Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА, МИКРООКРУЖЕНИЯ И АНГИОГЕНЕЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ У СТАРЫХ ЖИВОТНЫХ



На правах рукописи

БАРЫКИНА Ольга Павловна

ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА, МИКРООКРУЖЕННЯ И АНГИОГЕНЕЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ У СТАРЫХ ЖИВОТНЫХ

14.00.53 — герои і «лої на и гериатрии

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учено» сіенеїш кап л плата Он о логических наук

Санкт-Петербург - 21ИІ4

Работа выполнена в Санкт-І Іетербургском институте биорегуляции и геронтологии

Научный руководитель;

доктор медштнскич наук, профессор Квотой Игорь Моисеевич

Официальные оппоненты:

'іле і і-корреспондент РАМП, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильепич

доктор биологических наук Монахов Александр Степанович

Ведущая организация:

Военно-медицинская академия Ми побороли РФ

и геронтологии СЗО РАМН но адресу: 197110 Санкт-Петербург, up. Динамо, л. j.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского и,...їй; биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (L97110 Санкг-Петербург, пр. Динамо., ■ >

Северо-Западного отделения РАМН

Ученый секретарь диссертационного Сові кандидат биологи чес к*

Автореферат разослан

Козі ma JI.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В связи с увеличением средней продолжительности жини и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание уделяется исследованиям механизмов развития возрастной патологии, в частности опухолей, и разработке новых геропротекторных препаратов.

Известно, что одной из важных особенностей злокачественных новообразований является ил автономный рост, регулируемый локально продуцируемыми факторами [КушшскиЙ H.Ii.и др. 2000. Nicolsun G.L,,19931- К таким аутокринным и паракршшым регуляторам пролиферации опухолевых клеток относят «факторы м и кроо круже t е и я <> опухолей, продуцируемые как самими опухолевыми клетками, гак и клетками окружающей (ix стромм [Argiles J.M., Azcon-Bieto J., I'JSS]. Продуцируемые шдотедиальиыми клетками, моноцитами, макрофагами, лимфоцн гамн и тучными клетками им тер лей килы, простагландины, регуляторные пептиды прямо или косвенно влияют на пролиферацию н индуцированию гибель опухолевых клеток.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о непосредственном участии клегок микроокружения опухолей в патогенезе злокачественного роста и их'влиянии па чувствительность и ответ опухолевых клеток к той или иной методике лечения1 [Ярилин A.A., 1W9, Tutton P.Ï., 1987]. В процессе злокачественной трансформации клеток белковые продукты аберрантной экспрессии мутангных генов потенциально' йммуногенны и могут служить' в качестве антигенов отторжения. Однако, несмотря на то, что опухолевые клетки несуг антигены, способные активировать цитотоксические ' Т-лим<]иишты и вызьимть образование антител, многие опухоли способны избегать механизмов иммунного надзора и не разрушаться'факторами иммунной системы. Помимо" множественных механизмов «ухода» от иммунных факторов, существуют механизм ¿ГзащиШ опухолевых клеток, основанные на индукции иммупосупрессии [Wu J,, 1996], РаЛпифровка и молекулярный аиаДиз механизмов, лежащих в основе ухода опухолей от иммунного надзора, приведет к развитию новых стратег ий для предотвращения у онкологических больных Т-клеточной иммуносупрессии. развитию новых иммунотерапевтических мероприятий; способных . предотвращать профессию злокачественных новообразований и их развитие.

Одним из перспективных направления терапевтических мероприятий в онкологии является применение биомодулятороь, повышающих иммунную занцпу^о^еащцуд и усиливающих эффект противоопухолевых химиопрспаратов (Undemanji^/JJ i9SS,

t-iS^w+.Tw* ÄfiTSp?'

Long S J., 19У6, Lumsden A.J, et al„ 1996], Перспективными синтетическими пептидами, обладающими иммуномодулирующимн своОстпаыи и оказывающими влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, неспециф ическуго резистентность организма, являются вилон (Lys-Glu) и эниталок (Ala-Clu-Asp-Gly), полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [Морозов В.Г., Хавинсои В.Х., Мал и ни н В.В., 2000]. Исследование онкомодифнцирующих свойств в и лона и опиталона, их влияния на ангиогенез н микроокружение экспериментально индуцированных опухолей позволит более глубоко понять механизмы действия пептидов как биологических модификаторов, способных активировать эндогенные противоопухолевые защитные механизмы.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение онкомодифицирующих свойств вилона и эниталона, их влияния на ангиогенез и микроокружение экспериментально индуцированных опухолей у старых крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие вилона на продолжительность жизни старых mli шеи-опуходеносителей эпителноидной опухоли - карциномы легких Льюис (КЛЛ);

2. определить способность вилоиа влиять на пролиферативную активность опухолевых клеток и уровень апоптоза в КЛЛ;

3. оценить эффекты действия вилона иа КЛЛ при сочетанно.ч применении с цикл офосфаном ;

4. изучить эффекты вилона при иммуносут[рессорном действии опухоли на организм старых мышей;

5. исследовать влияние вилона и апиталона на рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс и их онкомодифицирующее действие в условиях нарушенного аптиогенеза и пострадиационной гипоксии.

Неуч пан новишэ

В работе впервые получены новые данные о пролиферотропных и онкомодифнцирующих свойствах синтетических пептидов — вилона и эпиталона, нх влиянии на микроокружение экспериментально индуцированных опухолей и на продолжительность жтни старых животных - он у холеное ителе й. Установлены

моле кулярио-клеточные механизмы дейсгния пептидов на пролиферацию эндотелиадынлх клеток, функциональное состояние щшуиоком110тен | пых клеток и ангиогеиез.

