Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Роль внутриклеточных протеолитических систем в развитии и прогнозе рака эндометрия

На правах рукописи

005533295

КОВАЛЬ ВАЛЕРИЯ ДЕНИСОВНА

РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В РАЗВИТИИ И ПРОГНОЗЕ РАКА ЭНДОМЕТРИЯ

14.01.12-онкология 14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 а сен т

Томск - 2013

005533295

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Кондакова Ирина Викторовна

доктор медицинских наук, профессор Коломиец Лариса Александровна

Официальные оппоненты: Афанасьев Сергей Геннадьевич

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник торакоабдоминального отделения. ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН

Степовая Елена Алексеевна

доктор медицинских паук. профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук. г. Москва

часов на заседании

Защита состоится «_»_2013г. в_

диссертационного совета Д001.032.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» СО РАМН (634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Фролова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак эндометрия (РЭ) является наиболее распространенным видом онкогинекологической патологии как в России, так и за рубежом. В России в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями суммарно по всем возрастам РЭ занимает 4-5 место, при этом отмечается увеличение доли заболевших женщин репродуктивного возраста [Чиссов В.И., 2011].

Большинство исследователей признает клиническую, морфологическую и прогностическую гетерогенность контингента больных РЭ даже в пределах одной стадии и подстадии, что определяет целесообразность выделения при раке тела матки дополнительных факторов неблагоприятного прогноза. Непредсказуемость биологического поведения опухоли даже среди больных с одинаковой распространенностью процесса во многом обусловлено вовлечением в канцерогенез различных молекулярных механизмов. В этой связи в последнее время большое значение придается молекулярным маркерам для прогноза клинического течения новообразований и их исхода. В ряде исследований получены доказательства того, что некоторые иммуногистохимические маркеры являются независимыми прогностическими показателями, в том числе при онкогинекологической патологии. Однако согласованного мнения о прогностической роли иммуногистохимических маркеров при РЭ в литературе нет [Чернышова АЛ., 2010], поэтому проблема поиска новых молекулярных критериев прогноза рака эндометрия требует дальнейшего изучения.

В связи с тем, что социальная значимость РЭ в настоящее время велика, актуальной является также проблема выявления в популяции женщин с высоким онкологическим риском по РЭ, что в конечном итоге представляется адекватным направлением в снижении заболеваемости и смертности от этого заболевания. В первую очередь к этой категории относятся пациентки, страдающие гиперпластическими процессами эндометрия (ГЭ). Несмотря на то, что механизм малигнизации ГЭ на сегодняшний день остается неясным, показано, что вероятность развития РЭ велика у пациенток с атипической гиперплазией (до 40%), в то время как для пациенток с типической гиперплазией такой риск значительно ниже, но все же существует (до 10%) [Lacey J.V., 2008].

Объективных и надежных критериев, позволяющих оценить степень онкологического риска у женщин с ГЭ, существует крайне мало. Большинство из них опираются на клинические данные, и описано крайне мало подходов, основанных на молекулярных и биохимических особенностях ткани [Чернышова А.Л., 2003; Бочкарева Н.В., 2010; Burbos N.. 2010; Habeeb О., 2010]. Тем не менее, эти подходы имеют ограниченную область применения и широкого применения в практике они не нашли.

Выделение критериев для оценки степени онкологического риска могло бы позволить оптимизировать выбор индивидуальной лечебной тактики и

значительно улучшить качество и продолжительность жизни у женщин с ГЭ за счет снижения частоты и объемов хирургического лечения у женщин в постменопаузальном возрасте, уточнения необходимости проведения аблации эндометрия в позднем менопаузальном периоде, а также выявления пациенток с высоким риском развития РЭ и своевременного выполнения им соответствующего лечения.

Теоретической основой разработки критериев для оценки степени онкологического риска и для прогноза течения РЭ может послужить изучение молекулярных механизмов развития гиперпластических процессов и РЭ. В этой связи перспективным является изучение специфических внутриклеточных протеиназ, поскольку известно, что процессы деградации во многом определяют эффективную регуляцию количества и функций многих белков, в том числе ростовых и транскрипционных факторов, участвуют в повышении пролиферативной активности, ингибировании апоптоза, стимуляции неоангиогенеза, функционировании иммунной системы и индукции лекарственной резистентности [Спирина Л.В., 2008; Edwards D., 2009].

Наиболее значимыми системами специфического внутриклеточного протеолиза являются убиквитин-протеасомная и кальпаиновая, и обе они вовлечены в развитие и прогрессирование опухоли. Показана важная роль убиквитин-протеасомной системы в развитии опухолей различных локализаций [Kitagawa К., 2009].

К субстратам протеасомной и кальпаиновой систем можно отнести и локомоторные белки, в частности актинсвязывающие белки и ß-катенин. Изменение их экспрессионного профиля вносит значительный вклад в приобретение клетками способности к движению, определяя инвазивный и метастатический потенциал трансформированной клетки [Van Troys М., 2008]. Протеолитическая регуляция экспрессии этих белков изучена недостаточно. Единичные литературные данные свидетельствуют о том, что некоторые из этих белков являются субстратами для кальпаинов, другие — для протеасом [Heuzé M.L., 2008; Ni X.G., 2008]. Таким образом, экспрессия актинсвязывающих белков и ß-катенина и, соответственно, процессы клеточной локомоции могут быть тесно связаны с протеасомной и кальпаиновой активностью.

