Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Диагностические возможности анализа ультраструктуры лейкозных клеток и активности ядрышковых организаторов при острых лейкозах у детей

П о и>

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

2-ой МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ии. Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи УДК 616.155.34:616.053

ИКОННИКОВА Ольга Альдоновна

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ АНАЛИЗА УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК И АКТИВНОСТИ ЯДРЫШКОВЫХ ОРГАНИЗАТОРОВ ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ

14.00.09 — Педиатрия

14.00.23 — Гистология, цитология и эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1990 г.

/ ' 1

Работа выполнена во 2-ом Московском ордена Ленина Государственном медицинском институте им. Н. И. Пирогова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

член-корреспондент АМН СССР, профессор Н. С. Кисляк

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор биологических наук Р. В. Ленская

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Г. И. Козинец доктор медицинских наук С. А. Маякова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Научно-исследовательский институт педиатрии АМН СССР

Защита диссертации состоится « » 1990 г. в

час. на заседании специализированного Ученого совета К.084.14.03 2-го Московского ордена Ленина государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова (117437, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1)

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, доцент

Л. В. Сапелкина

Г

Актуальность проблемы. Арсенал современных химиотералев-тических средств позволяет получи зь реки с сии в подавляющем большинстве случаев острых лейкозов (ОЛ) у детей. Опираясь на клинико-гематологическое оформление заболевания и особенности имнуноцитологических вариантов и субвариантов ОЛ, гематологи имеют возможность выбрать наиболее рациональные программы лечения, добиваясь полноты клинико-гематологических ремиссий в 90-95% случаев при остром лимфобластном лейкозе /stockley R. (1983), Chessells J. (1987),Румянцев А.Г.(1983),

Наяхова С.А. (1986) и др. /. Показана возможность

полного излечения отделыых больных острыми лейкозами.

Традиционные иммуноцитологические метода позволяют с этих позиций выделить 3 варианта острого лимфобластного лейкоза (ОМ) в зависимости от Т- и B-принадлежности клеточного субстрата: Т-ОЛЛ, В-ОЛЛ, ниТ ниВ-ОЛЛ. С помощью коноклональных антител (МКА) и ксеногеннах антисывороток (НА) / Foon к.

(1982), , Барышников A.B. (1984)/ выделены субварианты ОЛЛ: О-ОЛЛ, Ia-ОЛЛ, сОЛЛ, пре-В-ОЛЛ, субварианты Т-ОЛЛ, которые отличаются по клиническому оформлению заболевания и гистогенети-ческой зрелости клеточного фенотипа / Spior С. (1984), Барышников A.D. (1987)/. Однако и результаты современного им-мунофенотипирования не могут полностью удовлетворить гематологов при оценке каждого отдельного случая для выбора наиболее рациональной и патогенетически оправданной терапии.

Не вызывает сомнения, что клинические параметры и прогноз заболевания непосредственно зависят от биологических свойств опухолевых клеток, хотя многочисленные исследования ультратонкого строения злокачественных клеток практически не выявили специфических особенностей, характерных только для опухолевых клеток / Поликар,Бесси (1970),Наукенко 0.и.(1980), Бутенко З.А.(1984),Добрева А.(1967), Engene т. (1980) /.

В последние годы перспективным в качестве определения степени злокачественности клеточного субстрата при солидных опухолях зарекомендовал себя метод выявления активности яд-ршпковых организаторов (ЯОР) с помощью реакции серебрения / Egan м. (1988), Crocker J. (1987, 1988), Мамаев H.H.(1980, 1984,1988), Погорелов В.Й. (1986) /.

Ш считали актуальным провести комплексное имыуноцитоло-гическое исследование субстрата опухоли при ОЛЛ у детей, с

акцентом на анализ состояния ядрышкового аппарата в лейкозных клетках, как ключевого звена в спределении рибосомного синтеза. В комплексе цитологических методов наибольшее внимание было уделено адектронно-шкроскошческим исследованиям с использованием, полуколичественной ыорфометрги и определению активности ЯОР с помптцьд метода импрегнации серебром.

Полное комплексное изучение клеток опухолевого субстрата и связи его биологических свойств с клиническими параметрами заболевания, должно позволить точно диагностировать клеточные варианты заболевания, более аргументировано прогнозировать течение острых лейкозов и индивидуализировать терапию.

Дель исследования. Изучить особенности субмикроскопического строения клеточного субстрата опухоли различных ииму-ноцитологических вариантов ОМ у детей и оценить диагностические возможности анализа улътраструктуры лейкозкых клеток и активности ядрышковых организаторов при острых лейкозах у детей.

Задачи исследования.

1. Выявить особенности ульграгонкого строения властных клеток костного шага и периферической крош у детей с различными иммуноцитологическими субвариантами ОЛЛ, провести морфометрическое исследование субстрата опухоли на ультраструктурном уровне.

2. Провести анализ активности рибосомного синтеза властных клеток при различных вариантах ОД у детей с помощью реакции серебрения ящшпсообразующгх районов (ЯОР).

3. Проанализировать данные иадунофенатишровавия с помощью MÍA и KA в связи с особенностями ультратонкого строения лейкозных клеток и морфофушщиональкыми особенностями ядрыш-кового аппарата властных клеток при 01 у детей.

4. Оценить диагностическую значимость ульграгонкого строения лейкозных клеток а ялтавкости рибосомного синтеза в них при 0Л у детей.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Исследование ультраструктури субстрата опухоли -необходимый метод для постановки диагноза редко встречавшихся форм острых лейкозов ( плазыаклшточный вариант Б-ОЛЛ).

2. Экспрессия сОДД-антигена на поверхности лейкозных клеток сочетается с особенностями их субмнкроскопического

строения при ОЛЛ у детей, что имеет диагностическую важность.

3. Активность ядрышковых организаторов - новей индикатор клеточной активности и независимый прогностический признак при ОЛ у детей.

