Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Белок множественной лекарственной резистентности Pgp как фактор патогенеза немелкоклеточного рака лёгкого

На правах рукописи

005051758

ТИХОМИРОВ МИХАИЛ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

БЕЛОК МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ Рир КАК ФАКТОР ПАТОГЕНЕЗА НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЁГКОГО

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 АПР 2013

Москва - 2013

005051758

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН)

Директор

академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители:

академик РАН и РАМН,

профессор Давыдов Михаил Иванович

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук,

профессор Богуш Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты:

Красильников

Михаил Александрович доктор биологических наук, профессор,

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии

Высоцкая

Ирина Викторовна доктор медицинских наук, профессор

ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, профессор кафедры онкологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 2£у> 20/3 г. в_часов на заседании

диссертационного совета (Д 001.017.01) ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Каширское шоссе, д. 23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. КН.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Каширское шоссе, д. 24

Автореферат разослан « 21» ф -А 20/3 года. Ученый секретарь диссертационного совета.//

доктор медицинских наук, профессор /¿¿4*(¡^Ю.В. Шишкин

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Рак лёгкого является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний, которое характеризуется агрессивностью течения, неудовлетворительными результатами не только классической, но и современной тар-гетной терапии, трудностью прогноза исхода болезни и высокой смертностью. В последние годы рост заболеваемости раком лёгкого оправдывает наихудшие прогнозы ВОЗ и наносит огромный социально-экономический ущерб. В развитых странах мира и в Российской Федерации рак лёгкого остается главной причиной смертности онкологических больных мужского пола, причём на долю немелкоклеточного рака лёгкого приходится около 80% всех случаев заболевания.

Главным из установленных этиологических факторов рака лёгкого, в том числе немелкоклеточного, является курение. Курение влияет также на агрессивность клинического течения заболевания, и курящие пациенты имеют худший прогноз по сравнению с некурящими. Однако патогенетические механизмы реализации канцерогенного воздействия курения на ткань лёгкого изучены недостаточно.

Кроме того, известно, что заболеваемость немелкоклеточным раком лёгкого у женщин в 10 раз ниже, чем у мужчин, а средняя продолжительность жизни после постановки диагноза у женщин выше. Преобладающей формой немелкоклеточного рака лёгкого у мужчин является плоскоклеточный рак, тогда как у женщин чаще выявляются аденокарциномы, при этом женский пол выступает независимым прогностическим фактором более благоприятного течения болезни. Каковы причины этих различий до настоящего времени остается неясным.

Таким образом, поиск молекулярно-биологических механизмов, которые опосредуют воздействие на ткань лёгкого химических канцерогенов, прежде всего курения, и обусловливают различия в клиническом течении немелкоклеточного рака лёгкого у курящих и некурящих пациентов, мужчин и женщин, и у пациентов с различными гистологическими вариантами опухоли, представляет не только научный, но и практический интерес.

Данные литературы и результаты предшествующих исследований нашей лаборатории дают основание выделить в качестве важнейшего молекулярно-биологического параметра немелкоклеточного рака лёгкого транспортный белок множественной лекарственной резистентности - Р-гликопротеин (Pgp), экспрессия которого показана в нормальной и опухолевой ткани лёгкого. В нормальных тканях этот транспортный белок осуществляет защитную функцию, выбрасывая из клеток токсичные ксенобиотики, в том числе и канцерогены. В опухолевых клетках функция этого необходимого для организма белка переходит в свою противоположность, поскольку при гиперэкспрессии Pgp большая часть противоопухолевых препаратов выбрасывается из клеток, и эффективность химиотерапии снижается или не проявляется вообще. Это хорошо известный и широко распространенный механизм множественной лекарственной резистентности (multidrug resistance - MDR), которая одновременно развивается к множеству противоопухолевых лекарств, в том числе и к таргетным. Поэтому знания об уровне и интенсивности экспрессии Pgp в опухоли позволяют прогнозировать устойчивость к противоопухолевой химиотерапии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Количественная характеристика уровня и частоты экспрессии молекулярного маркёра множественной лекарственной резистентности Pgp в ткани немелкоклеточного рака и нормальной ткани лёгкого с первичным или метастатическим опухолевым поражением для выявления корреляционных связей с клинически значимыми особенностями возникновения и течения заболевания.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. С использованием проточной цитофлуориметрии разработать количественный метод иммунофлуоресцентного анализа экспрессии в клетках белка множественной лекарственной резистентности Pgp, пригодный для рутинного применения.

2. Используя разработанный метод, количественно оценить уровень, интенсивность и частоту экспрессии Pgp в ткани немелкоклеточного рака лёгкого и в нормальной ткани лёгкого с первичным и метастатическим опухолевым по-

ражением.

3. Провести сравнительный анализ выявленных количественных показателей экспрессии Pgp в опухолевой и нормальной ткани лёгкого с первичным или метастатическим поражением с тем, чтобы определить возможное участие Р§р в процессе лёгочного канцерогенеза.

