Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспрессия белков, регулирующих апоптоз, на лейкозных клетках разных этапов В-клеточной дифференцировки

На правах рукописи

ЛЫСЮК Елена Юрьевна

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ АПОПТОЗ, НА ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТКАХ РАЗНЫХ ЭТАПОВ В-КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ.

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004 г.

Работа выполнена в ГУ Российском Онкологическом Научном Центре им. H.H. Блохина РАМН (директор - академик М.И.Давыдов)

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор А.Ю.Барышников Доктор медицинских наук Ю.В.Шишкин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН А.В .Караулов Доктор биологических наук Т.П.Рябых

Ведущее учреждение:

Московский Научно-исследовательский Онкологический Институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита состоится: « U/dtX 2004 г. в № часов на заседании диссертационного совета (К.001.017.01) при ГУ Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан « /4 » &n>/d.u<X_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

ш^-ц /117>0Ёд9

Актуальность темы.

Устойчивость опухоли к проводимой терапии - одна из проблем, наиболее остро стоящих перед современной онкологией. Причин возникновения подобной резистентности множество, и одна из них - неспособность клеток активировать программу клеточной гибели (апоптоз).

Программированная клеточная гибель - нормальный физиологический процесс, происходящий, в частности, при дифференцировке клеток различной природы, в том числе лимфоцитов. Как известно, все клетки крови развиваются из плгорипотентной стволовой клетки; при развитии лимфоцитарного ростка гемопоэза до момента получения зрелых лимфоцитов происходит гибель до 90% предшественников и сохраняются только клетки с функционально-активными рецепторами. Несмотря на существование данных о том, что гибель клеток происходит путем апоптоза, нет точных сведений, на какой стадии дифференцировки задействован тот или иной механизм индукции апоптоза.

Нарушения в программе дифференцировки клеток крови приводит к развитию гематологических заболеваний, в том числе лейкозов. Четкое понимание механизмов клеточного и молекулярного контроля нормального развития клеток крови может дать ключ к ответу на вопрос о происхождении и лечении этих заболеваний.

Лимфопролиферативные заболевания представляют собой накопление или пролиферацию клеток лимфоидного ряда на определенной стадии дифференцировки Поэтому мы использовали эти заболевания в качестве модельной системы для изучения механизмов индукции апоптоза на этапах дифференцировки лимфоидных клеток.

Многие формы гемобластозов, в том числе В-клеточного происхождения, достаточно тяжело поддаются лечению. И хотя в последние годы достигнуты значительные успехи в терапии неходжкинских лимфом (НХЛ), у большого количества больных все же не удается достичь ремиссии при применении современных режимов химиотерапии. Исходя из этого, возникает необходимость в определении тех критериев, которые помогли бы выявить больных, требующих других, возможно более агрессивных, типов лечения.

К распространению опухолевых клеток могут приводить мутации онкогенов и генов - опухолевых супрессоров. Эти изменения могут снижать эффективность противоопухолевых агентов, так как действие многих цитотоксических препаратов и радиоактивного облучения приводит к гибели клеток путем апоптоза Таким образом,

Рис -

изучение путей, задействованных в регуляции апоптоза нормальных и опухолевых гемопоэтичееких клеток, может способствовать разработке усовершенствованных методов терапии при лечении лейкозов и лимфом.

Целью работы было исследовать экспрессию регуляторов апоптоза, таких как С095, Вс1-2, Вах, р53, а также их соотношение на различных стадиях дифференцировки В-лимфоцитов человека. Задачи исследования.

1 Исследовать экспрессию регулирующих апоптоз онкобелков Вс1-2 и Вах и их соотношение в лейкозных В-клетках разных степеней дифференцировки;

2 Исследовать экспрессию про-апоптотического белка р53 на примере различных лимфопролиферативных заболеваний.

3 Исследовать экспрессию СБ95 на стадиях дифференцировки В-лимфоцитов

4. Изучить взаимное соотношение экспрессии Вс1-2, Вах, р53 и С095 в клетках и корреляционные связи между ними. Научная новизна. С помощью одних и тех же моноклональных антител была изучена экспрессия апоптотических белков на широком спектре гемобластозов.

Выявлены различия в экспрессии Вс1-2 на этапах дифференцировки В-лимфоцитов человека: высокая экспрессия белка обнаружена на стадиях периферических В-клеток при гемобластозах. Вс1-2 отсутствовал при заболеваниях, соответствующих стадиям ранних и активированных В-клеток, и на стадии плазматических клеток.

Выявлена зависимость экспрессии Вс1-2 от цитологического типа центрофолликулярной лимфомы.

Обнаружено большое количество экспрессирующих Вс1-2 клеток при хроническом лимфолейкозе. Их число значительно снижалось в случае достижения клинико-гематологической ремиссии. Одновременно с этим наблюдалось снижение значения соотношения Вс1-2/Вах.

Научно-практическая значимость. Выбранные нами методы определения экспрессии внутриклеточных онкомаркеров могут быть использованы в клинической практике.

