Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов при меланоме кожи человека

На правах рукописи

И046У2320

КОВАЛЕВСКИИ ДМИТРИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ ПРИ МЕЛАНОМЕ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

14.01.12 - онкология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2010

2 О ВД 2010

004602320

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий и отделении биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН.

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук Бибилашвили Роберт Шалвович кандидат медицинский наук Михайлова Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Прасолов Владимир Сергеевич

доктор биологических наук, профессор Бочарова Ольга Алексеевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук

Медико-генетический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится <&у> текл. 2010 г. в часов на

заседании диссертационного Совета (Д.001.17.01) Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина

РАМН.

Автореферат разослан « 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного сове: доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Меланома кожи является одним из наиболее агрессивных заболеваний среди покачественных новообразований кожи. В последние десятилетия частота озникновения этой болезни значительно увеличилась и продолжает неуклонно озрастать. Несмотря на современные методы лечения меланомы отдаленные езультаты неудовлетворительные. Меланома считается «антигенной пухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные нтигены. Эти антигены используются при вакцинотерапии, которая является дним из методов лечения онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена. Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно кспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы:

(1) раково-тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, CTAG1B, SSX2),

(2) дифференцировочные антигены меланоцитов (TYR, MLANA, SILV, TYRP1,

DCT) и (3) мутированные антигены (MUM1, CDK4, CTNNB1, CDKN2B,

B3GALT5). С иммунологической точки зрения раково-тестикулярные антигены

могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в

нормальных тканях эта группа антигенов не экспрессируется за исключением

ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за

отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками и

отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса. В отличие от раково-

тестикулярных антигенов, иммуногенность дифференцировочных антигенов

меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим"

антигенам, за исключением гена MLANA, антиген которого содержит

1

несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цнтотоксическими

лимфоцитами) и способен индуцировать генерацию меланомо-специфичных ЦТЛ. Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. При использовании раково-тестикулярных антигенов (РТА), меланоцитно-дифференцирующих антигенов (МДА) при вакцинотерапии рака (по определению Яеяй/о N. и Бгпо1 М. - «вакцинотерапия - это метод, основанный на использовании любого антигена или комплекса антигенов (с или без адъювантом) для модуляции иммунного ответа») необходимо определить количество антигенов на опухолевых клетках и их изменчивость в процессе метастазирования. Развившиеся в последние годы интенсивные исследования РТА в различных опухолях, начиная с 1997 года опубликовано около 1500 статей, открыли новые возможности для разработки новых подходов диагностики и лечения опухолей. Исследования выявили существенные проблемы: (1) почему, несмотря на иммуногенность антигена при иммунотерапии не возникает регрессии опухоли, и нет реальных успехов в лечении; (2) какие прогностические факторы оказывают влияние на дальнейшие течение меланомы у больных; (3) какое значение имеет экспрессия генов РТА у больных с меланомой.

Актуальность данных проблем определила выбор исследования экспрессии генов РТА в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях, метастазах меланомы в лимфатические узлы для установления необходимости подбора индивидуального лечения методом вакцинотерапии и возможности прогноза течения заболевания с учетом данных экспрессии генов РТА. В связи с этим целью настоящей работы явилось: исследование значения экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов для прогноза и течения опухолевого процесса у пациентов с меланомой кожи.

Задачи исследования 1. Составить карты экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов (РТА), генов меланодифференцировочных антигенов (МДА) и генов маркеров

меланомы (ММ) в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях, метастазах меланомы в лимфатические узлы.

2. Провести анализ корреляции экспрессии набора генов с морфологическими признаками клеток меланомы.

3. Сравнить экспрессию набора генов в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях и метастазах меланомы в лимфатические узлы.

4. Исследовать корреляцию между экспрессией набора генов, образованием новых метастазов и выживаемостью пациентов.

Научная новизна

В данной работе показано наличие отрицательной корреляции между уровнем экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов и степенью дифференцировки клеток меланомы. Показана корреляция экспрессии исследуемого набора генов с продолжительностью жизни пациентов после операции и сроком появления у них новых метастазов.

Практическая значимость Полученные результаты экспрессии исследуемых генов предоставляют возможность количественно оценить степень злокачественности опухолевых клеток меланомы, а также определяют выбор антигенов клеточной линии для вакцинотерапии. Предложены новые прогностические факторы выживаемости пациента после хирургической операции и временем до прогрессирования.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научной

конференции с участием лаборатории экспериментальной диагностики и

биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории

фармакологии и токсикологии, лаборатории фармакоцитокинетики,

лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории лучевых методов

лечения опухолей, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории

трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии

опухолей и отделения биотерапии НИИ клинической онкологии РОНЦ им. H.H.

Блохина РАМН, состоявшейся 25 февраля 2010 года; и на межлабораторном

3

семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, состоявшемся 17 марта 2010г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе две статьи, и трое тезисов на международных конференциях. Одна статья принята к печати в журнал «Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН».

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков, 10 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Литература». Библиографический указатель включает 56 отечественных и 181 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культуры клеток меланомы. Двадцать одна клеточная линия диссеминированной меланомы кожи человека охарактеризована по морфологическим признакам и получена на 15 пассаже из лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМН. Цитоморфологические исследования позволили разделить полученные линии на три группы: Н - высоко, I - умеренно и Ь - низкодифференцированные. Биопсия первичной меланомы. Исследованию подвергалась ткань опухоли 29 больных первичной меланомой кожи после выполнения хирургического иссечения (на рисунках 2 и 4 обозначены номерами С№4>1>Г). Все больные находились на лечении в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 1998-2002 гг. После хирургической операции часть опухолевого образца использовали для гистологического исследования, другую часть хранили в жидком азоте или при температуре - 75°С до выделения РНК.

Клиническая характеристика пациентов с первичными опухолями.

Для исследования влияния клинических факторов на экспрессию генов РТА на уровне мРНК в первичных опухолях меланомы кожи были отобраны следующие клинические признаки: пол; возраст; площадь опухоли; локализация опухоли, общая выживаемость. Распространённость процесса оценивалась как I-III стадия по системе AJCC, (2002): стадия I (толщина по Breslow 1,8-2,2 мм; п=3; мужчины/женщины=0/3; возраст 49-71), стадия II (толщина по Breslow 1,5-8.0 мм; п=22; мужчины/женщины =13/9; возраст 1584), стадия III (толщина по Breslow >8.5-18.0 мм; п=4; мужчины/женщины =2/2; возраст 46-80). Опухоли у всех 29 пациентов имели вертикальную фазу роста и уровень инвазии по Clark II-V. Исходными материалами для исследования времени жизни пациентов после операции служили первичные учетные документы за период с 1998 по 2009 г. Извещения были выверены по историям болезни и амбулаторным картам отделений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН и онкологических диспансеров. При расчете выживаемости были учтены лица с диагнозом, поставленным при аутопсии.