4. Провести анализ корреляционных связей количественных показателей экспрессии Pgp с клинически значимыми характеристиками, определяющими особенности течения заболевания: у курящих и некурящих пациентов; в ткани аденокарциномы и плоскоклеточного рака лёгкого; у мужчин и женщин.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработан и запатентован иммунофлуоресцентный метод количественного определения экспрессии в солидных опухолях человека маркера множественной лекарственной резистентности Pgp с использованием проточной цитоф-луориметрии.

Впервые на большом клиническом материале РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН проведена количественная оценка частоты, уровня и интенсивности экспрессии Pgp в ткани НМРЛ, а также в нормальной ткани лёгкого с первичным или метастатическим опухолевым поражением. Сделано заключение о неправомочности бытующего в литературе представления, что уровень экспрессии Pgp в опухоли предопределён уровнем показателя в соответствующей нормальной ткани.

Показано, что по частоте, уровню и интенсивности экспрессии Р§р ткань НМРЛ отличается от окружающей нормальной ткани лёгкого: в нормальной ткани низкий уровень маркёра выявляется чаще, чем в опухоли. Различий между показателями экспрессии Pgp в ткани НМРЛ и в нормальной ткани лёгкого, окружающей метастаз, не выявлено. Впервые сформулировано представление, что экспрессия Pgp в нормальной ткани лёгкого не предопределяют фенотип множественной лекарственной резистентности НМРЛ того же больного, а является свойством клеток, изменяющимся в процессе малигнизации.

Впервые изучены тендерные различия в соотношении показателей экс-

прессии Pgp в опухолевой и нормальной ткани лёгкого с первичным и метастатическим поражением. У мужчин показатели экспрессии Р§р в ткани НМРЛ не отличаются от таковых у женщин. В то же время у пациентов мужского пола по сравнению с женщинами, в нормальной ткани лёгкого, окружающей первичный очаг, показатели экспрессии маркёра снижены. При этом экспрессия Р£р в нормальной ткани, окружающей метастаз в лёгкое, одинакова у пациентов мужского и женского пола.

Показано также, что у мужчин с НМРЛ и уровень, и интенсивность экспрессии Р£р в опухоли выше, чем в окружающей нормальной ткани. При этом только в группе пациентов мужского пола в нормальной ткани лёгкого, окружающей очаг НМРЛ, показатели экспрессии Р§р значительно ниже, чем в нормальной ткани, окружающей метастаз в лёгкое, тогда как в ткани НМРЛ и в нормальной ткани метастатически поражённого органа наблюдается близкий уровень экспрессии маркёра. У женщин сходный уровень экспрессии Р§р отмечен во всех трёх сравниваемых тканях: в опухолевой и нормальной лёгочной ткани больных НМРЛ, а также в нормальной ткани, окружающей метастаз в лёгкое.

Анализ экспрессии Р§р с учётом курения в анамнезе показал, что курящие пациенты с НМРЛ и метастатическим поражением лёгких имеют одинаковый уровень экспрессии маркёра в нормальной ткани лёгкого, и этот показатель значительно ниже, чем в ткани НМРЛ. Некурящие больные НМРЛ и с метастазом в лёгкое имеют одинаковые параметры экспрессии Р§р в нормальной ткани лёгкого и в опухоли. При этом в нормальной ткани как при первичном, так и при метастатическом поражении лёгких экспрессии Р§р значительно снижена по сравнению с некурящими.

Выявлены сходные показатели экспрессии Р§р в ткани аденокарциномы и в нормальной окружающей лёгочной ткани. В то же время, у пациентов с плоскоклеточным раком лёгкого выявлено значительное снижение параметров экспрессии Pgp в нормальной лёгочной ткани по сравнению с опухолевой.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые разработан и адаптирован для клинического применения имму-нофлуоресцентный метод количественного определения частоты, уровня и интенсивности экспрессии в солидных опухолях человека маркёра множественной лекарственной резистентности Р§р с использованием проточной цитофлуо-риметрии.

С использованием разработанного метода впервые получены важнейшие фундаментальные данные: экспрессия Р§р в нормальной ткани лёгкого не предопределяет фенотип множественной лекарственной резистентности НМРЛ; снижение экспрессии Рер в нормальной лёгочной ткани является фактором патогенеза НМРЛ; курение приводит к снижению экспрессии Р§р в ткани лёгкого, облегчая процесс лёгочного канцерогенеза; снижение экспрессии Pgp в нормальной лёгочной ткани ассоциировано с плоскоклеточным раком лёгкого у курящих мужчин; высокий уровень экспрессии маркёра множественной лекарственной резистентности Р§р наблюдается как в ткани плоскоклеточного рака, так и в ткани аденокарциномы, как у курильщиков, так и у некурящих пациентов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментов, обсуждение результатов, выводы. Работа изложена на 107 страницах, включает 38 таблиц, 15 рисунков и 165 ссылок на литературные источники.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация диссертационной работы состоялась 16 ноября 2012 г. на совместной научной конференции в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН с участием лабораторий медицинской химии; экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей; синтетических противоопухолевых веществ; лучевых методов лечения опухолей; фармакологии и токсикологии; химии природных соединений; радиоизотопных методов исследования; медицинской биотехнологии; комбинированной терапии опухолей; разработки лекарственных форм;

фармакокинетики; лаборатории клеточного иммунитета; трансгенных препаратов; иммунофармакологии; химического синтеза; биомаркёров и механизмов опухолевого ангиогенеза, а также отделения клинической фармакологии и химиотерапии; хирургического торакального отделения и хирургического диагностического отделения. Основные положения диссертации опубликованы в 18 научных публикациях, доложены на международных и российских конференциях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на хирургических образцах НМРЛ (110 образцов) и нормальной ткани лёгкого окружающей, первичную опухоль (101 образец) или метастаз в лёгкое (33 образца); рака пищевода (36 образцов) и желудка (46 образцов), а также на культурах клеток человека - Т-лимфобластный лейкоз линии Jurkat; рак лёгкого линий Calu-1 и А549, рак шейки матки линии HeLa.

