Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспрессия генов фактора роста эндотелия сосудов и тромбоспондина-1 в клетках тимуса и перитонеальных макрофагах мышей при опухолевом росте

КРЫЛОВ Андрей Витальевич

На правах рукописи

003166956

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ И ТРОМБОСПОНДИНА-1 В КЛЕТКАХ ТИМУСА И ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГАХ МЫШЕЙ ПРИ

ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

14.00.36 - АЛЛЕРГОЛОГИЯ ИИММУНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 АПР 2008

Санкт-Петербург 2008

003166956

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель доктор медицинских наук Киселева Екатерина Прохоровна Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна Доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

Ведущая организация Институт цитологии РАН

Диссертационного совета ДМ 001 022 01 при Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул акад И П Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан«/^ » С^-^ЛГРТА 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

Защита состоится

»

часов на заседании

доктор медицинских наук

Бурова Л А

Актуальность проблемы. Клетки иммунной системы являются основным эффекторным механизмом, обеспечивающим антигенный гомеостаз организма Считается, что иммунный надзор осуществляет контроль за появлением трансформированных клеток в организме Однако, этот контроль не является достаточно эффективным вследствие развития иммунодепрессивных состояний, сопровождающих рост большинства опухолей Хотя механизм, с помощью которого опухоли избегают иммунного надзора не вполне ясен, многие связывают его развитие с выделением различных иммуносупрессорных факторов, как самими опухолевыми клетками, так и нормальными клетками организма В последнее время появились данные о том, что к таким факторам можно также отнести и ангиорегуляторные молекулы, такие как ростовой фактор эндотелия сосудов (VEGF) и белок внеклеточного матрикса тромбоспондин-1 (TSP-1) VEGF играет важную роль в инициации неоангиогенеза и является необходимым компонентом опухолевой прогрессии, в то время как TSP-1 является антиангиогенным фактором, оказывающим подавляющее влияние на рост клеток эндотелия в различных моделях

Показано, что VEGF может оказывать ряд иммуносупрессорных эффектов, в частности вызывать развитие инволюции тимуса (Ohm et al, 2003) Инволюция тимуса сопровождает развитие многих опухолей человека и животных и может создавать основу для развития Т-клеточного иммунодифицита в организме Изучение механизмов этого процесса является актуальным, поскольку разработка методов, препятствующих этому процессу, могла бы существенно увеличить продолжительность жизни онкологических больных Одним из возможных механизмов действия VEGF является усиление апоптоза тимоцитов (Киселева, 2002) TSP-1 способен оказывать подавляющее действие на периферические Т-лимфоциты (Doyen et al, 2003), а также вызывать в них апоптоз (Manna, Frazier, 2003)

Многие опухолевые клетки продуцируют оба этих фактора (Lawler 2002, Senger et al, 1986) Известно, что сывороточные концентрации VEGF при росте опухолей могут увеличиваться (Kondo et al, 1994), а уровень содержания TSP-1 может значительно варьировать и быть как пониженным, так и повышенным (Tuszynski, Nicosia, 1996) Накопление VEGF и TSP-1 в циркуляции может оказывать системный эффект и подавлять нормальное функционирование иммунной системы

Многие нормальные клетки организма и, в частности, клетки иммунной системы также способны синтезировать VEGF и TSP-1, что показано in vitro (Carpizo, Iruela-Arispe, 2000, Bottomley M J et al, 1999) Мы предположили, что усиление внутриорганного синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе может влиять на развитие Т-кпеточного иммунодефицита при опухолевом росте Поскольку хорошо известно, что активными продуцентами VEGF и TSP-1 и основными регуляторами ангиогенеза в организме являются макрофаги, мы проводили сравнительное изучение системного влияния опухолевого роста на тимус и перитонеальные макрофаги

Перспективность исследования связана с возрастающим интересом клиницистов к применению ангаангиогенных препаратов для лечения новообразований В качестве мишеней для создания таких препаратов широко используются молекулы VEGF и TSP-1, причем без учета их иммуномодулирующих эффектов Поэтому изучение синтеза VEGF и TSP-1 клетками иммунной системы является актуальной задачей исследования

Цель работы. Оценка локального синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе и перитонеальных макрофагах мышей при росте сингенной опухоли гепатома 22а Для этого решались следующие задачи:

1 Оценить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в клетках тимуса мышей в норме и при росте экспериментальной гепатомы

2 Сопоставить эти изменения с изменением массы и клеточности тимуса и изменением уровня VEGF в циркуляции при росте гепатомы

3 Изучить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в перитонеальных макрофагах мышей при росте гепатомы и сопоставить их с теми же показателями в клетках тимуса

4 Оценить синтез мРНК VEGF, его рецепторов и TSP-I перитонеальными макрофагами под действием VEGF in vitro

Основные положения выносимые на защиту

1 Инволюция тимуса при росте опухоли сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF внутри тимуса и не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в циркуляции

2 Инволюция тимуса при росте гепатомы сопровождается усилением синтеза

л

мРНК VEGF в строме тимуса и мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах 3 VEGF усиливает синтез мРНК своих рецепторов (VEGFR1 и VEGFR2), экспрессию мРНК своей собственной молекулы, а также TSP-1 в макрофагах мышей m vitro Научная новизна. Впервые было показано наличие конститутивной экспрессии генов VEGF и VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах Также установлено, что запустевание тимуса при росте гепатомы сопровождается повышением локального синтеза мРНК VEGF в строме тимуса и усилением экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах Нами впервые было показано, что в тимоцитах и макрофагах при росте опухоли наблюдается однонаправленное изменение синтеза мРНК VEGFR2 Кроме того, установлено, что экспрессия мРНК VEGF и TSP-1 в макрофагах может быть усилена в присутствии VEGF in vitro

