Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Экспрессия MYC и BCL2 у больных диффузной B-крупноклеточной лимфомой

На правах рукописи

Мисюрина Анна Евгеньевна

ЭКСПРЕССИЯ МУС и ВСЬ2 У БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМОЙ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

8 АПР 2015

МОСКВА-2015

005566933

005566933

"Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Гематологический Научный Центр» Министерства Здравоохранения Российской

Федерации

Научные руководители:

Ковригина Алла Михайловна, доктор биологических наук, профессор кафедры патологической анатомии, цитологии и молекулярной патологии ФГБОУ Института повышения квалификации ФМБА РФ, заведующая патологоанатомическим отделением ФГБУ ГНЦ МЗ РФ

Барях Елена Александровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник научно-клинического отделения химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ

Официальные оппоненты:

Тумян Гаяне Сепуговна, доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии государственного бюджетного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» МЗ РФ, ведущий научный сотрудник отделения химиотерапии гемобластозов ФГБНУ «Российский Онкологический Научный Центр им. Н. Н. Блохина» МЗ РФ

Банков Вадим Валентинович, доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии, зав. лабораторией патоморфологии НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева»

Защита состоится «3» пюня 2015 года в 13:00 на заседании диссертационного совета Д 208.13S.0l при ФГБУ «Гематологический Научный Центр» МЗ РФ по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «Гематологический Научный Центр» МЗ РФ

Автореферат разослан ¿¿лА^^ 2015 г.

МЗРФ

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Буланов Андрей Юльевич

Актуальность работы

Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ) составляет 40 % от всех неходжкинских лимфом. Согласно определению Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) 2008 года в рамках нозологической формы ДВККЛ объединены опухоли с диффузным характером роста, представленные преимущественно крупными В-клетками, размер ядра которых сопоставим с размером ядра макрофага, либо в два раза превышает размер ядра лимфоцита [Н. Swerdlow, 2008]. ДВККЛ характеризуется разнообразием морфологических, иммунофенотипических, молекулярно-генетических характеристик, гетерогенностью клинического течения, прогноза заболевания и ответа на химиотерапию. Больные ДВККЛ разделяются на группы риска на основании клинических характеристик, в частности международного прогностического индекса (МПИ), наличия конкордантного поражения костного мозга [.М.А. Shipp, 1993; J. Campbell, 2006]. Среди факторов прогноза, характеризующих биологические особенности опухоли, принято выделять молекулярные типы ДВККЛ (ABC и GCB) и их иммуногистохимические аналоги - GCB/non-GCB подгруппы [С.Р. Hans, 2004; М. Frick, 2012]. Тем не менее, данное разделение не полностью отражает связь с выживаемостью больных, свободной от заболевания. Поиск новых прогностических маркеров, изучение механизмов патогенеза ДВККЛ в настоящее время остается актуальным.

Транслокации с участием генов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и созревание В-лимфощгтов, в частности, гена c-MYC, или c-MYC в сочетании с перестройками генов BCL2 и/или BCL6 (double и triple-hit лимфомы), ассоциируются с агрессивным клиническим течением ДВККЛ и неудовлетворительным ответом на «стандартную» химиотерапию по протоколу R-CHOP-21 [S.Z.. Barrans, 2010; S. Li, 2012]. Механизмы, приводящие к гиперэкспрессии каждого из генов (транслокации, амплификация, нарушение регуляции на уровне микроРНК), а также их клиническая значимость остаются областью исследования по настоящее время [Я. Mossaffa, 2006; Е. Leucci, 2008; A. Onnis, 2010; X. Zhang, 2012; A. Valera, 2013; А. Tzankov, 2014]. Учитывая то обстоятельство, что именно белок является конечным эффектором, реализующим функции гена, у больных ДВККЛ целесообразно

исследование количественных параметров экспрессии белков, контролирующих различные этапы развития лимфоидной В-клетки.

За последние три года всплеск интереса международных исследователей относится к выделению иммуногиетохимичеекой double-expressor (DE) MYC+/BCL2+ лимфомы, которая выявляется в среднем в 20% наблюдений и характеризуется неблагоприятным прогнозом при применении химиотерапии по схеме R-CHOP-21 [Я. Horn, 2012; Т.М. Green, 2012; N.A. Johnson, 2012; S. Ни, 2012; A. Valera, 2013; A.M. Perry, 2014]. При интенсификации режима терапии (R-DA-EPOCH) прогностическая значимость коэкспрессии MYC/BCL2 получена только в non-GCB иммуногиетохимичеекой подгруппе [К. Dunleavy, 2013]. Столь агрессивное поведение опухоли может быть обусловлено синергизмом воздействия онкогенов [A. Fanidi, 1992; J. Zhaolhui, 2006].

В ФГБУ «Гематологический Научный Центр» (ГНЦ) МЗ РФ с 2004 года для лечения больных ДВККЛ группы высокого риска разработан и применяется оригинальный протокол интенсивной химиотерапии m-NHL-BFM-90, показавший по данным одноцентрового наблюдения более высокую эффективность в сравнении с программой СНОР-21 ± R в группе ДВККЛ с признаками неблагоприятного прогноза (5-летняя общая выживаемость (OB) 70 % - по данным ГНЦ, v.? 26-42 % - согласно мировым данным) [М.А. Shipp, 1993; А. У. Магомедова, 2006]. Вместе с тем, у -30 % больных наблюдаются случаи резистентного течения заболевания, или развиваются рецидивы. Роль биологических факторов, регулирующих различные этапы созревания и дифференцировки B-лимфоцитов, таких, как экспрессия MYC и BCL2 остается неуточненной.