Экспрессию Pgp оценивали: по уровню - доле клеток, экспрессирующих маркёр в исследуемой ткани; по интенсивности - отношению специфической и изотопической флуоресценции клеток, выраженному в относительных единицах, которая позволяет судить о количестве Pgp в клетках. Для выявления частоты встречаемости случаев образцы были разделены на группы с низким (от 11 до 29% клеток), умеренным (от 30 до 50% клеток) и высоким (более 50% клеток) уровнем экспрессии Pgp, также с низкой (меньше 2,0 отн. ед.), умеренной (от 2,0 до 4,0 отн. ед.) и высокой (выше 4,0 отн. ед.) интенсивностью экспрессии маркёра в опухолевой и нормальной ткани лёгкого.

Использованы моноклональные антитела к Pgp человека: первичные -(Abeam, клон 4ЕЗ) и конъюгированные с FITC (BD Pharmingen, клон 17F9); соответствующие изотипические антитела: первичные - IgG2a (Abeam) и конъюгированные с FITC - IgG2b к (BD Pharmingen); вторичные поликлональные антитела, меченные FITC к мышиному IgG2a, Fc-специфичные F(ab')? фрагменты (Sigma).

Измерение флуоресценции проведено на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto И; визуализация флуоресценции клеток - на флуоресцентном мик-

роскопе Leica DMI6000B с программным обеспечением приборов - FACSDiva 6.0 и Leica LAS соответственно. Для статистической обработки результатов использованы программы: WinMDI 2.9; FlowJo 7.6; Statistica 7.0 (критерии Шапи-ро-Уилка, U-критерий Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента). Принятый уровень статистической значимости различий: р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Разработка иммунофлуоресцентного метода количественного определения экспрессии Pgp с использованием проточной цитофлуориметрии

Принимая во внимание задачу исследования, а именно, разработку метода для использования в клинической практике, когда часто возникает необходимость верификации результатов анализа, проведено изучение влияния на результат оценки экспрессии Pgp фиксации опухолевого материала 4% раствором формальдегида. На клетках Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jur-kat с выраженной экспрессией транспортного белка Pgp показано (рис.1), что после фиксации доля специфически флуоресцирующих клеток, взаимодействующих с моноклональными антителами к Pgp, не только не уменьшается, но значительно возрастает - от 39% (рис. 1а) до 81% (рис.1б). Отношение специфической флуоресценции к изотипической было также значительно выше в фиксированных клетках по сравнению с живыми - в 2,9 и 1,5 раза соответственно. Это указывает на то, что в фиксированных клетках происходит увеличение доступности антигена для взаимодействия с антителом, что повышает чувствительность, а, следовательно, и точность оценки.

Аналогичные данные получены и при сравнительной оценке показателей экспрессии Pgp в образцах опухолей, при этом продемонстрировано практически полное совпадение результатов анализа солидных опухолей разных локализаций (НМРЛ, рака пищевода и желудка) при получении суспензии клеток как до, так и после фиксации образцов опухолевой ткани. Следовательно, приготовление одноклеточной суспензии из хирургического биопсийного образца опухоли возможно как из нативной ткани, так и после её фиксации 4% раствором формальдегида.

а

1ЛО/ /1 С\ гл

б

Рис. 1. Иммунофлуорес-центное окрашивание ан-

с н и

3'

81% (2,9) ТИТелами к Pgp клеток ли-

нии Лигка{

с а н

г

5

10' 10-" 10' 10 р1тс-н

ю-

изотопическими антителами, незакрашенные - с антителами к Рйр.

а - живые клетки, б - клетки, фиксированные 4% раствором формальдегида. Закрашенные гистограммы -клетки после инкубации с

р1тс-н

Важнейшим параметром клинического метода оценки любого молекулярного маркёра опухоли является возможность повторного проведения анализа в случае необходимости верификации диагноза. Показано, что разработанный количественный метод иммунофлуоресцентного определения Pgp в солидных опухолях воспроизводится, по крайней мере, в течение 2 лет после приготовления клеточной суспензии и её хранения в 4% растворе формальдегида.

В ходе разработки метода снижены экономические затраты на проведение анализа за счёт уменьшения концентрации антител при увеличении продолжительности их инкубации с клетками. Конкретно, при снижении концентрации изученных в работе моноклональных антител к Pgp (ВО РИаптиг^еп, клон 17Р9) в 4 раза по сравнению с рекомендованным фирмой-производителем и при увеличении времени инкубации клеток с антителами до 16-20 ч. достигается плато иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, т.е. выявление всех клеток, экс-прессирующих Pgp.