Морфологическая характеристика образцов тканей первичной опухоли. Для

исследования влияния морфологических факторов на экспрессию РТА в

первичных опухолях меланомы и метастазах меланомы в лимфатические узлы

было отобраны следующие морфологические признаки: толщина опухоли по

Breslow; уровень инвазии по Clark; изъязвление опухоли; лимфатическая

инфильтрация (слабая, умеренная, выраженная); наличие метастазов и время их

выявления после удаления первичной опухоли; локализация метастазов;

митотический индекс. Гистологический анализ. Гистологические срезы

первичной опухоли меланомы окрашивали гематоксилин-эозином.

Пролиферативную активность первичных опухолей определяли по

митотическому индексу, который вычисляли как количество делящихся клеток

на 1 мм2 на гистологических препаратах первичной опухоли меланомы кожи.

Биопсии метастазов меланомы в лимфатические узлы. Десять тонко-игольных

аспирационных биопсий (ТАБ) метастазов меланомы (получены у больных,

отличающихся от больных с первичной опухолью) в лимфатические узлы взяты

5

у пациентов, которые получали различные виды лечения

(химиотерапию, иммунотерапию и хирургическое лечение). Распространённость процесса оценивалась как II-VI стадия по системе AJCC (2002): стадия II (п=6; мужчины/женщины=2/4; возраст 41-51), стадия III (п=3; мужчины/женщины =3/0; возраст 45-61), стадия VI (п=1; мужчины/женщины =0/1; возраст 64). На рисунке 2 ТАБ обозначены номерами от 1 до 10. Все больные находились на лечении в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в 2006-2007 гг. После биопсии одну часть ткани использовали для цитологического исследования с окрашиванием препаратов по Лейшману, другую часть хранили в жидком азоте и при температуре - 75°С.

Молекулярно-биологические методы исследования. Суммарную РНК из культур опухолевых клеток меланомы выделяли в соответствии с рекомендациями фирмы CLONTECH (Mountain View, USA), методом с применением кислого фенола, гуанидина тиоционата (NH2C(=NH)NH2HSCN) и аммония тиоционата (NH4SCN). В работе использовались реактивы фирмы Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Для реакции обратной транскрипции использовали обратную транскриптазу M-MLV, реактивы и протокол фирмы Promega (Madison, USA). Последовательности нуклеотидов ген-специфических праймеров (таблица 1) были выбраны при помощи программы ОН991 и синтезированы на фирме «Синтол»2. Последовательность мРНК была получена из баз данных UniGene3 и AceView4. Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов против геномной и мРНК последовательностей

1 — ОН99 (Техноген, Москва, Россия), [online] [Обращение к документу: 01.12.2009]. Доступ через http://www.technogene.ru.

" — Синтол (Москва, Россия), [online] [Обращение к документу: 01.12.2009]. Доступ через http ://www.syntol .ru/.

3 — Unigene/Genbank. // National Center for Biotechnology Information, [online] [Обращение к документу: 01.12.2009]. Доступ через http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi7db-unigene.

4 — AceView. // National Center for Biotechnology Information, [online] [Обращение к документу: 01.12.2009]. Доступ через

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/index.html.

6

проводили при помощи программы BLAST5. Для гена

глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (G3PDH) использовались праймеры фирмы CLONTECH (Mountain View, USA). В данной работе проанализирована транскрипционная активность набора генов, данные по которым суммированы в таблице 1. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в программируемом термостате фирмы Hybaid, (Waltham, USA). кДНК (1/100 часть объёма реакции обратной транскрипции) амплифицировали с 0,5 мкМ ген-специфических олигонуклеотидов и 2,0 ед. ДНК-полимеразы Thermus Aquaticus (БиоМастер, Москва, Россия). Амплификацию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 0,01 М Трис-HCl (pH 8,5 при 25°С), 0,05 М KCl, 0,002 М MgCb, 10 мкг/мл желатина, 200 мкМ каждого dNTP, 200 мкг/мл антител "TaqStart" (CLONTECH, Mountain View, USA). Для всех опытов ПЦР проводили по схеме: 94°С - 30 с, 60°С - 60 с, 72°С - 1 мин - 35 циклов. 72°С - 7 мин. Результаты ПЦР анализировали электрофорезом 5 мкл реакционной смеси в 1.5% агарозном геле в трис-ацетатном (ТАЕ) буфере с 0,002% бромистого этидия.

Таблица 1. Список генов

Название ампликона Имя гена Символ гена (HGNC)* * * « Я о. Е [ Кластер генов*** Кластер генов**** Кластер генов*****

Гены, снижение или потеря активности которых ассоциированы с метастазами меланомы и плохим прогнозом.

NME1 non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in; нуклеозид дифосфат киназа, ингибитор экспресии EDG2 -рецептора фосфолипида LPA (лизофосфатидной кислоты) NME1 NMJ98175 н/д н/д G2c

CDKN2A cyclin-dependent kinase inhibitor 2 A (melanoma, pi 6, inhibits CDK4); ингибитор циклина CDK4; онкосупрессор 1, MTS1 CDKN2A NM_000077 н/д н/д G2b

TRPM1 transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1; метастатин, cynpeccop метастазирования меланомы, ассоциирован с рецидивами меланомы. TRPM1 NM_002420 н/д н/д G2b

5 — BLAST. //National Center for Biotechnology Information: [online] [Обращение к документу: 01.12.2009]. Доступ через http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

Название ампликона Имя гена Символ гена (HGNC)* мРНК ** Кластер генов*** Кластер генов**** Кластер генов*****

DPP4 dipeptidyl-peptidase 4; связывающаяся с фибронектином плазма-мембранная дипепдидил пептидаза 4, супрессор метастазирования. DPP4 NM_001935 н/д н/д G2a

Гены, усиление активности которых или увеличение концентрации их продуктов ассоциированы с метастазами меланомы и плохим прогнозом.

BCL6 B-cell CLL/lymphoma 6; POZ- доменнный корепрессор транскрипции, онкоген. BCL6 NM_001706 н/д н/д G2a

SPP1 secreted phosphoprotein 1, остеопонтин OPN, экспрессия коррелирует с инвазивностъю меланомы. SPP1 NMJ)01040058 н/д н/д G2a

TNC tenascin С;тенасцин С, компонент межклеточного матрекса, вместе с FN1 формирует образование лимфатических сосудов, экспрессия коррелирует с инвазивностью меланомы TNC NM_002160 н/д н/д G2a

FN1 fibronectin 1, Фибронекгин, компонент межклеточного матрикса, вместе с TNC формирует образование лимфатических сосудов, экспрессия коррелирует с инвазивностью меланомы FN1 NM_212482 н/д н/д G2a

Антигены (раково-тестикулярные), кодируемые этими генами, узнаются аутологичными цитотоксическими лейкоцитами. Экспрессируются в разнообразных опухолях, но не в нормальных тканях, за исключением тестикул, плаценты и незрелых (Властных) клеток различной природы.