Учитывая важную роль внутриклеточных протеиназ и локомоторных белков в канцерогенезе и их вероятное участие в прогрессии РЭ, изучение состояния протеасомной и кальпаиновой систем и экспрессии актинсвязывающих белков и ß-катенина представляется актуальным и может послужить основой для разработки маркеров, позволяющих прогнозировать течение РЭ и объективно оценивать риск развития РЭ у пациенток, страдающих ГЭ.

Цель исследования: изучение роли внутриклеточных протеолитических систем в развитии и прогнозе рака эндометрия.

Задачи исследования

1. Изучить активность протеасом, их пулов и субъединичный состав в тканях мапигнизированного, неизмененного и гиперплазированного эндометрия.

2. Определить активность кальпаинов в малигнизированном, неизмененном и гиперплазированном эндометрии.

3. Изучить экспрессию актинсвязывающих белков (кофилина-1, гельзолина, тимозина В4, р45-5ег-В-катенина, АгрЗ) в ткани рака эндометрия и в гиперплазированном эндометрии.

4. Оценить связь активности протеасом и кальпаинов с экспрессией актинсвязывающих белков в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии.

5. Проанализировать взаимосвязь исследуемых показателей с клинико-морфологическими параметрами рака эндометрия.

6. Оценить значимость исследуемых показателей для прогноза течения рака эндометрия.

7. Создать математическую модель для оценки степени онкологического риска у пациенток с гиперплазией эндометрия на основе определения активности внутриклеточных протеиназ.

Научная новизна

Впервые исследованы активность протеасом и их пулов, а также их субъединичный состав в ткани РЭ и в гиперплазированном эндометрии. Показано усиление протеасом-зависимого протеолиза при РЭ по сравнению с ГЭ с повышением тотальной активности и активности 208 пула. Установлено изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ как по сравнению с неизмененной тканью, так и по сравнению с гиперплазированным эндометрием. В злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц относительно ГЭ. Получены новые данные о связи активности протеасом с глубиной инвазии опухоли в миометрий.

Приоритетными являются полученные данные о значительном повышении активности кальпаинов при РЭ по сравнению с ГЭ, отмечаемой уже при РЭ 1а стадии, с последующим ростом при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрий, что указывает на важную роль кальпаинов в развитии РЭ.

Впервые проанализирована взаимосвязь активности протеасом- и кальпаин-зависимого протеолиза с экспрессией локомоторных белков при РЭ и ГЭ. Показано, что и протеасомы, и капьпаины, вероятно, регулируют содержание ряда актинсвязывающих белков и фракций р-катенина, влияя тем самым на клеточную подвижность.

Впервые изучена прогностическая роль активности внутриклеточных протеиназ в ткани эндометрия для оценки степени онкологического риска у больных с ГЭ и для прогноза течения РЭ.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты позволяют расширить представления об особенностях функционирования внутриклеточных протеолитических систем при РЭ и обосновать их патогенетическую значимость в развитии этой патологии.

Представленные в работе данные о выраженных различиях в активности кальпаинов при ГЭ и РЭ, а также о взаимосвязи данного показателя с экспрессией локомоторных белков свидетельствуют об участии кальпаинов в процессах, как происходящих в клетке на ранних этапах возникновения злокачественной опухоли эндометрия, так и при развитии заболевания.

Выявленное изменение активности и субъединичного состава протеасом, установленный факт регуляции ими содержания локомоторных белков углубляют представления о возможных механизмах участия убиквитин-протеасомной системы в развитии РЭ.

Результаты исследования могут быть использованы для предсказания риска возникновения РЭ у женщин с ГЭ, для индивидуализации и оптимизации их лечения, а также послужить дополнительными критериями прогноза течения РЭ. Показано, что тотальная активность протеасом является значимым фактором в отношении 3-летней безрецидивной выживаемости больных РЭ, а экспрессия иммунной субъединицы протеасом ЬМР2 - 3-летней общей выживаемости. Создана математическая модель для оценки степени онкологического риска у пациенток, страдающих ГЭ, включающая активность кальпаинов, активность тотального пула протеасом, возраст пациентки и активность 26Б пула протеасом. Чувствительность разработанной модели составила 77%, специфичность - 100%.

Положения, выносимые на защиту

1. Состояние протеасомной и кальпаиновой систем не одинаково в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии. Активность протеасом в злокачественно измененном эндометрии выше, чем в прилегающей неизмененной ткани и в гиперплазированном эндометрии. Изменения активности сопровождаются изменением субъединичного состава протеасом. Активность кальпаинов значительно выше в тканях рака эндометрия, чем в гиперплазированном эндометрии.

2. Корреляционные связи активностей протеасом и кальпаинов с экспрессией актинсвязывающих белков и Р-катенина в ткани гиперплазированного и малигнизированного эндометрия дают основание предположить наличие протеолитической регуляции кофилина-1 протеасомами, тимозина Р4 и Р-катенина протеасомами и кальпаинами.

3. Определение активности протеасом и кальпаинов в ткани гиперплазированного эндометрия дает возможность прогнозирования риска развития рака эндометрия.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на VI-VIII Региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011-2013), на XI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Москва, 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Начальный рак эндометрия» (Москва, 2011), на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой прораммы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (государственный контракт П320), Российского фонда фундаментальных исследований (№ 13-04-00169).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, отражающих основные положения, в том числе 8 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, 7 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора

Анализ литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели и задач, выбор методов исследования, проведение экспериментального блока настоящей работы, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и иллюстрирована 16 рисунками. Бибилография включает 214 литературных источников, из которых 24 отечественных и 190 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 153 больных с гиперпластическими процессами и РЭ, обратившихся на консультативный прием и находившихся на стационарном лечении в отделении онкогинекологии с группой профилактики ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН с 2010 по 2012. В соответствии с международной классификацией FIGO (1988) и классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (2003) были сформированы две клинические группы:

I группа: 90 больных РЭ I-III стадии, средний возраст 56,55±10,45 года. Объемы диагностики и лечения больных РЭ соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований,

утвержденных Министерством здравоохранения РФ. На первом этапе лечения выполнялась операция в различных объемах.