Цель работы

Анализ влияния экспрессии MYC и BCL2, а также коэкспрессии MYC/BCL2 на клинический исход заболевания у больных ДВККЛ, получавших лечение по протоколу интенсивной химиотерапии m-NHL-BFM-90 ± R.

Задачи исследования

1. Оценить частоту встречаемости экспрессии MYC и BCL2, коэкспрессии MYC/BCL2 опухолевыми клетками у больных ДВККЛ.

2. Оценить связь экспрессии одного из белков МУС и BCL2 или коэкспрессии MYC/BCL2 с клиническими и демографическими факторами у больных ДВККЛ (пол, возраст, статус по шкале ECOG, B-симптомы, вовлечение экстранодальных областей, стадия заболевания по Ann Arbor, активность лактатдегидрогеназы, международный прогностический индекс).

3. Проанализировать частоту встречаемости экспрессии одного из белков МУС и BCL2 или коэкспрессии MYC/BCL2 в GCB или non-GCB иммуногистохимической подгруппе ДВККЛ.

4. Сопоставить уровень экспрессии одного из белков МУС и BCL2 или коэкспрессии MYC/BCL2 с цитогенетическими данными об аномалиях генов c-MYC и BCL2 (согласно данным стандартного онтогенетического исследования или fluorescence in situ hybridization), уровнями экспрессии мРНК кодирующих генов.

5. Проанализировать эффективность терапии m-NHL-BFM-90 ± R у больных ДВККЛ в зависимости от экспрессии белков МУС и BCL2.

Научная новизна

1. Данное исследование является первой работой в Российской Федерации, посвященной исследованию частоты встречаемости экспрессии белков МУС и BCL2 у больных ДВККЛ, проходивших лечение по протоколу m-NHL-BFM-90 ± R.

2. Впервые охарактеризованы клинические (пол, возраст, статус по шкале ECOG, B-симптомы, вовлечение экстранодальных областей, стадия заболевания по Ann Arbor, активность лактатдегидрогеназы, международный прогностический индекс), и лабораторные (принадлежность к GCB/non-GCB-иммуногистохимической подгруппе, уровень пролиферативной активности Ki-67) характеристики больных ДВККЛ в зависимости от экспрессии МУС и BCL2. Выявлено, что DE (MYC+/BCL2+) ДВККЛ (пороговые значения для экспрессии МУС > 40%, для BCL2 > 50%) чаще встречается в non-GCB, чем в GCB иммуногистохимической подгруппе (29 % vi 17 %, Р = 0,18).

3. Впервые в мировой практике проведено сопоставление данных об экспрессии МУС и BCL2 с эффективностью лечения больных ДВККЛ по протоколу интенсивной химиотерапии. Выявлено независимое прогностическое значение коэкспрессии MYC/BCL2, увеличивающее риск развития рецидива/прогрессирования

заболевания у больных ДВККЛ, проходивших лечение по интенсивному протоколу ш-NHL-BFM-90 ± R.

4. Проведено сопоставление данных стандартного цитогенетического исследования и fluorescence in situ hybridization с данными об экспрессии MYC и BCL2. Перестройка гена c-MYC выявлена у одного больного, что сопровождалось экспрессией кодируемого белка выше порогового значения. Перестройка гена BCL2 не выявлена ни в одном случае. У 18 из 50 случаев (36 %) в отсутствие перестройки гена c-MYC выявлена экспрессия белка MYC выше порогового значения. В 27 из 43 (63 %) случаев в отсутствие перестройки гена BCL2 выявлена экспрессия белка BCL2 выше порогового значения. Полученные данные подчеркнули высокую частоту встречаемости экспрессии белков MYC и BCL2 опухолевыми клетками выше пороговых значений у больных ДВККЛ в отсутствии перестроек кодирующих генов.

5. Проведено сопоставление экспрессии мРНК генов c-MYC и BCL2 с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени, выполненной на материале парафиновых блоков биоптатов опухоли, с данными об экспрессии MYC и BCL2 при использовании иммуногистохимического метода у больных ДВККЛ. Выявлена корреляция результатов иммуногистохимического метода определения экспрессии MYC с данными определения количества мРНК гена c-MYC.

Практическая значимость работы

Выявлена прогностическая значимость коэкспрессии белков MYC/BCL2 у больных ДВККЛ, получавших терапию по интенсивному протоколу m-NHL-BFM-90 ± R (пороговые значения для MYC и BCL2 > 40 %, и > 50 %, соответственно).

Использование молекулярно-биологических характеристик опухолевой ткани, включающих определение экспрессии белков MYC и BCL2 иммуногистохимическим методом, рекомендуется для включения в диагностический алгоритм в целях стратификации больных ДВККЛ по группам риска развития рецидива/прогрессирования заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Коэкспрессия MYC/BCL2 (пороговые значения экспрессии для MYC и

BCL2 > 40 % и > 50 %, соответственно) увеличивает риск развития рецидива/

прогрессирования ДВККЛ у больных, получающих интенсивную химиотерапию по протоколу ш-ЫНЬ-ВРМ-90 ± Я.

2. Экспрессия одного из белков МУС > 40 % или ВСЬ2 > 50 % не увеличивает риск развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ у больных, получающих лечение по протоколу т-ЫНЬ-ВРМ-90 ± Я. Экспрессия МУС > 40 % не оказывает негативного влияния на показатели общей выживаемости у больных ДВККЛ, получающих интенсивную химиотерапию по протоколу т-1ЧНЬ-ВРМ-90 ± Я.

3. Учитывая выявленную частоту коэкспрессии МУС/ВСЬ2 в исследуемой группе (24%), определение параметров экспрессии и коэкспрессии МУС и ВСЬ2 при ДВККЛ следует включать в диагностический алгоритм обследования больных. Вероятность обнаружения коэкспрессии МУС/ВСЬ2 выше у больных ДВККЛ старшей возрастной группы (> 60 лет).