Научная новизна. В работе впервые в отечественной практике дана комплексная оценка ультраструктурных особенностей клеток опухоли прт различных иммунопатологических субвариантах ОЛЛ, выделенных с помощью ША и КА. Впервые дана характеристика ЯОР в пуле костномозговых п циркулирующих клеток при 01 у детей с. различными иммунопатологическими вариантами и субвариантами заболевания.

Детально охарактеризован сОЛЛ, включающий более 50% случаев ОЛЛ у детей и являющийся клинически одним из самых благоприятных субвариантов. Шявлены ультраструктурные маркеры лейкозных клеток, знспрессирующих сОЛЛ-антиген, и нарушения клеточного метаболизма при этом субварианте заболевания.

Научно-практическая ценность. Результата проведенного исследования имеют научное и практическое значение. Шявле-ние биологических особенностей клеточного состава опухоли внесли свой вклад в понимание оценок полиморфности течения и прогноза острых лейкозов у детей.

Установлено, что группа оптимального прогноза ОЛЛ у детей представлена случаями сОЛЛ, в субстрате опухоли которых более 35 % лейкозных клеток костного мозга содержат гигантские вторичные фагосош и более 20% клеток содержат крупно- * гранулярную НИК-реакцию. В циркуляции в этих случаях выявляется более 20% зрелых Т-пмфоцитов с фенотипом Е^ НЭ*.

Установлено, что низкие показатели активности ЯОР, сравнимые с показателями нормальных лимфоцитов, являются независимым фактором благоприятного прогноза заболевания. Гипергранулярный характер отложения продукта реакции серебрения в более 10% клеток крупного размера, напротив могно считать фактором неблагоприятного прогноза.

Показана диагностическая значимость исследования суб- ' микроскопического строения лейкозных клеток опухоли при постановке диагноза различных клеточных вариантов ОЛЛ у детей, что влечет за собой индивидуализацию в лечении больных.

Внедрение в практику. Комплексная, не применявшаяся ранее цитологическая оценка субстрата опухоли и пула лим£оид-

ных клеток периферической крови здоровых детей внедрена в практику при анализе диагностических пункций в гематологическом отделении №14 и в отделении для детей раннего возраста ДКБ И. г. Москвы..

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на Всесоюзной научной конференции " Актуальные вопросы диагностики заболеваний системы крови" (Сухуми,1988), на Всесоюзной совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград,1988), на II Всесоюзной конференции по детской гематологии (Душанбе,1988), на конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии в педиатрии" (Кемерово,1989).

Публикация результатов исслвдования: По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описании материала и методов исследования, изложения результатов Собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель включает 52 отечественных и 152 зарубежных источников литературы. Диссертация иллюстрирована 5 0 элекронограммаыи, ю рисунками, 15 таблицами.

ССДЕРКАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

В работе представлены результаты иммуноцитологических, цитохимических, ультраструктурных характеристик клеток костного мозга и периферической крови 74" больных детей острыми лейкозами в возрасте от 2 мес. до 14 лет. Проведен анализ клинико-геыатологических и прогностических данных в исследуемых грушах больных. Больные были обследованы при диагностической пункции, до начала лечения. Клеточный вариант заболевания устанавливался по результатам морфологических и цитохимических исследований пунктата костного мозга, проводимых сотрудниками лаборатории детской гематологии при кафедре детских болезней № I 2-го 1ЮЛГШ им.Н.И.Пирогова.

Контрольную грушу составили 16 здоровых детей в возрасте от 4-х до 14 лет, госпитализированных в глазное отделение ДКБ И для хирургической коррекции косоглазия.

Для характеристики иммуноцитологических маркеров клеток

крови и костного мозга больных острыми лейкозами и использовали общепринятые методы розеткообразования по ¿опйа! (1972), И В1алсо, Hussenzweig (1971) , реакции прямой ИМ-

мунофлюоресценции с моноспецифическими сыворотками против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов ( определение поверхностных и цитоплазматических иммуноглобулинов ), реакции непрямой иммунофлюоресценции с различными МКА и КА ( обнаружение антигенов на поверхности бластных клеток), полученными в ВОЩ СССР ( А.Ю.Барылшиков). Использовалась следующая панель моноклональных антител: ИКО 01(НЬА-1Ж) , ико 02(Н1А-1Ж), ИКО 10 ( тЬу-1 ) , ИКО II (СТ-11а) . сОДЛ-акткген (СХ)-Ю) и Т-антиген шявлялись при помощи КА. .

Цитологический диагноз верифицировался по результатам исследования лейкозных клеток костного мозга и периферической крови цитохимическими реакциями: ШК-реакция на гликоген по Мак Манусу (1949), реакция на с<-нафтилацетатэстеразу (НЭ) по Пирсу (1962), на миелопероксидазу в модификации Р.П.Нар-циссова (1965). Гранулярный характер ШК-реакции и отрицательная реакция на миелопероксидазу служили основанием для постановки диагноза ОЛЛ.

В соответствии с делением ОЛЛ на субварианты / Барыши- • ков А.Ю. (1964),Коцдратчик К.Л. (1987)/, исследования проводились в следующих субвариантах: О-ОЛЛ, 1а-0ЛЛ, сОЛЛ, пре-В-ОЛЛ, Т|-0М, Т2-ОЛЛ. Кроме того, на основании результатов традиционного иымуноцитологического исследования был диагностирован Д-ОЛЛ, и на основании данных трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭН), был диагностирован В-клеточный плазмобластный вариант ОЛЛ.

У 51 ребенка, больного ОЛЛ, было проведено исследование субшкроскопического строения клеток костного мозга и периферической крови. В каждом отдельном случае проводилась мор- ■ {юметрия не менее 50 клеток костного мозга и 50 клеток периферической крови. Всего морфометрическое исследование про-зедено более чем в 5.500 лиыфоидных клетках. Проводилась щенка ядра, ядрышка, эндоплазматического, митохондриального I лизосомального компартментов клетки. При оценке энерго-1беспечивающей системы клетки учитывалось количество мито-:ондриальных профилей на клеточный срез, оценивалось состояла матрикса и крист митохондрий. Рассматривались 3 типа мито-

хондрий: I - митохондрии нормального строения, 2 - митохондрии, с признаками обратимой деэнергизации, 3 - митохондрии, с признаками необратимой дезорганизации /Ченцов Ю.С.(1984), Лейкина М.И. (1989), Engene Т. (1.980)/.