Выявление экспрессии Вс1-2 при острых лимфобластных лейкозах может быть признаком быстрого рецидивирования и может требовать более агрессивного лечения.

Исследование Вс1-2 и соотношения Вс1-2/Вах при хроническом лимфолейкозе может использоваться как дополнительный фактор, подтверждающий достижение или не достижение клинико-гематологической ремиссии на молекулярном уровне

Апробация работы. Апробация работы состоялась 21 ноября 2003г. на совместной научной конференции с участием лабораторий экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, медицинской биотехнологии, фармакоцитокинетики НИИ ЭДиТО, лаборатории клинической иммунологии опухолей и лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО РОНЦ им Н.Н Блохина РАМН.

Основные положения диссертации представлены на 6-ом Европейском конгрессе фармакологических наук (Будапешт, Венгрия, 2000г.), на 2-ом и 3-ем симпозиумах «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, 2001 и 2003 г.г.), на 4-ом международном симпозиуме по лекарственной резистентности при лейкозах и лимфомах (Амстердам, Нидерланды, 2001г.), на 1-ой московской городской научно-практической конференции "Медицина на пороге XXI века. Актуальные вопросы и проблемы" (Москва, 2001г.), на 9-ом международном семинаре по ХЛЛ (Сан-Диего, США, 2001г.), на 6-ой и 7-ой конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002 и 2003г г.).

Публикации. Материалы, изложенные в диссертации, оформлены в виде 12 публикаций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами, 33 рисунками Список литературы включает 159 работ, в том числе 8 отечественных авторов и 151 -иностранных.

материалы и методы.

Моноклональные антитела (МКА). Для исследования биологических маркеров в клетках больных использовали МКА к поверхностному маркеру СБ95 и внутриклеточному белку р53 серии ИКО, полученные в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, а также коммерческие антитела к внутриклеточным белкам Вс1-2, Вах, р53

Общая характеристика использованного материала. В работе использовали периферическую кровь, костный мозг или отпечатки лимфатических узлов больных с

различными лимфопролиферативными заболеваниями. Периферическую кровь забирали из локтевой вены в раствор гепарина (50 ед/мл). Клетки костного мозга получали при стернальной пункции в раствор гепарина той же концентрации. Отпечатки лимфоузлов получали сразу же после биопсии на предварительно обезжиренные предметные стекла.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) для проточной цитофлуориметрии Экспрессию антигена CD95 исследовали в реакции поверхностной иммунофлуоресценции. Для этого 5х105 /50 мкл клеток инкубировали с МКА в течение 30 мин при комнатной температуре и отмывали от не связавшихся антител К осадку клеток добавляли Р(аЬ)2-фрагменты бараньих IgG против иммуноглобулинов белой мыши, конъюгированных с FITC, инкубировали в течение 30 мин при 4°С, дважды отмывали и фиксировали в 1% растворе формалина.

Экспрессию внутриклеточных маркеров Вс1-2, Вах и мутантной формы р53 определяли методом прямой и непрямой иммунофлуоресценции в модификации для внутриклеточных маркеров. 1х106 в 50 мкл клеток последовательно фиксировали сначала в 0,25% растворе формалина, а после осаждения клеток -не менее 1 часа в 70% растворе этилового спирта (4°С). После осаждения клетки обрабатывали 0,1% раствором Тритона-ХЮО и дважды отмывали PBS. В случае непрямой РИФ окрашивание проводили указанным выше способом, а в случае прямой РИФ к осадку добавляли MICA, конъюгированные с флуорохромом и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После этого клетки дважды отмывали в PBS, содержащем 2% сыворотки крупного рогатого скота, и фиксировали в 1% растворе формалина.

Реакция двойного окрашивания для одновременного определения поверхностных и внутриклеточных маркеров. Окрашивание производили по методу, предложенному в литературе (Eynon et ai, 1999; Kim el al., 1998; Zheng el al., 2000). 0.7 - 1 xlO6 в 50 мкл клеток окрашивали конъюгированными с фикоэритрином (РЕ) МКА к поверхностным маркерам в течение 30 мин при 4°С, после чего дважды отмывали. К осадку клеток добавляли 0,1% раствор сапонина и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки осаждали, к осадку клеток одновременно добавляли 0,1% раствора сапонина и МКА к внутриклеточным маркерам, инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки отмывали в 0,1% растворе сапонина, содержащем 2% сыворотки крупного рогатого скота, к осадку добавляли 0,1% раствора сапонина и Р(аЬ)2-фрагменты IgG, конъюгированные с FITC, инкубировали 30 мин при 4°С. Клетки дважды отмывали в

0,1% растворе сапонина, содержащего 2% сыворотки крупного рогатого скота, и один раз - в 0,1% раствора сапонина, и фиксировали в 1% растворе формалина.

Иммуноцитохимические методы.