MAGE-B1 melanoma antigen family В1, тестикулярный антиген MAGEB1 NM_002363.3 Gla gla Gl

MAGE-B2 melanoma antigen family B2, тестикулярный антиген MAGEB2 NM_002364.3 Gla gla Gl

GAGE-1-8 G antigen 1,2C, 3,4,5,6,7; тестикулярные антигены GAGE1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 NM_001468.1 Gib gib Gl

GAGE3 G antigen 3, тестикулярный антиген GAGE3 U19144 Gib Rib Gl

GAGE-4-7 G antigen 4, 5, 6, 7; тестикулярные антигены GAGE4, 5, 6,7 NM_002045 Gib gib Gl

MAGE-C1 melanoma antigen family CI; не имеет четко выраженой тканевой специфичности MAGEC1 NM_005462.2 Glc gla Gl

MAGE-A4 melanoma antigen family А 4; не имеет четко выраженой тканевой специфичности MAGEA4 NM_002362.3 Gib gla Gl

BAGE В melanoma antigen; не имеет четко выраженой тканевой специфичности BAGE NM_001187 Glc gla Gl

Белки этих генов являются специфичными для опухолей и нор узнаются аутологичными цитотоксичными Т-лимфоцитами. О тестикулах, так и в яичниках, плаценте и п мальных лимфобластов. Они ia6o экспрессированы, как в ростате.

MAGE-A1 melanoma antigen family A, 1 (directs expression of antigen MZ2-E) MAGEA1 NM_004988.3 Glc gla Gl

MAGE-А10 melanoma antigen family A, 10 MAGEA10 NM_021048.3 Glc gla Gl

MG-A3 melanoma antigen family A, 2 ,3,6,12 MAGEA2, A3, A6, A12 NM_005362.3 G2a g2a Gl

MAGEA1 2 melanoma antigen family A, 12 MAGEA12, A2, A6, A3 NM_005367.3 G2a g2a н/д

MG-A2 melanoma antigen family A, 2 ,3,6,12 MAGEA2, A3, A6, A12 NM_175743.1 G2a g2a Gl

MAGEA6 melanoma antigen family A, 6 MAGEA6, A3, A12, A2 NM_005363.2 G2a g2a н/д

Название ампликона Имя гена Символ гена (HGNC)* # « M я о. s Кластер генов*** Кластер генов**** Кластер генов*****

CTAG1A Меланоцитный дифференцирующий антиген.(СТАС1) cancer/testis antigen 1 A, IB, 2 CTAG1A, IB, 2 NM_001327 G2a gla G2b

Дифференцировочные меланомные антигены. Компоненты меланосомы, участвуют в меланогенезе.

SILV silver homolog (mouse); gplOO; pmell7; компонент меланосомного матрикса SILV NM_006928 G2c g2c G2b

MLANA melan-A, Marti, Melanoma antigen recognized byT-cells-1; компонент меланосомного матрикса MLANA NM 005511.1 G2c g2c G2c

TYR tyrosinase (oculocutaneous albinism IA), тирозиназа TYR NM 000372.3 G2c g2c G2c

WARS tryptophanyl-tRNA synthetase, триитофаиил тРНК синтаза WARS NM_004184 н/д g2c G2c

Маркеры меланомы, высокоэкспресснрованы в меланоме.

S100B Са-связывающий белок S100 S100 calcium binding protein В S100B NM_006272.1 G2c g2c G2c

ITGB3 в метастазах меланомы в лимфоузлы нет синтеза интегрина ITGB3; integral, beta 3 (platelet glycoprotein Ilia, antigen CD61) ITGB3 NM_000212 н/д g2b G2b

MFI2 antigen p97 (melanoma associated) identified by monoclonal antibodies 133.2 and 96.5; подавлен в лимфоузлах с метастазами меланомы MFI2 NM005929.3 н/д g2b G2b

MIA melanoma inhibitory activity, секретируемый клетками меланомы белок, ассоциирован с прогрессированием меланомы MIA NMJ06533 н/д g2b G2c

МСАМ melanoma cell adhesion molecule; CD146, MUC18, меланомный адгезин MCAM NM_006500.2 н/д g2b G2c

TIMP1 metallopeptidase inhibitor 1; ингибитор металлопротеиназ; ассоциирован со многими опухолями. T1MP1 NM_003254 н/д g2c G2a

Гены кодирующие белки главного комплекса гистосовместимости.

HLA-E Major histocompatibility complex, class I, E; главный комплекс гистосовместимости, класс I, Е HLA-E, -A, -C, -G NM_002127.3 G2b g2c н/д

HLA-G HLA-G histocompatibility antigen, class I, G; главный комплекс гистосовместимости, класс I, G HLA-G NM_002127.3 G2b g2c н/д

Ген «домашнего хозяйства». Ген глицеральдегидфос( ^одегидрогеназы.

G3PDH | glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [ GAPDH NM_002046.3 | G2b | g2c | G2c

* - названия всех генов, для которых , хотя бы одна из альтернативных версий мРНК амплифицируется использованной парой праймеров.

** - описание каталожного номера мРНК: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/release_notes.html

***- см.рисунок 1

**** - см. рисунок 2

**♦**_ см. рисунок 4

н/д - нет данных

Фотографии гель-электрофореза продуктов ПЦР были оцифрованы при помощи программы ImageQuant фирмы Molecular Dynamics (Sunnyvale, USA) и результаты представлены в произвольных единицах. Для количественной

оценки исследуемых кДНК использовали серийные 4-кратные разведения в 1, 4, 16, 64, 256, 1024 раза (рисунок 4). Для одной кДНК проводился анализ всех 32 генов. В качестве внешнего стандарта использовали продукты амплификации двух генов TYR и SILV. Кривые серийных разведений удовлетворительно описывались гиперболической зависимостью с фиксированным уровнем насыщения не зависящим от гена. Уровни экспрессии генов вычисляли по кривым разведения в зависимости от выхода ПЦР-продукта по отношению к внешнему стандарту.

