Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия эстрогеновых рецепторов β в ткани немелкоклеточного рака легкого

На правах рукописи

ШАТУРОВА АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА

ЭКСПРЕССИЯ ЭСТРОГЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ р В ТКАНИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО: КОРРЕЛЯЦИИ С КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ

ЗАБОЛЕВАНИЯ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 СЕН 2015

Москва — 2015 005562399

005562399

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Директор

академик РАН, профессор Давыдов Михаил Иванович

академик РАН, профессор

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Тер-Ованесов Михаил Дмитриевич доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача по онкологии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Городская клиническая больница №40 Департамента здравоохранения г. Москвы

Научные руководители:

Давыдов Михаил Иванович Богуш Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты:

Высоцкая Ирина Викторовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр»

Защита диссертации состоится « 7"» в часов на заседании диссертаци-

онного совета СД 001.017.01) ФГБУ «РОНЦбм. Н.Н.Блохина» Минздрава России по адресу: 115478, Каширское шоссе, д. 23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России по адресу: 115478, Каширское шоссе, д. 24 и на сайте www.ronc.ru

Автореферат разослан «

» (/ЛО^/л^- 20 {¿> года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Рак легкого является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований, заболеваемость и смертность от которого неуклонно растет с 1930-ых гг. На сегодняшний день результаты терапии немелкоклеточного рака легкого, в том числе и с применением таргетных противоопухолевых препаратов, нельзя считать удовлетворительными, поэтому не вызывает сомнения актуальность разработки новых стратегий его лечения, основанных на современных представлениях о биологии этой опухоли.

Согласно ряду работ, в патогенез рака легкого вовлечены эстрогены. Установлено, что гормонозаместительная терапия увеличивает смертность от немелкоклеточного рака лёгкого, в то время как использование антиэстрогенов пациентками после менопаузы, напротив, связывают с уменьшенным риском смертности от этого заболевания. Действие эстрогенов реализуется через высокоафинные эстрогеновые рецепторы (ЭР), которые локализованы в клеточной цитоплазме или в ядре. Угнетение пролиферации опухолевых клеток за счет блокирования эстрогенового сигналинга посредством связывания с ЭР специальных терапевтических агентов - антиэстрогенов, в течение уже более 40 лет успешно применяется при адъю-вантной терапии рака молочной железы.

Логично предположить, что, используя антиэстрогены при лечении рака легкого, можно рассчитывать на аналогичный противоопухолевый эффект, хотя в большинстве случаев в клетках немелкоклеточного рака легкого экспрессируются ЭРр, а не ЭРа, как в ткани рака молочной железы. В пользу этого свидетельствуют, в частности, данные экспериментов in vitro о стимуляции пролиферации клеток немелкоклеточного рака легкого, экспрессирующих

под действием эстрогенов и ее ингибирование после применения антиэстрогенов. Более того, ЭРр являются благоприятным прогностическим маркером немелкоклеточного рака легкого, поскольку его экспрессия в опухолевой ткани ассоциирована с высокой общей выживаемостью пациентов.

Таким образом, ЭРр являются важным фактором патогенеза немелкоклеточного рака легкого и мишенью антиэстрогеновой терапии этой опухоли. Однако на сегодняшний день данные относительно экспрессии ЭРР в ткани немелкоклеточного рака легкого немногочисленны и зачастую противоречивы.

Кроме того, до сих пор не установлены причины половых различий в заболеваемости разными гистологическими типами немелкоклеточного рака легкого и ассоциации этих типов со статусом курильщика пациента. Так, плоскоклеточный рак легкого связан с курением и чаще диагностируется у мужчин, в то время как аденокарцинома преимущественно развивается у женщин и при этом не зависит от статуса курения. Очевидно, что выявление корреляций количественных показателей экспрессии эстрогеновых рецепторов р с типом опухо-

ли, полом пациентов или статусом курения позволит пролить свет на природу описанных различий.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественная характеристика экспрессии ЭР(5 в ткани немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани лёгкого, а также в метастазах в лёгкое опухолей другой первичной локализации для оценки корреляции выявленных параметров с клинико-морфологическими характеристиками опухолевого процесса и обоснования перспектив применения антиэстрогенов в адъювантной терапии немелкоклеточного рака лёгкого.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать количественный иммунофлуоресцентный метод с использованием проточной цитофлуориметрии для оценки экспрессии ЭР[3 в солидных опухолях человека.

2. Используя разработанный метод, выявить антитела, оптимальные для оценки экспрессии ЭРР в клинической практике.

3. Количественно оценить уровень, интенсивность и частоту экспрессии ЭР0:

- в хирургических образцах немелкоклеточного рака лёгкого;

- в нормальной ткани легкого, окружающей очаг немелкоклеточного рака лёгкого;

- в ткани метастазов в лёгких опухолей другой первичной локализации.

4. Количественно оценить уровень, интенсивность и частоту экспрессии ЭРр в ткани метастазов в легких в зависимости от локализации первичной опухоли.

5. Провести сравнительный анализ параметров экспрессии ЭРР:

- у пациентов мужского и женского пола;

- у курильщиков и некурящих пациентов;

- в ткани аденокарциномы и плоскоклеточного рака легкого.

6. Соотнести параметры экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака лёгкого и соответствующей нормальной ткани органа для того, чтобы выявить возможную предопределенность экспрессии ЭРр в опухолевых клетках

7. Оценить перспективу и сформулировать показания к применению антиэстрогеновой терапии немелкоклеточного рака и метастатического поражения легкого.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые разработан и адаптирован для рутинной клинической практики метод количественной иммунофлуоресцентной оценки экспрессии ЭРр в солидных опухолях человека с использованием проточной цитофлуориметрии. Ряд особенностей метода обеспечивают его пригодность для клинического применения. Благодаря фиксации анализируемого материала 4% раствором формальдегида возможно длительное хранение образца и, как следствие, - верификация анализа. Сокращение числа отмывок клеток за счет увеличения объема фосфат-

ного буферного раствора делает анализ менее трудоемким и минимизирует потери материала. Пролонгированная инкубация клеток с первичными и вторичными антителами позволяет, как повысить чувствительность метода, так и понизить его себестоимость за счет снижения расхода антител. Уменьшение количества клеток в суспензии и числа событий, анализируемых на проточном цитофлуориметре, делает возможным исследование малых по размеру фрагментов ткани. При этом метод удобен для персонала клинической лаборатории, поскольку разработан с учетом регламентированного рабочего графика.