Практическая ценность работы

Полученные данные об ингибировании роста экспериментальных опухолей под действием иепшдов, снижении иммуносупрессорного действия опухоли на организм под их влиянием, коррекции вилоном тимусзависимого иммунодефицита создают основу для дальнейшего изучения синтетических коротких пс п силой, как естественных онкомодифицирую тих факторов и разработки новых методов биотерапин опухолей п пожилом и старческом возрасте.

Основные нп.шжеиия, иыпоеммые на защиту

К Синтетический пептид вилон оказывает он комодифицируюшее действие на рост эиитениоидной опухоли - карциномы легких Лыоис у старых мышей, при этом эффективность его действия на опухоль зависит от дозы и продолжительное™ применения.

2. Выявленное снижение иммуносупрессорного действия опухоли на организм старых животных и коррекция вилоном тимуезависимого иммунодефицита создают основу для изучения его применения в качестве стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных пожилого и старческого возраста иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

3. При сочетал и ом применении внлони н циклофосфана тормозящее действие циклофосфана на рост опухолей менее выражено, чем при его изолированном применении и сопровождается повышением прсошферативной активности клеток нормальны* тканей, ччо предполагает нецелесообразность одновременного применения вило: [а и ци тостатн чески х ирепаратов.

4-, Действие пилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозш и стадия развития опухали. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухали проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообраюванмя. Инъекшш вшгона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5.0 мкг может сопровождаться как усилением, так н инвертированием иигибнрующего действия,

5. Синтетический пептид эгтиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крь1С, По механизму действия

исследованный препарат можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, при этом эффект его действия реал нчуотея через сосудистое русло опухолей.

6. Полученные данные свидетельствуют об актуальности дальнейших исследований по изучению синтетических коротких пептидов как естественных биологических модификаторов опухолевого роста в пожилом и старческом возрасте.

Апробации н реалист (и я диссертации

Материалы диссертации доложены на конференции Белорусской Академии Наук, (Минск, 2003), на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 2-ом съезде геронтологов России (Москва, 2003), Международном экологическом форуме «Окружающая среда к здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2003).

Результаты диссертации используются в научной, клинической и педагогическом деятельности Сам кг- Петербу pie кого института биорегулягши и геронтологии СЗО РАМП, НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Связь с нау ч н »-и сс леди в ател ьс кой работой Инст и гута

Диссертация выполнена но основному плану научно-и с следовательских работ: Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтолога и СЗО РАМН.

Структура и обьем диссертации

Диссертация состоит из введения, четыре* глав, заключения, выводов н указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы биорегуляшш злокачественного роста опухолей, роли регу ля горных пептидов в онкогенезе и коррекции иммунного статуса при опухолевом процессе. Глава 2 посвящена описанию материалов н методов, примененных в данном исследовании. Главы 3 и 4 являются изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждением.

Текст диссертации изложен на 119 страницах, иллюстрирован 21 рисунками, 3 таблицами. Указатель литературы содержит 175 работ, из них отечественных ■ 26, иностранных - 9'Л

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение действия етона на корцин лму легких Льюису старых мышей Эксперименты выполнены на 80 самцах мышей линии С57В1/6 в возрасте 16-18 месяцев. В качестве объекта исследования использовали перевиваемый шимм эп и те лиои л ной опухоли — карциному легких Льюис (КЛЛ). Суспензию опухолевых клеток вводили подкожно в правую заднюю конечность мышей ипсулиповым шприцем по 50 мкл Из расчета 10* клеток па одну инокуляцию. Чтобы обеспечить однородность опухолевого лттамма в исследуем ¡.їх группах материал ог одной опухоли был введен 80 животным. Животные с имплантированной КЛЛ распределили на пять групп: 1-я группа - животные - опухоленосигели, не подвергающиеся воздействиям препаратов; 2-я группа - введение вилона животным на 8-І 7 сутки роста опухолей в разовой дом 2 м кг/мышь (0,1 мг/кг) - Ш инъекций череї сутки с курсовой дозой 20 мкг препарата на мышь (1 мг/кг массы тела); 3-я группа - введение вилона животным на 8-17 сутки роста опухолей в разовой доте 100 мг/мышь (5,0 мг/кг) — 10 инъекций через сутки с курсовой дозой 1,0 мг препарата на мышь (50 мг/кг массы тела); 4-я группа - введение животным оиухоленосителям циклофосфала курсовой долой 100 мг/кг. Производили три введения циклофосфана в разовой дозе 0,67 мг/мышь: первое на 8 день после перевивки опухолей, второе на 13-е и третье на 17-е сутки роста КЛЛ; 5-я группа - введение вилона по схеме 3-й группы и циклофосфана по схеме 4-й группы. ІІилон и циклофоефан вводили ън утри брюши ни о отдельными инсулиновымн шприцами.

Размеры опухолей на месте прививки определяли 2-3 раза в неделю и рассчитывали их объем по формуле мл и пеон да:

V = 4/Зл(Ш)- (0/2)г [мм'], где Ь • длина опухоли; Р = (В, + а Б, и - 2 других взаимно перпендикулярных диаметра (мм).

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен контрольный срок для гистологического изучения карциномы - 1Н-С сутки роста опухолей (10-е сутки от качала курсового лечения препаратами; 24 часа после последней инъекции препаратов в оиьтгкых группах). Эвтаназию мышей осуществляли путем дислокации спинного мої га.

Ткань КЛЛ вырезали в виде пластинок толщиной 3-4 мм. ориентированны* вдоль длинной оси опухолевого узла. Также для исследования брали тимус и желудок. Кусочки опухоли к выделенные органы фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для

светомикросконических исследований и по Карнонекому для электронной микроскопии. Обезвоженный материал заливали, соответственно, R очищенный томом1 изиронашIый парафин для гистологических исследований и смесь зпонов (Ероху-Ei nbeltungsm Lucí-K¡ t, SMT Geraetehandel GmbH, Германия) для электронной микроскопии.

Изучение действия в плана а зпиталона па саркому М-1 у старых крыс

Объектом для исследования была выбрана саркома М-1 - солидная соединительнотканная опухоль, имплантированная самцам белых беспородных крыс в возрасте 2 лег. Материал для имплантация получен от опухоли животного-донора при достижении ем объема ] см'. После удаления кал суды, геморрагических и некротизнронангшх участков паренхиму опухоли разрезали на кусочки массой 5-6 мг. Затем с помощью троакара трансплантат вводили под кожу в правое бедро крыс. Чтобы обеспечить однородность опухолевого штамма в исследуемых группах материал от одной опухоли был введен 90 животным. На II сутки 60 животных с пальпируемыми опухолевыми узлами нранильной формы методом случайного отбора были распределены на 4 группы и« 15 крыс: 1 группа - контроль; 2 ipynna - введение шшалона; 3 ipyiina -гамма-облучение опухолей п дозе 30 Гр; 4 группа - гамма-облучение опухолей в дозе 30 Гр + введение эпитадона, Общий процент прививаемости составил 84%. Измерение трех взаимно перпендикулярных диаметров опухолей производили 2-3 раза в неделю. Объем опухоли рассчитывали по вышеприведенной формуле.

Иа 18 сутки в экспоненциальной фазе роста саркомы животным 2 и 4 групп начинали вводить эпиталон. К этому сроку средний объем опухолей в контрольной группе достиг 1 см\ Препарат вводили внутри брюшин но по 0,5 мкг на животное 7 дней подряд отдельным инеулиновым шприцем.

Местное однократное гамма-облучение опухолей животных 3 и 4 |ругш в дозе ЗОГр выполнено на кобальтовой установке «Луч» при мощности дозы 0,8 Гр/мнн, Размер поля облучения составил 10x10 см, время экспозиции 37,5 мин. В поле облучения выводились и жестко фиксировались в области голеностопного сустава задние правые конечности с опухолями. Выбор дозы в 30 Гр был обусловлен необходимостью провести максимально возможную лучевую инактивацию опухолевых клеток при однократном облучении с учетом толерантности кожи крыс. Облучение проведено на 16 сутки роста опухолей (за 2 суток до начала введения энигалона в 4 группе). Острые лучевые реакции кожи над опухолью оценивали на 10 сутки после гамма-облучения.

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен контрольный срок для гистологического изучения саркомы - 26 сутки роста

опухолей {2 сутки после окончания введения эпиталона во 2 и 4 группах); 10 сутки после гамма-облучения в 3 и 4 группам. Забой животных и выделение опухолей пропеден под нембуталовым наркозом (50 mi /кг). Ткань саркомы вырезали в виде пластинок толщиной 3-4 мм, ориеш про ванных вдоль длинной оси опухолевого узла, с возможным сохранением прилегающей кожи. Кусочки фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Ьуэна для светом и крое конических исследований и по Карновскому для проведения электронной микроскопии. Обезвоженный материал залипали, соответственно, в пара л ласт и элон.

Метода исследования Общую гистогго! (tto органон и опухолей изучали на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Ультраструктурные исследования проводили в электронном микроскопе JHM-KIOS (JEOL, Япония) на ультратонких срезах, приготовленных на ультрамикротоме LKB-7A (Швеция), контрасшрованных ураршлацетатом и цитра кш свинца. Тип клеток идентифицировали способом серийных полу гонких - ультратхтких срезов. Полутон кие срезы окрашивали метиленовым сипим -злу ром I! - основным фуксином.' Тучные к летки селективно окрашивали 1% раствором тол у иди нового синего.

Для изучения пролиферативной активности кдеток нснользонали мышиные м оно клоп альиые антитела к PCNA (1:100, Novocastra) и наоор для выявления мышиных иммуноглобулинов (1CN, США). Се ротоннн - и и м у п о познти вн ые клетки выявляли с помощью поли клон альнмх кроличьих антител к серотоннну (1:50, BioGenex) и биотип-стрелтавидин-пероксидазного набора (ICN). Для изучения гастрш hi редуцирующих клеток применяли кроличьи антитела к гасгрнну (1:50, DAKO) к авшшн-биотин-перокси дачный набор (Sigma), Иммуноглобулин (fg) -содержащие клетки идентифицировали набором для выявления мышиных иммуноглобулинов (BioGenex), Адгезионную связь клеток саркомы N1-1 с базальной мембраной эндотелия сосудов и их способность к локальной инвазии изучали с помошью пол и клепальных кроличьих антител к ламптшу (1:30, Sigma) н авидин-биотин-пероксидазкот набора для кроличьих имму ноглобулинов (Sigma).

Функциональную активность опухолевых клепж изучали методом избирательной импрегнации ядрышко в ых организаторов. Определение числа ацоптозных клеток и характера их распределения в паренхиме опухоли проводили на препаратах, им премированных но методу Мозера,

Индекс alio итога (ЦП) и митотнческий индекс (Wit) у животных с КЛЛ определяли по стандартной методике при иммерсионном увеличении микроскопа при подсчете не

менее 3000 ядер опухолевых клеток. Продиферативный показатель но PCNA (1и:на)

ОІГреДеіІЯ.ІК KOK ОТНОШеНИе КОПИЧССТВеНИОЙ ПЛОТНОСТИ PCNA-ПОЗИТИВНЫХ ЯДер (NfCMA) к количественной плотности ядер клеток (ИжжХ окрашенных гематоксилином. Количественную плотность определяли по числу сечений ядер на 1 мм2 площади среза. Исследования ПО определению и Ияок выполнены с помощью системы

компьютерного анализа микроскопических изображений IM STAR (Франция) с применением прикладных лицензионных программ MorpliosLar-2 и Colquanl-2, Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили не менее чем в 60 визуальных тестовых полях по і рем срезам каждой исследуемой опухоли. При этом тестовая площадь для ядер опухолевых клеток и определения индекса PCNA составляла 0,5 мм" и включала не менее 2000 опухолевых клеток в препаратах контрольной группы; для ЗОЯ = 0,3 мм2 и включала не менее ЮООядрышковых организаторов.

Кинетику роста опухолей рассчитывали по уравнениям линий тренда для участков, соответствующих определенным стадиям развития опухолей. Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программы Stalls Ii ка 5.0 (Slatsoft).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие вилона на карциному легких Льюис (КЛЛ) у старых крыс

Контрольная группа (I группа) Опухолевые узелки появляются под кожей бедра на 4 - 6 сутки после имплантации опухолевых клепок. Опухоли привились у всех животных первой группы и к 8-м суткам достигли размеров, позволяющих проводить достаточно' точные измерения. Самопроизвольного рассасывания привившейся карциномы не зарегистрировано. В интервале от 8-х до 18-х суток большинство опухолей растет в достаточно узком диапазоне варьирования. Наиболее интенсивный рост наблюдается до 20-х суток, а кривая роста отображается формулой: V(t) = Vu х t", где а - коэффициент, определяющий скорость роста опухолей. В процессе роста время удвоения объема опухолей постепенно увеличивается от 2-х до 4-х сугок. В контрольном интервале времени прирост массы опухолей по средней геометрической (G (S.[S)) составил 289± 9,5 мм'. Первые животные в этой группе погибли на 21 сутки, последние — на 24. Средняя продолжительность жизни старых мышей после имплантации опухолей составила 23,0 * 0,5 суток.

Гистологически карцинома легких Льюис имеет солидно-инфильтрирующий тип строения с выраженным клеточным полиморфизмом, явлениями тканевой и. клеточной

п

атипин. Зоны инвазии имеют неправильные (ранним, образованы отдельными клетками ник их скоплениями в вида небольших ш-peiaiOB и трабскулярпих тяжей.

Известно, что опухолевая инвазия является результатом патологических взаимодействий между онухояеными клетками, межклеточным матриксом и стромой. Активное участие в этих событиях принимают сгромалььые клетки микроокружения -фибробласты, макрофаг и, эндотеаиальные и тучные клетки, Инвазивность коррелирует со снижением адгезионных свойств опухолевых клеток, их подвижностью, потерей контактного торможения, выделением ферментов и других факторов, обусловливающих агрессивность новообразования.

При изучении ультраструктурнои организации опухолевых клеток в группе старых животных бен введения вилона установлено, что в интерфазных клетках ядра крупные, занимают большую чаегь клетки, имеют полиморфную форму, иногда с глубокими иивагинзциямн, расщепляющими их на сегменты. На поверхности клеток определяется наличие палы [с видных выростов цитоплазмы. Цитоплазма опухолевых клеток содержит достаточное количество органоидов. Хорошо дифференцируются многочисленные фигуры митоза и единичные клетки, погибающие в форме апоптозз.

Характерной картиной для клеток KJU1 является выраженный улътраегрукаурныи полиморфизм. На гистологических препаратах определяется зональная неоднородность распределения кровеносных сосудов в паренхиме опухоли. Так, относительно вас куля ризированы зоны инвазии опухолевые клеток в интактную ткань. И зонах иивазивного роста KJIJ1 микроциркуля горное русло представлено тонкостенным и сосудами синусоид но) о типа. Ядра эндотелиалыгых клеток имеют вытянутую овальную форму. В проспете сосудов часто обнаруживаются опухолевые клетки

Результаты проведенных исследований показывают, что в зонах инвазии, в сетчагом слое дермы и подкожной клетчатке над опухолью концентрируются многочисленные тучные клетки. Их количественная плотность у животных -опухолейосителей контрольной труппы составляет 162±22 клетки при их объемной плотности 0,64-Ь 0,04 у.е., что почти в два раза выше, чем в зоне имплантации опухолей > интактных мытей. В зонах инвазии можно наблюдать миграцию тучных клеток в паренхиму опухоли.

Наши исследования показали, что большая часть клеток стромалытго микроокруженяя карциномы представлена клетками гранулоцитарного ряда, в основном, моноцитами и макрофагами. Особенно высоко содержание макрофагов в зонах нньшивного роста опухолей. Обращает внимание, что в опухолевых клетках, которые непосредственно контактируют с макрофагами, цитологических признаков токсического

воздействия не обнаруживается. По данным проведенного нами компьютерного анализа микроскопических изображений, в периферической зоне плотность опухолевых клеток по ядрам, окрашенным гематоксилином, составляет 5022*124 клетки на 1 мм2. Рассчитанная фракция пролифериру ющих клеток но индексу РСИА - 47,4 ± 1,7%. В ядрах определяются от 3 до 11 ядрышковых организаторов. Их интегральное содержание в ядре - 26Д±0,48%. Митотический индекс опухолевых клеток равен 2,15*0,17%. На препаратах, ншрегнированных серебром по Мозеру, апоптотический индекс составляет 0,99±0,06%. По индексу соотношения (1е - 2,17) матотическая активность опухолевых клеток почти в 2 раз выше, чем их гибель по механизму апоптоза.

При окрашивании паренхимы опухолей на иммуноглобулины позитивный продукт реакции выявляется в виде характерной сеточки, интенсивность которой более выражена вокруг сосудов. Продукт реакции контурирует в основном стромальные клетки. Вокруг опухолевых клеток видна следовая позитивная реакция при иммерсионном увеличении микроскопа. В паренхиме и в тканях, окружающих опухоли, обнаруживаются единичные ¡£-позитивные клетки с невысокой интенсивностью нммуноокрашивания цитоплазмы. Суммарное содержание ^-позитивного продукта у животных первой группы составляет 2,7+0,16%.

Действие вшшиа в курсовой дозе 1 мг/кг (2-я группа) По данным сравнительного анализа существенных изменений в динамике роста опухолей после инъекций в клона в указанной курсовой дозе не отмечено. Однако средняя продолжительность жизни животных в згой группе возросла на 13% и составила 26,0*0,7 суток (р < 0,05).

Действие билона в курсовой дозе 50мг/кг (3-я группа) В начальном интервале времени диапазон варьирования и кривые роста опухолей, построенные по средним значениям, в третьей и контрольной группе практически совпадают. Явных отклонений параметров роста отдельных опухолей от средних значений не выявлено. Однако после пятой инъекции вилона на 13-е суткн появляется отчетливая дивергенция между кривыми роста в опыте к контроле, а в последующий период линия роста новообразований в третьей группе располагается выше. Прирост массы опухолей по средней геометрической увеличился относительно первой группы на 33,5% (р < 0,05), а коэффициент а - на 11%.

Средняя продолжительность жизни животных в третьей группе снизилась до уровня контрольной группы живота ых-опухоленосителей.

Действие циклофосфана на опухоли при курсойой дозе 100 мг/кг (4-я группа) У большинства животных эффект торможения роста опухолей начинает проявляться уже после первой инъекции цнтостатика. По данным сравнительного анализа, на этапе наблюдений между 13-27-ми сутками отмечается наиболее выраженное

торможение роста первичных опухолевых узлов. В контрольном интервале прирост массы

/

привившихся опухолей был на 25% ниже, чем в контроле (Са.18 = 21У±33; р< 0,05). Коэффициент а, определяющий кинетику роста по степенной зависимости, снижается до 1,8. Средняя продолжительность жизни животных увеличилась на 15% относительно первой группы опухоленосителей и составила 2б,4±0,8 суток.

Сочетанное действие «ияопа и «икгофосфана (5-я группа) Обращает внимание своеобразная «синхронизация» ответа опухолей ш введение циклофосфана в -этой группе. Практически у всех животных регистрируется снижение скорости роста имплантированных новообразований в раннем периоде совместного применения вилона н циклофосфана, что подтверждается н тенденцией к снижению прироста массы опухолей (О^в = 1й9±23). До 20-х суток диапазон варьирования и кривые роста, построенные по средним значениям, для пятой и четвертой группы в основном, совпадают. Мало отличаются и количествишые данные, пол енные по уравнениям линий тренда. Однако в последующий период времени при сочетанием применении вилона и циклофосфана наблюдается очевидное ускорение роста новообразований. Средняя продолжительность жизни животных после сочетанного применения вилона и цмтосташка снизилась до 21 суток (р<0,05).

Таким образом, результаты кинетических исследований свидетельствуют, что синтетический дапептид в ил он оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной эпителиоидной опухоли - КЛЛ. Онкомодулирующее действие этого препарата зависит от дозы и продолжительности его применения.

Введение вилона в разовых дозах 0,1 мг/кг в период активной фазы роста КЛЛ практически не влияет на ее кинетические параметры, но достоверно увеличивает продолжительность жизни опухоленосителей. Увеличение разовых доз исследуемого препарата до 5,0 мг/кг сопровождается активизацией темпа роста опухолей.

При сочетанием действии вилона н циклофосфана, в раннем периоде комбинированного лечения проявляется синхронизация ответа опухолей на тормозящее действие цигоетатика с последующим ускорением скорости роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных.

H

Действие m пиша на кинетику роста, ашнлгшез и микроокружепие саркомы М-1

Действие вилона « dote 0,5 мкг в питентнам nepuvàe н зкепоненцшиьнон фал; роста опухоли (вторая и третья группы)

У животных второй группы опухолевые узелки в тоне имнланташж начали визуализироваться на 7-13 сутки после перевивки. До 24 суток существенных изменений в скорости роста опухолей по коэффициенту а не регистрируется, однако обращает внимание, что прирост массы опухолей а этот период по средней геометрической снизился на 25% и составил 0,48±0,09 (р>0,05). Расхождение линий роста но средним значениям в контрольной и опытной группе было отмечено лишь через 2 недели после окончании введения вилона, но коэффициенту « уравнения линии гренла к интервале меаду 28 и 40 сутками теми роста опухолей снижался в 1,7 раза, а прирост массы опухолей по средней геометрической уменьшался на 33,2%. Различие становится достоверным но отношению к коггтрольной I русле при р-0,05. Средняя продолжительность жизни жнвотпых-опухоленоси гелей в второй группе состанила 40,5гЗ,4 сут (j)>0,5).

... В группе животных с введением вилона в дозе U.5 мкг в экспоненциальной фазе роста опухолевые узелки появились в зоне имплантации на 5-7 сутки (как и в контрольной группе). До 24 суток кинетические параметры роста саркомы в 3 группе практически не отличались от контрольных значений, В экспоненциальной фазе диапазон варьирования индивидуальною роста опухолей и кривые роста, построенные по средним значениям, практически совпадали. Коэффициент, определяющий кинетику роста по экспоненциальной зависимости, и прирост массы опухолей не отличались от аналогичны* показателей, определенных для контрольной группы, В последующий период была отмечена тенденция к снижению скорости роста и прироста массы опухолей — коэффициент а снижается до значении 1,16, = 13,56± 1,63. однако различие с

контрольными значениями не достоверно. Средняя продолжительность жизни животных -опух о доносителей в третьей группе увеличилась до 42,3* 3,6 суток (р>0,5).

При изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, и на полутонких срезах существенных изменений в гистологическом строении опухолей после введений вилона в разовых дозах 0,5 мкг не выявлено. Ультрасгруктурная организация паренхимы саркомы также соответствовала вариантам контрольной группы. Однако обнаружена активизация клеток стромы. Так, например, чаще регистрировались клетки гранулоцитарного рада т ипа моноцитов, тучные клетки И нейтрофильные лейкоциты.

Результаты гистохимических и и м му но пістохим и чески х исследований также практически полностью совпадали с данными по контрольної! группе (таблица). В иодкал судьи ой зоне количественная плотность опухолевых клеток но 2 группе составляет 4080±190 на і ммг, в 3 группе - 4136±170. Пролнферативная активность по индексам РСИА оставалась столь же высокой, как и в контрольной группе. Вместе с тем, по данным компьютерно!-о анализа, индекс апоптоза опухолевых клеток во 2 группе увеличился до 0,33±0,02, а в третьей группе составил 0,38±0,02.

Действие вч'миа в доіе 5,0 л»кг е латентном периоде и экспоненциальной фазе роста опухоли (четвертая и пятая группы)

В четвертой группе латентный период времени до повеления опухолевых узел ко» составил 6-7 дней, однако наблюдения над животными показали, что прививаемость саркомы в этой группе снизилась до 80%, По данным количественного анализа, в экспоненциальной фазе прирост массы привившихся опухолей по средней геометрической был в 1,7 раза выше по сравнению с контрольной группой (Сщ.м = 1,08±0,17), а в период 28 - 40 суток этот показатель превышал контрольные значения на 23% (028.40 = 18,05 ±2,5). Средняя продолжительность жизни жи потных после имплантации опухолей в этой группе составила 35,9 ± 4,2 суток (р>0,5).

В пятой труп не опухоль не привилась у одной крысы. її трех случаях после двух инъекций ьилона в разовых дозах 5 мкг роет привившихся опухолей прекратился, В последующие несколько дней они полностью регрессировали. В интервале времени 10-24 сут существенных отклонений в характере роста отдельных опухолей от средних значений в контрольной группе не отмечено. Диапазон варьирования и кривые роста, построении« по средним значениям, в основном, совпадают. Не отличаются и количественные данные, полученные по уравнениям линий тренда. Однако на 5-7 сут после окончания инъекций вилона у 4-х животных кривые роста начали отклоняться от средннх значений, характерных для контрольных животных. Замедленный темп роста опухолей сохранялся около 10 суток. По уравнению линии тренда в период 28-40 сут коэффициент « снизился на 20%, а прирост массы опухолей уменьшился на 23%, Средняя продолжительность жизни животных в 5-й группе составила 38,9 ± 2,6 суток.

При изучении гистологического строения опухолей животных 4-й и 5-й групп обращают внимание характерные изменения со стороны микроциркуляторного русла в капсуле и подкапсулъкой зоне. Просвет сосудов был расширен. Пернваскулярно определялись характерные признаки отека с выходом форменных элементов крови в межклеточное пространство. В 5-й группе животных периваскулярный и

и нтерсти циальн ыи отек бил выражен в большей степени. Проведенный анализ гистологических препаратов позволяет предположить, что введение достаточно больших доз пилона, по-видимому, стимулирует гемодинамику в опухолях. При этом в ранние сроки на первый план выступает усиление кровенаполнения практически всех звеньев сосудистого русла в саркоме, а в более поздние сроки - активизируется акгиогепез.

Пролиферируюшие опухолевые клетки были концентрически сгруппированы вокруг новообразующихся капилляров в виде небольших групп. По ультраструктур!мм характеристикам (крупные ядра с гипертрофированными ядрышками: цитоплазма, насыщенная свободными рибосомами, слабо развитый пластинчатый комплекс) клетки саркомы М-1 в 4-й и 5-й группах практически не отличались от опухолевых клеток контрольной группы. Тучные клетки и моноциты в зонах их диффереишфовкм тесно контактировал« с опухолевыми клетками, У животных, получавших внлон н разовых дозах 5 мкг, было отмечено повышение митоти ческой, нролиферативпон и функциональной активности ^ндотелиальных клеток. Кроме того, по данным количествен но IX) анализа, в подкапсулыюй зоне была отмечена небольшая тенденция к усилению нролнферативнои и функциональной активности опухолевых клеток. Однако вместе с этим увеличивался индекс апонтоза опухолевых клеток. В 4-И группе индекс апоптгоа составил 0,43±0,07; в 5-Й группе - 0,49±0.02 (р<0,05).

При нммуноократнивании препаратов на ламннин, существенных изменений в его экспрессии не выявлено. В то же время, заметно возросло содержание серогоннн-имму но позитивных клеток в нсринаску лирной етроме. Как н в контрольной группе, признаки экспрессии регуляторных пептидов в стромальпыч клетках микроокружения отсутствуют. Практически не выявлялись клетки с позитивной реакцией на иммуноглобулины. В отличие от предыдущих групп, в 5-й группе животных отмечена повышенная дегрануляция тучных клеток в подкожной клетчатке, паретическое расширение сосудов капсулы и появление локальных микроочагов некроза в нодкалсульной зоне опухолей.

Действие эп»талона на кинетику/юста и функциональную морфологию саркомы М-1

До 24 суток рост опухолей в 6-й опытной группе практически полностью соизмерим с контролем. Однако на 2 - 4 день после окончания введения испытуемого препарата появляется отчетливая дивергенция линий роста. В период 28-40 сут прирост массы опухолей по средней геометрической снизился на 26% относительно контрольной

группы (р<0,[)5). По коэффициенту а скорость роста опухолей в группе жнвотых, леченых эпиталопом, снижается в 1.5 раза (таблица). После -40 сут скорость роста опухолей начинает увеличиваться. При этом угол наклона кривой практически совпадает с контролем, а коэффнпнен г а возрастает с 0,88 до i ,2. Средняя продолжительность жизни животных в этой опытной группе увеличилась на 20% и составила 44,9*2.7 сут (р<0,()5).