4. Частота выявления коэкспрессии МУС/ВСЬ2 выше у больных ДВККЛ поп-ССВ иммуногистохимической подгруппы.

5. Экспрессия МУС и ВСЬ2 обнаруживается с высокой частотой в отсутствии перестроек кодирующих генов. Уровень экспрессии белка МУС коррелирует с экспрессией мРНК гена с-МУС, в том числе при отсутствии перестройки гена с-МУС.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены в докладе на конференции с международным участием «Лейкозы и лимфомы», Москва 2014 г.

Личный вклад автора.

Автор участвовала в разработке дизайна исследования, проводила выполнение всех этапов работы: ведение пациентов, лабораторные исследования (иммуногистохимическое и цитогенетическое), обобщение, интерпретацию статистических данных, обсуждение результатов исследования, формирование выводов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах и состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов, списка литературы, включающего 7 отечественных и 207 зарубежных источников, а также 4 приложения (схема протокола m-NHL-BFM-90, шкала оценки соматического статуса ECOG, классификация Ann Arbor, критерии оценки противоопухолевого ответа российских клинических рекомендаций по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний). Иллюстративный материал представлен в виде 23 рисунков и 12 таблиц.

Диссертационная работа выполнена в научно-клиническом отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии ФГБУ Гематологического Научного Центра МЗ РФ (зав. отд. к.м.н. Кравченко С.К.), патологоанатомическом отделении ФГБУ Гематологического Научного Центра МЗ РФ (зав. отд. д.б.н. Ковригина A.M.), в научно-клинической лаборатории кариологии ФГБУ Гематологического Научного Центра МЗ РФ (зав. лаб., к.м.н. Обухова Т.Н.), в лаборатории молекулярной биологии ООО «ГеноТехнология» (ген. директор к.б.н. Мисюрин A.B.), в лаборатории биостатистики ФГБУ Гематологического Научного Центра МЗ РФ (зав. лаб., к.т.н. Куликов С.М.).

Материалы и методы

В исследование включено 62 больных с морфологически и иммуногистохимически подтвержденным диагнозом ДВККЛ согласно критериям ВОЗ, 2008 [Swerdlow, 2008], получавших лечение в ФГБУ ГНЦ МЗ РФ с 2001 по 2014 гг., по протоколу интенсивной химиотерапии m-NHL-BFM-90 ± R (курсы А-В-А-В (4 или 6) или А-В-С-А-В-С или А-С-А-С). Интервалы между курсами - 21 день. В 1-й день каждого курса химиотерапии проводилась профилактика нейролейкемии путем интратекального введения химиопрепаратов. Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток крови (аутоТГСКК) выполнена 5 больным. С целью оценки противоопухолевого ответа использовались критерии, опубликованные в

российских клинических рекомендациях по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний [¡f.В. Поддубная, 2014].

Дополнительным критерием включения было наличие архивного биологического материала для проведения проспективного патоморфологического и цитогенетического анализа. С целью сопоставления частоты встречаемости экспрессии МУС и BCL2, а также клинических характеристик больных с различными вариантами экспрессии МУС и BCL2 в исследование была введена группа сравнения, включившая 13 больных ДВККЛ, получивших лечение СНОР-подобными курсами ± R.

62 больным исследуемой группы оценивали морфологический вариант опухоли при исследовании гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином. С целью верификации диагноза ДВККЛ проводилось иммуногистохимическое исследование с использованием антител к CD3, CD10, CD20, BCL6, MUM1, cyclin Dl, Ki-67. 62 больным исследуемой группы определялась иммуногистохимическая подгруппа опухоли (GCB или non-GCB) на основании алгоритма С.Р. Hans [С.Р. Hans, 2004].

С целью оценки экспрессии белков МУС и BCL2 в опухолевых образцах 75 больным проведено исследование с антителами к с-МУС (моноклональное кроличье антитело, Epitomics, клон Y69) и BCL2 (Dako, клон 124). Проведен двойной «слепой» анализ. Критерии оценки реакции с антителами к с-МУС и BCL2 были выбраны на основании анализа литературных данных, содержащих подробные кпинико-патоморфологические сопоставления с определением диагностически значимого порогового значения экспрессии МУС для ДВККЛ, а также с учетом более ранних опубликованных рекомендаций по оценке экспрессии прогностического маркера BCL2 [У. Chong, 2005; F. Amen, 2007; U. Thunberg, 2009; N.A. Johnson, 2012; S.L. Kendrick, 2014\ K.J. Savage, 2014; D.W. Scott, 2014]. В настоящей работе использованы идентичные клоны антител. При определении оптимального титра антитела и при иммуногистохимических реакциях на серийных срезах, изготовленных из парафиновых блоков биопсийного материала изучаемых групп пациентов, «внешним» позитивным контролем служили окрашенные с антителами к с-МУС препараты опухоли 4 больных лимфомой Беркитга (экспрессия МУС - 95-100 %, интенсивная ядерная реакция). При окрашивании антителами к с-МУС результат считали положительным при пороговом значении экспрессии МУС > 40 %. При окрашивании с антителами к BCL2 результат

считали положительным при пороговом значении экспрессии BCL2 > 50 % (рис. I). Условия демаскировки антигенов, технические аспекты проведения иммуногистохимических реакций были соотнесены с рекомендациями Lunenburg Lymphoma Biomarker Consortium 2009 [L. Colomo, 2003; D. De Jong, 2009].