В работе на клетках Т-лимфобластного лейкоза линии 1игка1 проведён ряд опытов с разными концентрациями клеток в суспензии - 100, 500 тыс. и 1 млн./мл, а также с разным количеством клеток, анализируемых на проточном цитофлуориметре - 1, 2 и 5 тыс. Показано, что возможно исследование опухолевой ткани минимального размера (например, эндоскопические образцы) за счёт понижения концентрации клеток в суспензии при проведении инкубации с антителами до 100 тыс./мл, а количества клеток, анализируемых на проточном цитофлуориметре - до 1000.

Визуализация результатов иммунофлуоресцентного анализа представлена на рис. 2. Гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции клеток приведены на рис. 2а. Видно, что Pgp экспрессирован практически во всех клетках (в 93% случаев) с высокой интенсивностью (4,2 отн. ед.). На рис. 26 представлена фотография, полученная с помощью микроскопа Leica DMI 6000В при увеличении в 400 раз. Все клетки, находящиеся в поле, интенсивно окрашиваются антителами к Pgp, при этом некоторые клетки имеют гетерогенность флуоресценции.

Рис. 2. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток линии Jurkat антителами к Pgp

а - гистограммы распределения клеток в зависимости от интенсивности флуоресценции. Закрашенные гистогпаммы -клетки после инкубации с изотипическими антителами, незакрашенные - с антителами к Pgp. б - клетки, окрашенные флуоресцентными антителами к Pgp.

Таким образом, культура клеток Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat характеризуется высоким уровнем и интенсивностью экспрессии Pgp, что позволяет использовать её в качестве референсной.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что разработан метод иммунофлуоресцентного анализа с использованием проточной цитофлуо-риметрии, который позволяет проводить количественное определение уровня и интенсивности экспрессии Pgp в солидных опухолях человека (патент № 2413948).

Экспрессия Pgp в опухолевой и окружающей нормальной ткани лёгкого индивидуально у каждого больного

Первый вопрос, на который мы хотели получить ответ - предопределены ли параметры экспрессии Pgp в опухоли их значением в нормальной ткани лёгкого?

Экспрессия Pgp была определена в ткани HMPJ1 и в окружающей нор-

11

мальной ткани лёгкого у 82 из 112 пациентов (73%). Уровень экспрессии Р§р в нормальной и опухолевой ткани лёгкого одного и того же больного совпадал только у 55,5% больных (рис. 3, пример 1). Пример 1

НМРЛ

НТЛ

р1тс-н

р1тс-н

Пример 2

НМРЛ

НТЛ

р1тс-н

р1тс-н

Пример 3

НМРЛ

НТЛ

р1тс-н

Рис. 3. Примеры гистограмм распределения по интенсивности флуоресценции клеток, демонстрирующие различия в экспрессии в клет-

ках немелкоклеточного рака лёгкого (НМРЛ) и окружающей нормальной ткани (НТЛ)

Закрашенные гистограммы - клетки после инкубации с изотипическими антителами; незакрашенные - после инкубации с антителами к Pgp. Стрелками на рисунке отмечено количество специфически окрашенных клеток в процентах.

р1тс-н

Среди остальных больных в 74,5% случаев в опухоли уровень экспрессии Pgp был выше (рис. 3, пример 2), а в 25,5% случаев - ниже (рис. 3, пример 3), чем в нормальной окружающей ткани лёгкого.

Таким образом, на вопрос о том, являются ли параметры, характеризующие экспрессию Pgp в нормальной ткани, фактором, предопределяющим фенотип множественной лекарственной резистентности в опухоли того же больного, можно уверенно ответить - нет. Экспрессия Рер является свойством клеток, изменяющимся в процессе малигнизации.

Экспрессия Pgp в опухолевой и окружающей нормальной ткани лёгкого в исследованной группе пациентов

На следующем этапе работы мы попытались определить, лежит ли в основе выявленных различий между опухолевой и нормальной тканью лёгкого по уровню экспрессии транспортёра какая-либо общая закономерность, либо уровень Pgp в процессе канцерогенеза изменяется случайным и индивидуальным образом у каждого больного. Для этого было проведено сравнение экспрессии Р§р в опухолевой и нормачьной ткани по всей группе обследованных пациентов с диагнозом НМРЛ. Показано (рис. 4), что уровень экспрессии Р§р в окружающей нормальной лёгочной ткани значимо снижен по сравнению с тканью опухоли. Такая же закономерность отмечена и для интенсивности экспрессии

§

3 к о

§ чР |>„

на *

В

г

М §

о

-т-

НМРЛ НТЛ

Рис. 4. Уровень Pgp в ткани НМРЛ и нормальной ткани лёгкого (НТЛ) по всей группе обследованных больных

* р < 0,05 (11-критерий Манна-Уитни), I- интерквартильный размах медианы значений.

В целом, в нормальной ткани лёгкого низкий уровень и интенсивность экспрессии Pgp выявлялись чаще, чем в опухоли.

Следовательно, выявленные индивидуальные различия между опухолевой и нормальной тканью лёгкого пациентов с НМРЛ в экспрессии Pgp не являются случайным Фактом, а отражают биологические особенности возникновения и протекания опухолевого процесса у разных больных.