Подготовка клеточного материала для метода ТЭМ проводилась по традиционной методике в модификации кафедры гистологии МГУ им.М.В.Ломоносова. В работе использовался метод полутонких срезов по Уикли (1975). Ультратонкие срезы изготавливались при помощи алмазных ножей на ультрамикротоме LKB-III. Контрастирование срезов проводилось традиционно при помощи 2% раствора уранил-ацетата и нитрата свинца. Объекты просматривались на электронном микроскопе ни -I2A (Япония) при ускоряющем напряжении 75 квт, с последующим фотографированием клеток.

Изучение активности рибосомного синтеза проводилось в субстрате костного мозга и крови методом серебрения ядрышко-вых организаторов по Howell, Black (1980) . Оценивалось количество гранул серебра в интерфазных клетках лейкозного субстрата, а также характер отложения продукта реакции (компактные кластера, рассеянные гранулы, сочетанный характер отложения продукта реакции серебрения).проводился анализ реакции серебрения в зависимости от размера клеток.

У всех больных детей по традиционным критериям /Курма-шов В.И. (1981), Румянцев А.Г. (1983), Woodcock (1984)/ оценивалось клинико-гематологическое оформление заболевания, проводился анализ терапевтического воздействия и оценка прогностических факторов риска в каждых отдельных группах заболевания.

После установления диагноза заболевания, всем больным детям (за исключением случаев отказа от терапии), применялисj общепринятые программы полихимиотералии, в зависимости от варианта заболевания. Использовались схемы лечения: предни-золон + винкристин и преднизолон + винкристин + рубомицин. В ряде случаев применялась схема ВАШ ( винкристин + мето-трексат + 6-меркаптопурин + преднизолон). При необходимости использовались более сильные схемы с включением в программы лечения циклофосфана, циторабин-арабинозида, L-аспарагиназы

В группе неТ-ОЛЛ полная клинико-гематологическая ремиссия достигнута в 85,4% случаев, в случаях Т-ОЛЛ - в 78,5*,

в случаях ОНЛ ремиссия достигнута лишь у 23% больных.

В течение ремиссии больные дети получали поддерживающую химиотерапию по общепринятым программам: 6-меркаптопурин + метотрексат + циклофосфан. Терапия реиндукции включала: пред-низолон + винкристин и преднизолон + винкристин + рубомицин. Всем детям проводилась профилактика нейролейкоза.

Из числа наблюдаемых 74 больных на момент написания диссертации (01.06.89) живы 22 больных (29,796), судьба 5 детей неизвестна. В 12 случаях зарегистрированы повторные ремиссии.

Работа выполнена на кафедре детских болезней (Р .1 ( зав. кафедрой - член-корр.АЫН СССР, профессор Н.С.Кисляк) 2-го МОЛГШ им.Н.Й.Пирогова, на базе 14 гематологического отделения (зав. - канд.мед.наук A.A. Мазо), 8 отделения для детей раннего возраста ( зав. - А.Г. Мотина ) ДКБ № I г. Москвы.

Иммуноцитологические и цитохимические исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории детской гематологии ( зав. - докт.биол.наук Р.В.Ленская ) при кафедре детских болезней PI.

Трансмиссионное электронно-микроскопическое исследование проводилось в лаборатории электронной микроскопии и микроциркуляции WIK 2-го МОЛШ им.Н.Й.Пирогова ( зав. отделом - • '

докт.мед.наук В.В. Банин).

Проводился статистический анализ полученных данных. Достоверность различий между полученными показателями оценивалась с применением критериев Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение.

Анализ клинико-гематологического оформления острых лейкозов широко представлен в литературе отечественными и зарубежными исследователями /Курмашов В.И.С1981), Румянцев А.Г. (1983), Кисляк Н.С. (1965), Ыаякова С.А. (1986), Borella J. (1975) и др./. Клиническая характеристика отдельных иммуно-цитологических субвариантов ОЛ в целом согласуется с рядом исследований, проведенных в этом направлении. Так при анализе возрастного аспекта заболеваемости в исследуемых группах больных показано, что наиболее гетерогенной по этому признаку является группа больных неТ-ОЛЛ, тогда как в группе больных Т-ОЛЛ, цетей моложе 3-х лет не встретилось.

Что касается неблагоприятных прогностических признаков, 1аиболее часто используемых педиатрами-гематологами, то не-

РЕЗУЛЬТАта ЛЕЧЕНИЯ ОЛ У ДЕТЕЙ, В ЗАШСИМОСГИ ОТ ИММУШЩТОЛОтЧЕСКОГО ВАРИАНТА ЗАБОЛЕВАНИЯ

Таблица I.

Показатель

не-Т-ОЛЛ (в целом) п = 47

И'

"сШ— п = 24

пре-В-ОЛЛ п *= 7

Тт-ОЛЛ

,пХ= I

Тр-ОЛЛ п = 9 'Д-ОШГ п = 4

В-плазмобл.-ОЛЛ

_п = I

Т-ОЛПГ (в целом ) п =14_

факт ~ достижения

ремиссии

%

(40/47) 85,1 (2/2 ) 100,% (9/13) 69,2 (22/24) 91,7

(7/7) 100,0 отс.

(11/14) 78,5

1Сроки

| достижения

: ремиссии I (дни) , М + м

; 47,7+2,4

: 54,5+0,2 42,8+2,7

38,4+1,4 __59,5+7,8

ОНЛ п = 13

(6/9) (3/4)

(3/13)

66,7

I

75,0 23,0 !