II группа: 63 больных с гиперпластическими процессами эндометрия, средний возраст 50,17±8,60 лет. Все больные с ГЭ получали хирургическое органосохраняющее или органоуносящее лечение. Среди больных II группы 78% имели типическую гиперплазию, 13% - атипическую гиперплазию и 9% — 5 полипы эндометрия.

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288), получено разрешение этического комитета института.

Материалом для исследования служили образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани, взятой на расстоянии не менее 1 см от границы опухоли, полученные при выполнении радикального оперативного вмешательства. Образцы гиперплазированного эндометрия получали при выполнении гистероскопии с биопсией или оперативного вмешательства. Весь полученный материал имел гистологическую верификацию. Образцы тканей замораживали и хранили при -80°С.

Для получения осветленных гомогенатов замороженные образцы ткани (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфере (рН=7,5), содержащем 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 минут при 10000g и 4°С.

Фракционирование протеасом и выделение пулов проводили по методу Е.Б.Абрамовой с соавт. [Абрамова Е.Б., 2006]. Фракцию, обогащенную 26S-протеасомами, получали добавлением сульфата аммония до 40% насыщения, 205-протеасом - до 70% насыщения.

Химотрипсинподобную активность протеасом определяли в осветленных гомогенатах опухолевой, гиперплазированной и неизмененной ткани эндометрия по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma). Для оценки активности примесных протеаз применяли специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma).

Экспрессию тотального пула протеасом и субъединиц протеасом в тканях исследовали методом Вестерн-блоттинг с применением первичных антител к субъединицам протеасом и к р-актину, вторичными антителами goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) и goat ani-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, США) в разведениях, рекомендованных производителем. Стандартизация проводилась относительно р-актина. Результаты выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Определение активности кальпаинов проводили в осветленных гомогенатах по гидролизу Suc-LLVY-AMC с добавлением ингибитора кальпаинов ALLN (Sigma) или ингибитора кальпаина-2 Z-LLY-FMK (Calbiochem). Удельную активность кальпаинов выражали в единицах активности на 1 мг белка.

Анализ уровня экспрессии актинсвязывающих белков (АгрЗ, гельзолина, кофилина-1, тимозина Р4) и р45-5ег-(3-катенина проводился методом проточной цитометрии на цитофлюориметре FACS Canto II (Becton Dickinson (BD), США). Образцы малигнизированного и гиперплазированного эндометрия дезинтегрировали на устройстве Medimachine (BD, США) по стандартной методике. Фиксация и пермеабилизация клеток проводилась с помощью набора Cytofix/Cytoperm (BD, США). В качестве первичных антител использовались суtokeratin-18-phycoerythrin (РЕ), афЗ, cofilin, thymosin-p4 фирм «АЬсаш» (Великобритания) и «Santa Cruz Biotechnology, Inc.» (США), gelsolin, p45-Ser-P-catenin-PE фирмы «BD» (США). В качестве вторичных - goat anti-mouse IgG fluorescein isothiocyanate (FITC) фирмы «BD» (США). В контроле использовались соответствующие изотопические антитела: мышиные IgGr F1TC и lgG2a-FITC, IgG,, к -РЕ («Santa-Cruz Biotechnology», «BD», США). Проанализированы количество клеток, экспрессирующих маркеры в процентах (%), а также медиана интенсивности флюоресценции (MFI) в условных единицах (у.е.).

Для исследования противоопухолевого действия ингибиторов протеасом и кальпаинов на клеточные культуры РЭ, полученные от больных, был проведен ингибиторный анализ. Суспензию клеток РЭ получали на дезагрегирующем устройстве и инкубировали в течение 20 ч в вентилируемых чашках Петри при 37°С, 5% С02 в присутствии 50 мкМ MG132 (Sigma), 0,5 мкМ бортезомиба (Велкейд, Ben Venue Laboratories Inc., США), 10 мкМ ингибитора кальпаинов ALLN (Sigma), 0,01% DMSO или без добавок. По окончании инкубации клетки с поверхности чашки Петри снимали раствором трипсина-версена (0,05%, Invitrogen), отмывали PBS и оценивали жизнеспособность клеток.

При статистической обработке полученных результатов использовались методы описательной статистики, критерии Шапиро-Уилка, Манна-Уитни, Краскала-Уоллиса, рассчитывался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Прогностическая значимость признаков в отношении общей и безрецидивной выживаемости у больных РЭ оценена с помощью программы Survival Analysis, Statistica 6.0; кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера; для сравнения показателей выживаемости был использован обобщенный критерий Гехана-Вилкоксона. Для создания модели оценки онкологического риска у пациенток с ГЭ использовался дискриминантный анализ. Обсуждаются результаты со значимостью различий при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование тотальной химотрипсиноподобной активности протеасом, активности пулов 26S и 20S проведено у 90 больных РЭ I-III стадии и 63 больных с гиперпластическими процессами эндометрия (табл. 1). Выявлено усиление прогеасом-зависимого протеолиза в злокачественной ткани эндометрия по сравнению как с соответствующей неизмененной, так и с гиперплазированной тканью. В ткани РЭ тотальная активность протеасом и

активность их пулов была выше, чем в неизмененной ткани в 1,7-1,9 раз. По сравнению с ГЭ тотальная активность в ткани РЭ была выше в 2,17 раза, активность 26S пула— в 1,36 раза, а пула 20S протеасом - в 1,77 раза. Причем повышение тотальной активности протеасом и активности 20S пула по сравнению с ГЭ отмечалось уже на 1а стадии заболевания.