Показано, что антитела клона 14С8 к тотальной фракции ЭРр являются оптимальными для оценки экспрессии маркера в опухолевой ткани в условиях клинической лаборатории.

При анализе экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака лёгкого обоснована необходимость совокупной оценки цитоплазматических и ядерных рецепторов.

Впервые на большом клиническом материале (183 образца) проведена сравнительная количественная оценка уровня, интенсивности и частоты экспрессии ЭРР в ткани немелко-клеточного рака и окружающей нормальной ткани легкого одних и тех же пациентов, а также в ткани метастазов в лёгком опухолей других первичных локализаций.

Впервые показано, что ЭРР в ткани немелкоклеточного рака экспрессированы практически у всех пациентов, 2/3 из которых с уровнем маркера >30% являются претендентами на проведение адъювантной антиэстрогеновой терапии.

Не выявлено корреляции экспрессии ЭРР в ткани немелкоклеточного рака легкого с полом пациентов и статусом курения. Напротив, ткань аденокарциномы легкого ассоциирована с повышенной экспрессией маркера по сравнению с плоскоклеточным раком, что позволило объяснить более высокие показатели экспрессии ЭРр у женщин по сравнению с мужчинами, поскольку преобладающим гистологическим вариантом немелкоклеточного рака легкого у пациенток женского пола является аденокарцинома.

ЭРР обнаружены не только в ткани немелкоклеточного рака, но и в окружающей нормальной ткани легкого у пациентов, страдающих как аденокарциномой, так и плоскоклеточным раком легкого. При этом взаимосвязи между показателями маркера в нормальной и опухолевой ткани не выявлено.

В ткани метастазов в лёгкое опухолей другой первичной локализации экспрессия ЭРР с уровнем маркёра >30% выявлена у половины пациентов, которые могут являться претендентами на проведение адъювантной антиэстрогеновой терапии, как и в случае первичного опухолевого поражения легкого.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработан и запатентован адаптированный для клинического применения иммуноф-луоресцентный метод, ассоциированный с проточной цитофлуориметрией, количественного

определения экспрессии эстрогеновых рецепторов р в солидных опухолях человека.

Получены принципиально новые количественные данные об экспрессии эстрогеновых рецепторов р в ткани немелкоклеточного рака и окружающей нормальной ткани легкого, позволяющие перевести эти первичные и метастатические поражения органа в разряд потенциально чувствительных к гормональной терапии.

Выявлена патогенетическая значимость эстрогеновых рецепторов р в развитии адено-карциномы легкого у некурящих женщин.

Обоснована перспективность новой стратегии терапии немелкоклеточного рака легкого и метастатического поражения органа у пациентов с экспрессией в опухолевой ткани эстрогеновых рецепторов р - применение антиэстрогенов в адъювантном режиме.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментов, обсуждение результатов, выводы. Работа изложена на 147 страницах, включает 39 таблиц, 27 рисунков и 336 ссылок на литературные источники.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация диссертационной работы состоялась 17 марта 2015 г. на совместной научной конференции в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России с участием лабораторий медицинской химии, фармакологии и токсикологии, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, фармакоцитокинетики, иммунофармакологии и комбинированной терапии опухолей, отделения клинической фармакологии и химиотерапии, хирургического торакального отделения, а также диагностического хирургического отделения. Основные положения диссертации опубликованы в 24 научных публикациях, доложены на международных и российских конференциях.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и иностранной литературы по изучаемой теме, разработан метод и оценена экспрессия эстрогеновых рецепторов р в исследуемых образцах, интерпретированы результаты, статистически обработаны полученные данные, сформулированы выводы и оформлена диссертация.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - онкология, а именно пунктам 2, 6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена на хирургических образцах НМРЛ (101 образец) и нормальной ткани

лёгкого (36 образцов), метастаз в лёгкое (46 образцов), а также культуре клеток аденокарци-номы молочной железы человека линии MCF-7.

Экспрессию 3Pß оценивали по следующим показателям: уровень экспрессии (доля клеток, экспрессирующих маркёр в исследуемой ткани) и интенсивность экспрессии (отношение специфической флуоресценции клеток к изотипической). Все образцы были разделены на группы с низким (от 11 до 29% клеток), умеренным (от 30 до 50% клеток) и высоким (более 50% клеток) уровнем экспрессии ЭРР, также с низкой (меньше 2,0 отн. ед.) или высокой (2,0 отн. ед. и более) интенсивностью экспрессии маркёра в опухолевой и нормальной ткани лёгкого.

Для определения тотальной фракции ЭРр использовали первичные мышиные монокло-нальные антитела клона 14С8 (Abeam), для обнаружения полноразмерной изоформы рецептора - ЭРРь использовали антитела клона EMR02 (Novocastra). В качестве изотопического контроля выступали первичные мышиные моноклональные антитела IgG2a (клон MG2a-53, Abeam) и IgGl (клон MGI-45, Abeam), соответственно. Вторичные антитела - мышиные по-ликлональные антитела, меченые FITC (F2772, Sigma).