Реакция поверхностной иммунофлуоресценции. Фиксированные отпечатки лимфоузлов инкубировали с 1% раствором БСА в течение 20 мин при комнатной температуре, удаляли избыток раствора, добавляли первичные МКА и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого препараты дважды промывали в PBS, наносили Р(аЬ)2-фрагменты EgG, конъюгированные с FITC и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Затем образцы трижды промывали в PBS, заключали в раствор глицерина и анализировали в течение 24 часов на флуоресцентном микроскопе "Opton" (Германия), при этом оценивали не менее 200 клеток в 5 полях зрения.

Модификация метода для выявления внутриклеточных маркеров Фиксированные отпечатки лимфоузлов обрабатывали охлажденным (4°С) 1% раствором Тритона Х-100 в цитратном буфере в течение 1 мин, после чего препараты трижды промывали в PBS. Далее реакцию проводили как описано выше.

Иммуноферментное окрашивание. Фиксированные отпечатки лимфоузлов обрабатывали охлажденным (4°С) 1% раствором Тритона Х-100 в цитратном буфере в течение 1 мин. После этого препараты обрабатывали 3% раствором перекиси водорода в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Промывали 2 раза в PBS и инкубировали с 1% раствором БСА в течение 20 мин при комнатной температуре. Удалив избыток раствора, наносили первичные МКА и инкубировали в течение ночи на холоде (4°С). Стекла трижды промывали в PBS. Для визуализации реакции применяли систему LSAB+Detection System согласно инструкции. После этого образцы докрашивали раствором гематоксилина, четырежды промывали в дистиллированной воде и заключали в канадский бальзам.

Проточно-цитометрический анализ. Проточно-цитометрический анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). В каждой пробе анализировалось от 1000 до 5000 событий Экспрессию антигенов менее 20% для внутриклеточных (Вс1-2, Вах и р53), и менее 10% - для поверхностных (CD95) маркеров считали негативной.

Микроскопический анализ. Микроскопический анализ проводили на флуоресцентном микроскопе Opton с использованием фильтра 400-440 нм. Если количество положительных клеток не превышало 20% для внутриклеточных

маркеров Bcl-2, Вах, р53, и 10% для поверхностного антигена CD95, то экспрессию оценивали как негативную.

Статистический анализ. Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica for Windows, V.5.5A и v.6.0 (StatSoft, Inc). Различия между двумя группами определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Для анализа нескольких параметров одновременно использовали ANOVA-тест Краскела-Уоллиса. Для динамического исследования маркеров использовали непараметрическую альтернативу t-критерия для зависимых выборок - критерий Вилкоксона Степень связи между числовыми рядами данных определяли с помощью корреляционного анализа, оценивая непараметрическую корреляцию Спирмена R. Различия между группами считались статистически достоверными при р<0,05.

Результаты исследований.

Экспрессия белков группы Вс1-2.

Белки семейства Вс1-2 играют немаловажную роль в процессе апоптоза в клетке. Предполагается, что программированная клеточная гибель регулируется соотношением анти- и про-апоптотических белков, точнее соотношением их гомо- и гетеродимеров (Capello and Gaidano, 2000; Kroemer, 1997; Simonian et a!., 1996). Мы исследовали экспрессию ингибитора апоптоза Bcl-2 и его индуктора Вах.

Контрольная группа.

Контрольную группу для отпечатков лимфатических узлов (л/у) составили 13 случаев реактивных л/у и 30 случаев лимфогранулематоза (ЛГМ, оценивали экспрессию маркеров в реактивном мелкоклеточном компоненте). Положительной экспрессии Bcl-2 практически не наблюдалось: белок выявлялся в 1 случае (8%) реактивных л/у и в 3 случаях (10%) ЛГМ (Рис. 1).

Экспрессию Вах исследовали на 12 контрольных отпечатках л/у (6 реактивных л/у и 6 ЛГМ), при этом белок выявлялся только в 1 случае реактивных л/у и ни в одном случае ЛГМ.

В донорском костном мозге (KM) Bcl-2 оценивали в 3-х случаях, и ни в одном из них белок не выявлялся (Рис.1). Вах исследовали в двух случаях, один из которых

Ремст пимфепш КогтьА мож

Рсяхт компонент при ЛГМ Перифер кровь

11 Среднее СИ ± спил, ошибка (БЕ) -С *ст»нл отхлои, (БО)

Рисунок 1. Экспрессия Вс1-2 в контрольной группе

был отрицательным по экспрессии белка, а другой - положительным (0,9% и 65,6% положительных клеток соответственно).

В периферической крови (ПК) доноров Вс1-2 исследовали в 14 случаях В тотальной популяции лимфоцитов Вс1-2 выявлялся у всех исследованных доноров, уровень экспрессии белка в среднем составил 85,1+9,2% положительных клеток (Рис.1). Методом двойного окрашивания с антителами к СО 19 исследовали экспрессию Вс1-2 на В-лимфоцитах. Обнаружено, что Вс1-2, в среднем, экспрессировали 91,0±9,3% В-клеток ПК (Рис.2).

Вах исследовали в 14 образцах донорской ПК и у 86% из них (13 из 14) экспрессии белка не выявлялось: наблюдалось б,0±5,9% положительных клеток (Рис.2).