Таким обратом, по данным кинетических исследований, эпиталон достоверно замедляет рост саркомы М-1, а тормозящий эффект сохраняется в течение 2-х недель после окончания курса введения препарата.

Микроскопически в опухолях этой группы обнаружено появнеиие в периферических зонах обширных, протяженных очагов некроза с вовлечением сосудов. В этих зонах пролиферирующие клетки сохранялись в виде «опухолевых манжеток», а оставшаяся часть паренхимы была представлена полями недавно погибших клеток с пикнотичными ядрами. В двух случаях гистологический рисунок опухолей в целом мало отличался от контроля. Однако в подкапсульной зоне крупные сосуды расширены, а в капиллярах видны признаки стаза крови. Кроме этого, в качестве характерного признака опухолей в этой ipynne можно отметить появление вокруг сосудов многочисленных клеток, окрашивающихся толуидиновым синим. Клетки дали отчетливую позитивную иммуногистохнмическую реакцию на серотонин. При использовании метода серийных полутонких - ультратонких срезов эти серотоникпозитивные клетки были идентифицированы как тучные клетки. По своим ультраструктурным и иммуногистохимическим характеристикам идентифицированный нами тип клеток фенотигшческн отличается of тучных клеток, концентрирующихся по периферии опухолей, и больше соответствует интраэшпелиальным тучным клеткам желудочно-кишечного тракта. Поскольку, ранее подобный тип тучных клеток в коже мышей был описан de Rey el al. (1994) при изучении механизмов экспериментального канцерогенеза, мы обозначили их. как тучные клетки интратуморального типа. Детальное электронно-микроскопическое исследование показало, что ш>сле пролонгированного введения эпнталона основные события развертываются в периваскулярнон строме. Судя по увеличению содержания шллаге новых волокон, активизировалась деятельность фиброб ластов. В подкапсульных участках опухолей обнаружены многочисленные моноциты, являющиеся, как известно, предшественниками макрофагов, и наряду с естественными киллерами, активированными Т-лимфоцитамн и тучными клетками, обладающие противоопухолевой цктотоксичностью.

Таблица. Сравнительные характеристики изученных параметров по данным компьютерного анализа

и контрольной и опытных группах

г Группа животных Кж ^ на 1 мм" 1|'ГМЛ (%) . _. т. _ .. 1ыит 1 1л|1Г1ПТ (*) 1 <»> 1с ^ мкм рзоя (%) НгК(СгТ) | Мтк(ст-п на I мм | на 1мм 11т"1 1шГ"

1 (контроль) 4220±80 76^+2,6 2,28+0,09 0,28+0,03 8,23:0,54 1 2,70±0,08 2,40±0,18 80-130 0-10

2 (эииталон) 4230+120 74,5 ±2,7 1,89+0,11 р3.,>0,05 0,67+0,13 Рз.1<0,05 3,26+0,59 <0,05 2,80+0,03 р1.1>0,05 7,382:0,17 70-140 | 20-90 1 1

3 (облучение} 3560*205 р_1.1<0,П5 62,3*3,9 | 2,31+0,06 PJ.K0.05 | 1,50+0,18 1,61+0,14 р.м<0,01 3,10+0,02 р3|<0,05 5,90+0,14 р.,! <(1,01 90-180 | 10-30 ]

4 (облучсние+ эшпалон) 3320+191) рч„1>1),05 (>1,1+3,8 2.(17+1,16 р4..1>0,05 1,30+0,12 1,64+0,18 Ргз>0,05 2,98+0,10 р4,3>П,05 5,10+0,20 80-140 20-50

- в связи с высокой подвижностью кожи над капсулой сохранить топографическую ориентацию подкожной клетчатки нал опухолями удалось не во всех случаях.

- клетки этого типа распределены в паренхиме опухолей очень неравномерно. Данные отражают диапазон варьирования по тестовым полям, ориентире ванн ым на сосудисто-стромальный компонент.

При иммуноокрашиванни препаратов на ламинин особых изменений в ею экспрессии и характере контурировапия стенок сосудов не обнаружено. Однако, обращало на себя внимание появление в периваскулярном пространстве бесклеточных участков в виде своеобразных «зон отчуждения». На электрон нограммах эти участки были представлены в виде скопления прозрачных вакуолей, отделяющих базальиую мембрану эндотелия от прилегающих к сосудам опухолевых клеток, в цитоплазме которых появляются признаки ультраструктурной патологии, характерные для клеток, испытывающих недостаток в кислороде: }илотняется цитоплазма, усиливается гетерогенность строения внутриклеточных органелл, развивается субтотааыюе набухание и отек митохондрий,

В настоящее время базальную мембрану рассматривают как важный фактор, определяющий прочность межклеточных связей, роет и днфференцировку клеток. При этом особая роль в регуляции клеточной адгезии, миграции, диффереичировке и переносе информации от зффекторных клеток к иммунной системе отводится ламипипу -интегральному глико протеи ну. представляющему основной биохимический компонент базальных мембран. Полагают, что именно ламинин вовлечен в ряд событий, определяющих инвазию опухолевых клеток и процесс мешегазировапия. Показано, что адгезия опухолевых клеток к база.1! ь ной мембране определяется экспрессией специфических рецепторов к ламинину и к IV типу коллагена, также входящему п состав базальных мембран, а ламинин способен как усиливать, так и ингибировать способность опухолевых клеток связываться с IV типом кол л лека. По данным некоторых исследователей, адгезия опухолевых клеток к базальной мембране эндотелнад ьн ых клеток может приводить к защите опухолевых клеток от иитотоксичеекого .чеисгвия естественными киллерами. Различают два типа клеточной адгезии: «гомоман и чеекчя» адгезия - величина, характеризующая соединение между клетками в опухоли (межклеточное сцепление), и иге/перо/нипическаял, отражающая взаимодействие поверхности опухолевой клетки со структурными элементами нормальной ткани. Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о гом. чго для клеток саркомы М-1 более характерна «-го.\ютгтичк'ская» адгезия и слабо выраженная «п'рили пасм ост ьи клеток к базальной мембране эндотелия сосудов. Не исключено, что образующиеся после введения шитадона зоны «отчуждения» формируют дополнительный барьер для миграции опухолевых клеток через сосудистую стенку.