Теоретическое и практическое значение Работа носит экспериментально-теоретический характер На основании проведенных экспериментальных исследований дополнена концепция развития инволюции тимуса при росте опухоли, заключающаяся в локальном усилении синтеза мРНК ангиогенного фактора VEGF стромой тимуса и усилении синтеза мРНК VEGFR2 тимоцитами При этом показано, что развитие инволюции тимуса, сопровождающее опухолевый рост, может не зависеть от повышения уровня VEGF в циркуляции Дополнены данные по взаимодействию VEGF и клеток иммунной системы на примере влияния VEGF на синтез ангиорегуляторных молекул макрофагами

Личный вклад автора в проведение исследований. Все исследования, включающие работу с культурой клеток экспериментальной гепаючы m vitro, работу с опухолевой моделью на лабораторных животных и проведение всех указанных в работе экспериментов, а также статистическая обработка и интерпретация полученных результатов проводились лично автором Роль соавторов состояла в предоставлении консультативной помощи и технической поддержки на начальных этапах исследования

Апробация. Основные результаты работы были представлены на Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В И Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2002, 2003, 2004, 2005 и 2006 годов), на конференции молодых ученых «Достижения фундаментальных наук в

решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) и Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006) Материалы докладывались на заседании С Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007)

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 18 декабря 2007г.

Публикации. Результаты работы отражены в 17 публикациях (4 статьи и 13 тезисов)

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы и список литературы Работа иллюстрирована 4 таблицами и 48 рисунками Библиографический указатель включает 177 литературных источников (10 отечественных и 167 иностранных)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали 220 мышей-самцов линии СЗНА, весом 18-20 г, в возрасте 2 месяца, полученных из питомника "Рапполово" РАМН

Опухоль. Гепатома 22а из коллекции клеточных культур института цитологии РАН была любезно предоставлена В А Ивановым и О Н Погодиной Клетки гепатомы вводили сингенным мышам СЗНА подкожно в область спины в количестве 105/мышь Контрольные животные получали инъекцию забуференного физиологического раствора (ЗФР) в том же объеме

Животных убивали методом цервикальной дислокации через 7, 14, 21, 28 и 35 сутки после введения клеток опухоли На каждом сроке исследовали 4 контрольных и 4 опытных животных, опыты повторяли 2-3 раза Изучали тимусы, клетки перитонеального экссудата (КПЗ) и сыворотку крови

Получение перитонсальных макрофагов. КПЗ получали путем перитонеального лаважа, инкубировали в течение 2 часов в 24-луночных планшетах, отмывали от не прилипающих клеток и исследовали экспрессию мРНК от каждого животного индивидуально Для тестов in vitro КПЗ объединяли от 10 животных Монослой макрофагов, отмытый от не прилипающих клеток, инкубировали в течение

4-24 часов при 37°С и 5%С02 в присутствии различных факторов VEGF1 M(Peprotech), LPS Е coli 055В5 (Sigma) или TNF-a (Sanitas, Вильнюс)

Исследование тимуса. Тимусы взвешивали, затем раздавливали в гомогенизаторе в ЗФР и разделяли на две части тимоциты и строму органа Получившуюся после раздавливания суспензию тимоцитов фильтровали через нейлоновый фильтр и подсчитывали концентрацию и общее количество клеток на орган Стромой тимуса считали ткань, оставшуюся на фильтре, которую промывали несколько раз в ЗФР Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 изучали от каждого животного индивидуально Для исследования синтеза белка материал предварительно объединяли от нескольких животных

Метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Экспрессию мРНК в клетках и тканях определяли методом ОТ -ПЦР Выделение суммарной мРНК проводили с использованием TRl-Reagent (Sigma) Для проведения обратной транскрипции (ОТ) к мРНК добавляли коктейль специфических обратных праймеров (Литех) В качестве внутреннего контроля прохождения ОТ-ПЦР использовали уровень экспрессии мРНК ß-актина ПЦР проводили с использованием праймеров, подобранных таким образом, чтобы длина продукта при прохождении реакции с кДНК, полученной в результате ОТ, и ядерной ДНК была разной В работе использовали следующие праймеры, для VEGF прямой-5' gaccctggctttactgctgta 3', обратный 5' gtgaggtttgatccgcatgat 3', TSP-1 прямой 5' caaaggagatgcctgtgacc 3', обратный 5' ctggaatcgtcggaaatcgg 3', VEGFR1 прямой 5' gaagcggttcacctggactgagacc 3', обратный 5' ggctttgctggggggatttctctaa 3', VEGFR2 прямой 5' acagacagtgggatggtccttgcat 3', обратный 5' aaacaggaggtgagctgcagtgtgg 3', ß-actm прямой 5' atggatgacgatatcgct 3', обратный 5' atgaggtagtetgteaggt 3' Праймеры для выявления экспрессии мРНК VEGF детектировали все четыре известные изоформы цитокина Для каждой пары праймеров температуру отжига и концентрацию MgCl2 подбирали индивидуально Визуализацию ПЦР-продуктов проводили в агарозном геле (Фармация) с добавлением бромистого этидия (ICN) Гели фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата в проходящем УФ-свете Изображение подвергали компьютерной обработке с помощью программного пакета Adobe Photoshop, после чего проводили денситометрический анализ полученных электрофоретических полос с помощью программы SCNImage

Вестерн-блот. Определение синтеза белка (VEGFR2) в тимоцитах и строме тимуса проводили при помощи Вестерн-блота Экстракцию суммарного белка из тимоцитов, стромы тимуса и ткани печени проводили при помощи буфера RIPA (Sigma) с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ (Sigma) Электрофоретическое разделение белков и их детекцию в геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по методике Laemmli, 1970 Перед внесением в гель в пробах измеряли суммарный белок с помощью реактива Бредфорда (Sigma) и наносили для разделения с помощью электрофореза в одинаковой концентрации После разделения белков с помощью электрофореза их переносили на PVDF-мембрану HyBond (Pharmacia) Мембрану инкубировали 2 часа с поликлональной сывороткой крысы aimi-VEGFR2 (Santa Cruz) и 1 час с поликлональной сывороткой кролика против IgG крысы, конъюгированной с пероксидазой хрена (Santa Cruz) Визуализацию продуктов проводили методом хемилюминесценции Люминесценцию детектировали с помощью анализатора Chemidoc (BioRad) Полученные результаты обрабатывали с помощью программного пакета Adobe Photoshop

Иммуноферментный анализ. Определение VEGF164 в сыворотке крови животных при росте гепатомы проводили с помощью иммуноферментного набора для определения мышиного VEGF^ (Bender Medsystems)

Статистический анализ полученных результатов проводили согласно критерию Вилкоксона с использованием программы Statistica 5 1

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 клетками тимуса интактных животных. При исследовании экспрессии мРНК VEGF и TSP-1 в цельном тимусе мышей была выявлена экспрессия мРНК обоих факторов (Табл 1) В дальнейших исследованиях мы разделили клетки тимуса на тимоциты и строму тимуса и исследовали экспрессшо мРНК ангиорегуляторных факторов отдельно Нами было показано, что как стромальные клетки тимуса, так и сами тимоциты экспрессируют мРНК VEGF и TSP-1 Строма тимуса представлена различными типами клеток, эндотелиоцитами, фибробластами, макрофагами, дендритными клетками и эпителиальными клетками стромы Известно, что все они способны

синтезировать VEGF и TSP-1 (Polvenni, 1997, Dikov et al, 2005, Wang et al, 2002, Inoue et al, 2001, Muller et al, 2005) Синтез VEGF и TSP-1 тимоцитами показан нами впервые

Для изучения механизмов влияния VEGF на клетки тимуса необходимо было показать присутствие на них рецепторов VEGF С помощью ОТ-ПЦР, в пределах чувствительности данного метода, было установлено, что изолированные тимоциты экспрессируют мРНК VEGFR2 и не экспрессируют мРНК VEGFR1 При этом клетки стромы тимуса синтезировали мРНК обоих рецепторов, что может объясняться наличием в ней сосудов Различия в экспрессии генов рецепторов между стромой тимуса и тимоцитами подтверждают правомочность применения нами методического подхода с разделением клеток тимуса на две части Способность тимоцитов экспрессировать мРНК VEGFR2 показана нами впервые Периферические лимфоциты, выделенные из паховых лимфоузлов, также как и тимоциты, синтезировали мРНК VEGF, TSP-1 и VEGFR2, но не VEGFR1 (Табл 1)

Таблица 1 Синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 клетками шмуса и лимфоцитами интактных мышей

Синтез мРНК

VEGF VEGFR1 VEGFR2 TSP-1

Тимус цельный + + + +

Тимоциты + - + +

Строма тимуса + + + +

Лимфоциты .лимфоузлов + - + +

Синтез мРНК УЕвГ, УЕСИИ, УЕСРШ и ТвР-1 в тимусе мышей в динамике роста гепатомы При росте гепатомы синтез VEGF в тимоцитах не усиливался Напротив, исследование экспрессии мРНК VEGF в тимоцитах на 7 сутки роста гепатомы выявило снижение этого показателя, на других сроках исследования отличий от контроля не было

При этом, в строме тимуса было обнаружено усиление экспрессии мРНК ангиогенной молекулы на 7, 21 и 28 сутки роста гепатомы по сравнению с контролем (Рис. 1).

При исследовании влияния роста гепатомы на синтез мРНК другого фактора-Т8Р-1 было установлено, что экспрессия его мРНК достоверно усиливается на 21 и 28 сутки в тимоцитах и не изменяется в строме тимуса (Рис. 2а). На 7, 21 и 28 сутки роста опухоли наблюдалось усиление экспрессии мРНК УЕОР112 в тимоцитах мышей- опухоленосителей по сравнению с тимоцитами, полученными от контрольной группы животных (Рис. 26). При этом, усиление экспрессии мРНК УЕОР112 тимоцитами происходило одновременно с усилением синтеза мРНК УЕвР в строме тимуса, что было отмечено нами на 7, 21 и 28 сутки роста опухоли. Экспрессия мРНК другого рецептора - УЕОРЮ в тимоцитах мышей не была обнаружена в процессе опухолевого роста, так же как и у интактных животных.

Рис. 1 Влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGF в строме тимуса

По оси абсцисс- время после инокуляции опухолевых клеток, сутки (п=8; в контроле (К) п=40). По оси ординат- экспрессия мРНК VEGF в условных единицах; результаты нормализованы

относительно ß-акгина. На рисунке представлены (М±о). * - различия с контролем по критерию Вилкоксона достоверны при р<0,05; ** - при р< 0,01.

В строме тимуса, параллельно с усилением синтеза мРНК УЕСР, было выявлено усиление экспрессии мРНК УЕОРЫ2. Этот показатель достоверно увеличивался на ранних сроках роста опухоли (3 и 7 сутки) по сравнению с теми же показателями у контрольной группы животных.

Исследование синтеза белка УЕОБЯ2 в тимусе с помощью вестерн-блота выявило, что тимоциты и стромальные клетки тимуса интактных животных

синтезируют УЕ0РЯ2 (Рис. 3). В положительном контроле (ткани печени) и строме тимуса детектировалась продукция двух форм рецептора с молекулярной массой 190 кДа и 230 кДа (Рис. За), в то время как в тимоцитах была обнаружена только одна форма рецептора 190 кДа (Рис. 36). Однако, не смотря на то, что мы показали усиление экспресии мРНК УЕОР112 в тимоцитах, нам не удалось выявить различий в синтезе белка УЕОР112 между тимоцитами, полученными от опухолевых животных на 21 сутки роста экспериментальной гепатомы и тимоцитами контрольной группы мышей.

Рис. 2 Влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитамх. А- экспрессия мРНК TSP-1; Б- экспрессия мРНК VEGFR2

По оси абсцисс- время после инокуляции опухолевых клеток, сутки (п=8; в контроле (К) п=40). По оси ординат- экспрессия мРНК в условных единицах; результаты нормализованы относительно Р-актина. На рисунке представлены (М±с). * - различия с контролем по критерию Вилкоксона достоверны при р<0,05; ** - при р< 0,01.

Сопоставление полученных данных по синтезу мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 в тимусе мышей с инволюцией железы при опухолевом росте и уровнем содержания VEGF в циркуляции. Поскольку при длительном перевивании и

хранении опухолевые клетки могут менять свои свойства, нами была подтверждена, описанная ранее, способность гепатомы 22а вызывать инволюцию тимуса. При исследовании изменения массы и клеточности тимуса в динамике роста гепатомы 22а эти показатели снижались, начиная с 3-й недели роста опухоли, и к 35 суткам составляли около 20% от показателей контрольных животных.

Йч* i Ш 190 кДа

зНУ^щШШ ' шШг' 150 кДа ЦИ ШДШаШ;

М 1 2 3

строма t

тимоциты Б

250 кДа

230 кДа

250 кДа

230 кДа

150 кДа

190 кДа

Рис. 3 Влияние опухолевого роста на синтез белка VEGFR2 клетками тимуса (Вестерн- блот).

М- маркер молекулярного веса, 1- ткань печени, 2- строма (А) или тимоциты (Б) контрольных животных, 3- строма (А) или тимоциты (Б) мышей на 21 сутки роста гепатомы.

При исследовании сывороточных концентраций VEGF при росте гепатомы было показано, что данный показатель не меняется ни на одном из сроков исследования (3, 7, 14, 21, 28 и 35 сутки роста опухоли) и не отличается от такового у контрольных животных. Однако, при этом, в экспериментах in vitro с помощью метода ОТ-ПЦР нами было показано, что гепатома способна синтезировать мРНК VEGF и секретировать его в культуральную среду (концентрация VEGF|64 в супернатанте 48ч культуры гепатомы составляла 200 пг/мл). Возможно, отсутствие повышения уровня содержания VEGF в циркуляции связано с тем, что VEGF связывается с матриксом и в циркуляцию не попадает. Таким образом, развитие инволюции тимуса при росте гепатомы не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в сыворотке крови. Однако при этом мы наблюдали усиление синтеза мРНК VEGF в строме тимуса.

При сопоставлении данных ОТ-ПЦР с динамикой морфологических изменений в тимусе оказалось, что изменения экспрессии некоторых генов начинались в тимусе уже на 3 сутки после инокуляции гепатомы, те за долго до появления количественных изменений массы и клеточности тимуса К таким показателям относятся усиление экспрессии мРНК УЕСР112 в сгроме тимуса на 3 сутки, а так же увеличение экспрессии мРНК УЕОРЯ2 тимоцитами и УЕСИ стромальными клетками тимуса на 7 сутки роста гепатомы (Табл 2) На более поздних этапах роста опухоли (21 и 28 сутки) снижение массы и клеточности вилочковой железы у экспериментальных животных сопровождалось усилением экспрессии мРНК УЕСБ в строме, а также усилением экспрессии мРНК \'ЕОРЕ12 и Т5Р-1 в тимоцитах Ранее было показано, что начиная с 21 суток роста гепатомы в тимусе наблюдаются гистологические изменения, выражающиеся в прогрессирующем истончении корковой зоны, уменьшении плотности малых лимфоцитов и снижении количества больших лимфоцитов (Киселева, 2002)

Таблица 2 Синтез мРНК УЕОБ, Т8Р-1, УЕОЕЬи и УЕОР112 в тимусе мышей в динамике роста опухоли

Сутки Изолированные тимоциты Строма тимуса

УЕОБ Т8Р-1 УЕОРЯ2 УЕСР Т8Р-1 УРСтРЯ2

3 = = = = = Т

7 1 = 1 т = 1 т

14 = = = = = =

21 = т т т = = =

28 = т т т = =

Примечания | увеличение уровня экспрессии мРНК по отношению к контролю,

I снижение показателя, = отсутствие изменений в уровне экспрессии мРНК

Таким образом, усиление локального синтеза УЕвЕ и ТБР-1 в тимусе предшествовало появлению морфологических изменений в этом органе и может скорее рассматриваться как причина инволюции тимуса, чем ее следствие

Исследование влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 перитонеальными макрофагами мышей. Следующим этапом наших исследований явилось изучение экспрессии мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 в динамике роста экспериментальной гепатомы другими, удаленными от опухолевого узла клетками, а именно, перитонеальными макрофагами мышей. В предварительных экспериментах нами было показано, что макрофаги интактных мышей конститутивно экспрессируют мРНК VEGF, его рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 и TSP-1, что соответствует данным литературы (Jaffe et al., 1985; McLaren et al., 1996). При исследовании влияния роста опухоли на те же показатели, было установлено, что уровень экспрессии мРНК VEGF и VEGFR1 не изменяется, при этом, на поздних сроках роста гепатомы (35 сутки) в макрофагах увеличивается уровень экспрессии mPFTK VEGFR2 (Рис. 4а). Кроме того, на 28 и 35 сут роста гепатомы, было показано усиление экспрессии мРНК TSP-1 (Рис. 46).

Рис. 4 Влияния роста опухоли на экспрессию мРНК VEGFR2 и TSP-1 перитонеальными макрофагами мышей. А- экспрессия мРНК VEGFR2 Б- экспрессия мРНК TSP-1. По оси абсцисс - время после инокуляции опухолевых клеток, сутки (п=8; в контроле (К) п=40). По оси ординат - экспрессия мРНК в условных единицах; результаты нормализованы относительно ß-актина. На рисунке представлены (М±о). * - различия с контролем по критерию Вилкоксона достоверны при р<0,05; ** - при р< 0,01.

При сопоставлении полученных данных по изменению экспрессии мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 в перитонеальных макрофагах мышей и тимусе было выявлено однонаправленное изменение двух из четырех показателей, а именно усиление экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 на поздних сроках опухолевого роста

Для того, чтобы выяснить, в какой мере эти изменения могут быть вызваны усилением локального синтеза VEGF в тканях, мы исследовали эффекты VEGF на синтез макрофагами мРНК ангиорегуляторных молекул VEGF и TSP-1, а так же рецепторов VEGF in vitro Можно предположить, что уровень содержания VEGF в перитонеальной полости может повышаться за счет его синтеза клетками серозного эпителия или другими клетками

Исследование влияния VEGF на экспрессию мРНК VEGF, TSP-1, VEGFR1 и VEGFR2 перитонеальными макрофагами мышей in vitro. При исследовании влияния VEGF на перитонеальные макрофаги in vitro нами было установлено, что инкубация макрофагов в присутствии этого фактора в течение 24 часов вызывает усиление синтеза мРНК самого VEGF и его рецепторов - VEGFR1 и VEGFR2 (Табл

3)

Наиболее выраженные изменения были отмечены при концентрациях 50 и 100 нг/мл VEGF В качестве положительного контроля использовали 100 ед/мл TNF-a и 1 мкг/мл LPS Извесгно, что оба этих фактора усиливают экспрессию мРНК VEGF макрофагами, что было подтверждено и нашими исследованиями Также нами было показано, что VEGF в концентрациях 50 и 100 нг/мл достоверно усиливает экспрессию макрофагами мРНК TSP-1 (Табл 3) Тот факт, что макрофаги усиливают экспрессию мРНК VEGF и VEGFR1 в ответ на действие VEGF in vitro, показано нами впервые Усиление синтеза макрофагами VEGF, VEGFR1 и VEGFR2 может создавать дополнительную петлю усиления ангиогенной активности макрофагов в тканях Описанные эффекты VEGF на мононуклеарные фагоциты могут иметь значение при росте опухолей человека и животных, при которых отмечается увеличение концентрации этого фактора в сыворотке крови

Полученные нами данные по влиянию VEGF на макрофаги in vitro отличаются от изменений тех же показателей в макрофагах на поздних сроках роста гепатомы, когда наблюдали усиление синтеза мРНК VEGFR2 и TSP-1 и не отмечали усиления синтеза мРНК VEGF и VEGFR1 (Табл 4)

Таблица 3 Влияние VEGF на синтез мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 перитонеальными макрофагами мышей in vitro

стимулятор мРНК

VEGF VEGFR1 VEGFR2 TSP-1

контроль 4,94±0,36 2,78±0,45 2,9±0,05 8,99±0,15

VEGF Юнг/мл 6,58±0,47* 3,08±0,64 3,38±0,25 10,13±1,36

VEGF 50пг/мл 6,64±0,42** 5,09±0,37* 5,21±1,71* 11,48±0,65**

VEGF 1 ООнг/мл 6,57±0,б4* 5,54±0,24** 4,49±1,04 11,84±1,17*

ЛПС 1мкг/мл б,97±0,71* 4,65±1,08 4,94±0,99 10,53±0,46*

TNF-a 100ед/мл 6,85±0,78* 4,78±1,8 3,74±0,53 13,73±1,95*

Примечание * - различия с контролем по критерию Вилкоксона достоверны

при р<0,05, ** - при р< 0,01

Таблица 4 Сравнение синтеза мРНК VEGF, VEGFR1, VEGFR2 и TSP-1 перитонеальными макрофагами мышей при росте гепатомы in vivo и под влиянием VEGF in vitro

Перитонеальные Синтез мРНК

макрофаги VEGF VEGFR1 VEGFR2 TSP-1

при росте т t

гепатомы (35 сут)

под влиянием VEGF in vitro t т т т

Примечание t увеличение уровня экспрессии мРНК по отношению к контролю,

= отсутствие изменений в уровне экспрессии мРНК

По всей видимости, усиление синтеза макрофагами VEGFR2 и TSP-1 на поздних стадиях опухолевого роста не связано с усилением локального синтеза VEGF в перитонеальной полости животных

Заключение. В настоящем исследовании в качестве экспериментальной модели была использована гепатома 22а, вызывающая состояние Т-клеточного иммунодефицита, выражающегося в развитии прогрессирующей инволюции тимуса, лимфопении и опустошении Т-зависимых зон отдельных лимфатических узлов (Киселева, 2002) Нами было показано, что рост опухоли не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в циркуляции, однако сопровождается усилением экспрессии мРНК VEGF стромальными клетками тимуса, а также TSP-1 тимоцитами

Мы предполагаем, что изменения локального синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе могут способствовать развитию Т-клеточного иммунодефицита благодаря тому, что VEGF может усиливать апоптоз тимоцитов (Киселева, 2002) Кроме того, усиление экспрессии мРНК VEGFR2 тимоцитами, происходящее параллельно с усилением синтеза мРНК VEGF стромой, может обуславливать их повышенную чувствительность к апоптозу В таком случае, активация оси строма- VEGF —> тимоциты- VEGFR2 с конечным эффектом в виде апоптоза может являться одним из механизмов запустевания вилочковой железы Данные по влиянию TSP-1 на тимоциты отсутствуют, однако известно, что TSP-1 способен вызывать апоптоз преиферических Т-клеток (Manna, Frazier, 2003)

Другим механизмом развития инволюции тимуса при опухолевом росте, дополняющим действие предыдущего, может служить усиленный выход популяции незрелых тимоцитов на периферию VEGF и TSP-1 могут способствовать данному процессу, а функциональная неполноценность Т-клеток и их повышенная чувствительность к апоптозу будет создавать предпосылки для их ускоренной элиминации на периферии Так известно, что VEGF усиливает трансэндотелиальную миграцию различных типов клеток, главным образом, усиливая проницаемость эндотелия (Zhang et al, 2001, Naiyer et al, 1999) TSP-1 является матриклеточным белком, который в отличие от структурных компонентов матрикса, играет важную роль во взаимодействиях клетка-клетка и клетка-матрикс В частности, он играет важную роль в адгезии и миграции Т-лимфоцитов (Forslow et al, 2007) Можно

предположить, что VEGF и TSP-1 образуют тандем, имеющий важное значение для подвижности тимоцитов, a VEGFR2 участвует в реализации этого эффекта Показанное нами усиление экспрессии мРНК VEGFR2 тимоцитами дополняет данные литературы, полученные недавно, о важной роли именно этого рецептора в инволюции тимуса у мышей в ответ на введение VEGF интактным животным (Huang et al, 2007)

Кроме того, было установлено, что на поздних сроках роста гепатомы в макрофагах также усиливается экспрессия мРНК TSP-1 и рецептора VEGF -VEGFR2 Влияние TSP-1 на миграционную активность моноцитов/макрофагов не вполне изучено, однако известно, что TSP-1 способен контролировать состав воспалительного очага (Puolakkamen et al, 2005, Agah et al, 2002) Мы предполагаем, чю усиление синтеза макрофагами мРНК TSP-1 и VEGFR2 может также свидетельствовать о возможной локальной активации миграционной активности данных клеток

Таким образом, в работе показано, что рост опухоли может оказывать ряд системных эффектов на клетки иммунной системы, а именно - на синтез VEGF стромой тимуса, на синтез VEGFR2 и TSP-1 тимоцитами и макрофагами Какие сигналы со стороны опухоли могут приводить к подобным эффектам"? В настоящий момент существует точка зрения, что акггивация клеток иммунной системы и запуск синтеза определенных молекул может происходить под влиянием «сигналов тревоги» (Martzmger, 2007) Такими сигналами могут являться компоненты разрушенных клеток, попадающие в кровоток при развитии некроза в опухолевом узле, а также нуклеиновые кислоты, аденозин, АТФ, белки теплового шока и др (Frantz et al, 2005) Подобные молекулы способны вызывать активацию клеток, удаленных от очага опухолевого роста, через toll-подобные, аденозиновые и другие рецепторы Например, известно, что аденозин стимулирует синтез VEGF в клетках эндотелия (Ryzhov et al, 2006), что, возможно, вносит вклад в усиление синтеза этого фактора стромой тимуса

Усиление синтеза TSP-1 макрофагами может иметь важное значение для опухолевой прогрессии, обеспечивая локальную супрессию Т-клеточного иммунитета в различных тканях и органах иммунной системы Иммуносупрессорный эффект TSP-

1 в отношении различных популяций Т-клеток описан в литературе (Zamin et al, 2005, Beppu et al ,2001, Marteau et al, 2005)

Данные, полученные нами в исследовании, имеют важное значение для понимания взаимодействия опухоли, факторов регулирующих ангиогенез и клеток иммунной системы Антиангиогенная терапия широко применяется при различных заболеваниях, сопровождающихся усилением синтеза VEGF, таких как рост опухолей, псориаз, ревматоидный артрит Полученные данные о локальном синтезе VEGF в тимусе подчеркивают важность применения антиангиогенных препаратов (специфических блокаторов рецепторов VEGF, или ингибиторов активности молекул, опосредующих проведение сигнала от этих рецепторов в клетке) в терапии опухолей не только для ингибиции опухолевой неоваскуляризации, но и для поддержания нормального функционирования Т-клеточного иммунитета Впервые показано влияние роста опухоли на синтез ангиорегуляторных молекул в клетках иммунной системы, удаленных от опухолевого узла Это важно для понимания связи опухолевой прогрессии с функционированием иммунной системы в организме Рост опухоли не просто привлекает клетки иммунной системы для реализации их про-, либо антиангиогенного потенциала, но и способен регулировать созревание и активацию клеток иммунной системы, а также синтез этими клетками факторов аншогенеза, характеризующихся иммуносупрессорными эффектами Данные представленной работы подчеркивают необходимость проведения дальнейших исследований взаимодействия роста опухоли с клетками иммунной системы и могут внести значимый вклад в область теоретической онкоиммунологии

ВЫВОДЫ

1 Тимоциты интактных мышей способны конститутивно экспрессировать мРНК VEGF и TSP-1, а также мРНК VEGFR2, но не VEGFR1

2 Перитонеальные макрофаги интактных мышей способны конститутивно экспрессировать мРНК VEGF и TSP-1, а также мРНК рецепторов VEGF VEGFR1 и VEGFR2

3 Инволюция тимуса при росте гепатомы 22а сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF стромальными клетками тимуса и не сопровождается изменением уровня содержания VEGF в сыворотке крови

4 Рост экспериментальной гепатомы вызывает однонаправленное изменение синтеза мРНК VEGFR2 и TSP-1 в гимоцитах и перитонеальных макрофагах, удаленных от опухолевого узла, что может рассматриваться в качестве системного эффекта роста опухоли

5 Синтез мРНК VEGF, VEGFR1 и VEGFR2 в перитонеальных макрофагах интактных мышей усиливается в присутствии VEGF m vitro, что может создавать дополнительную петлю усиления ангиогенной активности макрофагов в тканях

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Сшьи

1 Крылов А.В, Степанова О И Синтез рецепторов VEGF в макрофагах и лимфоцитах мышей// Вестник Уральской медицинской академической науки -2006-Т 14,-№3,-С 315-318

2 Киселева Е П, Крылов A.B., Людыно В И, Суворов АII Влияние VEGF на пролиферацию и апоптоз тимоцитов мышей in vitro// Бюлл экспер биол и мед - 2005 - Т 139,- №5 - С 533-537

3 Степанова О И , Крылов А.В , Людыно В И , Киселева Е П Экспрессия reHOBVEGF-A и VEGF-C и их рецепторов в лимфоцитах и макрофагах мышей// Биохимия- 2007 - Т 72,- №11 - С 1194-1198

4 Крылов А В. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) как модулятор воспалительной и ангиогенной активности макрофагов// Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины Сборник материалов конференции - Астрахань, 2006 -С 133-136

Тезисы

1 Крылов А.В , Киселева Е П, Людыно В И , Зубарева О Е Фактор роста сосудистого эпителия как регулятор ангиогенной активности макрофагов// Цитокины и воспаление - 2002 - Т 1,- №2 - С 10

2 Крылов А.В, Киселева Е П, Людыно В И, Зубарева О Е Регуляция ангиогенной активности макрофагов// Мед иммунология - 2003 - Т 5,- №3-4 -С 203

3 Kisseleva E V , Krylov A.V., Lioudyno VI, Zubareva О E The influence of VEGF on functional activity of murine peritoneal macrophages// European Cytokine Society Annual Meeting, - Dublin, -2003

4 Крылов А В , Кисилева E П, Людыно В И , Зубарева О Е Ангиогенез и иммунная система// Рос физиол. журнал им ИМ Сеченова- 2004- Т90,-№8 - С 128

5 Крылов А В., Киселева Е П, Людыно В И Экспрессия мРНК рецепторов VEGF в клетках иммунной системы// Мед иммунол -2004 - Т б,- №35 - С 235

6 Крылов А В., Киселева Е П, Людыно В И Ангиогенная активность макрофагов при росте синегенной прививаемой гепатомы 22а// Физиология и медицина Сборник материалов всероссийской конференции молодых исследователей - Санкт-Петербург,- 2005 - С 59

7 Крылов А В., Киселева Е П, Людыно В И Экспрессия мРНК про - и анти-ангиогенных факторов и их рецепторов в макрофагах мышей в динамике роста опухоли гепатомы 22а// Мед иммунол - 2005 - Т 7, №2-3 - С 116

8 Kisseleva Е V , Krylov A.V., Lioudyno V I Immunomodulatory effect of VEGF// Abstr of 7th J Humphery advanced summer program m immunology - Moscow,-2005 - P20

9 Крылов А В, Киселева E П, Людыно В И Роль VEGF в регуляции функциональной активности клеток иммунной системы// Цитокины и воспаление - 2005 - Т 4,- №2 - С 85

10 Крылов А.В Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) как потенциальный индуктор инволюции тимуса// Мед иммунол - 2006 - Т 8, №2-3 - С 149-150

11 Степанова О И , Крылов А В , Людыно В И , Киселева Е П Синтез факторов семейства VEGF и их рецепторов в клетках иммунной системы// Мед иммунол - 2006 - Т 8,- №2-3 - С 180-181

12 Степанова ОИ, Соколов ДИ, Крылов A.B., Киселева ЕП Исследование рецепторов VEGF на клетках иммунной системы мышей методом проточной цитометрии// Мед иммунол - 2007 - Т 9,- №2-3 - С 163-164

13 Киселева Е П, Крылов А.В , Людыно В И, Алешина Г М Экспрессия мРНК тромбоспондина в макрофагах и тимоцитах мышей при опухолевом росте// Цитология - 2007 - Т 49,- №9 - С 754-755

Подписано в печать 07 03 08 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,25 Тираж 100 экз Заказ 34

Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С -Петербург, ул Большая Монетная, 5 лит А

Актуальность проблемы. Клетки иммунной системы являются основным эффекторным механизмом, обеспечивающим антигенный гомеостаз организма. Считается, что иммунный надзор осуществляет контроль за появлением трансформированных клеток в организме. Однако, этот контроль не является достаточно эффективным вследствие развития иммунодепрессивных состояний, сопровождающих рост большинства опухолей. Хотя механизм, с помощью которого опухоли избегают иммунного надзора не вполне ясен, многие связывают его развитие с выделением различных иммуносупрессорных факторов, как самими опухолевыми клетками, так и нормальными клетками организма. В последнее время появились данные о том, что к таким факторам можно также отнести и ангиорегуляторные молекулы, такие как ростовой фактор эндотелия сосудов (VEGF) и белок внеклеточного матрикса тромбоспондин-1 (TSP-1). VEGF играет важную роль, в инициации неоангиогенеза и является необходимым компонентом опухолевой, прогрессии, в то время как TSP-1 является антиангиогенным фактором, оказывающим подавляющее влияние на рост клеток эндотелия в различных моделях.

Показано, что VEGF может оказывать ряд иммуносупрессорных эффектов; в частности вызывать развитие инволюции тимуса (Ohm et al., 2003). Инволюция тимуса сопровождает развитие многих опухолей человека и животных и может создавать основу для развития Т-клеточного иммунодефицита в организме. Изучение механизмов этого процесса является актуальным, поскольку разработка методов, препятствующих этому процессу, могла бы существенно увеличить продолжительность жизни онкологических больных. Одним из возможных механизмов действия VEGF является усиление апоптоза тимоцитов (Киселева, 2002). TSP-1 способен оказывать подавляющее действие на периферические Т-лимфоциты (Doyen et al., 2003), а также вызывать в них апоптоз (Manna, Frazier, 2003).

Многие опухолевые клетки продуцируют оба этих фактора (Lawler. 2002; Senger et al., 1986). Известно, что сывороточные концентрации VEGF при росте опухолей могут увеличиваться (Kondo et al., 1994), а уровень содержания TSP-1 может значительно варьировать и быть как пониженным, так и повышенным

Tuszynski, Nicosia, 1996). Накопление VEGF и TSP-1 в циркуляции может оказывать системный эффект и подавлять нормальное функционирование иммунной системы.

Многие нормальные клетки организма и, в частности, клетки иммунной системы также способны синтезировать VEGF и TSP-1, что показано in vitro (Carpizo, Iruela-Arispe, 2000; Bottomley M.J. et.al., 1999). Мы предположили, что усиление внутриорганного синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе может влиять на развитие Т-клеточного иммунодефицита при опухолевом росте. Поскольку хорошо известно, что активными продуцентами VEGF и TSP-1 и основными регуляторами ангиогенеза в организме являются макрофаги, мы проводили сравнительное изучение системного влияния опухолевого роста на тимус и перитонеальные макрофаги.

Перспективность исследования связана с возрастающим интересом клиницистов к применению антиангиогенных препаратов для лечения новообразований. В качестве мишеней для создания таких препаратов широко используются молекулы VEGF и TSP-1, причем без учета их иммуномодулирующих эффектов. Поэтому изучение синтеза VEGF и TSP-1 клетками иммунной системы является актуальной задачей исследования.

Цель работы. Оценка локального синтеза VEGF и TSP-1 в тимусе и перитонеальных макрофагах мышей при росте сингенной опухоли гепатома 22а. Для этого решались следующие задачи:

1. Оценить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в клетках тимуса мышей в норме и при росте экспериментальной гепатомы.

2. Сопоставить эти изменения с изменением массы и клеточности тимуса и изменением уровня VEGF в циркуляции при росте гепатомы.

3. Изучить изменение синтеза мРНК VEGF и TSP-1, а также рецепторов VEGF (VEGFR1 и VEGFR2) в перитонеальных макрофагах мышей при росте гепатомы и сопоставить их с теми же показателями в клетках тимуса.

4. Оценить синтез мРНК VEGF, его рецепторов и TSP-1 перитонеальными макрофагами под действием VEGF in vitro.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Инволюция тимуса при росте опухоли сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF внутри тимуса и не сопровождается повышением уровня содержания VEGF в циркуляции.

2. Инволюция тимуса при росте гепатомы сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF в строме тимуса и мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах.

3. VEGF усиливает синтез мРНК своих рецепторов (VEGFR1 и VEGFR2), экспрессию мРНК своей собственной молекулы, а также TSP-1 в макрофагах мышей in vitro.

Научная новизна. Впервые было показано наличие конститутивной экспрессии генов VEGF и VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Также установлено, что запустевание тимуса при росте гепатомы сопровождается повышением локального синтеза мРНК VEGF в строме тимуса и усилением экспрессии мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах. Нами впервые было показано, что в тимоцитах и макрофагах при росте опухоли наблюдается однонаправленное изменение синтеза мРНК VEGFR2. Кроме того, установлено, что экспрессия мРНК VEGF и TSP-1 в макрофагах может быть усилена в присутствии VEGF in vitro.

Теоретическое и практическое значение. Работа носит экспериментально-теоретический характер. На основании проведенных экспериментальных исследований дополнена концепция развития инволюции тимуса при росте опухоли, заключающаяся в локальном усилении синтеза мРНК ангиогенного фактора VEGF стромой тимуса и усилении синтеза мРНК VEGFR2 тимоцитами. При этом показано, что развитие инволюции тимуса, сопровождающее опухолевый рост, может не зависеть от повышения уровня VEGF в циркуляции. Дополнены данные по взаимодействию VEGF и клеток иммунной системы на примере влияния VEGF на синтез ангиорегуляторных молекул макрофагами.

Апробация. Основные результаты работы были представлены на четырех научных конференциях "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2002-2006), на конференции молодых ученых «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань 2006) и Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь 2006).

Материалы докладывались на заседании С.Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 18 декабря 2007г.

Публикации. Результаты работы отражены в 17 публикациях (4 статьи и 13 тезисов).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 48 рисунками. Библиографический указатель включает 177 литературных источников (10 отечественных и 167 иностранных).

выводы

1. Тимоциты интактных мышей способны конститутивно экспрессировать мРНК VEGF и TSP-1, а также мРНК VEGFR2, но не VEGFR1.

2. Перитонеальные макрофаги интактных мышей способны конститутивно экспрессировать мРНК VEGF и TSP-1, а также мРНК рецепторов VEGF: VEGFR1 и VEGFR2.

3. Инволюция тимуса при росте гепатомы 22а сопровождается усилением синтеза мРНК VEGF стромальными клетками тимуса и не сопровождается изменением уровня содержания VEGF в сыворотке крови.

4. Рост экспериментальной гепатомы вызывает однонаправленное изменение синтеза мРНК VEGFR2 и TSP-1 в тимоцитах и перитонеальных макрофагах, удаленных от опухолевого узла, что может рассматриваться в. качестве системного эффекта роста опухоли.

5. Синтез мРНК VEGF, VEGFR1 и VEGFR2 в перитонеальных макрофагах интактных мышей усиливается в присутствии VEGF in vitro, что может создавать дополнительную петлю усиления ангиогенной активности макрофагов в тканях.