Соотношение Вс1-2/Вах определяли у 13 доноров; значение соотношения варьировало от 1,2 до 98,4 (в среднем по группе - 24,0±27,1). В В-лимфоцитах значение соотношения в среднем составило 20,5±12,1 (Рис.3).

Таким образом, на значительной части всех нормальных В-клеток экспрессируется Вс1-2 и практически отсутствует Вах.

б)

4

т

Рисунок 2. Экспрессия Вс1-2 (а) и Вах (б) на В-лимфоцитах крови здоровых доноров. Двойное окрашивание антителами анти-С019-РЕ (РЬ-2) и анти-Вс1-2 или анти-Вах (РЬ-1).

100

Лимфоцит В-етегки Щ Минимум-максимум!_(25%-75?о персеитяля ■ Медиана

Рисунок 3. Соотношение Вс1-2/Вах у здоровых доноров в лимфоцитах в целом и в популяции В-клеток. На диаграмме представлены медианы (а не среднее значения±стандартное отклонение), поскольку на популяции лимфоцитов распределение значений не Гауссово.

Острые лейкозы.

Исследовали экспрессию Вс1-2 в КМ 5 взрослых и 10 детей с ОЛЛ. Все случаи ОЛЛ у взрослых были отрицательны по экспрессии этого белка: у них выявлялось 5,1±5,3% положительных клеток (Рис.4).

У детей в 80% случаев экспрессии Вс1-2 также не наблюдалось - в среднем выявлялось 1,4±1,1% положительных клеток. В двух случаях положительной

80

*

40

* --

О

I*

I 1

0| ' - I_

»p ОЛЛ «1 олл

ГЦ *Стаядолагоиен>» 1 I * Стамд ouartc» ■ Ср«япм

Рисунок 4. Экспрессия Вс1-2 при детских и взрослых ОЛЛ.

экспрессии белка наблюдалось более 50% положительных клеток (Рис.4)

Таким образом, по экспрессии Bcl-2 КМ больных ОЛЛ детей и взрослых практически не отличается от КМ здоровых людей Повышенная экспрессия Вс1-2 в КМ у больных ОЛЛ детей может свидетельствовать о меньшем сроке безрецидивного времени жизни, но для подтверждения этого необходимо обследование детей в динамике.

Вах исследовали на 7 образцах КМ детей с ОЛЛ. Положительная экспрессия белка наблюдалась в 43% случаев, выявлялось 23,4+25,2% положительных клеток У взрослых больных с ОЛЛ экспрессию Вах в КМ исследовали в 2 случаях, и в обоих из них белок не выявлялся (менее 1% положительных клеток) (Рис.5).

Фолликулярная и диффузно-крупноклеточная лимфома.

Исследовали 14 отпечатков л/у больных центрофолликулярной лимфомой (ФЛ), у 12 из 14 больных (86%) наблюдалась повышенная экспрессия Вс1-2.

В зависимости от цитологического типа ФЛ (Harris el ai, 1994; Jaffe et al., 2001), все исследованные случаи мы разделили на 3 группы (1 группа -1 цитологич. тип, 2 группа -1—II и II цитологич.типы; 3 группа - II-III и III цитологич.типы). В 1 группе выявлялось 58±17% положительных клеток, во 2 и 3 - 29±4% и 26,6±13% положительных клеток соответственно (Рис.6). При этом разница экспрессии Вс1-2 между 1-2 и 1-3 группами была статистически значима (р<0.05), а между 2 и 3 группами статистической разницы не было Возможно, это объясняется

80

# I

в 60

В £

40

* 20

взрослые дет»

JL =*Стацд отклонение I_]лСтляд-оши5кл ■ Средне«

ж Выпадающие значения

Рисунок 5. Экспрессия Вах при детских и взрослых острых лимфобластных лейкозах. 100 -------■-

80

Í «О и

§ "" с

] ст ЦФЛ 1-ПиНетЦФЛ П-ШиШетЦФЛ ДКЛ ГС * Стенд оттонение 1_I * Стенд ошибка " Среднее

Рисунок 6. Экспрессия Вс1-2 при различных цитологических типах фолликулярной и при диффузно-крупноклеточной лимфоме.

искусственным делением на 2 и 3 группы, вызванным условностью подразделения ФЛ на цитологич типы, которые определяются по содержанию крупных властных клеток в материале. I цитологич.тип устанавливается в случае преимущественного содержания малых клеток, II - при смеси малых и до 50% крупных (бластных) клеток,

а в случае преимущественного (>50%) содержания крупных клеток - III цитологич.тип. Таким образом, при отсутствии бластных клеток наблюдается высокая экспрессия Вс1-2, в то время как присутствие их в материале ассоциируется со снижением его экспрессии.

При диффузно-крупноклеточной лимфоме (ДКЛ) Вс1-2 исследовали на 8 отпечатках л/у; уровень экспрессии белка в этой группе был сравним с таковой в контрольной группе- белок выявлялся в 1 (12.5%) случае, что согласуется с литературными данными, согласно которым Вс1-2 выявляется в 10-40% случаев (Gascoyne et al, 1997; Willis and Dyer, 2000).

