Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Биологический потенциал мутантных вариантов генов Е6 и Е7 вируса папиллом человека тип 18

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

им. Н, Н. БЛОХИНА

На правах рукописи ЛААСРИ МАЖИД

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ МУТАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ Е6 И Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМ

ЧЕЛОВЕКА тип 18.

(Онкология-14.00.14)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор Киселев ФЛ.

Москва 1998

Оглавление

стр

Глава 1. Введение 1

Глава 2, Обзор литературы: Вирусы папилломы человека как модель 9

изучения молекулярных механизмов канцерогенеза.

2Л, Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе 9 V человека

2,2 Регуляция транскрипции вирусных генов 15

2.3.Трансформирующие гены вирусов папиллом 19 2.3,1, Ген Еб 19 23.2. Ген Е7 23

2.4. Функциональная кооперация онкобелжов Е-6 и Е7 29

Глава 3. Материалы и методы 31

3.1, Список использованных растворов и сред 3!

3 ^-Молекулярное клонирование 33

3.2 Л -Ферменты 3 3

3,2.2-Бактериальные штаммы и плазмиды 33

32.3-Трансформация бактерий Е.еоН. плазмидной ДНК 35

а). Получение компетентных клеток 35

б). Введение в клетки шгазмидной ДНК 35

3.2.4, Выделение плазмидной ДНК 36

3.2.5, Рестрикция и яигирование 37 3 2,6. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов 37

3.2.7. Секвенирование 38

3.2.8. Эяектрофоретическое разделение продуктов ееквенирования 38 в денатурирующем полиакрнламндном геле (ПААГ)

3.2.9. Амплификация ДНК 3 9

3.2.10. Клонирование генов Е6 и Е7 НРУ18 40

3.2.11. Сайт-направленный мутагенез 44

3.3. Получение и анализ культур клеток млекопитающих 46

3.3.1. Плазмиды и векторы 46

3.3.2. Клеточные линии 46 3.3,3 Трансфекция клеток млекопитающих 46

3.3.4. Выделение РНК и ДНК с помощью гуанидин изотиоцианата 47

3.3.5. Препаративное выделение специфических фрагментов 48 ДНК и:? агарозных гелей

3.3.6. Препаративный электрофорез ДНК в агарозных гелях. 49

3.3.7. Г ибридизация 49 3.3.7.1. Перенос ДНК из геля на нейлоновый фильтр (НуЬош! М+) 49

3.3.7.2. Получение молекулярных ДНК-зондов 50

3.3.7.3. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах 50

3.3.7.4. Авторадиография j I

3.3.7.5. Пробы для гибридизации 5 i 3.3.8. RT-PCR 51 3.33, Биологические свойства 53

3.3 3 ■. 1, Рост клонов 53

3.3.9.2. Измерение времени удвоения и насыщения плотности 53

клеточной популяции

3.3.9.3. Культивирование клеток в полужидкой среде 53

3.3.9.4. Введение клеток в сингенны крыс (линия Фишер) 54

Глава 4. Результаты исследования 55

4.1, Введение 55

4 2, Молекулярное клонирование 57

4.2.1, Анализ последовательностей вставки в шхазмиде рС7 57

4.2.2, Субкяонировшгае генов Бб и Б? 62

а). Ген Еб 62

о). Ген Е7 65

4.2.3, Получение и клонирование новых мутантных вариантов гена Е7 68 HPV тип 18.

4.3. Исследование биологической активности клонированных генов 73

4,3 Л, Трансфекция чувствительных клеток 73

4.3.2, Идентификация последовательностей трансфицированных генов 74

4.3.2.1. Саузерн б лот гибридизация 74

4.3.2.2. Полимер азная цепная реакция (PCR) 78 43. Экспрессия генов Еб и Е7 в трансфицированных клетках 81

4.3.4. Характеристики роста полученных клонов 85

4.3.5. Анализ морфологии клеток 89

4.3.6. Субстратная зависимость размножения клеток 89

4.3.7. Анализ туморогенности полученных клонов 90 Глава 5. Обсуждение результатов 93 Глава 6. Выводы 98 Глава 1, Список литературы J 01

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

HPV вирус папиллом человека

EMBI, - Европейский Банк данных молекулярной биологии

€Ш - интразпителиальная днеплазия

URR -регуляторный район HPV

pRB -белковый продукт гена ретинобластом ы

МЦ -метил-целлюлоза

н.п. - нуклеотидная пара

тл.я. -тысяча иуклеотидных пар

ФНГ1 -фланкирующая последовательность

CR -консервативный район

ND •• анализ не проводился.