Методы математического анализа результатов. Для нахождения

независимым способом соответствия между уровнем экспрессии генов в

исследуемых образцах и цитоморфологическими характеристиками клеточных

линий или клинико-морфологическими характеристиками биопсий, было

проведено двумерное иерархическое кластерирование данных ОТ-ПЦР при

помощи программ Майкла Эйзена "Gene Cluster v3", а результаты

визуализировали с помощью программы "Tree View". При анализе экспрессии

генов в культурах клеток меланомы, в первичных опухолях и метастазах

меланомы в лимфатические узлы кластерированию подвергался весь набор

логарифмированных по основанию 2 данных ОТ-ПЦР, нормированных для

каждой культуры на среднюю величину интенсивности полос ОТ-ПЦР генов

HLA-G1, HLA-E и GAPDH для каждой клеточной линии или биопсии ткани

(рисунки 1 и 2). Никакой последующей центровки или нормировки данных не

производилось. Для расчета меры несходства узлов дендрограмм

использовалась корреляция по Спирману или эвклидово расстояние и

коэффициент корреляции Пирсона, с одинаковым результатом. Для

дендрограмм использованы коэффициенты корреляции по Пирсону. При

кластерировании для зондов генов с вырожденной специфичностью

использованы весовые коэффициенты, обратно пропорциональные числу

зондов, соответствующих их вырожденности: для GAGE-1-8 и GAGE-4-7 - 0.5,

для MG-A3, MG-A2, MG-A6, MG-A12-236 - 0.25, HLA-G и HLA-A - 0.5. При

анализе экспрессии генов в первичных опухолях (рисунок 4) кластерированию

подвергался весь набор логарифмированных по основанию 2 данных ОТ-ПЦР,

10

нормированных для каждой первичной меланомы и генов на среднегеометрическое значение интенсивности сигнала по обоим направлениям. Все сигналы были нормированы на среднегеометрическое значение данных всех генов с ненулевым значением интенсивности (SILV, SPP1, МСАМ, BCL6, TIMP1, FN1, MIA, TYR, MLANA, NME1 и G3PDH), логарифмированы по основанию 2 и центрированы. Центрирование производилось по обоим измерениям, по генам и по группам пациентов, так что средние значения логарифма интенсивности сигнала в каждой строчке и в каждом столбце таблицы перед кластерированием были равны нулю. Для расчета меры несходства узлов дендрограмм в этом случае использовали корреляцию по Пирсону и эвклидово расстояние. Стабильность иерархического кластерирования проверялась путем последовательного исключения из анализа одного пациента или одного гена из каждой группы. Корреляцию активности каждого из генов или среднего значения логарифма групп генов с цитоморфологическими или клинико-морфологическими данными проводили по Спирману и по Пирсону, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследования экспрессии генов РТА и ДМА и последующий двумерный иерархический кластерный анализ данных ОТ-ПЦР позволили выделить шесть групп клеточных линий (рисунок 1). Культуры клеток, отнесенные к кластеру 1, являются высоко дифференцированными, к кластерам 2 и 3 -умереннодифференцированными, тогда как к кластерам 4, 5 и 6 -низкодифференцированными. Сопоставление «морфологических» и «генетических» групп указывает на отчетливую корреляцию между делением клеточных культур в соответствии с экспрессией РТА и ДМА генов и классификацией культур по степени их дифференцировки. Коэффициент корреляции между морфологическими ранжированными данными и кластерным ранжированием данных экспрессии генов составляет 0,92. Степень дифференцировки клеток, как графически отображено на рисунке 1, падает слева направо, сопровождаемая ростом числа и степени экспрессии генов РТА.

11

При этом форма клеток, эпителиальная, веретенообразная или невусоподобная, не коррелирует ни со степенью дифференцированности клеток, ни с экспрессией РТА. Интересно отметить, что экспрессия ДМА генов,

m

кластер 12 3

__ ijJli'íIIflSE e'I'b клетки

степень дифференцировкн ц I Gla

G2b G2c

■Sü £ ..... ГС. •~гавв зж_

"5

MAGE-81

МЛОЕ-В:

МАОЕ-А4

OAGE-l-S

0A0R4-7

GAGE3

MAGE-A1

MAGE-A10

MAGE-C1

BAGE

NV-ESO-1

MG-A3

MG-A2

MG-A6

MG-A12036

HLA-ACEG

HLA-G

03PDH

MIAÑA

TYP.

SILV

S100B

0 0.25 0.5 0.75 1.0 коэффициент корреляции

50< 450 850 >1250

уровень экспрессии

Рисунок L Двумерный кластерный анализ экспрессии генов РТА и ДМА методом ОТ-ПЦР в культурах клеток мел ином

Представлены результаты полно связного кластерирования (по обоим направлениям) данных по экспрессии 22 генов в 21 культуре клеток полученных, от пациентов с диссеминированной меланомой. Цветовая шкала, приведенная на двумерной кластерной картине и на врезке, соответствует исходной интенсивности полос на электрофореграммах, а не их логарифмированному преобразованию, использованному для расчета связности при кластерировании. Гены обозначены символами в соответствии с таблицей 1. Шкалы коэффициентов корреляции генов (слева) и культур клеток (сверху) отвечают корреляции для узлов дерева. Дендрограмма культур клеток однозначно разбивает все клеточные линии на 6 групп, отсеченных по коэффициенту корреляции 0,75.

в значительной степени изменяющаяся от кластера к кластеру (например, 1 и 2 или 5 и 6), не коррелирует ни со степенью дифференцировки клеток, ни с их формой, ни с активностью генов РТА. Значение и частота экспрессии генов РТА в клеточных линиях меланомы, полученных от различных метастазов

я «

§

^0.25 а

М4

—0.5

Пациент N5

Стадия

■0.75 ■§■

с* £

нннннндэя — ннннмм;; кО|И1й|С>й1ЫНН М Си Си Си Си й/ Си ь.

т ■ 1 ' * и

■ т 1 ■ Ь' * ■ 1

■ -ж У* ■

к >1 1®:

Ш яяЩ ■ ■ ■ я

1 ■ ■

ЫАСЕ-В1

МЗДЕ-В 2

ЫА<^Е-А4

ЫЗДЕ-АЮ

ЫАОЕ-А1 <

СТЗД1В

<»А«»Е-4-7

ОАСЕЗ

МЗДЕ—С1

взде

ыа-А2

мо-аз

ме-А12-23б

Ы&-А6

МСДЫ

Я100В

МП2 *

ггевз

Ы1А

НЬА-АСЕ<5

«ЗРШ

НЬА-б

ТХЫР1

МАКЯ

ТУЕ

мьама г

ЯТЪЧ ш

0 0.25 0.5 0.75 1.0 Коэффициент корреляции

5 0< 450 850 >1250

уровень экспрессии

Рисунок 2. Двумерный кластерный анализ экспрессии генов РТА и ДМА методом ОТ-ПЦР в первичных опухолях и метастазах меланомы в лимфатические узлы

Представлены результаты полно связного кпастерирования (по обоим направлениям) данных по экспрессии 28 генов в 27 биопсиях, полученных от пациентов с меланомой (РЬ - первичная опухоль, 1_Ы - метастазы меланомы в лимфатические узлы). Цветовая шкала, приведенная на двумерной кластерной картине и на врезке, соответствует исходной интенсивности полос на электрофореграммах, а не их логарифмированному преобразованию, использованному для расчета связности при кластерировании. Гены обозначены символами в соответствии с таблицей 1. Шкалы коэффициентов корреляции генов (слева) и биопсий (сверху) отвечают корреляции для узлов дерева. Дендрограмма биопсий однозначно разбивает все биопсии на б групп, отсеченных по коэффициенту корреляции 0,75.

меланомы, не однородны. Гены, входящие в группу С2а (рисунок 1) генов РТА, экспрессируются более часто и на более высоком уровне, чем другие гены РТА. Для определения распределения активности генов в тканях меланомы были проанализированы паттерны экспрессии в препаратах суммарной РНК случайным образом отобранных 17 первичных опухолей меланомы на

различных стадиях болезни (включая пациентов с дистальными метастазами) и 10 образцов метастазов меланомы в лимфатические узлы (других пациентов). На рисунке 2 показано распределение кластеров генов РТА, МДА и маркеров меланомы.