Полученные данные подтверждают предположение, что наличие в исследуемом материале бластных клеток ассоциируется с ослабленной экспрессией Вс1-2

Экспрессию Вах исследовали в 4 случаях ФЛ и в 2 случаях ДКЛ. Положительная экспрессия белка не выявлялась ни в одной из этих нозологий (9,5+5,7% и 6,0+2,8% положительных клеток при ФЛ и ДКЛ соответственно, диаграммы представлены на Рис.7).

100

80

*

<t

I

S 60

а

е

i*

о

J

30

о

I ^Стищоткпонвиив 1 I ±Ст«нд.оитбк« О Среднее

Рисунок 7. Экспрессия Вах при центрофолликулярной (ЦФЛ) и диффузно-крупноклеточной (ДКЛ) лимфомах.

Хронический лимфолейкоз.

Экспрессию Вс1-2 определяли в 84 образцах ПК больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ); белок экспрессировался в 71,4% случаев

ЦФЛ

Всех исследованных больных мы разделили на группы «первичные», «резистентные» и «после лечения» К первой группе относились первичные (то есть не получавшие лечение) больные, в группу «резистентные» входили больные, которые получали курсы терапии до начала исследования и либо не ответившие на лечение, либо рецидивировавшие. К третьей группе относили больных, получивших лечение за время исследования.

В группе первичных больных Вс1-2 выявлялся в 62% случаев, в группе резистентных- в 100%, а в группе после лечения - в 63%. Уровень экспрессии Вс1-2 в группе у первичных больных составил 50,9±39,9% положительных клеток, в группе резистентных - 76,1±21,1%, а в группе после лечения - 43,4±34,7% (различие статистически достоверно, р<0,05) [Рис.8].

100 ---

«

о-----

Долеченш Послелечснил ИГТ ± Ст&1!Д отхлI__I * Ствнд ошибп ■ Среднее

Рисунок 8. Экспрессия Вс1-2 у больных (ХЛЛ) до и после лечения.

При анализе группы больных после лечения было обнаружено, что, с высокой статистической достоверностью (р<0.01), при отсутствии клинико-гематологической ремиссии, выражавшейся, в частности, в сохранении повышенного лейкоцитоза, наблюдалась повышенная экспрессия Вс1-2 - 68,7±29.3% положительных клеток. В случае хорошего ответа на лечение наблюдалось заметное снижение уровня Вс1-2-положительных клеток - в среднем 27,1±30.4% положительных клеток (различие между группами статистически высоко достоверно - р<0.01) [Рис.9 и 10].

Уровень экспрессии Вс1-2 в группе больных с отсутствием ответа на лечение статистически не отличался от такового в группе резистентных больных (Рис 11)

а) б) в)

ъГ

Е

I (О

Резистентные больные Больные после лечение Больные после лечения.

помпоенный лейкоцитоз нормельный лейкодотоэ

±Стенд оттэтоненне I_I ¿Ст&ндошибх* ■ Среднее

Рисунок 9. Экспрессия Вс1-2 в группах больных ХЛЛ. (а) резистентные к проведенной терапии больные; (б) и (в) - больные после лечения с отсутствием (б) или наличием (в) ответа на терапию.

а) ^ б)

' • 1 • * •9

эд?..........

Рисунок 10. Экспрессия Вс1-2 в лимфоцитах ПК больных ХЛЛ до (а) и после (б) лечения. По РЬ-1 - Вс1-2, по РЬ-2 - СЭ19

Приведенные выше данные подтверждаются исследованной в 13 случаях экспрессией Вс1-2 в динамике' до начала лечения, на его фоне, после курсов терапии и, в 5 случаях, при рецидиве заболевания. Хотя это статистически не достоверно (р>0.05), отмечалась тенденция к снижению уровня экспрессии белка после терапии, причем его экспрессия значительно увеличивалась при рецидивировании (Рис 11).

Долечения На фоне печения Послелечения Рецидив

1С ± Стенд, отклонение!_I *Стенд ошибка • Среднее

Рисунок 11. Экспрессия Вс1-2 при исследовании больных ХЛЛ в динамике.

Экспрессию Вах исследовали в 10 случаях, и во всех из них белок выявлялся (84,6±12,4% положительных клеток). У двух больных исследовали Вах в динамике.

Обнаружено, что в обоих случаях после лечения увеличивалось количество положительных по Вах клеток.

Значение соотношения Вс1-2/Вах у резистентных больных было выше, чем у первичных больных.

Множественная миелома.

Вс1-2 исследовали на 12 образцах КМ больных множественной миеломой (ММ) Большинство исследованных образцов (83%) Вс1-2 не экспрессировали: у них выявлялось 9,4+15,5% положительных клеток

Таким образом, как видно из рисунка 12, экспрессия Вс1-2 выявлялась при ФЛ и ХЛЛ, и практически отсутствовала при детских и взрослых ОЛЛ, ДКЛ и ММ Экспрессия Вах была негативной при взрослых ОЛЛ, ФЛ и ДКЛ, положительная экспрессия этого маркера наблюдалась при детских ОЛЛ и ХЛЛ.

