной воды. К полученному раствору добавляли 20мкл ЗМ ацетата натрия рН=5,1 и после растворения осадка - 2,5 объема охлажденного 96% этанола, после инкубации не менее 2 часов при температуре -20°С центрифугировали при 13 000 об/мин 10 мин. Осадок высушивали в вакуумной сушке и растворяли в 30-70 мкл бидистиллированной воды. Образцы РНК хранились при -70С. Часть образцов ДНК были любезно предоставлены Кобзевой В.К.

2.6.Полимеразная цепная реакция.

2.6.1. Праймеры. При выборе праймеров для оценки их структуры мы использовали компьютерную программу Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Приблизительную температуру отжига вычисляли по следующей формуле:2°С х (А+Т) + 4°С х (G+C) - 4

Точное значение температуры подбирали опытным путем, используя положительный и отрицательный контр о ли.

Состав используемых праймеров и условия ПЦР приведены в следующих таблицах, (таб. 2 и 3)

Праймеры синтезировали в ООО НПФ «ЛИТЕХ» (www.lytech.ru).