Экспрессия Р§р в нормальной ткани, окружающей первичную опухоль и метастаз в лёгкое опухолей другой локализации Основным этиологическим фактором НМРЛ являются химические канцерогены. Поскольку белки множественной лекарственной резистентности, и в частности Рцр, выводят из клетки чужеродные соединения, в том числе и канцерогенные, логично предположить, что снижение уровня Р§р в нормальной

13

ткани лёгкого может способствовать процессу малигнизации. Для обоснования этой гипотезы необходимо ответить на вопрос: действительно ли в нормальной ткани, окружающей очаг НМРЛ, экспрессия Pgp является сниженной? Адекватным контролем, с которым сравнивалась бы нормальная ткань, окружающая очаг НМРЛ, может служить нормальная ткань лёгкого, не поражённого первичным злокачественным процессом и хроническим воспалительным заболеванием. Указанным критериям, по нашему мнению, соответствует ткань, окружающая метастаз в лёгкое, поскольку в этом случае опухолевые клетки попадают в лёгкое из удалённого очага, и лёгочная ткань вне метастаза является ин-тактной с точки зрения канцерогенеза первичного рака лёгкого.

Показано (рис. 5), что уровень экспрессии Р§р достоверно ниже в нормальной ткани, окружающей очаг НМРЛ, по сравнению с нормальной тканью лёгкого, поражённого метастазом. Таким образом, низкий уровень экспрессии Р§р в ткани лёгкого ассоциирован с развитием НМРЛ. Значительное снижение экспрессии Р§р в нормальной ткани лёгкого с первичной опухолью, по сравнению с тканью лёгкого, поражённого метастазом, указывает на важную роль Pgp в нарушении барьерной функции клеток и в создании благоприятных условий для реализации биологических эффектов канцерогенов. Иными словами, клетки с подавленной защитной системой АВС-транспортёра становятся более уязвимыми для воздействия канцерогенных веществ. *

-\

Й 60

л

я

Е 60

и

«

и Я

О § 30 О ь д О

•5 § 20

V

10

г-к

я

<3 о

Г

Рис. 5. Уровень Р§р в нормальной ткани лёгкого, окружающей пер.................. вичный (НТЛ) или метастатический очаг (НТЛт{8) * р < 0,05 (и-критерий Манна-Уитни),

_I- интерквартильный размах медианы

НТЛ НТЛт18 значений.

В совокупности, полученные данные свидетельствуют о том, что снижение уровня экспрессии Рер в ткани лёгкого является одним из патогенетически важных факторов, облегчающих развитие НМРЛ.

Тендерные различия в экспрессии Pgp в ткани НМРЛ и нормальной ткани лёгкого, окружающей первичный или метастатический очаг

При анализе уровня экспрессии Р§р в опухолевой и нормальной ткани лёгкого у пациентов мужского и женского пола выявлены следующие закономерности.

- Показано (рис. 6а), что у мужчин в нормальной ткани лёгкого, окружающей очаг НМРЛ, уровень Pgp снижен по сравнению как с тканью опухоли, так и с нормальной тканью, окружающей метастаз в лёгкое. У женщин же сходный уровень экспрессии Р§р отмечен во всех трёх сравниваемых тканях (рис. 66).

Рис. 6. Уровень Pgp в ткани НМРЛ и нормальной ткани лёгкого, окружающей первичный (НТЛ) или метастатический очаг (НТЛтй) у мужчин (а) и женщин (б)

* р<0,05; N8 - различия недостоверны (и-критерий Манна-Уитни), х- интер-квартильный размах медианы значений.

- Ранее выявленная на всей группе пациентов (без учёта половой принадлежности) закономерность, согласно которой уровень и интенсивность экспрессии Pgp в клетках опухоли превышают таковые параметры экспрессии транспортёра в нормальной ткани лёгкого, справедлива только для пациентов мужского пола.

- В ткани НМРЛ мужчин и женщин сходное количество клеток с одинаковой интенсивностью экспрессируют Pgp.

- У мужчин больных НМРЛ, в нормальной окружающей ткани экспрессия Pgp снижена по сравнению с соответствующим показателем у женщин с тем же диагнозом (рис. 7). При этом в группе пациентов с метастазами в лёгком поло-

а

б

НМРЛ НТЛ НТЛтК НМРЛ НТЛ НТЛ,

ns

g я

S X 30

° 2

о ^

а а го

н 5

вые различия отсутствуют: уровень Pgp в нормальной ткани, окружающей метастаз, одинаков у больных мужского и женского пола.

Рис. 7. Уровень Pgp в нормальной ткани лёгкого, окружающей первичный (HTJI) или метастатический очаг (HTJImts) у мужчин и женщин * р < 0,05; NS - различия - недостоверны (U-критерий ^ Мужчины Женщины Мужчины Женщины Манна-Уитни), I - интер-

HTJI HTJImt4 квартальный размах ме-

дианы значении.

Таким образом, подавление экспрессии Pgp. участвующего в защите клеток лёгочной ткани от воздействия канцерогенов, характерно для мужчин, но не для женщин. Это является еще одним свидетельством в пользу патогенетической роли снижения экспрессии Pgp в нормальной ткани лёгкого в развитии ЫМРЛ.