Измерение флуоресценции проведено на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto И; визуализация флуоресценции клеток - на флуоресцентном микроскопе Leica DMI6000B с программным обеспечением приборов - FACSDiva 6.0 и Leica LAS соответственно. Для статистической обработки результатов использованы программы: WinMDI 2.9; FlowJo 7.6.1; Statistica 7.0 (критерии Шапиро-Уилка, U-критерий Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента). Принятый уровень статистической значимости различий: р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Разработка методики иммунофлуоресцентного анализа экспрессии 3Pß с помощью проточной цитофлуориметрии

На первом этапе работы, имея в виду необходимость длительного хранения клеточного материала, оценили возможность изменения условий фиксации клеток в сторону повышения концентрации раствора формальдегида от рекомендованного коммерческим протоколом - от 0,01% до 4%. В культуре клеток MCF-7 показано, что изменение условий фиксации не влияет на эффективность антител, специфичных как к ЭРР, так и к ЭРр] с клетками культуры MCF-7 (рис. 1). Уровень экспрессии ЭРр и ЭРр1, определяемый в клетках, зафиксированных 0,01% и 4% раствором формальдегида, был одинаков (77% vs 75% и 76% vs 71%, соответственно). Аналогично, при различной фиксации клеток не различались показатели интенсивности экспрессии ЭРр и ЭРРь В связи с этим считаем, что при клинической оценке экспрессии ЭРр и 3PPi в солидных опухолях человека, учитывая лучшую сохранность материала, может быть использована фиксация клеток 4% раствором формальдегида.

Вторая проблема, которая возникает при оценке экспрессии опухолевых маркеров, -размер образца исследуемой ткани. В работе проведено сравнение результатов окрашивания ЭР)3 и ЭРРь полученных при разных концентрациях клеток в суспензии (100, 500 тыс. и 1 млн./мл) и разном количестве клеток, анализируемых на проточном цитофлуориметре (5, 3 и 1 тыс. клеток). Показано, что уменьшение количества клеток до 100 тыс./мл при иммуноф-луоресцентном окрашивании и снижение числа клеток, анализируемых на проточном цитофлуориметре до 1 тыс., не изменяет результатов оценки экспрессии ЭРр и ЭРР) в исследуемой опухоли. Таким образом, методика позволяет исследовать не только хирургические образцы, но и фрагменты ткани небольшого размера (например, эндоскопические образцы).

77% (3,8)

/

75% (4,1)

76% (4,2)

71% (4,6)

Рис. 1. Иммунофлуоресцентное окрашивание ЭРр (а, б) и ЭРр, (в, г) в клетках линии МСЖ-7, фиксированных 0,01% (а, в) и 4% (б, г) раствором формальдегида

Закрашенные гистограммы -клетки после инкубации с изотопическими антителами, не закрашенные - после инкубации со специфическими антителами.

Следующие задачи при адаптации любого метода для практического применения - минимизация продолжительности анализа, то есть снижение его трудоёмкости. В связи с этим показана возможность пермеабилизации в совокупной суспензии анализируемых клеток и снижение числа отмывок клеток от реагентов за счет 10-20 кратного увеличения объёма промывочного раствора, без снижения точности количественной характеристики экспрессии ЭРР и ЭРРь

При оптимизации условий проведения анализа установлено также, что продолжительность инкубации с первичными антителами в течение 15-20 ч. (ночная инкубация), а с вторичными - 1,5 ч. является оптимальной с точки зрения большей чувствительности метода, сокращения расхода антител, а также удобства проведения анализа, учитывая нерегламентированность времени получения опухолевого образца и график работы клинических лабораторий. Надежность метода значительно повышается благодаря контролю активности антител

при каждом анализе на референсной культуре клеток рака молочной железы линии MCF-7, в которой количественные параметры экспрессии ЭРр охарактеризованы в ходе настоящего исследования.

И, наконец, определен диапазон концентраций специфических антител, необходимый для оценки строго количественных параметров экспрессии ЭР в исследуемой опухоли. В него включены область линейной зависимости флуоресцентного окрашивания клеток от концентрации антител и область достижения плато. В культуре клеток MCF-7 - это 0,6; 1,2 и 2,5 мкг/мл для ЭРр и разведения коммерческого раствора антител 1:200; 1:100 и 1:50 для 3Pßi, При исследовании антигенов в солидных опухолях человека необходимо использовать более высокие концентрации антител, так как при этом увеличивается вероятность получения повторов в области плато, то есть в области выявления всех клеток, экспрессирующих исследуемый маркер. Так, для антител клона 14С8 эти значения составляют 1,2; 2,5 и 5 мкг/мл, а для антител клона EMR02 - разведения коммерческого раствора 1:100; 1:50 и 1:25 (табл. 1). В отдельных случаях, если область плато в указанном диапазоне концентраций антител не достижима, анализ должен быть повторен с большими концентрациями антител.

Анализ характера окрашивания клеток при исследовании экспрессии ЭРР исследован на клетках рака молочной железы линии MCF-7 с помощью светового флуоресцентного микроскопа. Ядра клеток идентифицированы при окраске ДНК-специфическим красителем Hoechst Н33258. Показано, что разработанный метод позволяет выявлять ЭРр, локализованные как в ядре, так и в цитоплазме. Поскольку известно, что в результате классического эст-рогенового сигналинга ЭР перемещаются из цитоплазмы в ядро, считаем, что этот интегральный показатель внутриклеточного содержания маркёра является наиболее адекватным для оценки его прогностической значимости в предсказании чувствительности к антиэстрогенам и для дальнейшего исследования корреляций с клинико-морфологическими особенностями опухолей.

Итак, в соответствии с первой задачей исследования, был разработан и защищен патентом РФ пригодный для клинического применения иммунофлуоресцентный метод, ассоциированный с проточной цитофлуориметрией, для количественной оценки экспрессии ЭРр в солидных опухолях человека (патент № 2429481 от 20.09.11).