Рисунок 12. Экспрессия Вс1-2 и Вах при исследованных заболеваниях

Экспрессия р53.

Функционирование р53 в качестве своеобразного «контролера» правильности считывания генома клетки при транскрипции делает его весьма «желанной» мишенью опухолевых трансформаций. Изменения этого онкогена наиболее часто встречаются при различных опухолях человека. Мутации р53 ассоциируются с плохим прогнозом заболевания, так что не удивительно, что при НХЛ его изменения, как правило, встречаются при наиболее агрессивных опухолях (БапсИез-ВеаЮ е/ о/, 2001).

) Контрольная группа.

Мутантную форму р53 (р53ти1) изучали на 42 отпечатках л/у, относившихся к контрольной группе Экспрессия маркера наблюдалась в 21% случаев; количество * положительных клеток в группе составило 14,3+13,5%

Из 42 изученных отпечатков л/у 13 приходилось на реактивные лимфоузлы и 29 - на л/у при ЛГМ. Различий по экспрессии р53ти1 в этих двух группах не наблюдалось: белок экспрессировался в 23% случаев реактивных л/у и в 21% л/у при ЛГМ (вьивлялось 14,7±14,8% и 14,1±13,2% положительных клеток, соответственно)

Острые лейкозы.

При взрослых OJIJ1 p53mut исследовали в 5 случаях, экспрессия маркера наблюдалась в 40% из них (13,5±14,8% положительных клеток). У детей белок исследовали в 1 случае' наблюдалось 20% положительных клеток. Это значение находится на границе чувствительности метода, поэтому его можно интерпретировать как «положительное» весьма приблизительно. Тем не менее, в литературе отмечено, что при детских OJ1JI, хорошо отвечающих на терапию даже на продвинутых стадиях заболевания, наблюдается крайне малое количество нарушений р53 (Fisher, 1994)..

Фолликулярная и диффузно-крупноклеточная лимфомы.

При ФЛ экспрессию p53mut определяли на 14 отпечатках л/у. Положительная экспрессия маркера наблюдалась во всех из них (выявлялось 54,1±17,0% положительных клеток). При ДКЛ экспрессия p53mut наблюдалась в 5 из 8 случаев (62,5%) и выявлялось 28,3±17,7% положительных клеток.

Различия по экспрессии белка в группах ФЛ и ДКЛ статистически не достоверны, но имеют тенденцию к достоверности (р=0,07, Рис. 13).

100

«о

20

ЦФЛ ДКЛ

Ш АСтвнд отклонение СИЗ *Станд ошибка ■ Среднее

Рисунок 13. Экспрессия мутантного р53 при ФЛ и ДКЛ.

Хронический лимфолейкоз.

При ХЛЛ экспрессию р53ши1 определяли в 14 случаях; положительная экспрессия маркера наблюдалась в 79% из них (вьивлялось 41,0±24,4% положительных клеток).

100%

| 80% г

3 60% I 40%

I £

А 20%

I

0%

Рисунок 14. Экспрессия Вс1-2 при ХЛЛ у больных до лечения в рбЗпиЛ-положительной и отрицательной группах.

У больных до лечения р53ши1 выявлялся у 73% больных (38,8±25,9% положительных клеток), а у больных после лечения экспрессия маркера наблюдалась во всех трех исследованных случаях (49,1+19,9% положительных клеток) Статистической разницы по экспрессии р53ши1 между этими группами не обнаружено. В группе больных до лечения обнаружена положительная корреляция между экспрессией Вс1-2 и р53 (11=0,7, р<0,05, Рис.14).

Множественная миепома.

При множественной миеломе экспрессию р53ши1 исследовали в 8 случаях, белок вьивлялся в 50% случаев (21,5±21,6% положительных клеток).

Корреляций между экспрессией Вс1-2 и р53ти1 отмечено не было, тем не менее, клетки половины из исследованных больных не экспрессировали ни один из этих маркеров (Рис. 15). Среди положительных по р53ши1 больньи у 75% экспрессии Вс1-2 не выявлялось.

Таким образом, как показано на рисунке 16, мутации р53 в той или иной степени присутствовали в клетках каждой из исследовавшихся нозологий. Больше всего мутаций обнаруживалось при ЦФЛ и ХЛЛ.

иш=

р53 - р53 <

¡■Вс12- РВс12+ |

Рисунок 15. Экспрессия Вс1-2 в р53ши1-положительной и отрицательной группах при множественной миеломе.

Рисунок 15. Экспрессия мутантного р53 при исследовавшихся нозологиях.

Экспрессия СР95.

Фолликулярная и диффузно-крупноклеточкая лимфомы.

При ФЛ СБ95 исследовали на 11 отпечатках л/у, положительная экспрессия маркера наблюдалась в 64% из них (в среднем по группе выявлялось 10,6±7,5% положительных клеток).