Экспрессия Pgp в ткани HMPJI и нормальной окружающей ткани лёгкого у курящих и некурящих пациентов

При проведении исследований в данном разделе работы получены следующие результаты.

- Уровень и интенсивность экспрессии Pgp в ткани НМРЛ, не различаются между курящими и некурящими пациентами.

- В группе курящих больных НМРЛ уровень экспрессии маркёра в нормальной ткани лёгкого существенно снижен по сравнению с тканью опухоли. В группе некурящих пациентов аналогичной закономерности не наблюдается (рис. 8).

- У большинства курящих больных в нормальной ткани лёгкого определяется низкий уровень экспрессии Pgp (рис. 9). И наоборот, ткань НМРЛ курящих пациентов в подавляющем числе случаев характеризуется умеренным и высоким уровнем экспрессии Pgp. В группе некурящих больных различий по частоте встречаемости разных уровней Pgp между НМРЛ и нормальной окружающей тканью не выявлено.

N8

К

р 30 <и § 20

10

О

£

НМРЛ нтл Курящие

НМРЛ НТЛ Некурящие

Рис. 8. Уровень Pgp в ткани НМРЛ и окружающей нормальной ткани лёгкого (НТЛ) у курящих и некурящих пациентов

* р < 0,05; N8 - различия недостоверны (11-критерий Манна-Уитни), I- интерк-вартильный размах медианы значений.

о4

в-

3

4 о И

60 50 ■ 40 ■

Низкий Умеренный Высокий (11-29%) (30-50%) (>50%)

Рис. 9. Распределение курящих больных по группам в зависимости от уровня экспрессии Pgp в ткани НМРЛ (ЩЦ ) и окружающей нормальной ткани лёгкого (Ш )

- У курящих пациентов с НМРЛ в окружающей нормальной ткани лёгкого уровень экспрессии Pgp статистически значимо снижен по сравнению с некурящими больными (рис. 10а).

- Аналогичная картина, а именно, снижение уровня экспрессии Р§р в нормальной ткани лёгкого, окружающей метастаз, выявлена у курильщиков по сравнению с некурящими пациентами (рис. 106).

6*

1

У 50

|*10 к ьа

° 2зо

е I

а>

X ю ц

3 о

НТЛ НТЛт,5 НТЛ НТЛт,5 Курящие Некурящие

Рис. 10. Уровень Pgp в нормальной ткани лёгкого, окружающей первичную опухоль (НТЛ) или метастаз (НТЛт„), у курильщиков и некурящих * р < 0,05 (11-критерий Манна-Уитни), I - интерквар-тильный размах медианы значений.

- Курящие пациенты с первичным или метастатическим поражением лёгкого имеют близкий уровень экспрессии Р§р в нормальной лёгочной ткани.

- У некурящих пациентов также не обнаружены отличия в экспрессии Р£р между нормальной тканью лёгкого, окружающей НМРЛ и метастаз.

В совокупности эти данные дают основание утверждать, что курение является фактором, приводящим к снижению уровня экспрессии Р§р в нормальной лёгочной ткани. Поскольку известно, что физиологической функцией белков множественной лекарственной резистентности является выброс из клеток ксенобиотиков, в том числе и канцерогенов, выявленное снижение уровня Р§р под влиянием курения является детектором подавления неспецифической устойчивости ткани лёгкого к воздействию ксенобиотиков, таким образом, облегчая процесс лёгочного канцерогенеза. Иными словами, есть все основания утверждать, что нами впервые описан один из этапов патогенного воздействия курения, который облегчает процесс лёгочного канцерогенеза и может рассматриваться в качестве фактора риска развития рака лёгкого.

Экспрессии Рёр в ткани плоскоклеточного рака, аденокарциномы и окружающей нормальной ткани лёгкого Показано, что у больных плоскоклеточным раком (рис. 11а) уровень экспрессии маркёра снижен в нормальной лёгочной ткани в сравнении с тканью опухоли и контролем - нормальной тканью метастатически поражённого лёгкого. У пациентов с аденокарциномой (рис. 116) опухолевая и нормальная ткань лёгкого по уровню экспрессии Р§р не отличаются друг от друга и от контроля.

Таким образом, снижение уровня Р§р в нормальной ткани лёгкого ассоциировано с развитием плоскоклеточного рака, но не аденокарциномы. Этот факт даёт основание считать, что снижение уровня Р£р в ткани лёгкого принимает участие в патогенезе только одной из изученных гистологических форм НМРЛ - плоскоклеточного рака, который в подавляющем числе случаев встречается у мужчин, а у женщин чаще развивается аденокарцинома.

С другой стороны, выше было показано, что снижение уровня экспрессии Р§р является одним из механизмов патогенного воздействия курения на ткань

1В

лёгкого. Мы предполагаем, что эти факторы связаны между собой, поскольку из всех гистологических форм НМРЛ именно плоскоклеточный вариант в наибольшей степени ассоциирован с курением.