Усиление активности протеасом в злокачественной ткани по сравнению с неизмененной тканью продемонстрировано и в некоторых других опухолях [Кондакова И.В., 2012]. Вероятно, повышение активности протеасом в ткани РЭ по сравнению с неизмененными тканями и ГЭ происходит вследствие возрастающей потребности клетки в обмене белков и интенсификации внутриклеточных процессов, направленных на приобретение и реализацию злокачественно трансформированной клеткой присущих ей свойств.

Таблица 1 - Активность протеасом в гиперплазированном, неизмененном и злокачественном эндометрии___

Вид эндометрия п Тотальная активность, х103 Ед/мг Активность пула 26S, xi О3 Ед/мг Активность пула 20S, xi О3 Ед/мг

Медиана QùQ, Медиана 0,;0з Медиана 0.;0з

Гипер- 63 37,04* 22,44; 27,70* 13,33; 51,67* 26,70;

плазированный р=0,000 60,42 р=0,009 51,20 р=0,005 94,44

Неизмененная

ткань больных 90 44,80* 22,70; 19,98* 10,7;38 53,12* 26,70;

раком р=0,000 87,30 р=0,000 ,80 р=0,000 100,00

эндометрия

Рак эндометрия 90 80,42 42,0; 150,0 37,73 22,20; 51,77 91,50 51,77; 177,73

Примечание: п - число больных; СЬ и СЬ — верхний и нижний квартили; * значимость различий по сравнению с опухолевой тканью больных раком эндометрия

При анализе особенностей изменения химотрипсинподобной активности протеасом в ткани РЭ в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания выявлено увеличение активности 26S пула протеасом в 3,2 раза и 20S пула в 1,31 раза при III стадии РЭ по сравнению со II стадией. Кроме того, тотальная активность протеасом была выше в опухолях с инвазией более половины миометрия, чем в неинвазивных опухолях в 1,76 раза (р=0,02), и наблюдалась тенденция к повышению активности всех пулов протеасом при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрий. Корреляционный анализ показал прямую связь между глубиной инвазии опухоли в миометрий и как тотальной активностью протеасом, так и активностью 26S пула (г=0,34, р=0,001 и г=0,24, р=0,03, соответственно). Полученные данные указывают на участие протеасом в прогрессии РЭ: распространении опухоли и её инвазии.

Определение экспрессии субъединиц протеасом ala2a3a5a6a7, LMP2, LMP7, РА28(3 и Rpt6 методом Вестерн-блоттинг показало изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ по сравнению с соответствующей неизмененной и с гиперплазированной тканью.

Наблюдалось снижение содержания тотального пула протеасом, о котором можно судить по экспрессии а1а2аЗа5а6а7-субъединиц протеасом, на 23% относительно неизмененной ткани, сопровождаемое увеличением экспрессии иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 (на 24,9% и 35,4%, соответственно). Значительное повышение количества иммунных субъединиц при снижении общего числа протеасом и повышении их активности свидетельствует об изменении функционирования протеасомной системы при РЭ по сравнению с окружающими неизмененными тканями эндометрия.

Качественное изменение протеасом в опухолевой ткани отличает также РЭ от ГЭ. По сравнению с гиперплазированным эндометрием, в злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц: незначительное повышение экспрессии ala2a3a5a6a7 (на 13%), иммунных субъединиц (LMP2 — на 18%, LMP7 — 16%) и статистически значимое повышение экспрессии РА28р (на 20%) и Rpt6 (на 39,9%).

При анализе экспрессии субъединиц протеасом в зависимости от кпинико-морфологических параметров РЭ зарегистрировано повышение содержания субъединиц LMP2 (р=0,04) и РА28Р (р=0,03) в группах опухолей с инвазией глубже середины миометрия по сравнению с опухолями с инвазией до середины миометрия в 1,4 и 1,23 раза, соответственно. Установлено наличие положительных корреляций между глубиной инвазии опухоли в миометрий и экспрессией LMP2 (г=0,25; р=0,04) и РА28Р (г=0,25; р=0,04).

В литературе нет единого мнения о значении иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 для канцерогенеза: некоторые клеточные линии опухолей демонстрируют высокую экспрессию этих субъединиц, другие — низкую [Hayashi Т., 2002, 2011; Wehenkel M., 2012; Zhang X., 2013]. Предполагается их участие в неиммунных процессах, в частности, в инвазии опухолей, а также известно, что LMP-содержащие иммунопротеасомы продуцируют больше пептидов, чем конститутивные, и являются более специфичными [Kesmir С., 2003; Wang Н.Х., 2006].

Представленные данные демонстрируют вовлечение структурной реорганизации протеасом в развитие РЭ. Результаты исследования могут представлять и практическую значимость в связи с необходимостью поиска новых ингибиторов протеасом, обладающих более узкой направленностью и позволяющим блокировать функционирование отдельных субъединиц, таким образом, избегая многочисленных побочных эффектов и успешно подавляя опухолевую прогрессию.

Была исследована активность и других важных внутриклеточных специфических протеиназ — кальпаинов — в злокачественной, визуально неизмененной и гиперплазированной ткани эндометрия (табл. 2).