По результатам компьютерного анализа, в зонах активной пролиферации количественная плотность опухолевых клеток практически не отличается от контроля. Интенсивность им мун докрашивания ядер на PCNA снижается лишь в области

периваскулярного отека. Отмечена слабая тенденция к снижению пролиферагивнон активности опухолевых клеток но сравнению с контролем (1кча = 74,5%; 1И111 = ],*>%; р>0,05). Однако в зоне ангиогенеза РСКА-нозитивные ядра эндотслиальнмх клеток встречаются редко. При этом рассчитанный индекс алоптоза увеличился по сравнению с контролем более чем в 2 раза.

Как уже отмечалось выше, для опухолей основными факторами «потерн» являюгея некроз и апоптоз. Полученные нами результаты микроскопического исследования свидетельствуют о формировании в паренхиме опухолей животных, получавших эготталон, как морфологических проявлений геморрагического некроза, так и усиление апоптоза опухолевых клеток, что позволяет предположить, модуляцию а питало ном функциональной активности клеток, продуцирующих факторы инициации апоптоза.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический пептид вилон оказывает онкомодифи цируюиtec действие на рост эпигелиоидной опухоли - карциномы легких Льюис у старых мышей. Эффективность действия ви лона зависит от дозы и продолжительности его применения,

2. Морфологическим отражением модифицирующего действия ви лона яв;тяется усиление про.чиферативной активности опухолевых клеток и снижение уровня апоптоза, индуцированного факторами физиологического стресса. Эффект вилона реализуется через функциональную активизацию эндотелия сосудистого русла новообразований и усиление ангиогенеза,

3. При сочетанием применении в и лона и циклофосфапа у старых мышей регистрируется двухфазный ответ опухолей на комбинированное воздействие препаратов. В первой фазе проявляется синхроннзация ответа опухолей на тормозящее действие цитостатика с последующим ускорением роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных. Эти данные свидетельствуют о нецелесообразности одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Снижение нмму носу прессорн ого действия опухолей на организм и коррекция тимусзависимого иммунодефицита под действием вилона создают основу для применения вилона как стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

5. Действие вилона 1га рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффекг ннгибирования роста опухоли проявляется лишь после введения пилона в достаточно малых дозах и латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фалы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибируюшего действия.

6. Эпитапон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли -саркомы М-1 у старых крыс, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей. Морфологическим отражением ингибируюшего действия эниталона является развитие геморрагического некроза опухолей,

7. Эииталон снижает интенсивность проявления рани их лучевых реакций кожи у старых мышей с саркомой М-1, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения его применения в качестве модификатора радиотерапии опухолей.

8. Проведенные исследования на двух моделях опухолей у старых животных показали разнонаправлепные эффекты действия двух разных синтетических пептидов - билона и эпиталона, что свидетельствует о разных механизмах их биологического действия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сочетанное влияние вилона и циклофосфапа на трансплантаты опухолей и эксплантаты лимфондной ткани мышей и крыс разного возраста / О.П Барыкина,

B,В. Южаков, П.И.Чалисова, U.M. Квотной, С,С, Коновалов И Успехи геронтол. -2003,-Вып.12.-С. 132-143.

2. Барыкина О.П. Исследование роли пептидов в механизмах ангиотенеза и формирования микроокружения в опухолях у сгарых крыс / О.П Барыкина, В.Lt. Южаков, П.И.Чалисова// Успехи геронтол,- 2<ХВ, - Вып. 13. - С, 110-114.

3. Барыкина О.П. Регулирующая роль незаменимых и заменимых аминокислот в органотипической культуре лимфондной ткани / О.П Барыкина.. П.И.Чалисова 11 Материалы научн. конф. Национальной Академии Паук Беларуси. - Минск, 2003. -

C, 169.

4. Модулирующая роль аминокислот в органотипической культуре лимфондной ткани с различной степенью иммунологической зрело«и / Г, Хаазе, НИ. Чалиеова, О.И. Барыкина, В.А. Пеннияйнец // Материалы VII Всеросс. научн. Форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Мед. иммунол. - 2003, Т. 5, №3-4. - С. 219-220.

5. Polyakova V.O. Tissue-specific effects of peptides on differentiation and aging of thymic epithelial cells in vitro / V.O. Polyakova, S.S. Konovälov, O.P Barykina I! Proc. Intern: Ecologic Forum "Enviroment an<J Human Health". St. Petersburg, 2003. - P. 534.

6. Полякова В,О. Влияние в и лона на репаративные процессы в вилочковой железе при преждевременном (радиационном) старении / В.О. Полякова, О.П. Барыкина // Материалы 2-го сьезда геронтологов России. - Москва, 2003. - С. 137.

ЬЛРЫКИНЛ О. II. Пептидная регуляция роста, микроокружения и апгиогенеза в экспериментальных опухолях у старых животных // Лвторсф, дне,,..канд. биод. наук: 14.00.53-СПб.. 2004. - 22 с.

Формат 60x84 1/8. Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Заказ Бесплатно. Подписано к печати Отпечатано с готового оригинал-макета ЧГ1 Свид. Ка 104090 ИТД-13 от 19.07.98

f/Чг

1.15 5t