40

* К о О 30

о ^ а й

Р 5 20

N5 N8 -¡1-

Рис. 11. Уровень Р§р в ткани НМРЛ и нормальной ткани, окружающей первичный (НТЛ) или метастатический очаг (НТЛт48)

ПЛРЛ НТЛ НТЛт(5 АДК НТЛ НТЛт„

А - плоскоклеточный рак (ПЛРЛ), Б - аденокарцинома лёгкого (АДК). *р<0,05; N8 - различия недостоверны (11-критерий Манна-Уитни), I - интерквартиль-ный размах медианы значений.

Что касается экспрессии Pgp в опухоли, то, согласно полученным данным, высокий уровень и частота экспрессии Р§р наблюдается как в плоскоклеточном раке, так и в аденокарциноме; как у мужчин, так и у женщин; как у курящих, так и некурящих пациентов. Выявленная закономерность показывает, что именно в повышенном уровне, интенсивности и частоте экспрессии фенотипа множественной лекарственной резистентности, в частности транспортного белка Pgp, заключается одна из причин неудовлетворительной эффективности противоопухолевой терапии НМРЛ.

Это делает больных НМРЛ потенциальными кандидатами на проведение терапии по преодолению множественной лекарственной резистентности или модификации схем химиотерапии, например, за счёт исключения противоопухолевых препаратов, являющихся субстратами Pgp. При этом в основу должно быть положено определение фенотипа множественной лекарственной резистентности, в частности уровня экспрессии Pgp, у каждого больного, так как персонификация лечения - это ведущее направление развития современной противоопухолевой терапии на пути достижения оптимальной эффективности широко применяемых и новых противоопухолевых лекарств.

выводы

1. Разработан и запатентован иммунофлуоресцентный метод количественной оценки экспрессии маркёра множественной лекарственной резистентности Pgp в солидных опухолях человека, пригодный для рутинного клинического использования.

2. Экспрессия Pgp в нормальной ткани лёгкого не предопределяет фенотип множественной лекарственной резистентности немелкоклеточного рака лёгкого.

3. Выявлен новый фактор патогенеза немелкоклеточного рака лёгкого - снижение экспрессии Pgp в нормальной лёгочной ткани.

4. Курение приводит к снижению экспрессии Pgp в ткани лёгкого, облегчая процесс лёгочного канцерогенеза.

5. Снижение экспрессии Pgp в нормальной лёгочной ткани ассоциировано с плоскоклеточным раком лёгкого у курящих мужчин.

6. Высокая частота гиперэкспрессии маркёра множественной лекарственной резистентности Pgp в опухолевой ткани является одной из причин неудовлетворительной эффективности лекарственной терапии немелкоклеточного рака лёгкого независимо от пола пациента, статуса курильщика и гистологического варианта опухоли.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в российских научных журналах, включенных в перечень ВАК

1. Богуш, T.A. MRP как новый прогностический маркер эффективности тамок-

сифена при лечении рака молочной железы с положительным статусом эстро-геновых рецепторов / Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, Е.А. Богуш, М.В. Тихомиров, В.Ю. Кирсанов, М.И. Давыдов // ДАН. - 2010. - Т. 430, №5. - С. 700-704. (Scopus)

2. Богуш, Т.А. Количественное иммунофлуоресцентное определение экспрессии Pgp в солидных опухолях человека с использованием метода проточной ци-тофлуориметрии / Т.А. Богуш, М.В. Тихомиров, Е.А. Дудко, М.Н. Синицина, Р.Ю. Раманаускайте, Б.Е. Полоцкий, С.А. Тюляндин, М.И. Давыдов // Вестник МГУ, Сер.2 Химия. - 2012. - Т. 53, №3. - С. 207-215. (Scopus)

Статьи в зарубежных рецензируемых научных журналах

3. Bogush, Т.А. MRP as a new predictive marker of tamoxifen efficiency in treatment of estrogen receptor positive breast cancer / T.A. Bogush, E.A.Dudko, E.A. Bogush, M.V. Tikhomirov, V.Yu. Kirsanov, M.I. Davydov // Dokl Biochem Biophys. -2010. - Vol. 430. - P. 36-40. (Web of Science, PubMed, Scopus)

4. Bogush, T.A. Quantitative immunofluorescence estimation of Pgp expression in human solid tumors by flow cytometry / T.A. Bogush, M.V. Tikchomirov, E.A. Dudko, M.N. Sinitsyna, R.J. Ramanauskaite, B.E. Polotsky, S.A. Tjulandin, M.I. Da-vidov // Moscow University Chemistry Bulletin. - 2012. - Vol. 67, N 3. - P. 142148. (Scopus)

Патенты

5. Патент № 2413948, РФ, 10 марта 2011. «Способ иммуноФлуоресцентного анализа маркёров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека» / Богуш Т.А., Дудко Е.А., Тихомиров М.В., Богуш Е.А., Кирсанов В.Ю., Лактионов К.К., Полоцкий Б.Е., Барышников А.Ю., Давыдов М.И.; опубл. 10.03.2011. Бюл. № 7.

Тезисы докладов на отечественных конференциях

6. Дудко, Е.А. Параметры иммунофлуоресцентной оценки экспрессии маркера множественной лекарственной резистентности Pgp в клетках Т-клеточного лейкоза линии Jurkat / Е.А. Дудко, Т.А. Богуш, М.В. Тихомиров, Р.Ю. Раманау-скайте, О.С. Бурова, А.Ю. Барышников // Мат. науч. конф. «Наноонкология». Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, №1. - С. 14.