отс. 46,0+3,9

45,0 ' 48,7

36,0+2,5 53,7+9,0

Средняя длительность ремиссии ( мес.) М + м

15,8+2,8

13,2+2,9 14,3+3,1

17,2+1,2

16,8+4,2 отс. 5,6+0,7

52,0 5,6+0,7

3,0+ 0,5 н.д.

Беэрецидивное течение заболевания, длительностью более 3-х лет 1

(17/47) 36,1 отс.

(5/13) 38,5

(11/24) 45,8

(1/7) 14,3 отс.

(2/14) 14,3 +

(1/9) П,0 отс.

отс.

Длительность оолезни при рецидивирующем течении оолезни (мес.) М + м

14,2+1,9_

н.д.

16,9+2,9

12,6+2,5

17,6+3,1

3,0

8,8+2,0 н.д.

8,8+2,0

7,3+2,0

2,8+0,8

I

00 I

+

благоприятные факторы риска распределены довольно равномерно во всех изученных субвариантах неТ-ОЛЛ и ОНЛ. При этом, для группы Т-ОЫ характерно отсутствие больных детей без неблагоприятных факторов риска и даже с одним из них.

Отдельно анализировалось представительство основного базисного фактора риска - инициального гиперлейкоцитоза в разных иымуноцитологических вариантах ОЛЛ. Шло выявлено, что наибольший процент случаев (сшше 6034), протекающих с инициальным гиперлейкоцитозоы приходится на Т-ОЛЛ. Причем внутри Т-ОЛЛ показано, что Д-ОЛЛ в нашем исследовании представлен исключительно случаями с инициальным гиперлейкоцитозом. Среди остальных вариантов ОЛЛ и ОНЛ, случаи гиперлейкоцитоза наблюдались не чаще 10-20%, причем наименьшая частота таких случаев отмечается при 1а-0ЛЛ ( I случай из 13 больных).

Анализ частоты клинико-гематологической ремиссии также выявил наиболее благоприятное течение заболевания у неТ-ОЛЛ, характеризующееся становлением ремиссии более чем в 65% случаев. При этом безрецидивное течение заболевания также чаще выявлялось в группе неТ-ОЛЛ, достигая в сОЛЛ субварианте 45,6^ случаев с длительностью заболевания без признаков ре-цидивирования лейкозного процесса в течение 3-х лет. Резуль- • тага лечения ОЛ в исследуемых группах больных, представлены в таблице I.

Объектом ультраструктурного морфометрического анализа были клеточные структуры, которые поддаются объективной визуализации: характер ядерной поверхности, соотношение конденсированного и деконденсированного хроматина, строение ядрышек, состояние митохондриального, эндоплазматического и ли-зосоыального компартментов. При .этом особое внимание уделялось ультраструктурным компонентам, которые в первую очередь изменяют свои морфологические характеристики.-К таким относятся изменения митохондрий, лизосом, эндоплазматического ре-тикулума, которые нехарактерны для лимфоцитов здороЕых детей.

В результате проведенных исследований была выявлена морфологическая неоднородность лиыроидних клеток здоровых детей, которая отражает по-видимому юс гетерогенность и муль-тифункциональность.

При оценке субмикроскопического строения лимфоидных лей-козных клеток костного мозга и крови удалось обнаружить неко-

торые отличия от лимфоцитов здоровых детей.

К таким изменениям со стороны клеточного ядра относятся: значительное преобладание в некоторых клетках деконденсиро-ванного хроматина, наличие больших полостей (вакуолей), окруженных оболочкой, наличие электроноплотных коныо'гатов внутри ядра, ядрышки с выраженными признаками активации, в отдельных клетках - мелкие ядрышковые включения, нехарактерной для ядрышек морфологической структуры. Выявлены клетки, в количественно значимом числе случаев с чрезвычайно углубленной ядерной мембраной, иногда с участками её расслоения.

К изменениям в цитоплазме лейкозных клеток относятся находки пучков фибриллярных образований, описание которых встречается при исследовании клеточного состава как острого лимфобластного, так и нелимфобластного лейкозов взрослых. Происхождение подобных структур до сегодняшнего дня остается неясным. Постоянным признаком для субвариакта сОЛЛ было наличие гигантских аутофагосом, наполненных гетерогенным содержимым. Необходимо заметить, что в лимфоцитах периферической крови здоровых детей непостоянно встречаются единичные клетки с вторичными фагосомами небольших размеров и скудным содержимым.

При оценке субмикроскопической картины клеток субстрата ОЛЛ в целом, достаточно характерным признаком явилось значительное количество клеток с патологически измененными митохондриями, в том числе и необратимого характера. Для одного случая острого плазмобластного лейкоза, из проанализированных 51ультраструктура клеток отличалась строго определенными чертами и имела решающее значение для диагностики.

Таким образом, выявленные ультр'аструктурные"находкипв клетках лейкозного субстрата•больных детей, не являясь специфическими достаточно четко указывают на процессы клеточного неблагополучия.

Морфометрический анализ ультраструктуры бластных клеток был проведен отдельно в различных иммуноцитологических субвариантах ОЛЛ, среди них: 2 случая О-ОЛЛ, 13 - 1а-ОЛЛ, 24 - сОЛЛ, 2 - пре-В-ОЛЛ, I - В-ОЛЛ, I - Т:-0ЛЛ, 6 - ^ЧШ, 2 - Д-ОЛЛ.

При исследовании были выявлены отличительные характеристики лейкозных клеток при сОЛЛ. Группу сОЛЛ составили дети, у которых от 5 до'70Я клеток костного мозга и крови экс-

дрессировали сОЛЛ-антиген. Характерной особенностью субмикроскопического строения лейкозных клеток, во всех случаях с высокой экспрессией сОЛЛ-антигена на поверхности клеток, явилось наличие гигантских вторичных фагосом, наполненных гетерогенным содержимым разной электронной плотности (Ф+-клетки). Подобных наблюдений при изучении ультраструктуры конкретных иммуноцитологических субвариантов ОЛЛ в литературе не описано.В этой же группе больных выявлено наибольшее число случаев с остаточной популяцией нормальных Т-хелперов в периферической крови. Наибольший процент клеток, содержащих ШИК-полржитель-ный материал в виде множества мелких гранул ( 33% в костном мозге и 21% в периферической крови), является аргументом в пользу способности их продуцировать антитела ( тайлица 2).