Таблица 1

Оптимизация условий иммунофлуоресцентного анализа экспрессии ЭР(5 и ЭРР1 в солидных опухолях человека с использованием моноклональных антител фирмы Abeam _(клон 14С8) и Novocastra (клон EMR02)_

Оптимизируемый этап анализа Протестированные условия Рекомендуемые условия

Фиксация клеток раствором формальдегида 0,01% Фиксация 4% раствором формальдегида

4%

Количество клеток в 1 мл суспензии при инкубации с антителами 1млн. От 100 тыс. до 1 млн. клеток/мл

500 тыс.

100 тыс.

Количество клеток, анализируемое на проточном цитоф-луориметре 5 тыс. От 1 до 5 тыс. клеток

3 тыс.

1 тыс.

Пермеабилизация клеток 1% ■ раствором Т\уееп 20 В аликвотах суспензии клеток (по 100 мкл) Пермеабилизация в общем объеме суспензии клеток

В общем объеме суспензии клеток

Количество отмывок клеток от пермеабилизирующего агента фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1:10 1 Одна отмывка клеток фосфатным буфером после пермеаби-лизации

2

Количество отмывок клеток после первичных и вторичных антител фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1:20 3+3 2 отмывки клеток фосфатным буфером после инкубации с вторичными антителами

0+2

0+1

Продолжительность инкубации с первичными и вторичными антителами 30 мин. и 30 мин. Инкубация с первичными антителами в течение ночи, инкубация с вторичными - 1,5ч.

1,5 ч. и 1,5ч.

Ночь и 1,5ч.

Количество моноклональных антител к ЭРр 0,3; 0,6; 1,2; 2,5; 5,0; 7,5 и 10 мкг/мл Для референсной культуры клеток \lCF-7 - 0,6; 1,2 и 2,5; при клинической оценке - 1,2; 2,5 и 5,0 мкг/мл

Количество моноклональных антител к ЭРр1 Разведения коммерческого раствора 1:400; 1:200; 1:100; 1:50; 1:25; 1:18; 1:12 Для референсной культуры клеток МСР-7 - разведения коммерческого раствора 1:200; 1:100 и 1:50; при клинической оценке- 1:100; 1:50; 1:25

Сравнительный анализ показателей экспрессии ЭРр и ЭРР1 в опухолевой ткани легкого при использовании разных моноклональных антител

В ходе экспрессии гена ЭР/3 образуются различные изоформы белка, единственной полноразмерной формой из которых являются ЭРРь имеющие сайт связывания с лигандами. На сегодняшний день оценку статуса ЭРР проводят как с помощью антител к ЭРр|, так и с использованием антител к совокупности изоформ рецептора. Насколько это верно, и какие антитела следует использовать, было определено при сравнительной оценке статуса ЭРр в ткани немелкоклеточного рака лёгкого (НМРЛ) с использованием антител обоих типов.

Статистически значимых различий между медианами уровня экспрессии ЭРр и ЭРР| в ткани НМРЛ обнаружено не было (30% и 42%, соответственно). Напротив, средняя интен-

10

сивность эрр, в 1,7 раза выше показателя ЭРр. Получение таких результатов может быть связано с различиями в структуре используемых антител и характера их взаимодействия с вторичными антителами. Однако оказалось, что при этом распределение больных по группам в зависимости от количественных показателей экспрессии ЭРр не зависят от типа используемых антител (табл.2).

Таблица 2

Распределение больных немелкоклеточным раком легкого по группам в зависимости _от уровня и интенсивности экспрессии ЭРР и ЭРР, в опухолевой ткани

Показатели экспрессии эстро-геновых рецепторов

Доля проанализированных образцов (%)

ЭР(3(п=32)

ЭРР, (п=32)

Низкий (11 - 29%)

Уровень экспрессии эстрогеновых рецепторов

(различия по I - критерию Стьюдента)

Умеренный (30 - 49%)

Высокий (50% и более)

44%

38%

18%

35%

26%

39%

Низкая (менее 2,0 отн.ед.)

Интенсивность экспрессии эстрогеновых рецепторов

>0,05

>0,05

>0,05

Высокая (2,0 отн.ед. и более)

59%

61%

41%

39%

>0,05

>0,05

Кроме того, при использовании любых антител выявлены сходные различия в показателях экспрессии ЭРр в ткани НМРЛ среди пациентов мужского и женского пола: у женщин средний уровень ЭРр был в 1,4 раза выше.

Учитывая эти данные, для сравнительной характеристики экспрессии ЭРР в опухолевой ткани пациентов с различным течением болезни или клинико-морфологическими особенностями опухоли могут быть использованы антитела, специфичные как к тотальной фракции ЭРР, так и к мажорной полноразмерной изоформе рецепторов ЭРР[. В настоящей работе использовали антитела к тотальной фракции ЭРр.

Характеристика количественных показателей экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ)

Экспрессия ЭРР выявлена у 94% исследованных пациентов. Средний показатель уровня экспрессии маркёра по группе обследованных больных составил 38,3±17,1% (от 11% до 77%) при среднем показателе интенсивности экспрессии ЭРр 2,5±1,2 отн. ед. (от 1,2 до 6,5 отн. ед.).

Частота встречаемости опухолей с низким, умеренным и высоким уровнем экспрессии ЭРр была практически одинаковой и составила 39%, 29% и 32% случаев соответственно (рис. 2).

По количеству случаев с разной интенсивностью экспрессии ЭРр исследованные опухоли разделились на две практически равные группы. 57% составили опухоли с высокой интенсивностью экспрессии ЭРр, 43% - с низкой интенсивностью экспрессии ЭРр.

Обсуждая полученные результаты в связи с возможностью применения гормональной терапии немелкоклеточного рака лёгкого и оценивая масштаб применения новой стратегии лечения опухолей этой локализации считаем, что реальными претендентами на проведения такой терапии (по аналогии с раком молочной железы - в адъювантном режиме) могут быть пациенты с высоким и умеренным уровнем экспрессии мишени антиэстрогенов. По нашим данным количество опухолей с таким уровнем экспрессии ЭРр составляет 61%, то есть около 2/3 пациентов с немелкоклеточным раком лёгких.