7. Богуш, Т.А. Молекулярные маркеры лекарственной резистентности немелко-клеточного рака лёгкого: научные факты и возможности их клинического применения / Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, М.В. Тихомиров, А.Б. Равчеева, А.В. Кону-хова, Л.А. Бахтадзе, К.К. Лактионов, Б.Е. Полоцкий, М.И. Давыдов // Мат. науч. конф. «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека». Вестн. РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. - 2009. - Т. 20, №1. - С. 78-79.

8. Богуш, Т.А. Экспрессия маркёра множественной лекарственной резистентности Pgp в клетках немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани лёгкого / Т.А. Богуш, М.В. Тихомиров, Е.А. Дудко, Е.А. Богуш, Р.Ю. Раманау-скайте, К.К. Лактионов, Э.Э. Джураев, Б.Е. Полоцкий // Мат. науч. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, №2. - С. 49-50.

9. Богуш, Т.А. Экспрессия маркёра множественной лекарственной резистентно-

сти MRP1 в клетках немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани лёгкого / Т.А. Богуш, М.В. Тихомиров, Е.А. Дудко, Э.Э. Джураев, К.К. Лактионов, Б.Е. Полоцкий // Мат. науч. конф «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, №1. - С. 11.

10. Богуш, Т.А. Экспрессия маркёра множественной лекарственной резистентности Pgp в клетках немелкоклеточного рака лёгкого (НМРЛ) у мужчин и женщин / Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, М.В. Тихомиров, В.Ю. Кирсанов, Э.Э. Джураев, Б.Е. Полоцкий, М.И. Давыдов // VI Съезд онкологов и радиологов стран СНГ. -Душанбе.-2010.-С. 46.

Тезисы докладов на зарубежных конференциях

11. Bogush, Т.А. Overcoming the chemotherapy resistance in non-small-cell lung cancer by tamoxifen / T.A. Bogush, E.A. Dudko, E.A. Bogush, M.V. Tikchomirov, A.A. Berne, K.K. Laktionov, L.A. Vakhtadze, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // 13th World Conference on Lung Cancer. - San Francisco. - 2009. - Abstr. 1.076.

12. Bogush, T.A. Tamoxifen as a potential inhibitor of the chemotherapy resistance in non-small cell lung cancer / T.A. Bogush, E.A. Dudko, E.A. Bogush, M.V. Tikchomirov, R.J. Ramanayskaite, K.K. Laktionov, B.E. Polotsky, M.I. Davydov//Materials of scient. conf. «Discovery based translational cancer research». Eur J Cancer. - 2010. - Vol. 8, N 5. - Suppl. 8. - P. 64.

13. Bogush, T.A. Expression of ABC-transporters, namely Pgp and MRP1, in adjacent normal lung tissue does not predict the marker expression in non-small cell lung cancer / T.A. Bogush, E.A. Dudko, M.V. Tikchomirov, A.A. Beme, V.Ju. Kirsanov, E.E. Juraev, K.K. Laktionov, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // 4th Latin American Conference on Lung Cancer. - Buenos Aires. - 2010. - Abstr. p.2.24.

14. Bogush, T.A. Expression of multidrug resistance marker P-glycoprotein (Pgp) in non-small cell lung cancer and adjacent normal lung tissue / T.A Bogush, E.A. Dudko, E.A. Bogush, M.V. Tikchomirov, E.E. Juraev, A.A. Beme, B.E. Polotsky, M.I. Davydov //21st 1С ACT International Congress On Anti-Cancer Treatment. - Paris. -2010.-P. 442-443.

15. Bogush, T.A. Pgp as a pathogenetic factor of non-small cell lung cancer / T.A. Bogush, E.A. Dudko, M.V. Tikchomirov, E.A. Bogush, E.E. Juraev, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // 14th World Conference on Lung Cancer. - Amsterdam. - 2011. -Abstr. p.2.162.

16. Tikchomirov, M. Multidrug resistance marker P-glycoprotein as a pathogenetic

22

factor of non-small cell lung cancer / M. Tikchomirov, E. Dudko // EAFO Global Oncology Forum. - Moscow. - 2012. - P. 55-56.

17. Bogush, T.A. Estrogen receptors alpha and beta as targets for non-small cell lung cancer hormonal therapy / T.A. Bogush, E.A. Dudko, A.S. Shaturova, M.V. Tik-homirov, E.A. Bogush, B.E. Polotsky, S.A. Tjulandin, M.I. Davydov // Materials of scient. conf. «Worldwide Innovative Networking (WIN) Symposium». Ann Oncol. -2012. - Vol. 23. - Suppl. 5. - Abstr. P2,16.

18. Bogush, T.A. Multidrug resistance transporter Pgp as a pathogenetic factor of non-small cell lung cancer / E.A. Dudko, M.V. Tikchomirov, A.B. Ravcheeva, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // Materials of scient. conf. «From basic research to personalised cancer treatment». Eur J Cancer. - 2012. - Vol. 48. - Suppl. 5. - Abstr. 735.

Подписано в печать 19.02.13 Формат60x84/16. Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 120

Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24