В ходе исследования были проанализированы 9 случаев Т-ОЛЛ отдельно в 3-х частях: Т^ОЛЛ, Т2-0ЛЛ и Д-ОЛЛ.

Т1- представлен одним случаем, в котором значительная доля клеток костного мозга и периферической крови ( 65% и 55% соответственно) экспрессировала сОЛЛ-антиген. Т-клеточная принадлежность лейнозного субстрата была верифицирована положительной, диагностически значимой реакцией с анти-Т-сыв.ороткой, а экспрессия ИКО 10-антигена (ТЬу-1 ) свидетельствовала о ранних этапах дифференцировки тимоцитов. При исследовании ультра-тонкого строения лейкозных клеток, в 32% клеток костного мозга и 18% клеток крови были выявлены характерные гигантские вторичные фагосоыы. Эти находки были найдены только в одном случае сОЛЛ-положительного Т^-ОЛЛ среди всех исследованных случаев Т-ОЛЛ. Также обращает на себя внимание благоприятное течение заболевания у этого больного из группы неблагоприятного, Т-клеточного варианта заболевания: продолжительность жизни от момента диагностики до настоящего времени составляет более 52 ыес. при безрецидивном течении, что само по себе является выдающимся событием для Т-ОЛЛ. Традиционные иммуноцитологичес-кие методы исследования клеточного состава периферической крови также документируют сохранность абсолютного числа Т-хелперов ( 10% НЭ^-клеток при инициальном лейкоцитозе 34-10^/л) до начала лечения. В настоящее время больная жива.

Таким образом и в данном случае это единственное наблюдение Т^-ОЛЛ, по-видимому демонстрирует не изученные на сегодня биологические свойства клеток, экспрессирующих сОЛЛ-анти-

НЕКОТОШЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ШТОХИЮЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ сОЛЛ

( костный мозг / периферическая кровь ) М + га Таблица 2

Показате- Содержание клеток Содержание клеток Содержание Содержание Количество ШИК - реакция ( положительных клеток ) Лейкоцитоз

ли \ экспрессир сОМ-антиген 94 0 вторичн. фагосоы, * Е-РОК * НЭ*-клетох т А^транул в ядре крупные гранулы мелкие гранулы сумма гранул Ю9/ л

сОЛЛ (в целом) 26,6+4,1 36,2+4,5 5,8+1,5 3,1+0,7 3,9±0,3 18,3+2,3 30,6+5,3 49,5+5,3 69,7+31,7

л = 24 26,4±4,4 11),7+4,2 25,0+4,0 ь;з±1,и 13,У+1,1 ¡И, 3+4,0

I группа 35,1+8,4 48,2+6,8 5,4+1,0 4,4+1.2 4,8+1,2 20,3+1,7 32,8+3,0 53,2+5,0 ■ 4,110.6

4>+- сОЛЛ п - 9 17,0+4,1 ¡М.и+Ь,«! 2Ь,ь+<;,1 21,2+3,0 28, Ь+3, Ь

II группа 13,6+2,3 23,0+4,0 5,5+1,6 2,110,9 3,4^0,3 27,3+3,0 24,9+2,0 52,2+7,0 10,7 +3,4

ф - сОЛЛ п - 10 9,9+3,9 13,3+2,4 20,3+2,8 31,0±6,6 3,4+0,5 12,4+1,8 9,6+2,0 22,0+6,5

111 ;31,6+10,3 38,6+9,3 2,4+1,0 2,0+0,7 3,6+0,4 20,6+3,9 37,8+4,0 58,4+5,2 ЗСб, 6+56,0

группа п - у -43,5+8,4 38,6+8,2 2,4+1,2 5,2+1,8 3,5+0,4 11,8+2,5 4,8+0,8 12,0+1,8

и-- .....-

».,н, часто сосуществующих с остаточной популяцией нормальных лимфоцитовспособных к функциональной активности. С другой стороны, этот пул сОЛЛ-клеток, возможно поддается существенной элиминации, как за счет химиотерапевтических препаратов, так и за счет собственных биологических механизмов.

Что касается ультраструктуры клеток Тс,- и Д-ОЛЛ, то специфических особенностей субмикроскопического строения клеточного состава выявлено не было.

Следующий этап морфоыетрического анализа посвящен оценке энергетики лейкозных клеток разных имыуноцитологичес-ких вариантов ОЛЛ.

Результаты морфоыетрии показали, что для лимфоцитов периферической крови здоровых детей, количество штохондриальных профилей составляет 5,6+0,8 на клеточный срез. Во всех изученных субвариантах ОЛЛ, несмотря на довольно значительные колебания данного параметра в отдельных клетках, среднее "количество" митохондрий в клетке остается постоянным и значительно не превышает нормального уровня. Исключением является сОЛЛ, для которого этот параметр в клетках костного мозга составляет 6,7+0,6 митохондрий /клет. Неинформативный характер подсчета числа митохондрий (ибо только данные сложной . реконструктивной техники оценки материала являются объективными для количественной оценки митохондрий) побудил нас провести анализ их функционального состояния.

При сравнении энергообеспечивающей системы в клетках разных субвариантов ОЛЛ получены данные, представленные на рисунке I.

Так наибольшее число патологических форм митохондрий выявлено в клетках костного мозга и крови неТ-ОЛЛ. Более половины клеточного состава костного мозга было представлено клетками с разрушенными митохондриями. Для клеток костного мозга Т-ОЛЛ характерна большая доля клеток с штохон-дриями нормального строения ( более 50$ клеток). При сравнительном анализе клеточной энергетики при разных субвариантах неТ-ОЛЛ выявлено, что наибольшее представительство клеток с патологическими типами митохондрий характерно для 1а-0ЛЛ и сОЛЛ. Внутри группы Т-ОЛЛ - набольшее "напряжение" клеточной энергетики выявлено в Т^субварианте.

В группе ОЛЛ в целом и отдельно в разных иммуноцитоло-

КРСЗЬ

ке-Т ОМ

Рис. I. Сравнительный анализ распределения клеточного состава больных Т-ОЛЛ и неТ-ОЛЛ в зависимости от состояния энергообеспечивавщей системы.

| | - клетки с митохондриями нормального строения

| I - клетки с митохондриями в дезнергизованном состоянии

г-—"3 - клетки с митохондриями с признаками разрушения

П/7777Д - клеточные срезы без митохондрий

I I И И»

гических вариантах заболевания был проведен анализ строения ядра и ядрышка в клетках лейкозного субстрата. Наши данные согласуются с данными отечественных и.зарубежных исследователей / Петерсон И.С. (1986), Науменко О.И. (1985,1966), Ойаиа Т. (1982), 2искег-Ггалк1±п Б. (1981) /, что для клеток Т-ряда более характерны ядра с выраженным рельефом поверхности в виде углублений и карманов, тонких перемычек ядерного материала. Однако,мы не можем согласиться с мнением некоторых исследователей /Науменко О.И. (1985,1988)/ о том, что полиморфизм и атипия ядрышек являются неоспоримыми признаками лейкозных клеток. В нашем исследовании установлено, что для клеток крови здоровых детей и для лимфоидных лейкозных клеток, характерно присутствие различных морфологических типов ядрышек, хотя и в разном процентном соотношении , что свя-

зано с различным уровнем их функциональной активности. Выявлено, что для Т-ОЛЛ характерно значительно большее представительство клеток с признаками выраженной активации яд-рышкового аппарата ( ядрышки компактно-нуклеолонемного типа составили для клеток костного мозга 65%, для крови - 59,7%).

Итогом анализа особенностей субыикроскопического строения клеточного состава стал вывод, что отличительные морфологические характеристики имеют клетки властного субстрата В-клеточного плазмобластного ОЛЛ, что представляет диагностическую ценность.

В-клеточный субвариант является одним из наиболее редких, не превышая 2% в структуре ОЛЛ у детей /Румянцев А.Г. (1983)/. При этом плазыобластный вариант является ещё более редким заболеванием, встречаясь не чаще 1-2% случаев /Еу-тенко 3.А.(1964)/.

Исследования показали, что клеточный состав В-плазмо-клеточного ОЛЛ представлен доминированием крупных клеток с ядрами относительно гладкого контура и невысоким ядерно-ци-топлазматическим отношением. Практически во всех клеточных срезах встречаются 2 и более ядрышек с признаками выраженной активации в виде увеличения площади нуклеолы, увеличения . гранулярного компонента, увеличения количества фибриллярных центров, что говорит об усилении транскрипционной активности рибосомной ДНК. Цитоплазма клеток представлена гипертрофированными каналами шероховатого эндоплазматического ретикулу- • ма с обильным гомогенным содержимым. Митохондрии представлены гигантскими формами с признаками разрушения.

Подобный тип клеток не встретился ни при одном из изучаемых субвариантов ОЛЛ у детей. Доминирование клеток подобного типа в клеточном субстрате при ОЛЛ можно считать маркерным ультраструктурным признаком плазмоклеточного В-ОЛЛ.

В своей работе мы придали большое значение изучению вопроса о функциональной активности ядрышкового аппарата при различных иммуноцитологических вариантах острых лейкозов у детей. ' .

Количественное исследование активности рибосомного синтеза методом серебрения ЯОР хромосом было проведено в кнтер-фазных клетках аспиратов костного мозга и периферической крови 68 больных детей ОЛ и лимфоцитах 13 здоровых детей конт-

рольной группы.

Шло установлено, что для лимфоцитов крови здоровых детей средний уровень аргентофилии ЯОР равен 3,3+0,9 Ag-гранул/ ядро. Причем 56% клеток содержат 1-3 Jte-гранул/яд., 39% -4-о Ag-гранул и лишь 3% клеток содержат 6-7 As-грайул в клеточном ядре. Перечисленные данные аргентофилии позволили охарактеризовать несколько рангов активности ЯОР в общей клеточной популяции лимфоцитов: стандартная для лимфоцитов здоровых детей активность ЯОР, характеризующаяся 1-5 te-гран. на ядро, высокая активность, соответствующая 6-10 Ag-гран./яд. и чрезвычайно высокая активность - при выявлении более 10 Ag-гранул/ ядро - не свойственная периферическим лимфоцитам, обозначенная нами как гипергранулярность. Кроме того, при подсчете 150-200 клеток были выявлены единичные, так называемые Ag-негативные клетки, то есть в которых ядрышки серебром не импрегнировались.

Результаты сравнительного анализа аргентофильности нухле-ол в клетках лейкозного субстрата различных вариантов ОЛ у детей представлены на рисунке 2.

Рис.2. Гистограмма распределения содержания гранул серебра в ядрышках клеток костного мозга (заштрихованная часть) и периферической крови (незаштри-хованная часть) у здоровых детей и при различных вариантах острых лейкозов. Абсцисса: 1-здоровые дети, П-1а-0ЛЛ, Ш-с0ЛЛ,1У-пре-В-ОЛЛ, У-Т-ОЛЛ, У1-Д-0ЛЛ, УП-ОНЛ. Ордината: Среднее число Ад-гранул в ядрышках*.

Наибольший уровень аргентофилии выявлен в лейкозных клетках при ОНЛ: 8,5+0,5 Ag-гранул/яд. в клетках костного мозга и 7,6+1,0 Ае-гранул/яд. на клетку периферической крови. При анализе уровня аргентофилии различных иммуноцитологических вариантов ОМ было обнаружено, что аргентофильность клеток при Т-ОЛЛ в целрм выше, чем при неТ-ОЛЛ. Причем наибольшая активность ЯОР выявлена в бластных клетках Д-ОЛЛ, которая количественно приближается к таковой при ОНЛ. Необходимо подчеркнуть, что максимальная активность ЯОР внутри -каждого исследованного субварианта ОЛЛ, выявлена в бластных клетках крупного размера. Это наблюдение согласуется с литературными данными / Мамаев H.H. (1987,1988)/.

Таким образом, в результате проведенного исследования выявлено, что активность ЯОР в лейкозных клетках при ОЛ у.детей имеет большой диапазон колебаний. Установлено, что при низкодифференцированноклеточных субвариантах неТ-ОЛЛ, какими являются прогностически наиболее благоприятные Ia-ОЛЛ и сОЛЛ, уровни аргентофилии как в клетках костного мозга, так и пери- • ферической крови, практически не отличаются от данного показателя лимфоцитов крови здоровых детей.

Для более "зрелоклеточных" субвариантов ОЛЛ, какими яв- ' ляются неблагоприятные по течению и прогнозу пре-В-ОЛЛ, Т-ОЛЛ, Д-ОЛЛ характерен достоверно более высокий уровень аргентофилии, который коррелирует с увеличением доли клеток, содержащих более 10 te-гранул в ядре.

Шявлена вариабильность в характере распределения продукта реакции серебрения. Для низкодифференцированноклеточных Ia-ОЛЛ и сОЛЛ характерно расположение гранул в виде компактных кластеров в сочетании с рассеянными гранулами. Для более зрелоклеточных вариантов - Т-ОЛЛ, пре-В-ОЛЛ, Д-ОЛЛ характерно преобладание доли клеток с рассеянными гранулами серебра. В случае крайне выраженной гипергранулярности в клетках Д-ОЛЛ, наблюдались преимущественно рассеянные по всему ядру гранулы. Случаи ОНЛ характеризовались преимущественно кластерным ха-' рактером отложения продукта реакции серебрения.

Требует обсуждения выявление так называемых "Ай-негатив-ных" случаев ОЛЛ. В группах Ia-ОЛЛ и сОЛЛ встретились больные, в пунктатах костного мозга которых в 50% и более клеток импрегнация серебром отсутствовала. При этом средний уровень

аргентофилии либо не отличался от средних показателей по группе, либо был несколько сниженным. Всего встретилось 9 случаев ig-негативного ОМ: 3 случая Ia-ОМ и б - сОМ. Наблюдалась тенденция к обратной корреляции между числом Ag-негативных клеток и уровнем инициального лейкоцитоза. Ag-негатив-ные клетки не выявлялись в случаях, протекающих с инициальным гиперлейкоцитозом. Ag-негативность клеток опухолевого субстрата отмечалась другими авторами на другом онкологическом материале / Мамаев H.H. (1980,19£У7)/. Наиболее убедительным представляется объяснение феномена Ае-негативности крайне низким уровнем активности рибосомного синтеза в популяции бластных лейкозных клеток, находящимся за порогом чувствительности применяемого метода.

Таким образом, результаты нашей работы продемонстрировали, что аргентофильность клеток лейкозного субстрата варьирует в значительных пределах: от Ag-негативности до гипергранулярности. Анализ периферической крови показал, что в случаях с инициальным нормоцитозом, при прогностически благоприятных вариантах Ia-ОМ и сОМ, циркулирующий пул имеет высокий процент нелейкозных лимфоидных клеток ( в ряде случаев до 40%). Этот факт доказывает реакция, точечноподобной неспецифической эстеразы ( НЭ*-клетки). По нашим данным при этих субвариантах отсутствуют признаки активации рибосомного синтеза в клетках опухолевого субстрата.

Диапазон изменчивости показателей активности ЯОР в лимфоидных клетках при ОМ, дает основание высказать гипотезу о том, что случаи ОМ у детей, находятся'на разных стадиях многоступенчатого процесса канцерогенеза, включая фазу промоции и фазу автономного роста злокачественных клеток; При этом не случайно, что максимальная активность ЯОР наблюдается при некурабельных случаях Д-ОМ, клеткой мишенью которого является аналог эмбрионального тимоцита 10-12 недель развития.

Особо следует остановиться на случаях Д-ОМ, ввиду его редкой встречаемости и доказанного Т-клеточного происхождения. Выявление одновременно двух, как правило взаимоисключающих традиционных маркеров в популяции Т-клеток (Е^ и ЕАС4"), заслуживает внимания, несмотря на большое увлечение иммуно-фенотипированием с использованием MKÄ.

Среди описанных нами 4 случаев Д-ОЛЛ, один заслуживает особого внимания в связи с тем, что его показатели являлись экстремальными. В популяции клеток костного мозга и крови в этом случае выявлялось 90 и 37% гипергранулярных клеток соответственно, в том числе 80% клеток костного мозга и 12% клеток крови содержали более 20 гранул серебра на клетку. Характер серебрения носил преимущественно мелкоточечный характер. Экскурс в эмбриональное кроветворение позволяет сделать вывод, что появление клеток с двойными рецепторами сопряжено с процессами наиболее интенсивного роста и пролиферации Т-лимфоцитов, и возможно с процессами амплификации рибо-сомных генов.

Таким образом, проецирование показателей активности ЯОР лейкозных клеток на их иммунопатологическую и цитохимическую характеристики, позволяет четко выявить увеличение активности рибосомного синтеза в ряду лимфоидной дифференцировки от 1а-ОЛЛ и сОЛЛ к более дифференцированноклеточным вариантам.

Результаты изучения аргентофильности клеточного субстрата опухоли убедительно показывают, что появление в клеточном составе гипергранулярных клеток крупного размера безусловно указывает на злокачественные клетки с резко повышенным уров- -нем метаболизма. Шявление более 10% таких клеток в субстрате, можно считать критическим уровнем для определения высокой степени злокачественности при разных вариантах ОЛ.

Таким образом, несмотря на то, что на сегодня вопрос о причинах и механизмах нарушения процессинга рРНК до конца не решен, метод изучения активности ЯОР признается большинством исследователей "индикатором", облегчающим наблюдение за клеточной активацией при злокачественных заболеваниях.

Изучение субмикроскопического строения клеток субстрата опухоли и функциональных особенностей их ядрышкового аппарата позволяет расширить представления о патогенезе лей -козных заболеваний, оказывает помощь в характеристике клеточных вариантов острых лейкозов у детей, что должно быть использовано для индивидуализации лечения каждого отдельно взятого больного, и несет в себе информацию, которая может иметь прогностическое значение.

ВЫВОДЫ

1. Исследование субмикроскопической организации клеток субстрата опухоли при остром лимфобластном лейкозе у детей позволило выявить особенности сСШЛ, Т^-ОЛЛ, плазмобластного варианта В-ОЛЛ.

2. Ультраструктурные признаки сОЛЛ и Т^-ОЛЛ,включая наличие в клетках опухолевого субстрата гигантских вторичных фагосом, могут свидетельствовать об извращении метаболизма в клетках, экспрессирующих сОМ-антиген.

3. Ультраструктурные особенности клеточных элементов костного мозга и крови: гипертрофированный шероховатый эндо-плазматический ретикулум с обильным гомогенным содержимым, митохондрии в разных стадиях деструкции, увеличенное количество ядрышек с признаками активации, расширяют возможности клинико-цитологической диагностики плазмобластного В-ОЛЛ.

4. Изучение активности ядрышковых организаторов в лей-козных клетках показало, что интенсивность рибосомного синтеза коррелирует со степенью дифференцировки доминирующего пула лейкозных лшфобластов. Наибольшая активность синтеза наблюдается при "крайних" по степени дифференцировки вариантах -минимальнодифференцированноклеточных (О-ОЛЛ и Д-ОЛЛ) и мак-симальнодифференцированноклеточных (Т-ОЛЛ и пре-В-ОЛЛ). Варианты с остановкой дифференцировки лейкозной клетки на промежуточных стадиях созревания, характеризуются низкими показателями активности ядрышковых организаторов, сравнимыми с показателями нормальных лиьсроцитов. Ори нелимфоидных формах острых лейкозов у детей активность рибосомного синтеза выше, чем при лимфобдастшх.

5. Выявление интенсивности рибосомного синтеза с помощью определения активности ядрышковых организаторов лейкозных клеток позволило заключить, что наличие в костном мозге и периферической крови более 10% клеток крупного размера с гипергранулярным характером реакции серебрения можно считать критическим уровнем для определения высокой степени злокачественности процесса.

6. Обнаружение признаков, свидетельствующих об экспрессии сОЛЛ-антигена в лейкозных лим^оидных клетках указывает

на лучший прогноз заболевания - частоту и длительность ремиссии. Этими признаками являются: крупно-гранулярная ШИК-реак-

ция, присутствие в цитоплазме гигантских вторичных фагосоы и низкая активность ядрышковых организаторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При постановке клинико-цитологического диагноза отдельных с уб вариантов ОМ следует учитывать уровень активности рибосомного синтеза: низкие показатели активности ЯОР указывают на благоприятный прогноз заболевания, напротив, гипергранулярный характер реакции серебрения в более 10* клеток лейкозного субстрата можно считать фактором неблагоприятного прогноза.

2.' Для проведения дифференциальной диагностики В-кле-точного плазмобластного варианта ОЛЛ необходимо учитывать ультраструктурные признаки клеток: состояние шероховатого эндоплазматического ретикулума, митохондрий, ядрыпшового аппарата.

3. Наличие гигантских аутофагосом в люфзидных клетках лейкозного субстрата указывают на благоприятное течение ОМ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Многомаркерное изучение бластных клеток при остром миелоидном лейкозе у детей.// Тезисы докладов. Республик, съезд гематологов и трансфузиологов Грузии. - Телави,1983, с.145, в соавт. с Р.В.Ленской,Л.А.Черемушкиной, В.М.Черновыы

2. Особенности внутриклеточного метаболизма, ультратонкой структур! и поверхностной мембраны лейкозных лимфоидных Т-, Д- и ниТниВ-клеток при остром лейкозе у детей.// Гематология

и трансфузиология, 1985, !Р2,с.20-23, в соавт. с В.М.Черновым, Р.В.Ленской, Т.А.Ериной, Л.А.Черемушкиной.

3. Активность ядрышкообразующих районов хромосом при различных иммунопатологических вариантах острого лим$олейко-за у детей.// Тезисы докладов Всесоюзн. совещания "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза". Ленинград, 1988, Цитология, 1988,т.ХХХ,1Р9,с.1131, в соавт. с М.Г.Коляскиной, О.В.Зацепиной, Р.В.Ленской.

4. Комплексная клинико-цитологическая характеристика 7 случаев Д-клеточного лимфопролиферативного заболевания у детей.// Тезисы докладов. II Всесоюзн. конференция по детской гематологии. Душанбе, 1988,с.72, в соавт. с Н.С. Кисляк, Р.В.Ленской, А.Г.Румянцевым и др.

5. "Общий" тип острого лимфобластного лейкоза у детей: клинические проявления, прогноз, характеристика клеточного субстрата с помощью спектра современных цитологических методов.// Тезисы докладов. Всесоюзн. конференция "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии в педиатрии". Кемерово, 1989,с.30, в соавт. с Р.В. Ленской, К.Л. Кондратчиком, В.М. Черновым и др.

6. Состояние ядрыжообразующих районов в клетках костного мозга и крови при остром лейкозе у детей.// Гематология и трансфузиология, 1989, (й,с.28-33, в соавт. с Р.Б.Ленской, 0.3. Зацепиной, Л.В.Байдун и др.