Сравнение экспрессии генов (рисунки 1 и 2) показывает, что, в общем, экспрессия генов РТА имеет подобное распределение в первичных опухолях, метастазах меланомы в лимфатические узлы и в клеточных линиях меланомы. Наиболее транскрибируются гены в семействах MAGE А2, A3, А6 и А12, а наименьшая экспрессия характерна для генов MAGE В1 и В2. В данном эксперименте использовали экспрессионные данные для первичных опухолей и метастазов в лимфатические узлы для анализа пропорции тканей неспособных экспрессировать «значительный уровень» каждого анализируемого гена или, по крайней мере, одного гена из генов РТА и генов МДА. Случайным образом, приняв уровень «отсечки» за «значительный уровень» интенсивность электрофорезных полос ОТ-ПЦР соответствующих генов равных (или больше) одной трети интенсивности электрофорезной полосы ОТ-ПЦР для гена GAPDH. Это равнозначно темному квадрату на рисунке 2 для пациента №5, зонд для гена MG-A6. Результаты такого анализа показаны на рисунке 3. По крайней мере, один из генов РТА экспрессируег «значительный уровень» в 90% образцов метастазов меланомы в лимфатические узлы по сравнению с 60% образцов первичной меланомы. Ни один из генов РТА не экспрессируется более чем в 60% образцов метастазов меланомы в лимфатические узлы или первичных опухолей меланомы. Гены маркеров меланомы, за исключением MIA показывают тенденцию к снижению экспрессии в метастазах меланомы в лимфатические узлы ITGB3 и MFI2, а также S100В и МСАМ. Гены, кодирующие компоненты меланина в меланосомах, по-видимому, инактивированы случайным образом. Исследовав экспрессию генов раково-тестикулярных антигенов, генов дифференцировочных меланоцитных антигенов и генов маркёров меланомы в клеточных линиях, первичных опухолях и метастазах в лимфатические узлы необходимо было определить

прогностическое значение этих генов на течение опухолевого процесса.

14

I

Q 0.

I 100%

80%

ra 60%

40%

3" 2

о 20%

0%

□ LN ■ PL

»- Í4

4> f ш ш ш ООО

III

?2s

СТА

3 s

Is

gla

Ш III

о о <

o¡¡.v - -

2 S ь s t 5 5 Jisif<«

СТА д1Ь СТА g2a

Макеры мепаномы

íSI

11 s

2 (D Ю

i s s

Мепаносома

Рисунок 3. Вероятность экспрессии генов РТА и МДА в случайно выбранных образцах метастазов лимфатических узлов и первичнох опухолей

Одна треть геометрического среднего значения для интенсивности электрофорезной полосы ОТ-ПЦР GAPDH взято за уровень отсечки для «значительно» экспрессирующихся генов. Верояность получить «значительный уровень» экспрессии в 10 образцах метастазов в лимфатические узлы и 17 образцов первичной меланомы (LN - голубые колонки , PL - коричневые колонки) не от одних и тех пациентов расчитаны и нанесены на график для каждого гена. Отдельно (справа) нанесены на график значения вероятности получить «значителый уровень» экспрессии хотя бы одного гена, принадлежащего к группе 15 генов РТА, одного из 4 генов меланосом (MLANA, SILV.WARS and TYR) и одного из 5 генов маркеров меланомы (MIA, МСАМ, MFI2, S100B and ITGB3). Колонки вероятностей обозначены соответственно Гены РТА, Меланосома и Меланома.

На основании результатов предыдущего исследования и литературных данных, ассоциирующих увеличение активности генов РТА генов с инициацией метастазирования, ожидалось наличие обратной корреляции между активностью РТА генов в первичной меланоме с продолжительностью жизни пациентов. Для решения этой задачи необходимо было проанализировать транскрипционная активность генов РТА, МДА и ММ. Кроме того, в исследование было включено дополнительно восемь генов различной

этиологии: гены BCL6, SPP1, TNC, FN1, - ассоциированы с инициацией

метастазирования, и гены NME1, CDKN2A (INK и ARF), TRPM1, DPP4, - служащие скорее онкосупрессорами (репрессорами метастазирования), утрата их активности ассоциирована с инициацией метастазирования по литературным данным (см. таблицу 1). Предполагалось наличие разнонаправленной корреляции между активностью этих генов и прогнозом заболевания. Полученная в результате картина экспрессии оказалась более сложной, чем ожидалось. Рисунок 4 показывает результаты двумерного кластерного анализа транскрипционной активности 32 генов в 26 препаратах первичной кожной меланомы человека. Дендрограмма в верхней части рисунка выделяет три кластера (группы) пациентов CI, С2 и СЗ с различным течением болезни, отвечающей пятилетней выживаемости в 11%, 100%, и 89% соответственно (с ORci/(C24C3) = 128 и относительным риском RRci/(C2+c3) = 15.1). Средняя продолжительность жизни после операции для первой группы 25±23 месяца (при 95% доверительном интервале в 22 мес., р=0.001, факторе риска смерти 89% и риска метастазирования 100%) и ожидаемое среднее время появления метастазов 6.2 ±4 месяцев. Группа СЗ характеризуется с'голь же высокой пятилетней выживаемостью, как и группа С2 (р = 0.57), но значительно отличается от последней по вероятности метастазирования опухоли за пятилетний срок с фактором риска метастазирования для С2 = 0%, а для СЗ = 56%, при ожидаемом времени появления метастазов 18.6±14 мес., (95% доверительном интервале 12 мес., р = 0.015). Если рассматривать принадлежность генной экспрессии в первичной опухоли к кластеру С1 в качестве независимого прогностического теста на выживаемость пациента после операции, то специфичность и чувствительность такого теста в соответствии с приведенными данными составляет 90% и 94% соответственно, что значительно превышает показатели других прогностических тестов, включая измерение митотического индекса, гистологических и других описанных в литературе тестов для больных с меланомой.

С1

Выживаемость 1 ИЗ 9 Метастазирование 9 ИЗ 9 г

п^рГП

С2 8 из 8 тО из 8

СЗ 8 из 9 5 из 9

-0.06 0.26

-ОН 0.40

0-45 0.43

-0.06 0.21

-0.11 -0.18

-0.08 0.00

-0.2Б -0.12

-0.41 -0.12

-0.32 -0.06

-0.17 -0.10

0.20 -0.25

-0.32 -0.31

0.28 0.49

0.13 0.22

■ОМв 0.07 0.22 0.35 -0.56 -0.11 -0 44

0.34

Относительная концентрация мРНК

О 33 0.18 •0.30 0.55

0.41 -0.38

-0 66 0.48

0.51 0.20

0.68 -0 33

0.07 0.17

0.62 0.45 0.16 0 10

0.06 -0.51

-0.34 -0.41

Рисунок 4. Двумерный кластерный анализ экспрессии генов РТА и ДМА методом ОТ-

ПЦР в первичныхмеланомах кожи человека

Представлены результаты полно связного кластерирования (по обоим направлениям) данных по экспрессии 32 генов в 26 первичных меланомах. Гены обозначены символами в соответствии с таблицей 1. Справа от картины двумерного кластерирования приведена таблица коэффициентов корреляции между уровнем экспрессии генов и временем появления новых метастазов; уровнем экспрессии генов и временем между операцией по удалению первичной меланомы и смертью пациента. Уровни коэффициентов с р< 0.08 отмечены цветом зеленым при благоприятном прогнозе (позитивной корреляции), красным и розовым при негативной корреляции.

Напротив распределение пациента по картине экспрессии генов к группе С2 со специфичностью 78% и чувствительностью 100% предсказывает состояние полного выздоровления, а отнесение пациента по карте экспрессии генов к группе СЗ, хотя и предсказывает высокую вероятность пятилетней выживаемости, но одновременно предсказывает, что с вероятностью 56% за пятилетний период после операции у пациента появятся метастазы.

азсс I п ш Пациент № з§шгШ§995з1з!УЗш§3

Появление метастазов (мес.) 4,00100 и £ Й £ °

Мнтотическнн индекс Продолжительность наблюдения (мес.) * 3 о 2 3

Пациент А-жив, Б умер ¿¿¿¿¿¿¿о¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿^

МС-А2 (ШДЗ-М МАБЕ-А1 МД6Е-&10 ИАБЕ-В2 МА6Е-В1 БАЕЕ-З ВРР4 ГНС ВСЬб Т2МР1 РН1 5РР1 1Т6ВЗ СВКН2А БИЛ? ТИРН1 СТА61 №12 меди

М1Л 5100В

ТУВ МЬДНЙ нюг НМЕ1 БЗРВН

МитотичвскиИ Индекс

Анализ экспрессии генов по кривым Катана - Майера. Несмотря на высокую специфичность и чувствительность метода двумерного кластерирования, он обладает существенным недостатком для практического применения из-за необходимости одновременного анализа множества пациентов. В то же самое время анализ корреляции активности каждого индивидуального больного или каждого отдельного гена не обеспечивает специфичности и чувствительности теста, значительно превышающего чувствительность и специфичность других известных прогностических критериев. Картина двумерного кластерирования генов (левая дендрограмма рисунок 4) и анализ корреляции активности генов со временем жизни пациентов после операции и временем появления у них новых метастазов, а также с другими клинико-морфологическими признаками, позволил выявить группы генов значимо (р< 0.05) положительно коррелирующими или отрицательно коррелирующими с ними. Это группы G2a & G2b, отмеченные на рисунке 4 слева, и отдельные гены, отмеченные справа цветными цифрами, свидетельствующими (при увеличении транскрипции гена): зелеными - о благоприятном прогнозе по обоим клиническим признакам, красными - о неблагоприятном по выживаемости, а розовыми - о неблагоприятном по скорости появления метастазов. Объединение генов в группы со сходным прогностическим профилем и вычисление разности средних значений логарифма нормированной концентрации соответствующих мРНК позволяет получить несколько независимых прогностических критериев, пригодных для характеристики индивидуального пациента без необходимости проведения кластерного анализа. Применение одного из таких критериев (G2b-G2a) для анализа прогноза течения заболевания по кривым Катана - Майера показаны на рисунке 5. Видно, что при (G2b-G2a) < 0 все 100% пациентов выживают более 80 месяцев после операции, и только четверть из них это время живет с медленно прогрессирующими метастазами. В то же время 75% пациентов с (G2b-G2a) > 0 погибает за 80 месяцев, а 60% за 20 месяцев. Новые метастазы у этих пациентов появляются в основном за 10 месяцев, а смерть наступает через 20 месяцев после этого.

месяцы

Рисунок 5. Кривые Каплана - Майера для выживания (синие) и метастазирования

(розовые) для двух групп пациентов Lu Н

Пациенты были отнесены к группе L (G2b<G2a), если отношение среднегеометрических концентраций мРНК генов, входящих в кластер G2a, к среднегеометрическому концентраций мРНК генов входящих в кластер G2b было больше 1, а к группе Н (G2b>G2a), если меньше 1. В кластер генов G2a входят гены SPP1, ТЫС, FN1, DDP4, ITGB3, BCL6 и TIMP1. Среднегеометрическое для них вычисляется с весовыми коэффициентами 6.6, 1.5, 0.3, ¡04.1, 13.4, 17.3, 0.2, обратно пропорциональными представленности данных мРНК в клетке. В кластер генов G2b входят NME1, МСАМ, WARS, S1LV, MLANA, TRPMl, CTAG1, MFI2. Среднегеометрическое для них вычисляется с весовыми коэффициентами 3.6, 1.3, 0.8, 0.1, 0.2, 71.9, 87.7, 32.0, обратно пропорциональными представленности мРНК этих генов в клетке.

Специфичность и чувствительность распределения на группы с

положительным и отрицательным значением (G2b-G2a) по отношению к

смертности составляет 75% и 100%, а по отношению к вероятности оставаться

свободным от признаков заболевания 83% и 75% соответственно, при OR =7.5

и относительном риске RR= 2.6.В заключение стоить отметить, что

теоретически, наилучшими кандидатами для вакцины могут быть

продукты генов РТА. Они не экспрессируются в обычных клетках с НЬА

молекулами, но экспрессируются в большинстве опухолевых клетках.

Многочисленные моновалентные и поливалентные иммунотерапевтические

методы, основанные на использовании РТА, имеют ограниченную

эффективность. Генетическая нестабильность и клональность являются

основными свойствами присущими опухолевому росту. Хорошо известно, что

опухолевые клетки в первичных опухолях чрезвычайно гетерогенны, как в

самой первичной опухоли, так и по сравнению клеток первичной опухоли с

метастазами. Меланома не является исключением, гены РТА в том числе.

Потеря экспрессии генов РТА и антигенпредставляющих молекул в первичной

опухоли в метастазах не редкое событие. Следовательно, не следует ожидать,

что иммуностимулирущее лечение с одним (даже очень хорошо

экспрессирующимся антигеном может полностью уничтожить злокачественные

клетки в формирующейся первичной опухоли или метастазе. Рано или поздно

злокачественные клетки ускользают от надзора иммунной системы. Таким

образом, если иммуностимулирующее лечение успешно против нескольких

антигенов, чья экспрессия положительно коррелирует со злокачественностью

клеток, экспрессирующих антигены, или отрицательно коррелирует с

выживаемостью пациента, то можно надеяться, что лечение уменьшит развитие

болезни посредством удаления более агрессивных клеток и уменьшением числа

клеток в непрерывном состоянии трансформации. Поэтому необходимо

отслеживать гены, кодирующие антигены-мишени и антиген-процессирующие

молекулы. Для каждого пациента, возможно, необходима подходящая

настройка антигенного набора для иммунотерапии с ожидаемым изменением в

антигенном узоре со временем. Анализ экспрессии генов-кандидатов в

биопсиях метастазов опухоли в лимфатические узлы и выбор подходящих

полученных клеточных линий, как продуцентов подходящих антигенов, может

временно помочь решить присущую опухоли проблему нестабильности. Для

реализации этого метода необходимо исследовать изменчивость паттерна

экспрессии генов РТА в биопсиях метастазов опухоли в лимфатические узлы

20

различных пациентов и изменять паттерн в течение последующих обследований в случае рецидива заболевания.

Следовательно, клеточная линия для вакцинотерапии должна иметь максимальное разнообразие генов РТА и до применения вакцинотерапии требуется провести анализ на их экспрессию у пациента. Индивидуальная клеточная линия, предназначенная для использования для вакцинации пациента, должна экспрессировать гены РТА, которые экспрессируются у данного пациента и в первичной опухоли и в метастазах опухоли в лимфатические узлы. Необходимы дальнейшие исследования для определения распределения экспрессии генов РТА и МДА среди множественных локальных микрометастазов у одного пациента, а также динамичность и распределение экспрессии генов в локальных и дистальных метастазах.

Исследование прогностического значения экспрессии набора генов в

биопсии первичной меланомы (см. рисунок 4), полученной после

хирургической операции, является экспериментальным исследованием,

проведенном на небольшом количестве пациентов. Такое количество пациентов

не позволяет их разделить на подгруппы по морфологическому или

клиническому признаку. Исследование не включает в анализ генетические

признаки, такие, например, как наличие полиморфизмов в генах,

ассоциированных с кожной меланомой: наследуемые мутации - CDKN2A ,

CDK4, MC1R, MDM2 и ненаследуемые (соматические) мутации - BRAF, EGF,

NRAS, HRAS, RET, PIK3CA, WT1. Данное исследование прогностического

значения экспрессии набора генов продемонстрировало, что возрастание числа

экспрессирующихся генов РТА не означает короткую выживаемость (до 20

месяцев) для пациентов, а свидетельствует о большей вероятности образования

метастазов в течение 100 месяцев. В субпопуляции пациентов,

экспрессирующих в первичной опухоли хотя бы один из РТА генов, гены

GAGE4, GAGE6 & MAGEC1 показывают значимую (р<0.05) положительную

корреляцию (г>0.4) уровня их экспрессии с продолжительностью жизни

пациентов после операции. Отсутствие связи между корреляцией экспрессии

генов со стадией заболевания и корреляцией ее с прогнозом заболевания

21

характерно не только для генов РТА. Например, при повышенном уровне экспрессии генов GAGE4, GAGE5, GAGE6, MAGEC1, DPP4, FN1 - прогноз по времени жизни после операции и времени до появления новых метастазов благоприятный, а экспрессия GAGE4, GAGES, GAGE6, MAGEC1, FN1 растет со стадией заболевания, a DPP4 падает. При повышенном в первичной опухоли уровне экспрессии генов WARS, MFI2 - прогноз по обоим клиническим признакам неблагоприятный, МСАМ - по времени жизни после операции неблагоприятный и S100B - по времени появления метастазов неблагоприятный, хотя в метастазах меланомы экспрессия MFI2, а также ITGB3 практически отсутствует, а МСАМ и S100В значительно снижена. Данное исследование предлагает независимые прогностические факторы на выживаемость пациента после хирургической операции и склонность опухоли к метастазированию. Анализ экспрессии (на уровне мРНК) выбранных для исследования генов (РТА, МДА, ММ) в биоптатах первичной опухоли позволил разделить всех пациентов на три группы с приблизительно 10% вероятностью выживания в течение 5 лет, с 90% вероятностью выживания при 60% вероятности рецидивирования за тот же срок и с 100% вероятностью выживания при отсутствии признаков заболевания в течении более чем 80 мес. после операции. Тест, опробованный на ограниченной популяции 26 пациентов вертикальной фазы роста опухоли, показал более чем 90% специфичность и чувствительность, и заслуживает апробации на широкой популяции пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена гетерогенность экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов (РТА) в клетках меланомы кожи. Каждый ген экспрессирован не более чем в 60% исследованных образцов первичных опухолей или метастазов меланомы в лимфатические узлы или клеточных линиях меланомы.

2. При снижении степени дифференцировки клеток культуры меланомы возрастает число экспрессирующихся генов раково-тестикулярных антигенов. Обнаружена обратная корреляционная зависимость (р<0.05) между экспрессией

16 генов раково-тестикулярных антигенов (MAGEA 1-3; 6; 10 и 12; GAGE 1-8; BAGE и MAGEC1) и степенью дифференцировки клеток меланомы в культуре.

3. Клеточная линия для вакцинотерапии должна иметь максимальное разнообразие генов РТА, потому что у различных больных экспрессируется различный набор генов РТА. При изучении набора из 22 генов раково-тестикулярных антигенов выявлена экспрессия хотя бы одного гена в 90% исследованных образцов.

4. Увеличенное количество экспрессирующихся генов РТА в первичной опухоли, которое наблюдалось только в одной трети биопсий пациентов, не означает короткую выживаемость (до 20 месяцев) для пациентов, а свидетельствует о большей вероятности образования метастазов в течение 100 месяцев жизни пациентов. В группе пациентов экспрессирующих хотя бы один из РТА генов, гены MAGEB2, MAGEB4, MAGE Al, MAGEA4 & MAGEA10 показывают значимую (р<0.05) положительную корреляцию (г>0.4) с продолжительностью жизни пациентов после операции.

5. Набор экспрессирующихся на уровне мРНК 40 генов (РТА, M ДА, ММ) может использоваться как группа прогностических факторов продолжительности жизни пациента после хирургической операции и риска появления метастазов. Анализ экспрессии (на уровне мРНК) генов в биоптатах первичной опухоли, независимо от наличия у пациентов метастазов и стадии заболевания, позволяет разделить пациентов на три группы: первая группа - с 90% вероятностью смерти в течение 20 месяцев и образованием метастазов, вторая группа - с 10% вероятностью смерти и 60% вероятностью образования метастазов в течение 100 месяцев и третья группа - с 100% вероятностью выживания при отсутствии метастазов в течение 100 месяцев после операции.

6. Показано отсутствие корреляции (р<0,05) между экспрессией дифференцировочных антигенов меланомы (MLANA, TYR, WARS, SILV) и степенью дифференцировки клеток меланомы в культуре.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Л.Ф. Морозова, Е.С. Воронина, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, С. Субраманиан, Т.Т. Кондратьева, Е.А. Черемушкин, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, Р.Ш. Бибилашвили Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. // Сибирский онкологический журнал. — 2010. — Т.1. — С. 29-39.

2. IN Mikhaylova, DA Kovalevsky, LF Morozova, VA Golubeva, EA Cheremushkin, MI Lukashina, ES Voronina, OS Burova, IA Utyashev, SL Kiselev, LV Demidov, RSh Beabealashvilli, AY Baryshnikov. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines. // Melanoma Res. — 2008. — Vol. 18, № 5. — P. 303-313.

3. Д.А. Ковалевский, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Е.С. Воронина, Е.А. Черемушкин, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, H.H. Петенко, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, Р.Ш. Бибилашвили, А.Ю. Барышников Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов при определение степени дифференцировки клеток меланомы кожи. // Сборник статей международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Пущино, 2-4 июня 2009. — 2009. — Т. 1. — С. 55-58.