На следующем этапе исследования мы попытались последовательно выяснить, одинаковы ли шансы на проведение антиэстрогеновой терапии среди этой группы в зависимости от пола и статуса курильщика пациента, а также гистологического типа опухоли.

Экспрессия ЭРр в ткани немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) у

Показано, что у женщин уровень экспрессии ЭРр в опухолевой ткани выше, чем у мужчин. Так, медиана показателя у женщин почти в 2 раза превышает значение у мужчин -50 и 31%, соответственно (р=0,008). Экспрессия ЭРр на низком уровне в 3,3 раза чаще выявлялась у пациентов мужского пола по сравнению с женщинами (р<0,05). Высокий уровень маркёра, напротив, встречался в 2 раза реже (р<0,05) в опухолевой ткани у мужчин - 29% и 53%, соответственно (рис. 3).

29% Рис- 2. Распределение образцов

НМРЛ по группам в зависимости от уровня экспрессии ЭРр в опухолевой ткани

32%

мужчин и женщин

Рис. 3. Распределение больных НМРЛ по группам в зависимости от уровня экспрессии ЭРр в опухолевой ткани у мужчин (Н ) и женщин (С] )

* - достоверные различия между показателями экспрессии в группах

Однако полученные результаты не позволяют утверждать, что именно пол является причиной выявленных различий. Среди женщин большинство не курили, и страдали адено-карциномой легкого. В то же время практически все включённые в исследование мужчины курили и в 65% случаев у них диагностирован плоскоклеточный рак легкого. Возможная связь этих факторов с описанными тендерными различиями в экспрессии ЭРр в опухолевой ткани лёгкого исследована в следующих разделах работы.

Экспрессия ЭРр в ткани аденокарциномы легкого у некурящих пациентов разного пола

При сравнении показателей экспрессии ЭРр в группах некурящих пациентов - мужчин и женщин с аденокарциномой легкого получены следующие результаты.

Среднее значение уровня экспрессии ЭРр в ткани аденокарциномы некурящих мужчин и женщин составило 50,8±13,5% и 50,5±16,3%, соответственно (р=0,968). Медианы показателя у мужчин и женщин совпадают (51%). Показатели средней интенсивности экспрессии ЭРр в группах сравнения составили 3,4±0,9 отн. ед. против 3,1±1,6 отн. ед. (р=0,3б7).

Таблица 3

Распределение опухолевых образцов по группам в зависимости от показателей экспрессии ЭРр в ткани аденокарциномы легкого некурящих пациентов разного пола

Показатели экспрессии ЭРр Доля проанализированных образцов (%) Р (различия по X - критерию Стью-дента)

Мужчины (п=б) Женщины (п=17)

Уровень экспрессии ЭРр

Низкий (11 - 29%) 0 6 >0,05

Умеренный (30 - 49%) 40 35 >0,05

Высокий (50% и более) 60 59 >0,05

Интенсивность экспрессии ЭРр

Низкая (менее 2,0 отн. ед.) 33 24 >0,05

Высокая (2,0 отн.ед. и более) 67 76 >0,05

Распределение больных в зависимости от уровня и интенсивности экспрессии ЭРР было практически одинаковым в исследованных группах сравнения (табл. 3), при этом как у

13

низкий умеренный высокий

мужчин, так и у женщин у большей части пациентов (в 60% и 59% случаев, соответственно) маркер экспрессируется на высоком уровне.

Таким образом, половая принадлежность не является фактором, определяющим уровень экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака лёгкого.

Экспрессия ЭРр в опухолевой ткани курящих и некурящих мужчин с различным гистологическим типом рака легкого

Исследование корреляции показателей экспрессии ЭРр в ткани НМРЛ с гистологическим типом опухоли проведено на группах курящих и некурящих мужчин.

Курящие и некурящие мужчины с плоскоклеточным раком легкого имеют одинаковую медиану экспрессии ЭРР - 28% и 29%, соответственно (р=0,976). Интенсивность экспрессии маркера в этих группах сравнения тоже не различается (р=0,917).

Статус курильщика не влияет на частоту встречаемости опухолей с низким уровнем экспрессии ЭРр - 58% и 57% курящих и некурящих пациентов, соответственно (табл. 17). И умеренный, и высокий уровни экспрессии рецепторов в опухолевой ткани курильщиков и некурящих мужчин обнаруживались с одинаковой частотой: 28% уб 29% и 14% уб 14%, соответственно (р>0,05).

Распределение больных по интенсивности экспрессии ЭРР среди пациентов сравниваемых групп было одинаковым: низкая и высокая интенсивность экспрессии маркёра выявлена приблизительно в 60% и 40% случаев, соответственно (р>0,05) (табл. 4).

Таким образом, можно сделать вывод, что среди мужчин с плоскоклеточным раком легкого курение не влияет на экспрессию ЭРр в опухолевой ткани.

Закономерности, полученные для пациентов с плоскоклеточным раком легкого, необходимо было подтвердить при анализе больных аденокарциномой легкого. Поэтому сравнили экспрессию ЭРр в опухолевой ткани курящих и некурящих мужчин с аденокарциномой легкого.

_ Таблица 4 Распределение образцов плоскоклеточного рака легкого курящих и некурящих мужчин _в зависимости от показателей экспрессии ЭРр в опухолевой ткани

Показатели экспрессии ЭРр

Доля проанализированных образцов (%)

Курят (п=43) | Не курят (п=7)

Низкий (11 -29%)

Умеренный (30 - 49%)

Высокий (50% и более)

Уровень экспрессии ЭРВ

Р

(различия по I - критерию Стьюдента)

58

28

14

57

29

14

Низкая (менее 2,0 отн.ед.)