pRB bdg - сайт связывания ретинобластомы бедка

/ ловя 1* Введение

Вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим фактором ори раке шейки матки , Многочисленные данные свидетельствуют о том. что генетический материал этих вирусов присутствует практически во всех опухолях этой локализации, причем превалирующим среди них являются HPV !6 и 18 типов* За последне годы достигнуты существеные успехи в пониманий механизмов действия этих вирусов. Оказалось что ключевую роль в этом процессе иг рают 2 вирусных гена Е6 и Е7, которые нарушают функции основных генов, контролирующих размножение клеток, т.е. генов» супрессоров и генов-регуляторов клеточного цикла. Гены Еб и Е7 клонированы и секвенированы. получено достаточное количество как делециошшх, так н точечных мутантов этих генов. Благодарим этому имеется достаточно подробная информация о роли отдельных участков указанных генов в проявлении трансформирующих потенций, однако эта информация в основном касается генов Еб и Е7- HPV 16 типа и имеется сравнительно мало данных о генах HPV 18 тина.

В силу этого целью настоящего исследования было изучение биологического потенциала генов Еб и Е7 HPV 18 типа, т.к. существует предположение о том, что HPV именно этого типа обнаруживается в более агрессивных опухолях шейки матки. Тема настоящей работы является

актуальной как в теоретическом, так и в практическом плане, т.е. получение любого генетического маркера, обладающего биологическим эффектом на грансфицированные им клетки, является необходимым для дальнейшего прогресса биологии, медицины и онкологии в частности. Для выполнения этой задачи были использование экспериментальные модели, полученные в лаборатории молекулярной биологии вирусов ранее: иммортализованые клетки крыс IE5 и плазмида рС7, содержащая гены Её и Е7, обладающая трансформирующим эффектом на эти клетки. Гены Еб и Б? HPV (В были субклонированны и установлено, что эти гены в дополнение к нескольким бессмысленным мутациям, содержат по одной точечной мутации в С концевой области. С помощью сайт - направленного мутагенеза было получено еще 2 варианта гена Е7 по доменам CR1 и CR2 и показано, что точечная мутация по кодону 24 (CR2 домен) элиминирует трансформирующий потенциал вируса. Таким образом, полученные нами клоны генов Е6 и Е7 дополняют коллекцию существующих вариантов этих генов и получение результаты нереданы в Европейский Банк Молекулярной Биологии (EMB L).

1 шва 2. Обзор шжершпуры Вирусы попито мы человека как модель изучения молекулярных механизмов канцер о генз а,

2.1. Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе у человека.

За последние десятилетие особый интерес к изучению вирусов папиллом вполне объясним. После того как в середине 70-х годов было высказано предположение [1], что вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим агентом рака шейки, эта область вирусологии и онкологии подучила стремительное развитие. С одной стороны, это привело к твердым доказательствам этнологической роли HPV при данной формы рака, что окончательно подтверждено в Бюллетене Всемирной Организации Здравоохранение [2], а с другой -способствовало стремительному прогрессу в анализе не только вирусов этой группы, но и механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую под действием этих вирусов,

В настоящем обзоре мы не ставили своей задачей представление всех данных по доказательству роли HPV в возникновении раки шейки матки, таких как частота встречаемости вирусной ДНК в опухолях, экспрессия этой ДНК. форма ее персистентнии. эпидемиологические данные (об этом

подробно см. раздел 2.3), а хотели бы акцентировать особое внимание на тех вирусных генах, которые играют ключевую роль в процессах злокачественной трансформации клеток.

Известно более 100 типов вирусов папиллом человека [3]. Одной из наиболее характерных особенностей вирусов этой группы является отсутствие адекватной чувствительной клеточной модели для их размножения, поэтому подавляющее большинство вирусов этой группы идентифицированы на основании выявления в зараженных клетках вирусной ДНК, последующего ее клонирования и секвенирования.

Фактически все HPV можно условно разделить на две большие группы, которые ассоциируются либо с поражениями кожей, либо поражениями слизистых ободочек. Наиболее типичными проявлениями инфекции кожи являются доброкачественные бородавки, а слизистых - предраковые и раковые поражения шейки матки [4].

Все HPV имеют весьма сходную структуру. Они содержат ДНК в 8.000 пар оснований, содержащую 9 открытых рамок считывания, причем две из них (LI и L2) кодируют структурные белки вириона, остальные 7 (El - Е?) относятся к так называемым "ранним" вирусным генам, контролирующим функции, необходимые для репродукции и проявления патогенного потенциала [5].

Среди всех известных HPV лишь сравнительно небольшое количество связано с различными злокачественными поражениями. К числу "кожных" вариантов HPV, относятся те, которые были обнаружены при бородавчатой эшщермодисшгазии, заболевании, при котором пноскокпеточные

карциномы возникают ш папиллом в результате воздействия солнечной радиации [6]. Наиболее часто при этом заболевании выявляется HPV 5 типа, а существенно реже HPV других типов (типы 8,14,17,20) [7], и поскольку отсутствуют какие-либо клеточные модели этого заболевания о механизмах (Ьункниониоования вирусов (этих типов) практически ничего неизвестно,

2. а* • А. JL а* .'А

Наиболее серьезные данные о связи HPV с канцерогенезом у человека были получены для вирусов, выявляемых в слизистых оболочках прежде всего при раке шейки матки. Пионерские исследования группы zur Hansen Н, [8-!1| в середине 80-х годов убедительно показали, что как миниум 2 типа HPV: 16 и 18 типов выявляются при раках шейки матки, в то время как при доброкачественных поражениях были обнаружены в основном HPV 6 и 1! типов. В дальнейших исследованиях еще несколько типов HPV было обнаружено как при раках шейки матки, так и при других злокачественных поражениях аногенитальной области у женщин, и у мужчин (типы 31, 33, 35, 39,45, 51, 52,56, 58, 59, 66, 70), в то же время количество новых типов HPV, которые были выделены из папиллом (доброкачественных поражений) этой области, и папиллом ротовой полости было существенно меньше (типы 3,

! ? 'i > Ч ? ч Г i - Vi

32ä >г, !.?} j h:j.

К настоящему времени сложилась ситуация, что при использовании соответствующих чувствительных методов исследований, ДНК HPV различных типов выявляются более, чем в 90% опухолей шейки матки. Это

является важным аргументом в пользу того, что присутствие вирусного генетического материала необходимый фактор для превращения

нормальных клеток в опухолевые.

На основании вышеизложенных данных все HPV, выделенные при доброкачественных и злокачественных неоплазиях, были разделены на так называемые HPV "низкого" и "высокого" риска. Анализ этих 2 классов HPV не выявил принципиальных структурных отличий в генетической структуре - и те и другие содержат по 2 структурных гена (L1 и L2) и 7 функциональных генов (El - Е7) (рис.1). Кроме того, в составе всех HPV была идентифицирована регуляторная область (URR - upstream regulatory region), локализующаяся непосредственно перед генами Е6 и Е7. В URR было выявлено значительное количество сайтов, способных взаимодействовать как с позитивными, так и негативными факторами транскрипции. Необходимость такого взаимодействия очевидна, исходя из того, что инфекция HPY для плоскоклеточного и слизистого эпителия является персистентной и вызывает ускоренную пролиферацию зараженных клеток. Для достижения такой инфекции вирус должен инфицировать банальные клетки, поскольку только эти клетки эпителия способны к размножению. Эти клетки активируют все остальные клетки вышележащих слоев, которые в процессе дефференцировкн теряют способность к размножению и отслаиваются от поверхности. Репликация вирусной ДНК, экспрессия поздних генов и сборка вирионов тесно связаны со стадией дифференцировки и происходят только в верхн ел ежащих клеточных слоях.

На разных стадиях инфекции после проникновения вирусной ДНК в клеточное ядро транскрипция генов НРУ зависит в основном от клеточных транскрипционных факторов. На более поздних стадиях в регуляции

экспрессии как ранних, так и поздних вирусных функций принимают участие и вирусные факторы.

Вирусный геном в зараженных кллетках может персистировать как в эписомальной, так я в интегрированной формах [13] и первые данные свидетельствовали и том, что на ранних стадиях опухолевого процесса ( интраэпителиальной днсплазии - CIN) эписомальная форма является превалирующей, в то время как в карциномах основная масса вирусной ДНК интегрирована в клеточный геном [14]. Однако, в настоящее время столь однозначная трактовка этих результатов вряд ли справедлива. По-видимому, в опухолевых линиях, подученных из карцином шейки матки, в подавляющем большинстве случаев вирусная ДНК интегрирована в клеточную ДНК, в то время как в опухоли (где выявляется высокая гетерогенность клеточной популяции) возможно выявление обеих типов персистенции вирусной ДНК [15], Б какой степени, интеграция является определяющим фактором для поддержания опухолевого статуса клетки, остается неясным, поскольку отсутствует полная информация о том, какие типы РНК считываются с интегрированного и эписомального вирусного генома.

Р»йон,& котором при

неэкспрессирующийся при интеграции

Рис.1 Структура генома папиллом человека 16 тала

1Л* Регуляция транскрипции вирусных генов.

Из представленных выше данных с очевидностью следует, что поддержание трансформированного фенотипа контролируется вирусными генами. В настоящее время можно считать установленным, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7, экспрессия которых модулируется областью URB.. Размер этой области составляет от 800 до 1000 пар оснований для HPV различных типов и условно может оыть разделена на 3 участка - 5' область, центральный сегмент, и V- область, которая расположена непосредственно перед двумя вышеуказанными генами. За генами Е6 и Е7 локализуются гены Е! и Е2, причем последний перекрывает ген Е4, и ген Е5, который также возможно является трансформирующим геном. Сигнальная терминирующая последовательность для поли А локализуется на 3'-конце ранней области, Транскрипция РНК начинается с промотора в У - области URR, непосредственно перед началом гена Е6. Этот промотор получил обозначение Р97 для HPV 16 и PÍ05 для HPV 18. Промотор содержит 1АТА бокс и сайт инициации транскрипции, которые регулируются различными знхансерными элементами, локализованными в центральном и V = сегментах ORR. Именно они и узнаются клеточными факторами. 3f - область URR содержит также 2 сайта для вирусного траскрипционного фактора Е2, сайты связывания для клеточных транскрипционных факторов Spl и YYÍ и ориджины репликации с сайтом связывания для вирусного белка Ei,

Центральный сегмент URR содержит конститутивный энхансер, наиболее активный в эпителиальных клетках и зависящий только от клеточных факторов [16-19]. В этом участке идентифицированы сайты связывают для различных клеточных факторов, включая API, NF1, Octl, TEF1, TEF2, YY1, рецепторы стероидных гормонов. Все эти факторы являются убнквнтарными и могут функционировать в клетках различных типов. 5' -участок URR содержит сигналы для терминации и полиаденилирования поздних вирусных транскриптов [18].

Среди многочисленных факторов, способных взаимодействовать с участком URR. имеется лишь один фактор вирусной природы (продукт гена Е2), активность которого может иметь существенное значение для функционирования трансформирующих генов HPV. URR HPV содержит 4 В2 - связующих сайта. Данные по действию Е2 на транскрипцию генов Е-6 и Е7 носят противоречивый характер. С одной стороны, белки-продукты гена Е2 могут функционировать в качестве репрессоров для промотора HPV 18 типа [20], а мутации по гену Е2 увеличивает уровень иммортализации под действием генов Е6 и Е? [21]. С другой стороны - имеются данные о том, что белки Е2 HPV 16 и 18 типов активируют промотор в URR [22]. По-видимому эти различия обусловлены синтезом различно сплайсированных aiРНК данного гена, приводящих к образованием белков Е2 меньшего размера. Именно белок Е2, утерявшей N-концевой, трансакхнвирующий домен, может интерферировать с активирующими потенциями полноразмерного белка Е2 [22]. Таким образом, регуляция активности генов Е6 и Е7 под действием продукта вирусного гена Е2 является достаточно

сложной, т.к. этот белок обладает двойной функцией - активатора и репрессора.

Среди многочисленных клеточных факторов, способных взаимодействовать с участком URR, отметим лишь некоторые из них, значимость которых для проявления функций генов Е6 и Е7 представляется очевидной, Это прежде всего фактор АР!, представляющий собой димерный белковый комплекс, содержащий по одному из представителей двух семейств генов Jim н fos. URR HPV 16 и 18 типов содержат соответственно 3 и 2 АР1 - связывающих сайтов. По-видимому, основная функция АР!-сайта - участие в определении специфичности транскрипта и уровня дифференцировки на транскрипционную активность ÜRR [23]. Другим важным регулятором Ö RR является фактор YY1, причем в данной системе он может функционировать как активатор и как репрессор транскрипции в зависимости от типа вируса, ти