ШРШШШШШШШ #1111111 шФтшшшшт 'тШттш тт:тшшщ» , - •. > '. MYC>40% . жВ'- ■ MYC<40%

' ■ -'РЦЛ- i / •• • • . . >• v й" * • л Л'- — ■-: -- .. . .. . ■ ' • -.л . . » i■■ : ■■■ ■ , -'Л. •--. . ' • ; •■•. : ■■ ■■ >-> -'; „• - ' : : '». ' • >'':.*• Л'./- ■ • -ВС L2«50% У- г.." •.: • V"; v v

Рис. 1. Лимфатический узел. Реакции с антителами к c-MYC (ядерная экспрессия) и BCL2 (цитоплазматическая экспрессия). Увеличение х 200. Иммуноферментный метод.

Стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ) на суспензии клеток лимфатического узла/опухоли выполнено 19 больным исследуемой группы. 53 больным исследуемой группы выполнялось fluorescence in situ hybridization (FISH) исследование с ДНК-зондом Vysis LSI MYC Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular) для выявления перестройки локуса гена c-MYC. 43 больным - с использованием Vysis LSI BCL2 Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular) для выявления перестройки локуса гена BCL2. Для определения наличия транслокации t(8;14)(q24;q32) 7 больным проводилось исследование с зондом Vysis LSI IGH/MYC/CEP 8 Tri-Color Dual Fusion Probe. В 35 случаях FISH-исследование выполнено на гистологических срезах парафинового блока биоптата опухоли, согласно модифицированной методике [Т.Н. Обухова, 2007]. Гибридизацию выполняли по протоколам фирмы-производителя Vysis для локусспецифичных праймеров и проб (www.vysis.com). Визуализацию сигнала проводили под флюоресцентным

микроскопом Zeiss-Axioscope с использованием тройного фильтра DAPI/ORANGE/GREEN; для оценки реакции с зондом Vysis LSI IGH/MYC/CEP 8 Tricolor Dual Fusion Probe дополнительно использовался фильтр AQUA. В каждом случае анализировали 200 интерфазных ядер с четкими сигналами. При использовании зонда LSI MYC Dual Color Break Apart Rearrangement Probe (Vysis) позитивными (с транслокацией) считали ядра с одним красным сигналом, одним зеленым и одним желтым сигналами. Позитивный результат свидетельствовал о наличии одной из трех перестроек t(8;14)(q24;q32), t(2;8)(pl2;q24), t(8;22)(q24;ql 1). При гибридизация интерфазных ядер нормальных клеток с пробой Vysis LSI BCL2 Break Apart FISH Probe Kit (Vysis) визуализировали две пары перекрывающихся или практически перекрывающихся сигналов оранжевого и зеленого (слитные желтые) сигналы. Другие варианты наблюдались в случае наличия дополнительных генетических аномалий. Для определения границ нормальных значений анализировали 1000 ядер от каждого из 5 здоровых доноров костного мозга для каждой пробы. Границы нормальных значений 0 % для перестройки генов с-МУС и BCL2 - 0,1 %.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (RQ-PCR) выполнена на материале парафиновых блоков биоптатов опухоли/лимфатического узла с целью определения количества мРНК генов с-МУС и BCL2 17 больным исследуемой группы. Для выделения общей РНК использовались реагенты набора RNeasy FFPE Kit (Qiagen, США) согласно инструкции изготовителя. Для получения кДНК использовали реактивы набора «RNA-экстракт-!» (ООО «ГеноТехнология», Россия) по инструкции, предложенной разработчиком. Определение уровня экспрессии генов проводилось с использованием плазмид с клонированным геном в качестве положительного контроля. Уровень экспрессии гена «домашнего хозяйства» ABL был определён для контроля качества выделенной мРНК и для возможности количественной оценки уровня экспрессии генов с-МУС и BCL2. Системы праймеров и зондов для оценки уровня экспрессии с-МУС, BCL2 и ABL были разработаны на основании данных о геномных последовательностях, опубликованных в режиме on-line ресурсом http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Синтез специфических праймеров и зондов был заказан в компании «ДНК-синтез», Россия.

Для сравнения частотных характеристик оценивался критерий х2- При анализе влияния различных факторов риска на результаты лечения использовался стандартный анализ выживаемости (событийный анализ) (критерий Каплана-Мейера, логранговый

11

тест). Результаты считались достоверными при значении Р < 0,05. Многофакторный анализ проведен с помощью Кокс-регрессионной модели. Для математической обработки данных использовалась программа SAS 9.3.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных ДВККЛ исследуемой группы и группы сравнения

В большинстве наблюдений больные исследуемой группы и группы сравнения имели высокий риск согласно МПИ. Больные обеих групп были сопоставимы по основным клиническим характеристикам, за исключением возраста (таблица 1). Медиана возраста больных в группе сравнения была достоверно выше 69 vs 48,5 лет (Р = 0,0001). Это объясняется тем, что пожилые больные с отягощенным соматическим статусом не включались в протокол интенсивной химиотерапии m-NHL-BFM-90 в связи с высоким риском развития фатальных осложнений.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных ДВККЛ в исследуемой группе и группе сравнения.