Корреляций между экспрессией СЭ95 и Вс1-2 обнаружено не было, равно как не выявлялись статистически значимые корреляции между экспрессией С095 и мутантного р53. Тем не менее, мы выявили тенденцию к уменьшению количества С095-положительных клеток в зависимости от цитологического типа ФЛ,

представленную на рисунке 16 Различия между двумя этими группами статистически достоверны (р<0.05).

-]0

П-П к П1ЦГХ Т1ГТ1 П-ПТ и Ш щи тип

а (. реднее □ ±Стпнд ошибка X ±Стянд отклонение " Выпадающие «аченпя

Рисунок 16. Экспрессия С095 при ФЛ в зависимости от цитологического типа

заболевания.

При ДКЛ СБ95 исследовали в 7 случаях, в которых вьивлялось 10,6+9,3% положительных клеток. Среди исследованных больных положительная экспрессиямаркера наблюдалась в 57% случаев. Корреляций между экспрессией СИ95 и других маркеров не наблюдалось.

Хронический пимфолейкоз.

При ХЛЛ экспрессию С095 исследовали в 93 случаях, положительная экспрессия маркера выявлялась в 50,5% из них (в среднем по группе наблюдалось 16,9±18,2% положительных клеток). Обнаружена положительная корреляция между экспрессией СЭ95 и уровнем лимфоцитов в ПК (рис. 17). Анализ экспрессии СЭ95 в группах больных до начала лечения, резистентных к терапии больных, и больных после лечения не вьивил каких-либо различий между группами (рисунок 18).

Множественная шелома.

Исследуя экспрессию СЭ95 на 14 образцах КМ больных ММ, положительную экспрессию маркера мы наблюдали в 57% случаев. Количество положительных по СЭ95 клеток в среднем по группе составило 24,4±22,1%.

80"/.

£ 60%

40%

20%-

Норм. лимф-ты

ШС1Э95-

Повыш лимф-ты

1С095+

Рисунок 17. Экспрессия С095 в зависимости от уровня лимфоцитов в крови больных ХЛЛ (Коэффициент корреляции 11=0,35, р<0,05).

Первичные Резистеклап Послелечения 1С *Ст*идошюиени||_| *Стеид ошибке * Среднее

Рисунок 18. Экспрессия С095 в группах больных при ХЛЛ.

Коэкспрессию С095 и Вс1-2 исследовали в 8 случаях, и, хотя достоверных корреляции между экспрессией этих двух маркеров не наблюдалось, в 62,5% образцах при положительной экспрессии С095 экспрессии Вс1-2 выявлено не было (Рис. 19). Коэкспрессию СВ95 и р53гтЦ исследовали в 5 случаях, и хотя корреляций между ними выявлено не было, у 60% больных наблюдалась положительная экспрессия обоих маркеров.

Таким образом, положительная экспрессия С095 выявлялась во всех исследовавшихся нозологиях (Рис. 20).

С 1)95- СЮ5+

■ Вс1-2- И Вс1-2 +

Рисунок 19. Экспрессия Вс1-2 в С095-отрицателыюй и С095-положительной группах больных множественной миеломой.

>

Рисунок 20. Экспрессия С095 при исследовавшихся нозологиях

Выводы.

]. Экспрессия Bcl-2 изменяется на этапах дифференцировки В-клеток.

2 Вс1-2 экспрессируется на стадии зрелых периферических B-клеток и отсутствует в ранних B-клетках, активированных B-клетках и плазматических клетках.

3. Вах экспрессируется в на стадии зрелых периферических B-клеток и отсутствует в активированных B-клетках и в клетках зародышевых центров лимфоузлов.

4 Высокая экспрессия CD95 наблюдается в рециркулирующих зрелых В-клетках, в клетках зародышевых центров лимфоузлов и в плазматических клетках.

5. Существует зависимость уровня экспрессии Вс1-2 от цитологического типа фолликулярной лимфомы и диффузно-крупноклеточной лимфомы При I цитологическом типе фолликулярной лимфомы выявляется большое количество Вс1-2 положительных клеток, число которых достоверно снижается во II и III цитологических типах.

6. При хроническом лимфолейкозе наблюдается высокая экспрессия Bcl-2. Высокий уровень экспрессии белка сохраняется при отсутствии клинико-гематологической ремиссии, и достоверно снижается в случае достижения ремиссии.