У больных РЭ активность кальпаинов не отличалась от этого показателя для неизмененной ткани, но была в 6 раз выше, чем при ГЭ (р=0,000). Возрастание кальпаиновой активности по сравнению с ГЭ наблюдалось уже при 1а стадии РЭ.

При анализе особенностей изменения активности кальпаинов в злокачественных опухолях эндометрия в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания выявлено увеличение активности кальпаина-2 при III стадии РЭ по сравнению со II стадией.

Таблица 2 - Активность кальпаинов в гиперплазированном, неизмененном и злокачественном эндометрии

Вид эндометрия п Общая кальпаиновая активность, х ] О3 Ед/мг Активность кальпаина-1, х103 Ед/мг Активность кальпаина-2, xl О3 Ед/мг

Медиана Q.;Q3 Медиана Qi;Qs Медиана QbCb

Гиперплазиро-ванный эндометрий 32 8,16* р=0,000 3,99; 25,51 - - - -

Неизмененная ткань эндометрия 43 38,04 19,57; 61,87 15,35 8,21; 38,08 13,73 3,18; 26,03

Малигнизиро-ванный эндометрия 43 47,11 25,57; 81,43 24,54 14,18; 33,07 20,92 9,75; 45,59

Примечание: п - число больных; * - значимость различий по сравнению с опухолевой тканью больных раком эндометрия.

При оценке противоопухолевого действия ингибиторов протеасом и кальпаинов in vitro на культуре клеток РЭ, полученных от 4 больных РЭ I-II стадии, выявлено, что наиболее выраженным противоопухолевым эффектом обладал ингибитор кальпаинов ALLN, в то время как ингибиторы протеасом MG132 и бортезомиб оказывали меньшее влияние на выживаемость злокачественных клеток эндометрия. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований по использованию ингибиторов кальпаинов в таргетной терапии РЭ.

Таким образом, усиление специфического внутриклеточного протеолиза при РЭ происходит на начальных этапах заболевания. Считается, что протеазы функционируют взаимосвязано друг с другом и в злокачественной ткани образуют комплекс, представленный ферментами различных каталитических типов и получивший название «раковый деградом». Компоненты ракового деградома обеспечивают эффективный протеолиз в течение опухолевой прогрессии, в частности, для инвазии и метастазирования [Rothberg J.M., 2012].

Одним из механизмов реализации участия протеиназ в опухолевой профессии может быть регуляция ими актинсвязывающих белков, которые играют важную роль в подвижности клеток. В тканях РЭ и ГЭ была определена экспрессия некоторых белков, ассоциированных с клеточной подвижностью

(АфЗ, гельзолина, кофилина-1, тимозина 04, фракции Р-катенина, фосфорилированного по серииу-45). В злокачественной ткани наблюдалось повышение экспрессии всех изучаемых белков по сравнению с гиперплазированной тканью: наиболее значимые отличия коснулись актинветвяшего белка АфЗ (повышение на 28%), гельзолина (повышение на 33%) и тимозина р4 (повышение на 29%) (табл. 3). Отличия обнаруживаются уже при I стадии РЭ.

При анализе содержания локомоторных белков в ткани РЭ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами заболевания выявлено увеличение экспрессии гельзолина и кофилина-1, а также снижение экспрессии тимозина р4 при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрин. В нашем исследовании при инвазии РЭ в миометрий наиболее значительные изменения (увеличение на 61%) в экспрессии актинсвязывающих белков по сравнению с неинвазивными опухолями коснулись кофилина-1, что свидетельствует о его активном участии в прогрессии РЭ.

Таблица 3 - Экспрессия белков, ассоциированных с клеточной подвижностью, в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии

Показатель Гиперплазия эндометрия Рак эндометрия п=28 Значимость различий

Медиана Q.;Q3 Медиана Q,;Q3

p45-Ser- Р-катенин % позитивных 79,0 60,0; 92,0 93,5 85,5; 98,0 р>0,05

MFI, у.е. 3789,0 2518,0; 7565,0 8497,0 6400,0; 12427,0 р=0,04

АфЗ % позитивных 22,2 12,9; 31,8 28,5 24,4; 33,2 р=0,04

MFI, у.е. 2115,0 1710,0; 2606,0 2071,5 1902,0; 2666,0 р>0,05

гельзолин % позитивных 19,0 10,9; 21,2 25,25 20,4; 41,3 р=0,001

MFI, у.е. 1861,0 1401; 2055,0 2236,0 1941,0; 2834,0 р=0,004

кофилин 1 % позитивных 16,0 13,4; 19,8 20,65 14,6; 27,8 р>0,05

MFI, у.е 1835,0 1599,0; 1957,0 2051,5 1790,0; 2256,0 р=0,04

тимозин р4 % позитивных 15,4 6,8; 17,5 19,85 16,0; 30,1 р=0,01

MFI, у.е. 1615,0 1525,0; 1889,0 2068,0 1875,0; 2421,0 р=0,001

Вопрос о протеолитической регуляции актинсвязывающих белков на сегодняшний день остается открытым. Согласно результатам разрозненных исследований, одни и те же белки могут быть субстратами как протеасом, так и кальпаинов или каспаз. Результаты корреляционного анализа экспрессии актинсвязывающих белков и р-катенина выявили неодинаковый характер связей между активностью внутриклеточных протеиназ и уровнем экспрессии изучаемых белков в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии. При РЭ большинство обнаруженных взаимосвязей касались протеасом, и, по-видимому, протеасомы принимают участие в деградации ряда белков. Так, наблюдалась отрицательная корреляция между активностью 268 пула протеасом и количеством тимозина Р4 и р-катенина. Причем последний также находился в обратной зависимости от экспрессии субъединицы Яр1б, одной из АТФазных субъединиц 19Б регуляторной частицы (РА700) 268 протеасомы. Эти данные позволяют утверждать, что в тканях РЭ Р-катенин подвергается убиквитин-зависимому протеолизу протеасомами, то есть проходит по классическому пути утилизации р-катенина. Отрицательная корреляция выявлена и для экспрессии гельзолина, кофилина-1 и тимозина Р4 и активности 20Б пула протеасом. Стоит отметить, что снижение экспрессии кофилина-1 коррелировало с повышением экспрессии РА28Р, субъединицы активатора 208 протеасом.

При ГЭ наблюдалась несколько иная картина. Так, повышение активности 268 пула протеасом сопровождалось снижением экспрессии АгрЗ и гельзолина, в то время как активность 208 протеасом коррелировала с содержанием в клетке тимозина Р4. Экспрессия же р-катенина в гиперплазированном эндометрии обратно коррелировала как с активностью 208 пула протеасом, так и с кальпаиновой активностью, что указывает на возможность его альтернативной регуляции при ГЭ.

р-катенин

тимозин |М

кофилин-1

Рис. 1 - Схема возможного участия протеасом в прогрессии рака эндометрия

Выявленные особенности патогенеза гиперпластических процессов и РЭ позволили выделить дополнительные объективные прогностические критерии. С учетом этих критериев была разработана математическая модель для оценки онкологического риска у больных с ГЭ, а также обозначены дополнительные критерии прогноза течения РЭ.

Математическая модель для оценки онкологического риска у больных с ГЭ была построена с помощью дискриминантного анализа. Наиболее информативными показателями явились активность капьпаинов, возраст пациентки и активность 20S пула протеасом. Дискриминантные функции имели следующий вид:

Yl=0,0285xX1+0,0091xX2+0,5429xX3-0,0031xX4-14,6595;

Y2=0,0517xXl+0,0239xX2+0,6568xX3-0,0072xX4-21,0753,

где XI — активность кальпаинов, Х2 — тотальная активность протеасом, ХЗ — возраст пациентки, Х4 — активность 20S пула протеасом.

При Y1>Y2 объект относится к классу с низким риском развития РЭ (менее 5%), при Y1<Y2 объект относится ко второму классу — высокий риск развития РЭ. Чувствительность и специфичность разработанной модели составили 77% и 100%, соответственно, что позволяет планировать адекватный объем лечения этой категории пациентов в рамках вторичной профилактики РЭ.

Были проанализированы результаты общей и безрецидивной 3-летней выживаемости во взаимосвязи с параметрами протеасомной системы. Сроки наблюдения за больными составили от 2 до 38 месяцев, среднее время наблюдения - 18 месяцев. В результате установлено, что статистически значимыми факторами в отношении 3-летней безрецидивной выживаемости у больных РЭ являются стадия заболевания, степень дифференцировки опухоли и тотальная активность протеасом (рис. 2); в отношении 3-летней общей выживаемости — экспрессия субъединицы протеасом LMP2 (рис. 3).

Установлено, что высокая (более 80x103 Ед/мг) тотальная активность протеасом является неблагоприятным фактором в отношении риска развития рецидивов. По-видимому, более высокая активность протеасом свидетельствует о более активном обмене белков-субстратов протеасом, принимающих участие в критических процессах для опухолевой прогрессии.

Выявлено, что высокая (более 250%) экспрессия иммунной субъдиницы LMP2 в ткани РЭ по сравнению с неизмененной тканью является неблагоприятным фактором в отношении общей выживаемости. Полученные результаты согласуются с данными о повышении экспрессии этой субъединицы с увеличением глубины инвазии опухоли в миометрий. Таким образом, иммунные ЬМР2-содержащие протеасомы в злокачественной ткани осуществляют неиммунные функции.

1,00

°£ 0,95

I-

о

£ 0,90

5

X

0 0,85 к

СО X

1 0,80

I 0,75

Ю Ш

0,70

0,65 _

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50.... менее 804 ООО Ед/мг Срок наблюдения, мес.

Рис. 2 — Показатели 3-летней безрецидивной выживаемости больных раком эндометрия в зависимости от тотальной активности протеасом

<-н—н-м--*" I I

I 6++-.

0 ■

¿^ -«-м-—...... 0—!

! Сн р=0,048

¿4-!-Н < >4-!-!—Н-Н-

г.........

О

р=0,03

15 20 25 30 35 40 45 50.. Срок наблюдения, мес.

- ШР2<250% • 1Л!Р2>250%

Рис. 3 - Показатели 3-летней общей выживаемости больных раком эндометрия в зависимости от экспрессии протеасомной субъединицы ЬМР2

Заключение

В целом, представленные в работе данные свидетельствуют о том, что протеасомная и кальпаиновая системы играют важную роль в патогенезе рака эндометрия, обуславливая его инвазивный рост. По-видимому, участие протеолитических систем в процессе инвазии связано с регуляцией ими белков, ассоциированных с клеточной подвижностью. Кроме того, протеасомы и кальпаины оказывают влияние на характер течения и прогноз заболевания, что позволило выделить объективные информативные критерии прогноза общей выживаемости и рецидивирования РЭ. Разработана математическая модель для оценки риска развития РЭ у больных с гиперпластическими процессами эндометрия, что позволяет проведение мероприятий по вторичной профилактике и ранней диагностике РЭ.

ВЫВОДЫ

1. В злокачественной ткани эндометрия выявлено повышение активности всех пулов протеасом по сравнению с гиперплазированной тканью, причем тотальная активность и активность 20S пула значимо возрастали уже при 1а стадии РЭ.

2. Установлено изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ как по сравнению с неизмененной тканью, так и по сравнению с гиперплазированным эндометрием. В злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц (ala2a3a5a6a7, LMP2, LMP7, PA28ß и Rpt6) относительно их экспрессии гиперплазированном эндометрии.

3. У больных РЭ выявлено повышение активности кальпаинов по сравнению с ГЭ, отмечаемое уже при 1а стадии. Достоверных различий между активностью кальпаинов в мапигнизированной и визуально неизмененной ткани не обнаружено.

4. При РЭ выявлено повышение активности протеасом и кальпаинов, а также экспрессии субъединиц LMP2 и PA28ß с увеличением глубины инвазии опухоли в миометрий, а также повышение активности пулов 26S и 20S протеасом и активности кальпаинов в ткани РЭ III стадии по сравнению со II стадией. Отмечена тенденция к снижению активности кальпаинов при снижении степени дифференцировки опухоли и тенденция к повышению активности кальпаинов в постменопаузальном периоде.

5. При РЭ наблюдалось повышение экспрессии локомоторных белков по сравнению с ГЭ: актинветвящего белка АгрЗ (повышение на 28%), гельзолина (повышение на 33%) и тимозина ß4 (повышение на 29%). Отличия обнаруживаются уже на I стадии РЭ. Различий в экспрессионном профиле локомоторных белков при разных типах ГЭ не выявлено.

6. Выявлены взаимосвязи между активностью внутриклеточных протеиназ и экспрессией локомоторных белков, различающиеся в тканях РЭ и ГЭ. При РЭ с активностью протеасом было связано содержание в клетках кофилина-1, тимозина ß4 и ß-катенина. При ГЭ выявлена корреляция между

активностью протеасом и экспрессией кофилина-1, в то время как экспрессия тимозина 4р и р-катенина были связаны с активностью как протеасом, так и кальпаинов.

7. Показатели протеасомной системы могут использоваться в качестве дополнительных критериев прогноза течения РЭ. Высокая (более 80х103 Ед/мг) тотальная активность протеасом является неблагоприятным фактором в отношении риска развития рецидивов. Высокая (более 250%) экспрессия иммунной субъединицы ЬМР2 в ткани РЭ по сравнению с неизмененной тканью является неблагоприятным фактором в отношении общей выживаемости.

8. Разработана математическая модель для оценки онкологического риска у больных, страдающих ГЭ. Наиболее информативными показателями явились активность кальпаинов, возраст пациентки и активность 205 пула протеасом. Чувствительность и специфичность разработанной модели составили 77% и 100%, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При формировании групп повышенного риска по развитию РЭ у больных с ГЭ необходимо учитывать показатели внутриклеточного протеолиза. Оценка риска развития РЭ рассчитывается с помощью линейных дискриминантных функций:

У1 = 0,0285 хХ1+0,0091 хХ2+0,5429хХЗ-0,0031 хХ4-14,6595;

У2=0,0517хХ1+0,0239хХ2+0,6568хХЗ-0,0072хХ4-21,0753,

где XI — активность кальпаинов, Х2 — тотальная активность протеасом, ХЗ

— возраст пациентки, Х4 — активность 20Б пула протеасом.

Процедуру отнесения объекта к классу необходимо проводить в два этапа. На первом этапе рассчитываются значения У1 и У2 с использованием значений показателей у исследуемого объекта. Далее объект (больную с ГЭ) относят к одному из классов на основании следующих неравенств: если У1>У2, то объект относится к первому классу (риск развития РЭ менее 5%); если У1<У2, то объект относится ко второму классу (высокий риск развития РЭ).

2. У больных РЭ для прогнозирования течения заболевания наряду с клинико-морфологическими факторами рекомендовано использовать определение тотальной активности протеасом в ткани опухоли и экспрессии субъединицы протеасом ЬМР2. Необходимо учитывать, что фактором высокого риска рецидива в течение трех лет после лечения является уровень тотальной активности протеасом выше 80хЮ3 Ед/мг. Фактором, неблагоприятным в отношении общей выживаемости высокая (более 250%) экспрессия субъединицы ЬМР2 в ткани РЭ по сравнению с неизмененной тканью.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коваль В.Д. Активность протеасом и их субъединичный состав при раке и гиперпластических процессах эндометрия на фоне метаболического синдрома [Текст] / Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, В.Д. Коваль, Л.А. Коломиец, АЛ. Чернышова, Н.П. Шарова // Актуальные вопросы онкологии : материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-летию онкологической службы Красноярского края, 17 декабря 2010 г. С. 105-106.

2. Коваль В.Д. Активность протеасом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия [Текст] / Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышова, О.Н. Асадчикова, Н.П. Шарова, В.Д. Коваль // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2011. - №4. — С. 64-67.

3. Коваль В.Д. Активность и субъединичный состав протеасом в опухолях женской репродуктивной системы [Текст] / И.В. Кондакова, Л.В. Спирина, Е.Е. Шашова, В.Д. Коваль, Л.А. Коломиец, Е.М. Слонимская, А.Л. Чернышова, Н.П. Шарова // Вопросы онкологии. - 2011. - Т.57. - С.39.