Клинические параметры Исследуемая группа, л = 62, % Группа сравнения, п= 13,% Р

пол (муж.) 35 (56 %) 5 (38 %) 0,24

медиана возраста, лет 48,5(15 - 73) 69(42-91) 0,0001

ECOG > 2 53 (85 %) 12 (92 %) 0,11

поражение более одной экстранодальной области 38(61 %) 7 (54 %) 0,61

поражение костного мозга 12 (19 %) 4(31 %) 0,36

нейролейкемия 3 (5 %) 0 0,42

В-симптомы 23 (47 %) 6 (60 %) 0,45

активность ЛДГ выше нормы 55 (90 %) 8 (73 %) 0,1

III-IV стадия по Ann Arbor 47 (76 %) 9 (70 %) 0,87

МПИ (3-5) 48 (78 %) 9 (70 %) 0,99

Гистологическое и иммуногистохимическое исследования

В большинстве случаев 47 (78 %) опухоль была представлена крупными клетками с округло-овальными ядрами с морфологией центробластов, примесью иммунобластов в различном соотношении, в 10 (17 %) случаев опухолевый субстрат представлен клетками среднего размера с морфологией центробластов, в 2 (3 %) выявлен иммунобластный морфологический вариант ДВККЛ (рис. 2), в одном случае опухоль образована клетками с морфологией центробластов с многодольчатыми ядрами.

Рис. 2. Лимфатический узел. А - опухоль представлена преимущественно центробластами крупного размера; Б - опухоль представлена центробластами среднего размера; В - иммунобластный вариант ДВККЛ. Увеличение х 630. Окраска гематоксилином и эозином.

Частота встречаемости различных вариантов экспрессии МУС и ВСЬ2 была сопоставима у больных исследуемой группы и группы сравнения (таблица 2). Коэкспрессия МУС/ВСЬ2 выявлена у 15 из 62 (24 %) больных ДВККЛ. Соотношение ССВ/поп-вСВ-подгрупп в исследуемой группе больных составило 24 (39 %) /38 (61

%).

Таблица 2. Иммуногистохимическая характеристика опухоли у больных исследуемой группы и группы сравнения.

Иммуногистохими-ческие параметры Исследуемая группа, и = 62 Группа сравнения, п = 13 Р

МУС > 40 % 24 (39 %) 4(31 %) 0.59

ВСЬ2 > 50 % 36 (58 %) 10(77%) 0,20

МУС+/ВСЬ2- 9 (14,5 %) 0(0) 0,46

МУС-/ВСЬ2- 17(27%) 3 (23 %)

МУС-/ВСЬ2+ 21 (34%) 6 (46 %)

МУС+/ВСЬ2+ 15 (24%) 4(31 %)

В зависимости от наличия или отсутствия экспрессии белка BCL2 в опухолевых образцах больных ДВККЛ выявлены различия по уровню пролиферативной активности Ki-67. Большинство 28/35 (80 %) больных с экспрессией BCL2 > 50 % имели значения маркера Ki-67 менее 90 %, Р = 0,02. В зависимости от наличия или отсутствия экспрессии белка MYC > 40 % по уровню пролиферативной активности Ki-67 значимых отличий выявлено не было.

Сопоставление данных стандартного нитогенетического исследования с экспрессией белков MYC и BCL2

По результатам СЦИ у 19 больных выявлены комплексные нарушения кариотипа. Среди них дополнительная хромосома 8 - в двух случаях (в одном выявлена экспрессия MYC > 40 %); изохромосома 8 в одном (это сопровождалось MYC > 40 % и дополнительным сигналом от локуса гена c-MYC [8q24] по данным FISH-исследования); дериваты хромосомы 8 выявлены в двух случаях (в одном - MYC > 40 %); дериваты хромосомы 14 - в трех. У одного больного выявлена транслокация t(8;14)(q24;q32), дополнительная хромосома 18, что сопровождалось экспрессией MYC 90 %.

Результаты FISH-исследования. Сопоставление с данными иммуногистохимического исследования

FISH исследование с зондом LSI MYC Dual Color Break Apart Rearrangement Probe (Vysis) выполнено 53 больным. Перестройка гена c-MYC, транслокация t(8;14)(q24;q32) выявлена у одного больного, уровень экспрессии белка MYC - 90 %. Двум больным исследование выполнить не удалось ввиду низкого качества парафиновых блоков. В остальных случаях перестройки локуса гена c-MYC [8q24] не обнаружено. У 11 (21 %) больных выявлено от 1 до 4 дополнительных сигналов от локуса гена c-MYC [8q24], FISH исследование с зондом BCL2 Break Apart FISH Probe Kit (Vysis) выполнено 43 больных. Перестройка гена BCL2 [18q21] не выявлена ни в одном наблюдении. У 17 (40 %) больных выявлено от 1 до 4 дополнительных сигналов от локуса гена BCL2 [18q21] (рис. 3). Появление дополнительных сигналов могло быть связано с амплификацией генов c-MYC и BCL2 или полисомией хромосом 8 и 18.

Рис. 3. FISH исследование клеток лимфатического узла с зондом LSI MYC Dual Color Break Apart Rearrangement Probe (Vysis) и BCL2 Break Apart FISH Probe Kit (Vysis). Дополнительные сигналы от гена c-MYC [8q24] и гена BCL2 [ 18q21],

Таким образом, у 18 из 50 случаев (36 %) в отсутствие перестройки гена c-MYC выявлена экспрессия белка MYC выше порогового значения. В 27 из 43 (63 %) случаев в отсутствие перестройки гена BCL2 выявлена экспрессия белка BCL2 выше порогового значения. Полученные данные подчеркнули высокую частоту встречаемости экспрессии белков MYC и BCL2 опухолевыми клетками выше пороговых значений у больных ДВККЛ в отсутствие перестроек кодирующих генов.

Сопоставление экспрессии белков MYC и BCL2, определенной методом иммуногистохимического окрашивания, с данными RQ-PCR

В пересчёте на проценты относительно гена ABL, медиана уровня экспрессии мРНК гена c-MYC составила 1748 % (492 % - 5408 %). Медиана уровня экспрессии мРНК гена BCL2 составила 373 % (87 % - 2600 %). Выявлена тенденция к увеличению количества мРНК гена c-MYC при возрастании значения экспрессии белка MYC (корригированный коэффициент R2 = 0,13, Р = 0,08). В случае перестройки t(8;14)(q24;q32) количество мРНК гена c-MYC было выше медианы (3940 %). Не выявлено корреляции между уровнем экспрессии мРНК гена BCL2 и количеством белка BCL2 (корригированный коэффициентR2= -0,07, Р = 0,98) (рис. 4).