7. Соотношение BcI-2/Bax у больных хроническим лимфолейкозом снижается при достижении ремиссии. До лечения, а также при отсутствии ответа на лечение, значение соотношения повышено.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Baryshnikov AYu, Lysyuk E.Y., Poddubnaya IV, Kovrigina AM, Bogatirev V, Tahaev Z, Probatova N, Sholohova E. Prognostic markers of B-cell low grade lymphomas. European Journal of pharmaceutical sciences, 2000, vol.11, suppl.l, S105, PO-217

2 Ковригина AM, Лысгок Е.Ю., Пробатова H.A., Богатырев B.H., Шолохова E.H., Поддубная И.В., Тахаев З.В, Барышников А.Ю. Цитоморфологическая

дифференциальная диагностика и оценка p53mut, bcl-2, CD95 при периферических B-клеточных мелко-клеточных лимфомах Архив патологии, 2000, т62, №5, стр.30-34

3. Лысюк ЕЛО , Логачева Н.П., Шишкин Ю В., Барышников А.Ю. Роль биомаркеров в резистентности к химиотерапии, вызванной блокированием апоптоза. Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний Материалы симпозиума. 2001, стр 16

4 Baryshnikov AYu, Lysyuk EY. Expression of apoptotic biomarkers in B-CLL lymphomas. Leukemia, 2001, Vol.15, N3 P14

5 Baryshnikov AYu, Lysyuk E.Y., Logacheva NP, Shislikin YuV. Apoptotic biomarkei expression in CLL. Leukemia, 2001, Vol.15, N3, P13

6. Лысюк Е.Ю., Бялик Т. Экспрессия апоптотических биомаркеров на этапах В-клеточной дифференцировки «Медицина на пороге XXI века Актуальные вопросы и проблемы» Материалы первой московской городской научно-практической конференции Москва, 2001, стр 44

7. Volkova MA, Bialik ТЕ, Lysyuk EY, Logacheva NP, Zabotina TN, AA Molodik, Andreeva LYu. Combination of rituximab, fludarabine, cyclophosphamide in the treatment of B-CLL. The first Russian experience. Leukemia&Lymphoma, suppl 1 to vol.42, 2001, p.45, #75

8. Катаева E.B., Голенков А.К., Трифонова E.B, Луцкая Т.Д, Иншаков А Н , Логачева Н.П., Лысюк Е.Ю., Барышников А.Ю Сравнительный анализ данных МТТ-пробы у больных хроническим лимфолейкозом с различным ответом на химиотерапию. Российский биотерапевтический журнал, 2002, т. 1, №1, 65-67.

9. Лысюк Е.Ю., Логачева Н.П., Полосухина Е Р., Шишкин 10 В , Барышников А Ю. Экспрессия апоптотических биомаркеров Вс1-2, Вах и CD95 на В-клеточных субпопуляциях при лимфопролиферативных заболеваниях. Медицинская иммунология, 2002, т.4, №2, с 301

10 Лысюк Е.Ю., Полосухина Е.Р., Иншаков А Н., Бялик Т.Н, Волкова М А, Кузнецова С С., Маякова С.А., Катаева Е В , Трифонова Е В., Голенков А К , Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю. Экспрессия Вс1-2, Вах и CD95 на субпопуляциях B-клеток при ряде лимфопролиферативных заболеваний. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002, т.1, №2, стр.82-83

П.Кузнецова С.С., Иншаков АН, Логачева Н.П, Лысюк Е.Ю, Барышников АЮ, Маякова С.А. Определение чувствительности бластных клеток к химиопрепаратам in vitro как прогностический фактор острых лейкозов у детей Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002, т 1, №2, стр 99-100

12 Лысюк Е.Ю., Полосухина ЕР., Ковригина А.М, Шишкин 10В., Барышников А.Ю. Экспрессия апоптотических биомаркеров на этапах дифференцировки В-лимфоцитов человека. Медицинская иммунология, 2003, т.5, №3-4, с 205.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН Подписано в печать 6 .04 .04 Г.Заказ № 123 Тираж ЮОэкз

f

f

РНБ Русский фонд

2006-4 3875

'^ ДПР ш

Цель работы.6

Задачи исследования.6

Научная новизна.6

Научно-практическая значимость.7

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.8

Выводы.

1. Экспрессия Bcl-2 изменяется на этапах дифференцировки В-клеток.

2. Bcl-2 экспрессируется на стадии зрелых периферических В-клеток и отсутствует в ранних В-клетках, активированных В-клетках и плазматических клетках.

3. Вах экспрессируется в на стадии зрелых периферических В-клеток и отсутствует в активированных В-клетках и в клетках зародышевых центров лимфоузлов.

4. Высокая экспрессия CD95 наблюдается в рециркулирующих зрелых В-клетках, в клетках зародышевых центров лимфоузлов и в плазматических клетках.

5. Существует зависимость уровня экспрессии Bcl-2 от цитологического типа фолликулярной лимфомы и диффузно-крупноклеточной лимфомы. При I цитологическом типе фолликулярной лимфомы выявляется большое количество Bcl-2 положительных клеток, число которых достоверно снижается во II и III цитологических типах.

6. При хроническом лимфолейкозе наблюдается высокая экспрессия Bcl-2. Высокий уровень экспрессии белка сохраняется при отсутствии клипико-гематологической ремиссии, и достоверно снижается в случае достижения ремиссии.

7. Соотношение Bcl-2/Bax у больных хроническим лимфолейкозом снижается при достижении ремиссии. До лечения, а также при отсутствии ответа на лечение, значение соотношения повышено.