4. Д.А. Ковалевский, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Е.С. Воронина, Е.А. Черемушкин, И.А. Утяшев, Г. С. Аллахвердян, H.H. Петенко, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, Р.Ш. Бибилашвили, А.Ю. Барышников. Экспрессия раково-тестикулярных генов при определении степени дифференцировки клеток меланомы кожи. Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», 21-22 апреля 2009, Москва. // Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — Т. 8, № 2. — С. 64.

5. И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, В.А. Голубева, H.H. Петренко, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев, Р.Ш. Бибилашвили. Клеточные линии меланомы. Материалы V симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. — 2006. Т. 5, № 4. —

6. И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, Я.В. Вишневская, И.А. Утяшев, В.А. Голубева, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, Е.А. Черемушкин, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, Р.Ш. Бибилашвили. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов в первичной меланоме кожи человека. //Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2010. — Т. 2. — С. (принята к печати).

С. 15.

Подписано в печать: 23.04.2010

Заказ № 3629 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499)788-78-56 www.autoreferat.nj

Актуальность темы.

Меланома кожи является одним из наиболее агрессивных заболеваний среди злокачественных новообразований кожи. В последние десятилетия частота возникновения этой болезни значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать [15]. Несмотря на современные методы лечения меланомы отдаленные результаты неудовлетворительные.

Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные антигены. Эти антигены используются при вакцинотерапии, которая является одним из методов лечения онкологических заболеваний. По определению Restifo N. и Sznol М. [178] «вакцинотерапия — это метод, основанный на использовании любого антигена или комплекса антигенов (с или без адъювантом) для модуляции иммунного ответа». Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена. Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены как правило подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы:

- раково-тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, CTAG1B, SSX2),

- дифференцировочные антигены меланоцитов (TYR, MLANA, SILV, TYRP1, DCT) и

- мутированные антигены (MUM1, CDK4, CTNNB1, CDKN2B, B3GALT5).

С иммунологической точки зрения раково-тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов не экспрессируется за исключением ткани яичек, которые недоступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [66] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [207]. В отличие от раково-тестикулярных антигенов иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Исключением является ген MLANA, антиген которого содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (цитотоксическими лимфоцитами) и способен индуцировать генерацию меланомо-специфичных ЦТЛ. Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета.

При использовании раково-тестикулярных антигенов, меланоцито-дифференцирующих антигенов при вакцинотерапии рака необходимо определить количество антигенов на опухолевых клетках и их изменчивость в процессе метастазирования.

Развившиеся в последние годы интенсивные исследования раково-тестикулярных антигенов в различных опухолях (начиная с 1997 года, опубликовано около 1500 статей) открыли новые возможности для разработки новых подходов диагностики и лечения опухолей. Исследования выявили существенные вопросы:

- почему, несмотря на иммуногенность антигена при иммунотерапии, не возникает регрессии опухоли, и нет реальных успехов в лечении;

- какие прогностические факторы оказывают влияние на дальнейшие течение меланомы у больных;

- какое значение имеет экспрессия генов РТА у больных с меланомой? Актуальность данных проблем определила выбор исследования экспрессии генов РТА в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях, метастазах меланомы в лимфатические узлы для установления необходимости подбора индивидуального лечения методом вакцинотерапии и возможности прогноза течения заболевания с учетом данных экспрессии генов РТА.

Цель работы: исследование значения экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов для прогноза и течения опухолевого процесса у пациентов с меланомой кожи.

Задачи исследования:

1. Исследовать экспрессию генов раково-тестикулярных антигенов (РТА), генов меланоцитодифференцировочных антигенов (МДА) и генов маркеров меланомы (ММ) в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях и метастазах меланомы в лимфатические узлы.

2. Провести анализ корреляции экспрессии набора генов с морфологическими признаками клеток меланомы.

3. Сравнить экспрессию набора генов в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях и метастазах меланомы в лимфатические узлы.

4. Исследовать корреляцию между экспрессией набора генов, образованием новых метастазов и выживаемостью пациентов.

Научная новизна:

В данной работе показано наличие отрицательной корреляции между уровнем экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов и степенью дифференцировки клеток меланомы. Показана корреляция экспрессии исследуемого набора генов с продолжительностью жизни пациентов после операции и сроком появления у них новых метастазов.

Научно-практическая значимость:

Полученные результаты экспрессии исследуемых генов предоставляют возможность количественно оценить степень злокачественности опухолевых клеток меланомы, а также определяют выбор антигенов клеточной линии для вакцинотерапии. Предложены новые прогностические факторы выживаемости пациента после хирургической операции и временем до прогрессирования.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Исследована экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов, генов меланоцитодифференцировочных антигенов и генов маркеров меланомы в клеточных линиях меланомы, первичных опухолях и метастазах меланомы в лимфатические узлы.

2. Выявлена гетерогенность экспрессии генов раково-тестикулярных антигенов (РТА) в клетках меланомы кожи. Каждый ген экспрессирован не более чем в 60% исследованных образцов первичных опухолей, метастазов меланомы в лимфатические узлы, а также клеточных линий меланомы. При изучении набора из 22 генов раково-тестикулярных антигенов выявлена экспрессия хотя бы одного гена в 90% исследованных образцов.

3. При снижении степени дифференцировки клеток культуры меланомы возрастает число экспрессирующихся генов раково-тестикулярных антигенов. Обнаружена обратная корреляция (р<0.05) между экспрессией 16 генов раково-тестикулярных антигенов (MAGEA 1-3, 6, 10 и 12; GAGE 1-8; В AGE; MAGEC1) и степенью дифференцировки клеток меланомы в культуре.

4. Увеличенное количество экспрессирующихся генов РТА в первичной опухоли, которое наблюдалось только в одной трети биопсий пациентов, не означает короткую выживаемость (до 20 месяцев) для пациентов, а свидетельствует о большей вероятности образования метастазов в течение 100 месяцев жизни пациентов. В группе пациентов, экспрессирующих хотя бы один из РТА генов (MAGEB2, MAGEB4, MAGEA1, MAGEA4 и MAGEA10), показана значимая (р<0.05) положительная корреляция (г>0.4) с продолжительностью жизни пациентов после операции.

5. Набор экспрессирующихся на уровне мРНК 40 генов (РТА, МДА, ММ) может использоваться как группа прогностических факторов продолжительности жизни пациента после хирургической операции и риска появления метастазов. Анализ экспрессии (на уровне мРНК) генов в биоптатах первичной опухоли, независимо от наличия у пациентов метастазов и стадии заболевания, позволяет разделить пациентов на три группы: первая группа - с 90% вероятностью смерти в течение 20 месяцев и образованием метастазов; вторая группа - с 10% вероятностью смерти и 60% вероятностью образования метастазов в течение 100 месяцев; третья группа - с 100% вероятностью выживания при отсутствии метастазов в течение 100 месяцев после операции.

6. Показано отсутствие корреляции (р<0,05) между экспрессией дифференцировочных антигенов меланомы (MLANA, TYR, WARS, SILV) и степенью дифференцировки клеток меланомы в культуре.

7. Клеточная линия для вакцинотерапии пациентов с меланомой кожи должна иметь максимальное разнообразие генов РТА, потому что у различных больных экспрессируется различный набор генов РТА.