Нг=0,13, п=17, Р=0,08

К'=-0,07, п=17, Р=0,98

О ;000 <000 6000 О 500 1000 1500 ;ооо :500

% экспрессии мРНК г*ма М>С % экспрессии нРНК гена ВС1Л

Рис. 4. Корреляция результатов по определению количества мРНК генов с-МУС и ВС12 методом ЛСЗ-РСЯ и экспрессии белков МУС и ВСЬ2, определяемой методом иммуногистохимического окрашивания.

Клиническая характеристика больных ДВККЛ в группах МУС+/ВСЬ2-, МУС-/ВСЬ2-, МУ С-/ВС1.2+, МУС+/ВСЬ2+

В зависимости от экспрессии МУС и ВСЬ2 больные исследуемой группы были разделены на 4 иммуногистохимические подгруппы, которые были сопоставимы по основным клиническим характеристикам за исключением возраста и частоты встречаемости поражения костного мозга (таблица 3). Доля больных старше 60 лет была выше в группе с коэкспрессией МУС/ВСЬ2, Р = 0,0005.

Таблица 3. Сравнительная характеристика больных исследуемой группы MYC+/BCL2-, MYC-/BCL2-, MYC-/BCL2+, MYC+/BCL2+.

Клинические параметры MYC+/BCL2- MYC-/BCL2- MYC-/BCL2+ MYC+/BCL2 + Р

и = 62 (100 %) 9 (100%) 17 (100%) 21 (100%) 15 (100%)

пол (муж.) 3 (33 %) 11 (65 %) 13(62%) 8 (53 %) 0,43

больные старше 60 лет 0 1 (9 %) 2(18%) 8 (73 %) 0,0005

ECOG > 2 6 (66 %) 14 (82 %) 20 (96 %) 13(86%) 0,18

поражение более одной экстранодальной области 4 (44 %) 9 (53 %) 14(67%) 11 (73 %) 0,43

поражение костного мозга 0 2 (12 %) 8 (38 %) 2 (13 %) 0,05

нейролейкемия 1 (11 %) 1 (6 %) 0 1 (7 %) 0,57

В-симптомы, п — 49 5 (55 %) 8 (53 %) 6 (46 %) 4 (33 %) 0,7

активность ЛДГ выше нормы, л = 61 9(100%) 14 (88 %) 19(91 %) 13(87%) 0,73

I1I-IV стадия по Ann Arbor 6 (66 %) 12(71 %) 18(86%) 11 (73 %) 0,8

МПИ (3 - 5) 6 (66 %) 13 (76 %) 18(85%) 11 (74 %) 0,18

Коэкспрессия МУС/ВСЬ2 чаще встречалась у больных поп-ССВ-иммуногистохимической подгруппы, чем у больных ССВ-подгруппы (29 % и 17 %, Р = 0,18) (таблица 4).

Таблица 4. Частота встречаемости экспрессии белков MYC и BCL2, коэкспрессии MYC/BCL2 в GCB и non-GCB иммуногистохимической подгруппе ДВККЛ.

Иммуногистохими ческие подгруппы MYC-/BCL2- MYC+/BCL2- MYC-/BCL2+ MYC+/BCL2+ Р

GCB, п = 24 10(42%) 4(17%) 6 (25 %) 4(17%) 0,18

non-GCB, п = 38 7(18%) 5 (13 %) 15 (40%) 11 (29 %)

При анализе объединенной группы, включавшей 75 пациентов с ДВККЛ (исследуемой и группы сравнения) по вариантам экспрессии белков МУС и ВСЬ2 выявленные различия между группами больных МУС+/ВСЬ2-, МУС-/ВС1.2-, МУС-/ВСЬ2+, МУС+/ВСЬ2+ были такими же, как и при анализе только исследуемой группы. Частота поражения костного мозга выявлялась чаще в группе МУС-/ВСЬ2+ с большей статистической достоверностью (Р = 0,02).

Клиническая характеристика больных с/без коэкспрессии МУС/ВСЬ2

Группы больных ДВККЛ с/без коэкспрессии МУС/ВСЬ2 значимо не различались по большинству клинических характеристик (за исключением возраста). Не выявлено связи коэкспрессии МУС/ВСЬ2 с указанными клиническими параметрами (таблица 5).

Таблица 5. Связь коэкспрессии МУС/ВС Ь2 с различными клиническими характеристиками заболевания. (Ж - отношение шансов, С1 - доверительный интервал.

Клинические параметры Коэкспрессия MYC/BCL2 Нет коэкспрессии OR (95 % CI) Р

число больных, и=75 19(100%) 56(100%)

пол (муж.) 10(53%) 30 (54 %) 1,04(0,37-2,95) 0,94

пол (жен.) 9 (47 %) 26 (46 %)

медиана возраста, лет 61 (25-73) 48(15-91) <0,05

ECOG > 2 17(90%) 48 (86 %) 0,16

активность ЛДГ выше нормы 16(84%) 47 (85 %) 0,68(0,15-3,04) 0,6

стадия по Ann Arbor III-IV 14(73%) 36 (65 %) 0,91

В-симптомы 5 (26 %) 24 (52 %) 0,42 (0,12-1,42) 0,16

МПИ (3-5) 14(73%) 44 (79 %) 0,74 (0,19-2,84) 0,66

поражение более одной экстранодальной области 14 (74 %) 31 (55 %) 2,26 (0,72-7,13) 0,16