Интенсивность экспрессии ЭРР

>0,05

>0,05

>0,05

Высокая (2,0 отн.ед. и более)

58

42

57

43

>0,05

>0,05

В целом, курение ассоциировалось с незначительным и статистически незначимым понижением показателей экспрессии маркера в ткани аденокарциномы. Так, у курильщиков средний уровень ЭРр составил 43,1±16,4%, а у некурящих - 50,8±13,5% (р=0,332). Аналогично, средняя интенсивность экспрессии ЭРР составила 3,4±0,9 и 2,7±1,2 отн. ед. у тех, кто не курит и у курящих, соответственно (р=0,219).

Различий во встречаемости опухолей с низким, умеренным и высоким уровнем, а также высокой и низкой интенсивностью экспрессии ЭРр между курящими и некурящими мужчинами с аденокарциномой не выявлено (табл. 5).

Таблица 5

Распределение образцов аденокарциномы легкого курящих и некурящих мужчин _в зависимости от показателей экспрессии ЭРР в опухолевой ткани_

Показатели экспрессии ЭРр Доля проанализированных образцов (%) Р (различия по 1 - критерию Стьюдента)

Курят (п= 19) | Не курят (п=6)

Уровень экспрессии ЭРВ

Низкий (11 -29%) 28 0 <0,05

Умеренный (30 - 49%) 28 40 >0,05

Высокий (50% и более) 44 60 >0,05

Интенсивность экспрессии ЭРВ

Низкая (менее 2,0 отн.ед.) 33 33 >0,05

Высокая (2,0 отн.ед. и более) 67 67 >0,05

Таким образом, курение не влияет на экспрессию ЭРр в ткани немелкоклеточного рака лёгкого.

Сравнительный анализ экспрессии ЭРр в ткани плоскоклеточного

рака и аденокарциномы легкого у мужчин

При сравнении показателей экспрессии ЭРР в ткани немелкоклеточного рака лёгкого в зависимости от гистологического типа опухоли получены следующие результаты.

Выявлено, что медиана уровня экспрессии ЭРр более чем в 1,5 раза выше в ткани аденокарциномы лёгкого по сравнению с плоскоклеточным раком (48% уб 29%, р=0,001). Интенсивность экспрессии маркера также выше в ткани аденокарциномы, чем в плоскоклеточном раке: 2,5 отн. ед. уэ 1,8 отн. ед (р=0,002).

Кроме того, среди больных аденокарциномой легкого по сравнению с плоскоклеточным раком почти в 3 раза чаще встречаются опухоли с экспрессией маркёра на высоком уровне - 44% уэ 14%, соответственно (р<0,05) (рис. 4). И наоборот, низкий уровень экспрессии ЭРр в 2 раза чаще встречается в ткани плоскоклеточного рака, чем аденокарциномы - в 58% и 28% случаев, соответственно (<0,05).

р<0,05 Рис. 4. Распределение мужчин с плос-

— в зависимости от уровня экспрессии _ ЭРр в опухолевой ткани

* - достоверные различия между показателями экспрессии в группах.

карциномой (□) легкого по группам

коклеточным раком (В) и адено-

низкий умеренный высокий

Таким образом, в ткани аденокарциномы по сравнению с плоскоклеточным раком легкого показатели экспрессия ЭРр выше.

Завершая этот раздел исследования можно заключить, что пол пациента и статус куре-

кого ассоциирован с экспрессией этого маркёра: в ткани аденокарциномы показатели экспрессии ЭРр выше по сравнению с плоскоклеточным раком. Тот факт, что у женщин опухолевая ткань лёгкого характеризуется более высокими показателями экспрессии ЭРр по сравнению с мужчинами, есть отражение того, что преобладающим гистологическим вариантом у пациенток женского пола является аденокарцинома.

Сравнительная оценка экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака (НМРЛ) и окружающей нормальной ткани легкого

Показано, что ЭРр экспрессируются не только в ткани немелкоклеточного рака легкого, но и в окружающей нормальной ткани. При этом уровень экспрессии маркера в нормальной и опухолевой ткани каждого больного в 44% случаев совпадает, у 39% больных - в опухоли выше, чем в окружающей ткани, а у 17%, наоборот, - ниже. В целом по группе, среднее значение уровня ЭРР в ткани немелкоклеточного рака легкого незначительно и статистически незначимо выше, чем в окружающей ткани - 34,1±15,2% уя 29,2±12,1%, соответственно (р=0,237). Частота встречаемости различных показателей экспрессии ЭРр, выявляемых нормальной и опухолевой ткани, также совпадает (р>0,05 для всех пар сравнения).

Более того, в отличие от выявленной повышенной экспрессии ЭРр в ткани аденокарциномы по сравнению с плоскоклеточным раком легкого, ткань легкого, окружающая опухоли разных гистологических типов, имеет сходные средние значения и медианы уровня и интенсивности экспрессии ЭРр, а также одинаковую частоту встречаемости разного уровня экспрессии маркёра (р>0,05 во всех случаях).

Таким образом, не выявлено корреляции между экспрессией ЭРР в ткани немелкоклеточного рака и в окружающей нормальной ткани лёгкого, что позволяет предположить от-

ния не оказывают влияния на экспрессию ЭРр, тогда как гистологический тип опухоли лёг-

сутствие предопределенности эстрогенового статуса опухоли от показателей экспрессии маркера в нормальной ткани органа.

Экспрессия ЭРр в ткани метастазов в легких опухолей другой первичной локализации

Показано, что в 91% случаев в ткани метастазов выявляются ЭР(3. Медиана уровня экспрессии ЭРр в метастатической ткани составляет 31%, а интенсивности - 1,7 отн. ед. При этом низкий уровень ЭРр выявлен в 43% образцов метастатической ткани, умеренный - в 45%, высокий - в 12% случаев (рис. 5).