4. Коваль В.Д. Активность и субъединичный состав протеасом в доброкачественных и злокачественных новообразованиях эндометрия [Текст] / В.Д. Коваль, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, О.В. Шпилева // Онкохирургия. - 2011. - Т. 3, №4. - С. 82-83.

5. Коваль В.Д. Активность и субъединичный состав протеасом в гиперплазированном и неоплазированном эндометрии [Текст] / В.Д. Коваль, Л.В. Спирина, О.В. Замкова, АЛ. Чернышова // Сибирский онкологический журнал,-2011.-Прил.№ 1.-С. 62-63.

6. Коваль В.Д. Активность протеасом в опухолях женской репродуктивной системы [Текст] / И.В. Кондакова, Л.В. Спирина, Е.Е. Шашова, В.Д. Коваль, Л.А. Коломиец, АЛ. Чернышова, Е.М. Слонимская // Биоорганическая химия. — 2012. — Т. 38, № 1. - С. 106-110.

7. Коваль В.Д. Регуляция инсулнноподобных факторов роста и NF-kB протеасомной системой при раке эндометрия |Текст] / Л.В. Спирина, Н.В. Бочкарева, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, Е.Е. Шашова,

B.Д. Коваль, А.Л. Чернышова, О.Н. Асадчикова // Молекулярная биология. - 2012. - Т. 46, № 3. - С. 452-460.

8. Коваль В.Д. Роль убиквитнн-протеасомнон системы в развитии рака эндометрия [Текст] / В.Д. Коваль, И.В. Кондакова, Л.В. Спирина // Вопросы онкологии. - 2012. - Т. 58. - №4. - С. 473-480.

9. Коваль В.Д. Активность протеасом и их субъединичный состав в ткани рака эндометрия: связь с клинико-морфологическими параметрами [Текст] / Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, В.Д. Коваль, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышова, ЕЛ. Чойнзонов, Н.П. Шарова // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. — 2012. — Т. 153, №4. —

C. 491-494.

10. Коваль В.Д. Протеолитическая регуляция экспрессии ростовых факторов и HIF-1 при раке эндометрия |Текст] / Л.В. Спирина,

H.В. Юнусова, И.В. Кондакова, JI.A. Коломиец, В.Д. Коваль, АЛ. Чернышева, О.В. Шпилева // Сибирский онкологический журнал. -2012.-№2.-С. 45-51.

11. Коваль В.Д. Активность протеасом и кальпаинов при новообразованиях эндометрия [Текст] / В.Д. Коваль, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, О.В. Шпилева // Молекулярная медицина. - 2012. - №4. - С. 45-48.

12. Koval V.D. Association of growth factors, HIF-1 and NF-кВ expression with proteasomes in endometrial cancer [Текст] / L.V. Spirina, N.V. Yunusova,

I.V. Kondakova, L.A. Kolomiets, V.D. Koval, A.L. Chernyshova, O.V. Shpileva // Molecular Biology Reports. - 2012. - 39(9). - P. 8655-62.

13. Коваль В.Д. Внутриклеточные протеиназы в новообразованиях эндометрия и регуляция ими белков, ассоциированных с клеточной подвижностью [Текст] / В.Д. Коваль, Л.С. Спирина, О.В. Шпилева // Сибирский онкологический журнал : научно-практическое издание. - 2012. - Прил.№1. -Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: седьмая региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н. В. Васильева. - С. 81-82.

14. Коваль В.Д. Экспрессия В-катенина и актинсвязывающих белков в доброкачественных и злокачественных новообразованиях эндометрия [Текст] / В.Д. Коваль, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышева, О.В. Шпилева // Высокие технологии в онкологии : материалы Российской научно-практической конференции с международным участием 26-27 июня 2012 г. / РАМН РОНЦ им. H. Н. Блохина, Алтайский филиал, Администрация Алтайского края, Главное Управление по здравоохранению и фармацевтической деятельности, Алтайский краевой онкологический диспансер, Алтайский государственный медицинский университет. -Барнаул : Азбука, 2012. - С. 70-71.

15. Коваль В.Д. Актин-связывающие белки, их регуляция и связь с инвазией и метастазированием злокачественных новообразований [Текст] / И.В. Кондакова, Н.В. Юнусова, В.Д. Коваль, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышова // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» : Материалы симпозиума. — Уфа: ИСЭИ УНЦ РАН, 2013.-С. 100.

16. Коваль В.Д. Определение онкологического риска у больных с гиперпластическими процессами эндометрия на основе показателей внутриклеточного протеолиза / В.Д. Коваль, Л.В. Спирина, Ю.М. Былина // Сибирский онкологический журнал : научно-практическое издание. - 2013. -Прил.№1. - VIII региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» : материалы конференции. — С. 52-53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЭ — гиперпластические процессы эндометрия РЭ — рак эндометрия

ALLN - N-ацетил-лейцин-лейцин-норлейциналь, ингибитор кальпаиновой активности

Агр 3 — actin-related protein 3, компонент актин-ветвящего комплекса Агр 2/3 EGFR — epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста

LMP - low molecular mass polypeptide, иммунные субъединицы протеасом

РА28 - proteasome activator, активаторная частица протеасом

Rpt6 - regulatory particle aTpase 6, регуляторная субъединица протеасом

Suc-LLVY-AMC — 1Ч-сукцинил-лейцин-лейцин-валин-тирозин-7-амино-4-

метилкумарин

Z-LLY-FMK - Z-лейцин-лейцин-тирозин-флюорометилкетон, ингибитор кальпаина-2

Тираж 100 экз. Заказ 834. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. (3822) 533018.