поражение костного мозга 3 (16 %) 13(23%) 0,62(0,16-2,47) 0,5

нейролейкемия 1 (5 %) 2 (4 %) 1,5 (0,12-17,54) 0,75

Результаты лечения больных ДВККЛ

Результаты лечения больных, получавших интенсивную химиотерапию, были более высокими, чем у больных, получавших химиотерапию средней интенсивности. Подтвержденной полной ремиссии в исследуемой группе достигли 52 пациента (84 %). 9 (14,5 %) больных достигли частичной ремиссии, у 1 больного - стабилизация заболевания. 9 (69 %) больных группы сравнения больных достигли полной подтвержденной ремиссии, стабилизация заболевания отмечалась у 4 (31 %) больных. Рецидивы ДВККЛ в исследуемой группе развились у 9 (15 %) больных, в группе сравнения — у 5 (39 %), (Р = 0,13). Прогрессирование заболевания — у 7 (11 %) и 4 (30 %) больных в исследуемой и группе сравнения, соответственно (Р = 0,07). После развития рецидива ДВККЛ вторая ремиссия была достигнута у 4 (7 %) больных исследуемой группы. В качестве терапии второй линии выполнялась высокодозная химиотерапия; в одном случае выполнена аутоТГСКК. Летальность от осложнений полихимиотерапии в исследуемой группе составила 8 % (5 больных). Одна больная в группе сравнения погибла от острого инфаркта миокарда через 4 года после достижения полной ремиссии заболевания. 4-летняя ОВ в группе больных, получавших лечение по схеме СНОР-21 ± R достоверно ниже, чем у пациентов, получивших лечение по протоколу m-NHL-BFM-90 ± R (37 % га 67 %, Р = 0,0335). Вероятность развития рецидивов/прогрессирования ДВККЛ в течение 4 лет в группе больных, получавших лечение по схеме СНОР-21 ± R достоверно выше, чем у пациентов группы m-NHL-BFM-90 ± R (70 % vs 31 %, Р = 0,0038). АутоТГСКК проведена 5 больным: 4 в первой линии терапии, 1 - после достижения второй ремиссии заболевания. У одного больного развился рецидив заболевания, несмотря на проведение аутоТГСКК.

Однофакторный анализ

Однофакторный анализ прогностического значения различных клинико-лабораторных характеристик в отношении ОВ в исследуемой группе больных выявил роль следующих параметров: высокий и промежуточный высокий риск по МПИ (3-5) (Р = 0,02), поражение костного мозга (Р = 0,03) и генерализованная (I1I-IV) стадия заболевания согласно классификации Ann Arbor (Р = 0,06) (таблица 6).

Таблица 6. Влияние различных клинико-лабораторных характеристик на параметры 4-летней ОВ и вероятности развития рецидива/прогрессировання ДВККЛ у больных, получавших лечение по протоколу т-МНЬ-ВЬМ-90 ± Я.

Клинические характеристики, число больных 4-летняя ОВ, % Р Вероятность развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ в течение 4 лет Р

пол, м/ж (35/27) 64 % vs 71% 0,59 35 % vs 29 % 0,82

ECOG 1 (9) 100 % 14 %

ECOG 2 (25) 59% 0,12 28% 0,2

ECOG 3 (25) 69% 35 %

ECOG 4 (3) 33 % 67%

I стадия по Ann Arbor (5) 100 % 0

II стадия по Ann Arbor (10) 100 % 0,06 11 % 0,23

III стадия по Ann Arbor (6) 63% 33%

IV стадия по Ann Arbor (41) 55% 42%

МПИ (0-2 баллов) (14) 100% 0,02 ' 10% 0,08

МПИ (3-5 баллов) (48) 58% 38 %

поражение более 1 экстранод. очага есть/нет (38/24) 60 % vs 79 % 0,1 20 % vs 40 % 0,17

поражение костного мозга есть/нет (12/50) 37 % vs 74 % 0,03 48 % vs 29 % 0,33

GCB/non-GCB (24/38) 71 % vs 64 % 0,72 17 % vs 39 % 0,07

MYC+/BCL2+ (15) 57% 64 %

MYC+/BCL2- (9) 100 % 0,09 14%. 0,02

MYC-/BCL2+ (21) 53 % 26 %

MYC-/BCL2- (17%) 78% 14 %

Прогностическую значимость в отношении риска развития

рецидива/прогрессирования ДВККЛ в течение 4 лет наблюдения имела принадлежность к определенной иммуногистохимической подгруппе (ССВ/поп-вСВ), МПИ, а также вариант экспрессии МУС и ВСЬ2: МУС+/ВСЬ2+ (65 %), МУС-/ВСЬ2+ (26 %), МУС+/ВСЬ2- (14 %), МУС-/ВСЬ2- (14 %), (Р = 0,02) (рис. 5).

«а1 Ё =

ШХ- вси- <■«->. 0=1?

§

5.П С-ВСО- Л»». И=С1

>п с- вал- 0-1т

МУС-Вси- 14»». 0=9

Рис. 5. Вероятность развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ в течение 4 лет у больных исследуемой группы в зависимости от экспрессии МУС и ВСЬ2.

При сравнении группы МУС+/ВСЬ2+ с объединенной группой (МУС+/ВСЬ2-, МУС-/ВСЬ2+, МУС-/ВСЬ2-) коэкспрессия МУС/ВСЬ2 сохраняла свою значимость с более высокой достоверностью (65 % га 14 %, Р = 0,0029) (рис. 6).

Во

2 П

£ |

3«!