Рис. 5. Распределение образцов метастатической ткани легкого по группам в зависимости от уровня экспрессии ЭРр в опухолевой ткани

12%

Доля образцов с высоким уровнем экспрессии ЭРр выше в группе немелкоклеточного рака легкого по сравнению с метастатическим поражением легких (32% против 12%). Тем не менее, по аналогии с первичным раком легкого, считаем, что более половины (57%) пациентов с высокой и умеренной экспрессией ЭРр в метастатической ткани лёгкого также являются претендентами на проведение антиэстрогеновой терапии в адъювантном режиме.

Итак, в рамках данной работы был разработан новый методический подход с использованием прецизионной проточной цитофлуориметрии к количественной иммунофлуорес-центной оценке статуса ЭРр в ткани солидных опухолей человека. С помощью новой методологии исследован статус этого маркёра в ткани немелкоклеточного рака, нормальной ткани лёгкого и метастазов в лёгком. Наряду с новыми фундаментальными данными обоснована правомочность применения гормональной терапии рака легкого и определены перспективы новой стратегии. Считаем, что есть основания рассчитывать на сходный с раком молочной железы положительный эффект при адъювантном применении антиэстрогенов более чем у половины больных немелкоклеточным раком и метастатическим поражением органа при высокой и умеренной экспрессии 3Pß в опухоли. Наилучший прогноз эффективности антиэстрогеновой терапии немелкоклеточного рака лёгкого у женщин с аденокарциномой лёгкого.

выводы

1. Разработан и защищен патентом РФ иммунофлуоресцентный метод, ассоциированный с проточной цитофлуориметрией для количественной оценки экспрессии ЭРР в солидных опухолях человека.

2. ЭРр экспрессированы в ткани немелкоклеточного рака легкого у 94% пациентов, две трети из которых с уровнем маркёра >30% являются претендентами на проведение адью-вантной антиэстрогеновой терапии.

3. Не обнаружено статистически значимой взаимосвязи между экспрессией ЭРР в опухолевой и окружающей нормальной ткани легкого.

4. Показатели экспрессии ЭРр в ткани немелкоклеточного рака легкого не ассоциированы с полом и статусом Курения пациента.

5. Для ткани аденокарциномы легкого характерны более высокие показатели уровня, интенсивности и частоты экспрессии ЭРр по сравнению с плоскоклеточным раком.

6. В ткани метастазов в лёгких опухолей другой первичной локализации экспрессия ЭРр с уровнем маркёра >30% выявлена у половины пациентов, которые могут являться претендентами на проведение адъювантной антиэстрогеновой терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в российских научных журналах, включенных в перечень ВАК

1. Богуш Т.А. Количественная иммунофлуоресцентная оценка с использованием проточной цитофлуориметрии экспрессии эстрогеновых рецепторов р в солидных опухолях человека / Т.А. Богуш, A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, Э.Э. Жураев, Б.Е. Полоцкий, Г.В. Унгиадзе, М.И. Давыдов // Вестник МГУ, Сер.2 Химия. - 2011. - Т.52. - №4. - С. 305-312.

2. Шатурова A.C. Экспрессия эстрогеновых рецепторов Р и pi в ткани немелкоклеточного рака легкого человека / A.C. Шатурова, Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, Г.Ю. Чемерис, Р.Ю. Рама-наускайте, И.Д. Калганов // Антибиотики и химиотерапия. - 2012. - Т.57. - №5-6. - С. 11-17.

3. Богуш Т.А. Сравнительная оценка экспрессии эстрогеновых рецепторов бета в ткани немелкоклеточного рака легкого и метастазов в легком опухолей других первичных локализаций / Т.А. Богуш, A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, Е.А. Богуш, Б.Е. Полоцкий, С.А. Тюляндин, М.И. Давыдов // ДАН. - 2014. - Т.454. - №6 - С. 720-724.

Статьи в зарубежных рецензируемых научных журналах

4. Bogush Т.А. Quantitative Immunofluorescent Estimation of Estrogen Receptor P Expression in Human Solid Tumors Using Flow Cytometry / T.A. Bogush, A.S. Shaturova, E.A. Dudko, E.E. Juraev, B.E. Polotsky, G.V. Ungiadze, M.I. Davydov // Moscow University Chemistry Bulletin. -2011. - Vol. 66. - N 4. - P. 253-258.

5. Bogush T.A. Comparative assessment of the estrogen receptor ß expression in the tissues of non-small cell lung carcinoma and lung metastases of tumors of other primary localizations / T.A. Bogush, A.S. Shaturova, E.A. Dudko, E.A. Bogush, B.E. Polotsky, S.A. Tjulandin, M.I. Davydov // Dokl. Biochem. Biophys. - 2014. - Vol. 454. - P. 29-33.

Патенты

6. Патент № 2429481, РФ, 20.09.2011. «Способ иммунофлуоресцентного анализа эстрогеновых рецепторов ß в солидных опухолях человека» / Богуш Т.А., Шатурова A.C., Дудко Е.А., Полоцкий Б.Е., Тюляндин С.А., Барышников А.Ю., Давыдов М.И.

Тезисы докладов на отечественных конференциях

7. Шатурова, A.C. Оптимизация иммунофлуоресцентного анализа эстрогеновых рецепторов методом проточной цитофлуориметрии / A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, О.С. Бурова, Т.А. Богуш // Мат. науч. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9. - №2, - С.83-84.

8. Шатурова, A.C. Применение проточной цитофлуориметрии для количественной оценки экспрессии эстрогеновых рецепторов ß / A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, Р.Ю. Раманаускайте, С.Д. Коломийцев, Т.А. Богуш // VI Съезд онкологов и радиологов стран СНГ. - Душанбе. -2010.-С.98

9. Шатурова, A.C. Анализ экспрессии эстрогеновых рецепторов ßi в солидных опухолях методом проточной наноцитофлуориметрии / A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, Т.А. Богуш // Мат. науч. конф. «Наноонкология». Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9. - №3, -С.27.

10. Шатурова, A.C. Разработка алгоритма количественной клинической оценки эстрогеновых рецепторов ß / A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, Т.А. Богуш, Э.Э. Джураев, К.К. Лактионов, Б.Е. Полоцкий // Мат. науч. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10. - № 1, - С.68.

11. Дудко, Е.А. Экспрессия эстрогеновых рецепторов ß в ткани немелкоклеточного рака легкого / Е.А. Дудко, A.C. Шатурова, А.Е. Булысов, Э.Э. Джураев, Т.А. Богуш, Б.Е. Полоцкий // Мат. науч. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10. - № 1, - С.22-23.

12. Шатурова, A.C. Половые различия экспрессии эстрогеновых рецепторов бета в ткани немелкоклеточного рака легкого / A.C. Шатурова, Е.А. Дудко, Т.А. Богуш // Электронные конференции ИВТН.ги. - 2013.

13. Богуш, Т.А. Сравните льная оценка экспрессии эстрогеновых рецепторов бета в ткани немелкоклеточного рака лёгкого и метастазов в лёгком опухолей другой первичной локализации / Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, A.C. Шатурова, А.Б. Равчеева, A.B. Конухова, Б.Е. Полоц-

кий // Мат. науч. конф. «Противоопухолевая терапия: от эксперимента к клинике». Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т.13. - №1, - С.65.

Тезисы докладов на зарубежных конференциях

14. Bogush, Т.A. Estrogen receptor beta as a target for antiestrogen therapy in non-small cell lung cancer - gender differences / T.A. Bogush, A.S. Shaturova, E.A. Dudko, E.A. Bogush, E.E. Ju-raev, S.A. Tjulandin, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // 6th International Symposium on Targeted Anticancer Therapies. - Paris. - 2011.- Abstr. F04.

15. Bogush, T.A. Estrogen receptor beta in non-small cell lung cancer as a molecular target for antiestrogen therapy - expression and gender differences / T.A. Bogush, A.S. Shaturova, E.A. Dudko, E.A. Bogush, E.E. Juraev, S.A. Tjulandin, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // 14th World Conference on Lung Cancer. - Amsterdam. - 2011. - Abstr. p.2.154.

16. Bogush, T.A. Estrogen receptors alpha and beta as targets for non-small cell lung cancer hormonal therapy / T.A. Bogush, E.A. Dudko, A.S. Shaturova, M.V. Tikhomirov, E.A. Bogush, S.A. Tjulandin, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // Materials of scient. conf. « Worldwide Innovative Networking (WIN) Symposium». Ann. Oncol. - 2012. - Vol. 23. - Suppl. 5. - P. 27.

17. Shaturova, A.S. Gender differences of estrogen receptor beta expression in non-small cell lung cancer / A.S. Shaturova, E.A. Dudko // EAFO Global Oncology Forum. - Moscow. - 2012,- Abstr. p.56.

18. Dudko, E.A. Gender differences of estrogen receptor beta expression in non-small cell lung cancer / E.A. Dudko, A.S. Shaturova, G.B. Smimova, T.A. Bogush, B.E. Polotsky, S.A. Tjulandin M.I. Davydov // Materials of scient. conf. « 5th Latin American Conference on Lung Cancer». J Thorac Oncol. - 2012. - Vol. 7. - Suppl. 2. - P. S142-S143.

19. Shaturova, A.S. Perspectives of antiestrogen therapy in non-small cell lung cancer patients / A.S. Shaturova, E.A. Dudko // World Cancer Congress. - Montreal. - 2012.

20. Shaturova, A.S. Comparative analysis of estrogen receptor beta expression in non-small cell lung cancer by using different antibodies / A.S. Shaturova, S.D. Kolomiytsev // Materials of scient. conf. «European Conference of Oncology Pharmacy ». EJOP. - 2012. - Vol. 6. - №2. - Suppl. 1. -Abstr. 53.

21. Bogush, T. Flow cytometry estimation of tumor estrogen receptor beta in non-small cell lung cancer female and male patients / T. Bogush, E. Dudko, A. Shaturova, B. Polotsky, S. Tjulandin, M. Davydov // 21st ICACT International Congress On Anti-Cancer Treatment. - Paris. - 2013. - P. 307.

22. Tikhomirov, M.V. Flow cytometry estimation of tumor multidrug resistance transporters Pgp and MRP1 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC) / M.V. Tikhomirov, T.A. Bogush, N.P. Petrova, A.S. Shaturova, E.A. Bogush, B.E. Polotsky, M.I. Davydov // Materials of scient. conf. «WIN 2013 Simposium». Ann. Oncol. - 2013. - Vol. 23. - P.20.

conf. «WIN 2013 Simposium». Ann. Oncol. - 2013. - Vol. 23. - P.20.

23. Bogush, T.A. Estrogen receptor beta expression in non-small cell lung cancer and lung metastases of different primary tumors / T.A. Bogush, A.S. Shaturova, E.A. Dudko, E.A. Shestakova, B.E. Polotsky, S.A. Tjulandin, M.I. Davydov // WIN 2014 Symposium. - Paris. - 2013. - P2.12.

24. Bogush, T.A. Perspectives of antiestrogen therapy in non-small cell lung cancer (NSCLC) based on estrogen receptor beta expression in tumor tissue / T.A. Bogush, E.A. Dudko, A.S. Shaturova, R.J. Ramanauskaite, B.E. Polotsky, S.A. Tjulandin, M.I. Davydov // Materials of scient. conf. « EACR 23 Congress ». Eur. J. Cancer. - 2014. - Vol. 50. - Suppl. 5. - P. S208.

Подписано в печать 15. о 7.15 Формат 60x84/16. Бумага офисная «Буе1дСору». Тираж 100 экз. Заказ № 397 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России 115478, г. Москва, Каширское ш., 24