мусвсь: 11=15

\iyc-rct.:-. мус-ясхж

Рис. 6. Вероятность развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ в течение 4 лет у больных исследуемой группы в зависимости от напичия/отсутствия коэкспресии МУС/ВСЬ2.

Вероятность развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ в течение 4 лет в группе сравнения была значительно выше, чем в исследуемой группе (70 % га 31 %, Р =

0,0038). Вероятность развития рецидива/прогрессирования заболевания в группе сравнения была выше у больных ДВККЛ с коэкспрессией MYC/BCL2 - 75 % vs 67 % в группе больных без коэкспрессии (Р = 0,69).

В зависимости от добавления ритуксимаба к схеме m-NHL-BFM-90 достоверных различий по ОВ (62 % с ритуксимабом (л = 12) га 69 % без ритуксимаба (л = 50), Р = 0,41) и вероятности развития рецидива или прогрессирования заболевания (39 % с ритуксимабом и 29 % без ритуксимаба, Р = 0,36) у больных ДВККЛ не выявлено.

Многофакторный анализ

Многофакторный анализ ОВ и вероятности развития рецидива/прогрессирования у больных ДВККЛ, прошедших лечение по протоколу m-NHL-BFM-90 ± R, проведен с учетом таких параметров, как возраст, соматический статус по шкале ECOG, стадия заболевания согласно классификации Ann Arbor, поражение более одного экстранодального очага, поражение костного мозга, нейролейкемия в дебюте заболевания, МПИ, добавление к терапии ритуксимаба, аутоТГСКК, принадлежность к GCB/non-GCB иммуногистохимической подгруппе, наличие экспрессии одного из белков МУС или BCL2, коэкспрессии MYC/BCL2. В результате пошаговой селекции отобраны следующие параметры, прогностическая значимость которых была проанализирована в отношении ОВ: стадия заболевания согласно классификации Ann Arbor, экспрессия BCL2 > 50 %, аутоТГСКК. Статистически значимое влияние на ОВ имела только генерализованная (III-IV) стадия заболевания (HR = 3,079, Р = 0,0451).

В отношении вероятности развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ в результате пошаговой селекции отобраны следующие параметры: коэкспрессия MYC/BCL2, МПИ. Коэкспрессия MYC/BCL2 являлась независимым фактором риска развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ (HR = 4,717, Р = 0,0024), при учете МПИ (HR = 6,496, Р = 0,0719).

выводы

1. Коэкспрессия белков MYC/BCL2 (пороговые значения для MYC и BCL2 > 40 % и > 50 %, соответственно) является независимым фактором риска развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ у взрослых больных, получающих химиотерапию по интенсивному протоколу m-NHL-BFM-90 ± R (Р = 0,003).

2. Экспрессия одного из белков МУС или BCL2 с превышением порогового значения не оказывает статистически значимого влияния на вероятность развития рецидива/прогрессирования ДВККЛ у больных, получающих химиотерапию по протоколу m-NHL-BFM-90 ± R. Экспрессия белка MYC выше порогового значения не ухудшает результаты ОВ у больных ДВККЛ, получающих химиотерапию по протоколу m-NHL-BFM-90 ± R.

3. Коэкспрессия MYC/BCL2 выявлена у 24 % больных ДВККЛ исследуемой группы. Не обнаружено связи коэкспрессии MYC/BCL2 с такими клиническими характеристиками, как пол, статус по шкале ECOG, стадия заболевания по Ann Arbor, В-симптомы, активность лактатдегидрогеназы, поражение более одной экстранодальной области, нейролейкемия, поражение костного мозга. Вероятность выявления коэкспрессии MYC/BCL2 выше в группе больных старше 60 лет (Р = 0,0005).

4. Частота обнаружения коэкспрессии MYC/BCL2 выше в non-GCB иммуногистохимической подгруппе ДВККЛ (29 % vs 17 %, Р = 0,18).

5. Экспрессия белков MYC и BCL2 опухолевыми клетками выше пороговых значений выявляется с высокой частотой (36 % и 63 %) в отсутствии перестроек кодирующих генов. Количество мРНК гена c-MYC коррелирует с уровнем экспрессии белка MYC, определяемым методом иммуногистохимического окрашивания (R2 = 0,13, Р = 0,08).

6. Исследование экспрессии белков MYC и BCL2 имуногистохимическим методом является важным молекулярно-биологическим параметром и обосновано для включения в диагностический атгоритм обследования в целях стратификации больных ДВККЛ на группы риска развития рецидива/прогрессирования заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мисюрина А.Е. Роль экспрессии генов c-MYC, BCL2 и BCL6 в патогенезе диффузной В-крупноклеточной лимфомы / Мисюрина А.Е., Мисюрин В.А., Барях Е.А., Ковригина A.M., Кравченко С.К.. Клиническая онкогематология. 2014. 7 (4): 512-521.

2. Лукина А.Е. Успешное лечение больного двумя гемотологическими опухолями: double-hit лимфомой и острым миеломонобластным лейкозом / Лукина А.Е., Барях Е.А., Кравченко С.К., Нарейко М.В., Кузьмина Л.А., Паровичникова E.H., Обухова Т.Н., Ковригина A.M., Магомедова А.У. Терапевтический архив. 2014. 86 (7): 80-84.

3. Мисюрина А.Е. Экспрессия белков МУС и BCL2 у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой / Мисюрина А.Е., Ковригина A.M., Барях Е.А., Мисюрин В.А., Кравченко С.К., Мисюрин A.B., Обухова Т.Н., Куликов С.М., Копылов А.Н., Магомедова А.У., Гемджян Э.Г., Воробьев А.И. Клиническая онкогематология. 2015. 8 (1): 44-53.

Подписано в печать: 24.03.2015 Тираж: 100 экз. Заказ № 1273 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru