Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Особенности пролиферации и дифференцировки лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе человека

< } 9 11'

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ОНКОЛОГИИ И РАДИОБИОЛОГИИ им. Р. Е. КАВЕЦКОГО

На правах рукописи

КОГАРКО Ивегпша Николаевна

ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ ЧЕЛОВЕКА

14.00.14 —онкология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук в форгле научного доклада

Киев 1991

Г |

| ЛКАДЕ.'.'МЯ НАУК УКРАИНЫ

ПРОБЛЕМ ОНКОЛОГИИ И РАДИОБИОЛОГИИ им.Р.Е.КАВЕЦКОГО

На правах рукописи

когарко Иветта Николаевна ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ и ДИ<ШРЕНЦИРОВКИ лишюцитов

при хроничнлш т-тоткозЕ

14.00.14 - онкология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук в '¿ор:ле научного .доклада

Киев 1991

Работа выполнена в Институте химической физики АН СССР им.H.H.Семенова.

Официальные оппоненты:

академик АН Украины, доктор медицинских наук, профессор З.А.Бутенко

доктор медицинских тук,

профессор

Л.Г.Ковалева

доктор медицинских наук, профессор

ß.Я.Кинзельский

Ведущее учревдение: Всесоюзный онкологический научный

центр АМН СССР

Защита состоится b S 199 i г. в/3 час, на

заседании специализированного ¿овета Ж7016.0337OI в Институте проблем онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого АН Украины / 25202.2., г.Киев, ул.Васильковская,45/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШОиР п.м.Р.й.Ка-взцкого АН Украины

Автореферат разослан liO&'b Я г>Лг.

Учений секретарь спецлалпзпрогзп.нного совета

канд. биол. наук Ь.В.шш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Современный этап исследований в экспериментальной онкологии и онкогематалогии характеризуется выяснением структурных и метаболических изменений кроветворных клеток и механизмов лейкоэной трансформации на молекулярно-генетическом уровне.

Рост частоты лимфопролиферативных заболеваний, недостаточная эффективность мер профилактики и ранней диагностики являются основой для разработки этой общебиологической проблемы, решение которой актуально в медицине, биологии и экологии. Выяснение вопросов злокачественной трансформации важно в плане нахождение новых теоретических подходов к пониманию развития лейкозного процесса на различных уровнях дифференцировки нормальных кроветворных клеток и для разработки современных методов диагностики и лечения, которые должны быть направлены на элиминацию лейкозного клона, нормализацию измененных свойств клеток и общего гомеоста-за.

По существующим представлениям лейкозогенез - многостадийный процесс. Нарушения в клеточном метаболизме, генетической и мембранной системах клеток приводят к изменениям фундаментальных процессов лимфопоэза - пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. В настоящее время не до конца ясны пути и механизмы злокачественной трансформации нормальных кроветворных клеток, стадии дифференцировки, наиболее чувствительные к лейкомогенному фактору, и при зтом обидев изменения регуляции кроветворения и иммуногенеза. Развитие лейкозного процесса,возможно, обусловлено дефектностью иммунной системы, нарушениями пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток, поэтому исследование особенностей процесса биосинтеза нуклеиновых кислот, изменений молекулярной структуры и функций мембран популяций лимфоцитов при гемоб-ласгозах особенно актуально. Изучение клеточных основ и молекулярных механизмов трансформации при лейкозах человека затруднено многообразием форм заболевания и недостаточным использованием специальных методов исследования отдельных клеточных и субклеточных систем. Достигнутый в настоящее время прогресс в изучении лейкозов связан, в основном,с успехами морфологического, биохимического анализов и тестов иммунологической диагностики для выявления и дифференциации некоторых видов гемобластазов.

Требуют дальнейшего изучения физико-химические и молекулярные нарушения мембран, ядер и других структур лейкозных клеток для выяснения функционирования популяции в целом при лимфопроли-Феративных заболеваниях. На современном этапе исследования лей-козогенеза первоочередной задачей остается поиск комплекса экспериментальных подходов к характеристике процессов пролиферации и дифферэнцировки лимфоидных клеток, разработка методов идентификации и характеристики отдельных субпопуляций лимфоцитов при возникновении и развитии лейкоза, а также оценка их роли в лей-комогенезе. Для решения этих вопросов необходимо применять наиболее совершенные морфологические, цитологические, физико-химические и другие методики, позволяющие изучать различные функциональные структуры лимфоцитов клеток в норме и при их злокачественной трансформации, использовать достаточно чувствительные методы регистрации минимальных нарушений основных клеточных компонентов на, начальных стадиях лейкоза, отличающих трансформирован-ку;:-' клетку от ее нормального аналога. В доступной нам литературе обнаружены единичные работы по исследованию корреляции изменений молекулярной структуры ядер и. мембран гемопоэтических клеток при развитии заболевания: часть работ посвящена изучению свойств и особен ностей ДНК, РНК, белков' трансформированных лейкозных клеток в модельных опытахГ G. Gall о, 1982, Ф. Хейхоу, 1933,П. Torell у,1985,В. Г. Пинчук, 1986,3. А. Бутенко, 1984.P. Dormer, 1986), другие исследования проведены на клиническом материале; Y. Tempi ,1974, Д. г. Глузмак, 1982,3. Riceardi, 1983, Е А. Федоров, 1983, Г. И. Козинец,1984, D. Quagl i no, 1985, F. Gavosto, 1936, К П. Танина, 1986, D. Butturi ni , 1983, M. E блинов, 1990).

Для раскрытия механизмов трансформации нормальных гемопоэтических клеток при лимфопролиферативных заболеваниях необходимо комплексное изучение лимфоидной системы и отдельных ее звеньев -субпопулнций лимфоцитов лимфатических узлов и крови, что позволит, возможно., определить изменения лимфоцитов при лейкозах, выяснить особенности биосинтеза нуклеиновых кислот и молекулярные различия липидов цитоплазматических мембран и, в дальнейшем, оценить уровень повреждений на ранних этапах и при прогрессиро-вании лейкоза. Выяснение перечисленных выше вопросов актуально

для более глубокого понимания процессов опухолевой трансформации ¡слеточной популяции и подтверждения современных представлений о главенствующей роли структурных нарушений генома и особенностях его функционирования в лейкогенезе человека. Учитывая современное состояние проблемы лейкозов,необходимы поиски новых научных направлений на основе экспериментальных исследований и обоснованные предложения для внедрения в практику, так как достижения современной фундаментальной и клинической лейкозологии способствуют поэнанию закономерностей функционирования лимфоидной системы в норме и патологии.

В связи с актуальностью проблемы гемобластозов в нашей стране ГКНТ СССР создана программа для решения научно-технической проблемы 0.69.05 "Разработать и внедрить систему государственных мероприятий по эффективной профилактике,лечению и снижению заболеваемости депрессиями кроветворения и лейкозами человека,сельскохозяйственных животных и птиц",М государственной регистрации N 01.86.0126230, частью которой является настоящая работа.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Основная цель работы комплексная оценка процессов пролиферации и дифферениировки клеточной популяции на основе определения метаболических изменений ядра и цитоплазматической мембраны лим фоцитов лимфоузлов и крови на разных стадиях заболевания и в норме.

Для достижения поставленной цели необходимо: Провести морфологическое идентифицирование популяции в целом и групп лимфоцитов лимфоузлов и крови при хроническом димфолей-козе(ХЛЛ)и у здоровых лиц.

Определить- пролиферативную активность всей популяции и групп лимфоцитов лимфоузлов и крови при ХЛЛ и в норме, -степень диффе-ренцировки лимфоцитов лимфоузлов и крови в различные периоды ХЛЛ в сравнительном аспекте с клетками здоровых доноров.

Установить- особенности биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот на одних и тех же лимфоцитах лимфоузлов и крови, исследуя корре-.

ляцию морфологических изменений и процессов пролиферации и дифференцировки в норме и при развитии лейкоза,

- изменение фаз клеточного цикла лимфоцитов при лейкозе по сравнению с их нормальными аналогами, - нестабильность ДНК лимфоцитов крови на начальных стадиях и при прогрессировании лей-козного процесса.

Охарактеризовать- липиды цитоплазматических мембран при ге-мобластовах и у здоровых лиц. - суммарную ненасыщенность жирных кислот липидов лимфоцитов и плазмы крови в норме и при развитии ХЛЛ, ЗЛ ,МБ и особенности изменений ненасыщенности липидов при каждом виде гемобластозов.

Показать взаимозависимые изменения биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот,нестабильности ДНК и липидов лимфоцитов при гемоб-ластозах в корреляции с клинико-гематологическими показателями.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА В результате применения комплекса методов двухэпатной авто-радиографии,сканирующей микрсспекгроцитометрии,КФ,Н-ЯМР спектроскопии и других получены новые данные об особенностях биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот и деспирализации ДНК,изменениях липидов цитоплазматических мембран и ненасыщенности липидов лимфоцитов и плазмы крови при гемобластозах и в норме.

На примере ХЛЛ дана характеристика взаимосвязей процессов пролиферации и дифференцировки и изменений динамического состояния цитоплазматических мембран лимфоцитов в корреляции со стадиями заболевания.

Получены оригинальные результаты: -по пролиферативной активности и степени дифференцировки морфологически различных групп лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови доноров и больных в 'различные стадии заболевания;

-по идентичности процентного соотношения групп лимфоцитов лимфоузлов и крови в норме и в различные периоды ХЛЛ; -по снижению в 8-10 раз,по сравнению с нормой,числа включающих НЗтимидин клеток крови и лимфоузлов и увеличению в 1,5 раза числа клеток,включающих НЗуридин в начальной стадии ХЛЛ; -по интенсификации биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот и выявлению различий интенсивности биосинтеза у лимфоцитов,расположенных в норме-в трех периодах б фазы, а при ХЛЛ- в двух перио-

дах б фазы;

-по установлению лимфоцитов,характеризующихся активацией биосинтеза ядерной РНК и повышенной плоидностью при отсутствии включения НЗтимидина;

-по возникновению гетерогенности лейковных лимфоцитов в связи с изменением продолжительности и 3 периодов митотического цикла в начале и при прогрессии ХЛЛ Получены:

-новые данные при ХЛЛ о наличии дефектов в структуре ДНК лимфоцитов крови,количество которых не коррелирует с длительностью заболевания,стадией процесса и возрастом Сольных;

-сравнительные Н1-ЯМР спектральные характеристики липидов ци-топлазматических мембран при гемобластозах и в норме,а такжеиз-менения ненасыщенности жирных кислот липидов плазмы и лимфоцитов крови в начале,при прогрессировании лейкозов .и в норме. Для. каждого вида гемобластозов установлены индивидуальные особенности изменений липидов. Химиотерапия воздействует преимущественно на лимфоциты с нестабильной структурой ДНК и повышенной ненасыщенностью жирных кислот липидов.

ПЬпуляция лимфоцитов при ХЛЛ может рассматриваться как система с нарушенными соотношениями процессов пролиферации и диффе-ренцировки. Предложена гипотеза,по которой установленные при ХЛЛ нарушения процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов и изменения динамического состояния мембран клеток лимфатических узлов и крови обусловлены взаимосвязанными перестройками в ядре/биосинтез нуклеиновых кислот/ и цитоплазматических мембра-нах( липидьП,что приводит к появлению и формированию патологи ческого клона лимфоцитов с определенными функциональными особенностями и свойствами к рециркуляции и долгожительству.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСИТСЯ:

Система комплексного исследования процессов пролиферации и дифференцировки всей популяции и групп лимфоцитов при гемобластозах и в норме на основе определения нарушений основных клеточных структур/ядерные ДНК, РНК, липиды цитоплавматической мембраны/ при использовании современных физико-химических методов.

Гетерогенность популяции лимфоцитов лимфоузлов и крови'по морфологическим критериям, пролиферативной активности и степени дифференцировки при развитии лейкозного процесса.

Особенности процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов лимфатических уэлов и крови при ХЛЛ, обусловленные измене1-ниями относительной продолжительности фаз клеточного цикла( 61, 3,), приводящими к приобретению лимфоцитами свойств рециркулирующих и. долгоживущих.

Увеличение нестабильности ДНК лимфоцитов в начальной стадии и в период клинических проявлений болезни и отсутствие влияния повышенного числа деспирализованных участков ДНК на жизнеспособность и пролиферативную активность лимфоцитов.

Изменения Ш-ЯМР спектральных характеристик липидов мемб ран лимфоцитов при гемобластозах й в норме. Увеличение ненасыщенности жирных кислот липидов при гемобластозах и специфичность изменений для каждого вида изученного заболевания и нормы.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Разработан метод оценки процессов, пролиферации и дифференцировки всей популяции и отдельных групп лимфоцитов при лейкозе и в норме при совместном применении соврмененных морфологических и физикохимических методов.

Предложен новый подход к характеристике лейковной трансформации лимфоцитов и развития лимфопролиферативного процесса, основанный на комплексной оценке суммарного биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот и состояния липидов цитоплазматической мембраны лимфоцитов.

Получены характеристики пролиферативной активности и степени дифференцировки нормальных лимфоцитов лимфоузлов и крови,что является основой для выявления минимальных изменений процессов пролиферации и дифференцировки при лейкове.

Представлены данные о популяции лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови при хроническом лимфолейкозе как системе, в

которой нарушены соотношения процессов пролиферации и дифферен-цировки.

Разработан и предложен практический метод ранней и дифференциальной диагностики ХЛЛ и злокачественных лимфом по изменению Н'-ЯМР спектральных характеристик липидов мембран лимфоцитов крови.

Разработан и предложен практический метод определения ненасыщенности жирных кислот липидов лимфоцитов и плазмы крови в норме и в начальный период заболевания. Получены данные об изменении ненасыщенности липидов при прогрессировании гемобластозов. Выявлен ные индивидуальные особенности нарушений суммарной ненасыщенности липидов лимфоцитов и плазмы крови при каддом из гемобластозов являются основанием для ранней и дифференциальной диагностики, а также для проведения контроля 8а эффективностью лечения.

Совокупность представленных результатов выявляет новый перспективный научный подход - изучение взаимосвязанных изменений метаболических процессов ядра и цитоплазматических мембран лимфоцитов при их лейкозной трансформации.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

1. Издание научно-методических рекомендаций "Проведение биохимических, иммунохимических и радиохимических исследований имму-нокомпетентных клеток, клеточных структур и их компонентов" (В соавторстве с Г. Ф. Коромысловым, А. Л, Газдаровым, П. Б. Садаускасом и др.), Москва, 1983 г.

2. Публикация результатов исследования в периодической печати.

3. Доклады на международных и Всесоюзных конференциях.

4. Обучение научных сотрудников на рабочих местах методам дву-

хэтапной авторадиографии,сканирующей микроцитофото-

метрии, озонированию липидов и др. для оценки параметров пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток в норме и при лейкозе.

5. Доклады на школах молодых ученых и практических врачей.

6. Получены акты о научно-практическом применении предложенных методов: из 2-й клиники Всесоюзного научного гематологического

центра ЫЗ СССР, Института биохимии АН Лит. ССР,Всесоюзного института экспериментальной ветеринарииВАСХНИЛ.

АЛПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты исследований отражены в 37 работах, опубликованных в периодических . журналах, сборниках научных трудов, Материалах Международных и Национальных Конгрессов, Всесоюзных конференциях,с"е8дов и симпозиумов. Материалы, вошедшие в диссертацию, докладывались и обсузцЯались: на Весоюз-ных конференциях и Координационных совещаниях Совета по решению научно-технической проблемы 0.69. 05. "Лейкозы человека и животных" ГКНТ СССР,- Рига(1971,1978,1981),Таллин(1975), Тар-ту(1978,1983,1987) .Вильнюс(1979,1982),Белая Церковь(.1982).Моск-ва( 1982,1984), Минск( 1986) ,Сухуми( 1979,1987,1988); на Международных и Всесоюзных с"ездах по онкологии: 2-й,3-й,4-й Националь-ный(БНР, София,1974,Варна,1979,Варна,1985). 2-й ■ Национальны^ СРР, Бухарест, 1975), 10-й Шждународный(США, Хьюстон, 1970), 3-й, 4-й Национальный ССОР,Ташкент,1979,Ленинград,1986); Международных и Всесоюзных с"ездах по гематологии: 1-й,2-й Националь-ныйГСССР,Баку,1979,Львов,1985),19-й Национальный(ВНР,Будапешт, 1987);й-й Мелздународный Конгресс по сравнительному изучению лейкозов(СССР,Сухуми,1979),Европейский по цитологии(ВНР, Будапешт, 1983) ¡Международных совещаниях: по лейкозу человека и живот-ных( СССР,Сухуми,1986)."Вирусология опухолей" (ГДР, Дрезден, 1987); Всесоюзных конференциях: по проблеме лейкозовРи-га(1971,1987), Тарту( 1937),Белая Церковь(1982),Сухуми(1988) по иммунологии-Алма-Ата(1981),Таллинн(1982), Самарканд( 1984) ; по проблеме "Стволовая клетка и опухолевый рост"( Киев,1983); Всесоюзных симпозиумах и совещаниях: по структуре и функции клеточного ядра(Киев,1970),по кинетике клеточных популяций(красно-ярок, 1973),по авторадиографии( Москва,1976), по методам количественного анализа в патоморфологии( Полтава, 1977), по проблеме "Взаимодействие опухоли и организма" (Киев,1980),1-й Всесоюзный конгресс4 по биофизике( Москва , 1982), "Биофизика рака'Ч Москва, 1987), "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований"(Москва,1989)."Механизмы канцеро- и лейкозогенеза'Ч Киев, 1990).

Отдельные разделы работы выполнялись совместно с научными сотрудниками других лабораторий ИХФ АН СССР ( Л. А. Сибельдиной,

В. Е. Юшмановым, Г. П. Жижиной, Г. П. Троицкой, Л. С. Евсеенко, Б. С. Ко-гарко, А. А. Конрадовым, Т. И. Позняк, Е. В. Киселевой, Д. М. Лисици-ным), а также научными сотрудниками и врачами различных медицинских учреждений СЮ. Э. Виноградовой, Г. В. Кругловой, 0. С. Шкробом, А. М. Кулаковой, Б. Б. Фуксом, М. С. Задгенидзе).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Основным об"ектом исследований были лимфоциты лимфатических узлов и периферической крови 300 больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом( ХЛЛ), злокачественной лимфомой с лейкемиваци-ей(ЗЛ),миелоидной болезнью(МБ)на разных стадиях развития процесса. Больные представлены в возрасте от 35 до 80 лет.муж-чин-200,женшин-100. По клинико-гематологическим показателям больные разделялись на группы,которые характеризовались различной степенью прогрессирования'лейкозного процесса(классификация ВОЗ 1976, Нильская классификация,1978).Длительность заболевания с момента установления диагноза колебалась в пределах от нескольких месяцев до 10 и более лет. Наряду со случаями с медленным течением заболевания(около 150 больных) у 30 человек имело место быстрое,агрессивное развитие ХЛЛ и ЗЛ, у 20 больных отсутствовали признаки прогрессии ХЛЛ в течение 5-7 лет,что позволило воздержаться от химиотерапии. В 120 случаях выявлена генерализованная ферма ХЛЛ с различной степенью увеличения лимфоидных органов, у 30 больных ХЛЛ и ЗЛ отмечалась преимущественно гиперплазия лимфоузлов или селезенки;лейко- и лимфоцитоз крови при ХЛЛ колебались в пределах от сублейкемических(15-40тыс. лейкоцитов с 60-75% лимфоцитов) до лейкемических(200-400тыс. лейкоцитов с 80-95% лимфоцитов).Клинико-гематологическая компенсация больных к моменту исследования различна;часть из них в начальной стадии ХЛЛ и при развитии болезни не требовала применения химиотерапии. Для оценки течения лейкоза и действия препаратов изучали лимфоциты у нелеченных больных в начале заболевания ХЛЛ, при развитии болезни/ХЛЛ,ЗЛ, МБ/ и при лечении прогрессирующих стадий; лимфоциты исследовали -после окончания лечения через 12-36час. ,от 2до 60 дней, через 1-3 года. Таким образом, работа проведена при разнообразных клинико-гематологических состояни-

ях,отражающих динамику развития процесса и изменения в это время трансформированных лимфоцитов. Б качестве контроля были выделены лимфоциты лимфоузлов и крови 100 доноров; лимфоузлы получены из брыжейки толстого кишечника людей,оперированных по поводу язвенной болезни 12-перстной кишки и не регионарные к очагу воспаления, по гистологической структуре не имеющие отклонений от нормы; также взяты лимфоциты крови при миокордите и параксизмальной ночной гематурии( ПНГ синдром)-12человек.

При исследовании морфологических и функциональных свойств лимфоцитов лимфоузлов и крови исспользовали следующие методы;

1. Получение нормальных и патологических лимфоцитов,постановка 4-часовой краткосрочной культуры клеток-по модифицированному И. Н. Когарко с соавт. (19691 методу.

2. Световая микроскопия и кариометрия клеток на мазках - на универсальном микроскопе Ш-2("Цейс,Йена,ГДР),

3. Радиоактивное мечение нуклеиновых кисло,т осуществляли с помощью 5-метил-НЗ тимидина и НЗ уридина.

4. Интенсивность синтеза ДНК и РНК для всей популяции и групп клеток, индекс мечения лимфоцитов определяли методом

авторадиографии(О. И. Епифанова, Е Е Терских, 1967,1989)

5. Содержание ДНК клеток исследовали методом сканирующей мик-роспектроцитометрии( Ю. А. Морозов, 1953, Ф. Хейхоу,1983)

6. Комплексное изучение плоидности клеток и интенсивности синтеза нуклеиновых кислот на модели одной клетки проводили методом, предложенным Ф. Хейхоу( 1969) в модификации И. Н. Когарко.

7. Дифференциальную окраску ядер и цитоплазмы нормальных и лейкозных клеток производили по методу Браше; окраску первичных мазко в лимфоцитов с фотоэмульсией проводили по модифицированному методу А. ХейлаГ 1965,19331.

8. Препараты ДНК получали из нормальных и лейкозных лимфоцитов по методу Мармура. Реакцию ДНК о Формальдегидом проводили в 2,24% растворе при 1+54 С.

9. Деспирализацию ДНК определяли кинетическим формальдегид-ным(КФ) методом(К). Н. Лазуркин, 1Э70. Г. П. Жижина,1934).

10. Анализ на наличие разрывов однсцецочечной и двуцепочечной ДНК проводили методом горизонтального гель-злектрофорева в 0,4% агарозных гелях.

11. Регистрацию динамического состояния липидов цитоплазмати-ческих мембран лимфоцитов в норме и патологии проводили на ЯМР-Фурье спектрометрах фирмы Брукер на частотах 250 и 360 Мг.

12. Липиды плазмы крови и лимфоцитов в норме и при лимфопроли-феративных заболеваниях экстрагировали по модифицированному методу Фолча( Т. И. Позняк с соавт. ,1987).

13. Ненасыщенность липидов клеток и плазмы крови измеряли озонатором АДС-5(конструкции ИХФ АН СССР). Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методами вариационной статис-тики(Поляков,1981),была составлена в ИХФ АН СССР программа решений для ЭВМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Раздел 1. Некоторые особенности процессов пролиферации и дифференцировки нормальных лимфоцитов лимфоузлов и крови.

Современное учение о лимфоцитах характеризует эти клетки как полифункциональные,являющиеся предшественниками антителообразую-аих клеток и центральным звеном ь специфических иммунологических реакциях?3. Nassel ,1972, J. Rabí novi ch, Í9S2, И. Л. Чертков, 1986,Р. В. Петров, 1983, Г. И. Козинец,1989,). Несмотря ка многочисленные результаты, свидетельствующие о роли этих клеток в различных жиз-неноважных биологических процессах,лимфоциты как клетки крови и лимфоиднсй системы,отличающиеся по степени зрелости,Функциям и метаболизму, все также интенсивно изучаются. Ко времени начала работы в доступной нам литературе имелись немногочисленные сообщения об исследовании лимфоцитов лимфоидных органов и крови в норме и при гемобластсзах в сравнительном аспекте с использованием различных инструментальных методов для изучения основополагающих процессов- пролиферации и дифференцировки при злокачественном перерождении^. Gavosto, 1964, D. Quagl i no, 1963, Ф. Хей-хоу,1969).

Для оценки изменений,происходящих при лейкозной трансформации клеток, необходимо было изучить особенности пролиферативной активности и степень дифференцировки их нормальных аналогов. Об"ек-том изучения стали лимфоциты,полученные из лимфоузлов и крови доноров. В нормальном лимфоузле человека лимфоциты составляют 96-98% от общего числа клетокГВ. Ке1 пег, 1972, Ю. А. Уманс-кий,1983). Клеточная взвесь,полученная из биопсированного лимфо-

узла,состояла, в основном ,из лимфоцитов,что подтверждено цито-морфологическим анализом. Лимфоциты крови получали несколькими методами-центрифугированием в градиенте плотности(1,077 г/смЗ) фиколл-верографина,высаживанием на пищевой желатине с центрифугированием и отстаиванием гепаринизированной крови при 1= +4 С в течение 2-х час. с центрифугированием и получением лейкоконцент-рата.

1.1Характеристика клеточной популяции нормальных лимфоцитоь лимфоузлов и крови дана на основании применения модифицированного метода Браше, что позволило выявить четкие морфологические критерии различных групп лимфоцитов по размерам-ядра и цито плазмы. В популяции лимфоузлов и крови преобладают клетки сред него размера 57+/-0,3%, малых лимфоцитов-30+/-0,2%,а больших- 12+/-0,3%( табл. 1).

1. 2. Определение биосинтеза ДНК,в популяции и различных группах лимфоцитов проводили методом авторадиографии с меченым предшественником ДНК- НЗ тимидином. Сравнительный анализ показал , что 8+/-0,7% из лимфоузлов и 3,5+/-0,ЗХ-из крови лимфоцитов активно синтезируют ДНК В группе больших лимфоцитов индекс мечения равен-24+/-0,1%(лимфоузел) и -18+/-0,Щкровь), для средних кле-токЗ+/-0,1% и 4+/-0,2% соответственно,малые лимфоциты лимфоузлов и крови пролиферировали в 0,4+/-0,1%. Существенным критерием является определение интенсивности синтеза ДНК: оказалось, что большие лимфоциты имеют 30-50,средние-12-20,малые-3-4 гранул серебра на клетку. Наблюдается увеличение интенсивности синтеза ДНК в лимфоцитах большего размера( табл. 1), что совпадает с данными Ф. Хейхоу(1983).

Анализ количества меченых клеток и интенсивность их мечения для лимфоузлов и крови установил двукратное увеличение данных показателей в группах больших и средних лимфоцитов лимфоузлов по сравнению с кровью,что свидетельствует об увеличении числа про-лиферирующих клеток в лимфоузлах.

1.3. Определение уровня биосинтеза суммарной ядерной РНК в лимфоцитах лимфоузлов и крови проводили добавлением в клеточную суспензию меченого по тритию уридина. Методом авторадиографии определяли индекс мечения и интенсивность синтеза суммарной ядерной РНК для всей популяции и для различных групп клеток. При оп-

ределение подобранных условиях эксперимента доля клеток,активно синтезирующих РНК для всей популяции-50+/-0,3%;в группах малых, средних и больших лимфоцитов-примерно одинакова- 47 О, г%,54ь'- о,55+/-О,IX соответственно,что согласуется с данными Нитап' а и В. ЗЬпа М'а( 1966,1984.). 1фи анализе интенсивности синтеза суммарной ядерной РНК по группам лимфоцитов оказалось, что в клетках большего размера идет более интенсивный синтез РНК, что подтверждается результатами

и. Тоге! 1 уг 1965.1986) .Р. НауЬое,0. Quaglino ; 1969,1983). Литературные данные и сравнительный анализ полученных результатов на лимфоцитах лимфоузлов и крови показывает,что интенсификация биосинтеза суммарной ядерной РНК происходит в средних и больших клетках и.за их счет идет прирост в популяции числа РНК-синтезирую-ших лимфоцитов табл. 1).

1.4. Изучены процессы оиоситеза ДНК и РНК в краткосрочной культуре на одних и тех же лимфоцитах лимфоузлови крови. Это стало возможным с применением модифицированной нами методики двухз-тапной автораяиог рафии с одновременным введением в культуру клеток меченных предшест венников нуклеиновых кислот-НЗ тимидина и 'нз у-рицина. Зое лимфоциты, синтезирующие ДНК, активно осуществляют синтез суммарной ядерной РНК. Параметром,характеризующим динамику изменений интенсивности синтеза ДНК и РНК в одной и той же клетке,является угловой коэффициент "К"прямой,проходящей че-экспериментальные точки. Показано наличие линейной зависимости между увеличением интенсивности синтеза ДНК и РНК для одной и той же клетки. Б доступной нам литературе не оказалось аналогичных работ,выполненных на нормальных лимфоцитах с применением таких методов,за исключением работы Г. Зеег1'а (1965) .который использовал меченные предшественники для исследования клеток здоровых .-.Сй&ьян и опухолей мышей. 'Обнаруженная нами группа нормальных активно пролиферирующих лимфоцитов с интенсивным синтезом ДНК и РНК,выделенная из лимфоузлов и крови, состоит из клеток среднего и большого размеров,что согласуется с полученнми позднее данными Г. И. КозинцаГ 1973.1933).

Б коде дальнейших исследований клеток лимфоузлов и крови доноров получены результаты о степени дифференцировки групп лимфоцитов к взаимосвязи с процессом пролиферации.

1.5. Выявление особенностей процессов пролиферации и дифферен-цировки лимфоцитов проводилось с помощью комплекса современных физико-химических методов- количественного определения содержания ДНК методом сканирующей микроспектроцитометрии и авторадиографического анализа синтеза ядерных нуклеиновых кислот в тех же клетках. При изучении содержания ДНК среди лимфоцитов разного размера лимфоузлов и крови оказались идентичными по плоидности соотношения между группами клеток. В популяции преобладают клетки с содержанием ДНК = 2с(диплоиды). Среди малых лимфоцитов 8+/-0.1% -гипердшиюиды(2,1с-2,4с).Средние лимфоциты располагаются в интервале 2,1с-Зс(гипердиплоиды) и 12+/-0,3% из. них-триплоиды и гипертриплоиды. В группе больших лимфоцитов-25+/-0,IX с содержанием ДНК=2с,основную массу клеток составляют гипердиплои-ды-55+/тОД% ' и 7+/-0,2%-гипертриплоиды. Нами впервые дан детальный анализ различных групп лимфоцитов лимфоузлов и крови по количественному содержанию ДНК. Полученные результаты чрезвычайно важны для определения доли ДНК-синтезирующих и дифференцирующихся клеток и пролиферативного пула нормальных лимфоцитов.

1. 6. Комплексное исследование содержания ДНК,биосинтеза РНК и ДНК в одних и тех же нормальных лимфоцитах лимфоузлов и крови позволило определить следующие закономерности процессов пролиферации и дифференцировки:

а/определенная часть клеток среднего размера синтезирует и содержит ДНК в количестве 2с-4с. ,эти клетки активно синтезируют и РНК Такого типа пролиферирующие и дифференцирующиеся лимфоциты расположены в трех участках синтетической фа-зыс.2,4с-2,7с;2,7с-3,0с;3,3с-3,6с).Эти интервалы 3 фазы характерны тем,что клетки,находящиеся в каждом из них, синтезируют ДНК приблизительно с одной и той же, свойственной этому периоду, интенсивностью, которая различна для разных участков синтетической фазы.

б/часть лимфоцитов с увеличенным,более 2с, содержанием ДНК не включают меченый по тритию тимидин.но активно синтезируют РНК. Такие клетки проявляют четкую тенденцию к увеличению интенсивности синтеза РНК в связи с увеличением их плоидности. Вычислен ный по экспериментальным данным коэффициент корреляции г (характеризующий близость точек к теоретически предполагаемой

прямой) равен 0,37fp<0,05),след. .зависимость между . увеличением интенсивности синтеза ядерной РНК и повышением плоидности является линейной. При зтом угловой коэффициент равен 3,4,т. е,с увеличением плоидности нормального лимфоцита на 1 интенсивность синтеза суммарной ядерной РНК увеличивается в среднем на 3,4 гранул на клетку.

Итак, на одних и тех же клетках найдено экспериментальное подтверждение факту,что лимфоциты представляют собою особую группу клеток в системе кроветворения. Они бифункциональны, т. е. могут быть дифференцированы и одновременно обладать свойствами пролиферирующих клеток. Популяция лимфоцитов лимфоузлов и крови в норме гетерогенна по своему составу: часть клеток только начинает синтез ДНК(плоидность-2,1с и более),дру-гие-заканчивают репликацию ДНК(3,6с).обнаружены клетки с плоид-ностью около 4с,не включающие меченый тимидин.но активно синтезирующие РНК. Такая гетерогенность популяции лимфоцитов в норме и их бифункциональность обеспечивает многогранные способности лим-фоидной системы,направленные на зашиту организма при действии разных физических и химических агентов. Итак,получены экспериментальные данные,подтверждающие корреляционную связь- процессов пролиферации и дифференцировки в лимфоцитах лимфоузлов и крови доноров.

1.7. в настоящее время установлено,что в процессе регуляции функций генетического аппарата в нормальных и трансформированных клетках подвергаются изменениям структуры нуклеиновых кислот, белков, липидовС А. В. Алесенко, 1987; И. Ф. Сейц, 1988; Г. П. Георгиев, 1981). Полученные данные о пролиферативной активности нормальных лимфоцитов,особенностях соотношений синтеза и содержания ДНК создали возможность для более углубленного исследования стабильности ДНК. В серии экспериментов, проведенных совместно с Г. Жижи-ной,изучали стабильность вторичной структуры ДНК кинетическим формальдегидным методом,в основе которого-реакция формальдегида с амино- и имино группами азотистых оснований ДНК при нарушенных или ослабленных Бодородных связях,фиксация деспирализованных участков и расплетания спирали от первоначального дефекта с выявлением одного измененного участка на 10000 пар оснований нук-леотидов. Были выделены лейкоциты от 30 практически здоровых до-

нора и показано,что в ДНК нормальных клеток имеются деспирализо-ванные участки,количество которых варьирует от 0,2 до 1,0(0,6+/-0,3) на 10000 пар нуклеотидов. Это может Сыть обусловлено репликацией ДНК, транскрипцией и другими генетическими превращениями и указывает на отсутствие статичности вторичной структуры ДНК и ее функциональную актив-ность( J. Frenster, 1976; Г. П. Жилина, 1983).

Раздел 2. Изучение некоторых физико-химических характеристик липидов цитоплазматических мембран нормальных лимфоцитов; связь процессов пролиферации и дифференаировки с изменениями ненасыщенности липидов лимфоцитов.

Роль мембран в клеточном метаболизме и регуляции жизненно важных процессов определяется их структурной лабильностью. Выявление кснформационных изменений в процессе функционирования мембран в норме позволяет судить о структурно-молекулярных особенностях составляющих их компонентов? Л. Д. Бергельсон. ispn.

Для определения физико-химических характеристик липидов и белков цитоплазматических мембран Еажными являются методы после -дования динамических свойств структурных элементов; спикоьые зон ды,Н-ЯМР спектроскопия). Последний метод основан на изучении молекулярных перестроек важнейших звеньев мембранной системы -липидов. Фосфолипиды,в которых диффузионно протекают метаболические процессы, тип,степень насыщенности,длина цепей имеют существенное значение для нормального функционирования мембране R. Gi 11,1980, Е. К. Fi cher, 1984). Дискутируется вопрос о возможной корреляции функциональных свойств клеток,пролив рации и диф-ференцировкя их с изменениями лйпшгоб мембране M. A. Kl aus, 1934. В. А. Ляшенко, 1933) -, показано участке липидов внутриядерных мембран в регуляции синтеза дтп'.; а. б. Алесен ко,1937); основой нарушений биосинтеза РНК и дифферАНЦировки клеток могут стать молекулярные перестройки фосйолипизоЕ ь мембра-не(И. М.Молотковкая,1935).

2.1. Липидный состав цитоплазматических мембран îkvw-h достаточно подробно традиционными биохимическими м&т.чзами! Ленинд-жер, 1983). Исходя из положения о лимфоцитах Лак о клетках дифференцированных со способностью к пролиферации и для -.ценки молекулярных перестроек их мембран .было проведено исследование ди-

намического состояния мембранных липидов методом Н'-ЯМР спектроскопии высокого разрешения на частотах 250 и 360 Mr. Использовали ЯМР-фурье спектрометр фирмы Брукер. При изучении модельных и биологических мембран^. Fi nner, 1971; T. Yamer, 1975) было показано, что сигнал с химическим сдвигом 0,89 обусловлен протонами метальных групп жирнокислотных цепей липидов,сигнал при 1,3-протонами метиленовых групп тех же цепей, сигнал-3,21-протонами метальных групп полярных головок фосфатидилхолина.

Спектр нормальных лимфоцитов обусловлен липйдами цитоплазма-тической мембраны, обладающими определенной подвижностью. Для характеристики мембран использовали параметры Р0.89 и Р3,2, равные отношению амплитуд сигналов протонов групп СН}И /С1^/^Р0,89 и N' (CHj^k /сн2/п.-

/ -Р3,2. Выбранные сигналы протонов разных химических групп отражают различия в липидном составе,являясь косвенной характеристикой подвижности мембран;интенсивность сигналов определяется долей соответствующих протонов,находящиеся в расторможенном состоянии. Нами получено,что сигнал протонов групп/СН / с химическим сдвигом 1,3 имеет ширину на половине высоты= бОМг. Практически, все экспериментальные точки попадают в строго ограниченную зону, принадлежащую результатам .полученным от нормальных лимфоцитов(рис. 1). Все сигналы спектров не изменяются в интервале t= 15-50 С. Пробы от одного и того же донора,взятые в разное время суток и года,незначительно разнятся и укладываются в названную графическую область. Возраст и пол доноров не влиют на параметры спектрограмм. Спектры 1Н-ЯМР некоторых нормальных лимфоцитов сравнимы со спектрами пролиферирующих клеток в модельных опытах(С. tountford, 1982), что служит экспериментальным подтверждением гетерогенности популяции нормальных лимфоцитов крови и их бифункциональности. Определение спектральных особенностей различных химических групп липидов мембран клеток проводили без предварительного разрушения лимфоцитов,в нативном состоянии.

2.2. Изучение ненасыщенности липидов клеток и плазмы крови доноров. Гетерогенность по химическому составу липидов предполагает наличие неоднозначного количества ненасыщенных жирных кислот, дающих основной вклад при"определении суммарного числа двойных связей. По литературным данным структурные нарушения жирных

кислот приводят к изменениям функциональных свойств клеток'G. Р. Martin, 1931), в свою очередь, функциональная активность нормальных лимфоцитов влияет на молекулярные перестройки липидов мембран.Измененное динамическое состояние липидов может привести к переключению клеточного метаболизма на пролиферацию или диффе-ренцировку( М. Chi esi nger, 1977).

Нами показано наличие лимфоцитов с определенной динамической подвижностью мембран( Н'-ЯМР спектроскопия) и достаточно активным синтезом ядерных нуклеиновых кислот в них(авторадиография с НЗтимидином и НЗ уридином). Для установления взаимосвязи проли-феративных процессов, происходящих в популяции лейкозных лимфоцитов, с изменением ненасыщенности жирных кислот липидов клеток и плазмы крови применялся метод озонирования (совместно с Т. И. Позняк.Е. Е Киселевой и Д. М. Лисициным). Нами была изучена суммарная ненасыщенность жирных кислот лимфоцитов и плазмы крови методом озонирования липидов. Измерения проводили на анализаторе двойных свя8ей( АДС-5).озонограммы характеризуют количество поглощенного озона в образце,которое соответствует числу двойных связей(ДС) ненасыщенных жирных кислот(НЖК), пребывающих как в свободном состоянии,так и в составе липидных комплексов. Единица измерения ненасыщенности липидов-моль ДС/мл( молекулярная масса фрагмента углеводородной цепи ЖК, где находится одна ДС). Количество двойных связей липидов плазмы крови доноров колеблется от 240 до 280 (255+/-11,0)условных единиц,не зависит от пола и возраста. Число двойных связей НЖК липидов лимфоцитов находится в пределах 80-100(90+/-4,0) усл. ед. (табл,3). Колебания ненасыщенности липидов клеток в норме,возможно,отражает их бифункциональное^ которая, по данным литературы,в свою очередь может приводить к изменениям структуры липидов, влияющую на активность ряда мембранных ферментных систем,ответственных за синтез белков,нуклеиновых кислот и др. клеточных структур/В.. А. Ляшенко, 1988/.

2. 3. Проведена серия экспериментов по изучению ненасыщенности жирных кислот липидов различных групп лимфоцитов,полученных с применением фиколла и перколла( табл. 41. При увеличении размера клеток не наблюдается изменений в количестве ДС НЖК липидов,т. к. в физиологически нормальных услобиях процессы трансформации цир-

кулирующих лимфоцитов, сопровождающиеся увеличением размера клеток, протекают адекватно молекулярным перестройкам структуры ЖК липидов. На краткосрочной культуре лимфоцитов^72 час.) с добавлением ФГА исследовали корреляцию изменений ненасыщенности липидов и проходящей трансформации клеток. При сравнительном анализе самый высокий показатель числа ДС НЖК липидов обнаружен в группе малых лимфоцитов,в них под действием митогена начинается процесс бласттрансформации, приводящий, по литературным данным(Ф. Хей-хоу/1963/, последовательно к увеличению синтеза РНК и репликации ДНК. Очевидно,в это же время происходят изменения ненасыщенности липидов лимфоцитов,что согласуется с результатами, полученных в модельных опытах (А. К. Давыдова, 1973, В. А. Ляшенко,1988) и на клиническом материале^. Мегип, 1983). Уровни кенасыщенности липидов полученных РНА-бластных клеток и больших лимфоцитов крови практически идентичны,что является подтверждением сравнимости изменений ненасыщенности липидов клеток при идущх пролифератизных процесах в нормально функционирующем большом лимфоците ин виво и бласттран&формированной нормальной клетке ин витро. Установленный факт подтверждает связь пролиферативных процессов, происходящих при бласттрансформации при воздействии РНА на клетки, с изменениями числа ДС НЖК липидов лимфоцитов.

2. 4. Установлено уменьшение числа ДС НЖК липидов клеток(2-4 раза) при действии на них фиколла и перколла по сравнению с необработанными лейкоиитами(табл. 4). Это происходит на фоне изменения морфологии клеток в связи с уменьшением их размеров на 1-2микр. в каждой исследуемой группе лимфоцитов. Результаты согласуются с данными 31иаг1:"а и 1.31 шрзоп"а(1970) .что может иметь значение при исследованиях поверхностнорасположенных комплексовГлипид-белковых,иммуноглобулинов и пр.)

Раздел 3. ?ймплексная характеристика процессов пролиферации и дифференцировки в популяции лимфоцитов лимфоузлов и крови больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Гемобластозы человека-многостадийный процесс,при котором под действием лейкомогенных факторов( канцерогены,онковирусы, радиация и пр.) повреждаются, кроветворные костномозговые клетки-мише-ни( А. И. Воробьев, 1976; Р. Е. Кавецкий.З. А. Бутенко, 1978,1984; Ф. 5а-йалкоу,¡983). Существующие теории происхождения гемобластозов че-

¿овека подчеркивают начальные молекулярно-генетические изменения в стволовых или коммитированных клетках костного мозга( родоначальниках патологически трансформированного клона). В норме гемо-поэз поликлонален,обеспечивая многообразие и полноценное функционирование кроветворных клеток; при лимфопролиферативных заболеваниях в результате злокачественной трансформации процесс становится практически моноклональным( Е. A. MacCul 1 och, 1979; J. Senn 1980;А. И. Воробьев, 198В);происходит доминирование патологиче ского клона,а его взаимодействие с другими клетками приво дит к угасанию нормальных клонов. Сейчас известны некоторые морфологические, иммунологические и функциональные признаки нормальных и лейковных лимфоидных клеток,выявленные на определенных стадиях их развития или отдельных фазах клеточного цик-ла( D. Me teal f, 1971; И. R Когарко, 1970,1979,1988; Д. Ф. Глузман 1932; 3. А. Бутенко,1987) ,что можно использовать для уточнения происхождения трансформированных клеток и для классификации отдельных форм лейкозов. В результате нестабильности злокачественных клонов осуществляется эволюция,сопровождающаяся изменениями их свойств и прогрессией процесса(И. Ф. Сейц, 1986, Ю. Б. Бахтин, 1937 и др.). Лейкозныв клетки образуется из малодифференцированных,способных к пролиферации,находящихся в клеточном цикле, активно синтезирующих нуклеиновые кислоты кроветворных и лимфоидных клеток, которые легче осуществляют перепрограммирование генома. При этом частично сохраняются нормальные стволовые клетки. Предполагается при лейкозе увеличение способности клеток к имплантации в лимфоидные и др. органы и их ускоренный перенос,в результате чего диагностика осуществляется только на этапах генерализации процесса(А. И. Воробьев, 1987). В зависимости от происхождения клеток-предшественников, степени дифференцировки и нахозвдения их в различных фазах клеточного цикла возникают разные формы лейкозов. Предполагаем, что морфологические,иммунологические, цито- и биохимические нарушения в лейкозных клетках являются вторичными, зависимыми от первоначальных изменений генома в клетках-предшественниках; злокачественно трансформированные лимфоидные клетки сохраняют обычно ^нотипические особенности исход ных нормальных клеток-мишеней.

Хронический лимфолейкоз!" XJUI)- заболевание, при котором наблюда-

ются незначительные хромосомные нарушения в лимфоцитах, находящихся на ранних этапах клональной эволюции(D.Newel, 1978)¡обнаружена моноклональная пролиферация Т- или В клеток,которые в эксперименте могут быть доведены до стадии плазматических (G. Parker, 1979); это-уникальный об"ект исследования процессов злокачественного перерождения клеток, т. к. лейкозной трансформации подвергаются сами лимфоидные клетки,являясь субстратом дальнейшей прогрессии заболевания. Молекулярно-генетические изменения приводят к нарушению или блоку дифференцировки на различных уровнях и появлению трансформированных лимфоцитов,способных к длительному самоподдержанию. Нарушения процессов рециркуляции Т и В клеток на разных стадиях созревания,структурные изменениях их мембран,ведут к резкому и устойчивому увеличению общего числа лейкоцитов и лимфоцитов крови. Предполагаем,что при лейкозной трансформации клеток в патогенеза ХШ1 основное значение имеют генетические нарушения,приводящие к дедифференцировке, пролиферации определенных субпопуляций лимфоцитов,"долгожительству" и накоплению лейкозных клеток в крови и лимфоидных органах. Все остальные перестройки различных клеточных систем являются их следствием, вторичны и могут быть необходимы лейкозным лимфоцитам для реализации жизненной программы.

3.1. Получены экспериментальные данные, выявляющие изменения в ядре и цитоплазматической мембране лимфоцитов при их лейкозной трансформации при применении комплекса современных цитохимических, физико-химических и радиоизотопных методов.

Для характеристики лейкозной популяции и различных групп лимфоцитов лимфоузлов и крови при ХЛЛ предложена модификация метода Браше,позволившая выделить по морфологическим критериям группы лимфоцитов,показать гетерогенность лейкозной популяции и выявить, что морфология клеток отражает процессы пролиферации и дифференцировки в них. Установлена идентичность процентного соотношения групп лимфоцитов в лимфоузлах и крови в начальной стадии и прогрессии ХЛЛ,отсутствие различий с нормой,что свидетельствует о сохранности морфологических свойств клеток и процесса рециркуляции при их лейкозном перерождений табл. 1).

В популяции преобладают лимфоциты средних • размеров!' 44^-58%) , малые -составляют 30%-35%,большие-10%-12~,что сог-

ласуется с литературными данными! М. Bessi s, 1933; G. 011 а, 1935). Малые лимфоциты чаще являются более "зрелыми" клетками (по данным световой и электронной микроскопии,И. Е Когарко,1970; К. П. Зак, 1980, Г. И. Козинец, 1985). размер клеток и ядер увеличен по сравнению с нормой в каждой группе: для малых-на 2-Змикр. , сред-них-на 3-4микр. ,больших-в 1,5-2 раза( лимфоузлах и крови идентично) . Присутствие тех же Групп лимфоцитов при лейкозе служит экспериментальным подтверждением сохранности морфологической стадийности при ХЛЛ Неизменность соотношений разных групп лимфоцитов в норме и при ХЛЛ и идентичность по относительному количеству клеток в группах лимфоцитов лимфоузлов и крови может свидетельствовать о сохранности процесса рециркуляции лимфоцитов.

3.2. Для оценки процеЬса пролиферации всей популяции и различных групп лимфоцитов при лейкозе,наряду с морфологическими,были использованы радиоивотопные методы- авторадиография нуклеиновых кислот с меченными предшественниками -НЗ тимидином и НЗ уриди-ном.

При введении НЗ тимидина- 0,7+/-0,1% клеток лимфоузлов и 0,5+/-0,1% клеток крови активно синтезируют ДНК, что говорит о снижении числа ДНК-синтезируюших лимфоцитов почти в 10 раз по сравнению с нормой(табл. 1). Это согласуется с данными литерату-ры( Л. Е Липчина,1967; F. Hayhoe, 1983; P. Dormer, 1986). Необходимо при этом учитывать установленную гетерогенность популяции лимфоцитов при лейкозе и нахождение различных по зрелости клеток в разных фазах клеточного цикла. Были изучены отличающиеся по зрелости группы л4йкозных лимфоцитов: среди больших лифоцитов - 4+/-0.2Z клеток лимфоузлов и 3+/-0.1Z клеток крови активно пролифериру-ют;средние лимфоциты крови и лимфоузлов в 0,4Z синтезируют ДНК. Установлено увеличение интенсивности синтеза ДНК в меченых клетках(на фоне уменьшения числа включающих НЗ тимидин лимфоцитов)^ больших лимфоцитах определяется 70-t-/-0,4 гранул - для клеток лимфоузлов и 40+/-0,3-для клеток крови; средние лимфоциты содержат 27+/-0,Згранул для клеток лимфоузлов и крови. Клетки большего размера активнее синтезируют ДНК; наблюдается линейная зависимость мевду увеличением размера лимфоцита( мерой незрелости) и интенсивностью синтеза ДНК в лейкозных клетках. Усиление биосинтеза ДНК идет за счет укорочения фазы S клеточного цик-

ТАБЛИЦА. I

СОСТАВ КЛЗТОЧНОЛ ПОПУЛЯЦИИ И БИОСИНТЕЗ ДЦЕЯЖ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ЛИМФОЦИТОВ ЛИМФОУЗЛОВ

И КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ Ш,<ЖШЕдК03Е / в % , М ± м /

Исслед. материал Состав клеточной популяции /в % Индекс мечения по ■ ' Н3 урвдинт / % мечен.клет./ Интенсивность меченая Н3ури-дшом/ гр.-кл./ Индекс мечения по 1{ {Зтимидину / % ма-' 1ен. кл./ 1нтенсивность ве-чения НЗтимиди-ном/гр.-кл./

тшщ-ты Бол. Оредн, Мал. Ш попу-ляц. Б. С Р. ы ал. Лдя попу-ляц. Б. Ср. М. № пу-ляц. Б. Ср. м. Бол. Средн. Мал.

ЛЖЬОУУ-ЛА В НОР МЕ 12,6 +0,1 57,0 ±0,3 30,0 ± 0,2 51,0 ±0,3 55,4 ±0,1 54,5 ±0,1 47,0 ±0,2 5,0 ь0,2 № б.о к,о 8,0 ±0,7 24,0 8,0 ±01 0,4 42,0 ± 0,Е 15,0 ±0,1 3-4

)1имфоуз-ла больного в НАЧАЛЬН. СТАЮ® 12,0 ± ф 58,0 ±0,2 30,0 ±0,3 69,0 ±1,2 89,0 ±0,1 75,0 ±0,9 52,0 ±0,2 [2,0 Ь0.1 24,С ±0,3 8,0 ±02 5,0 ±0 О,1! 3 ±ф 4,0 ±02 0,4 ±03 70,0 ±0,4 27,0 ±0,4

Лимфоуз_ ла сольного при ПРОГРЕС. БОЛЕЗНИ 14,0 ±0,3 48,0 ±0,3 38,0 ±0,3 75,0 ±1,1 98,0 ±0,2 89,0 ±0,1 65,0 ±0,5 [3,0 ±0,8 33,0 ±0,3 130 5,0 0,5 ±01 3,0 ±01 0,3 ±01 72,0 ±0,2 13,0 ±0,5 —

КРШИ практиче ски здор. доноров 3,0 49,0 ±0,5 43,0 ±0,4 48,0 ±0,5 54,0 ±0,1 52,0 ±0,1 43,0 ±0,2 1,0 ^02 3,0 5,0 ±Ф; 4,0 ±01 3,5 ±¿3 19,0 ±01 4,0 ±02 ■ 20,0 ±0,5 10,0 ±0,5 —

крови больного НАЧАЛЬН. СТАДИИ 13,0 ±0,3 44,0 ±0,2 43,0 ±0,2 70,0 86,0 ±0,3 70,0 ±0,1 55,0 ±0,2 [5,0 20,0 ±0,2 1ф ±01 6,С ±ф 0,5 ±02 3,0 ±с£ 0,4 ±Ц2 40,0 ±0,3 25,0 ±0,1

Крови больного при ПРОГ-ЕЕС.БОЛЕЗ НИ 12,0 ±0,4 44,0 ±0,3 44,0 ±0,5 72,0 ±1,4 100 80,0 ±0,3 60,0 ±0,1 Ю,0 к),9 32,0 ±0,2 15р ч? 7,С ±03 0,4 ±03 3,0 ±С£ 0,3 ±0* —• 44,0 ±0,5 12,0 ±0,4 —■

ла,что согласуется с литературными данны-

ми( Р. БаУоэЮ, 1964, Р. Нау1чое, 1933), но наряду с абсолютным возможно относительное укорочение синтетической фазы за счет удлинения других периодов клеточного цикла. Итак,в начальных стадиях ХЛЛ для всей популяции и разных , отличающихся по зрелости, групп лимфоцитов присуще определенное число активно синтезирующих ДНК клеток,в которых ,по сравнению с нормой,интенсивность синтеза ДНК увеличена в 2 раза.

3. 2а. Получены результаты также по сравнительному изучению биосинтеза ДНК лимфоцитов лимфоузлов и крови, в норме и при лейкозе. В лимфоузлах больных число синтезирующих ДНК клеток примерно в 1,5 раза выше,чем для клеток крови. Процентное отношение в группах больших и средних ДНК-синтезирующих лимфоцитов одинаково для лимфоузлов и крови; интенсивность синтеза ДНК в больших лимфоцитах лимфоузлов увеличена вдвое,сравнительно с кровью,а среди средних лимфоцитов-она идентична для лимфоузлов и крови. При сравнительном анализе в норме и при ХЛЛ наблюдается те же количественные соотношения числа пролиферирующих клеток и интенсивности синтеза ядерной ДНК в них для лимфоцитов лимфоузлов и крови. Предполагается, что при развитии лейкоза процесс биосинтеза ядерной ДНК также интенсифицируется преимущественно в незрелых клетках лимфоузлов и крови, не изменяется их рециркуляция. Наблюдаемые нарушения биосинтеза ДНК в популяции и разных группах лимфоцитов регистрируются в начальной стадии лейкоза,что может служить доказательством дефектности процесса синтеза ядерной ДНК при лимфопролиферации.

3.26. Изучали биосинтез суммарной ядерной РНК для различных групп лимфоцитов лимфоузлов и крови на разных стадиях ХЛЛ. При использовании меченного предшественника РНК-КЗ уридина обнаружено: доля лимфоцитов лимфоузлов и крови,активно синтезирующих РНК,для всей популяции составляет 69+/-1,2% в начале и 75+/-1,3%-при прогрессировании заболевания^ табл. 1). Большие лимфоциты лимфоузлов в 39+/-0,1% и крови в 85+/-0,3% активно синтезируют РНК в начале болезни и в 96+/-0,1%-100%-при прогрессии ХЛЛ. Средние лимфоциты лимфоузлов и крови синтезируют РНК в 7СЯ-/-0,3% в начальной стадии и в 30+/_0,1%-при развитии ХЛЛ. Содержание меченных малых лимфоцитов практически не изменяется по

мере развертывания лейкоза-52+/-0,2^ и 55+/-0.2Х в начале и 65+/-0,5% и 60+/-0,2% при прогрессировании. При исследовании интенсивности синтеза ядерной РНК в популяции и различных группах лимфоцитов лимфоузлов и крови в начальной стадии и. при развитии ХЛЛ показано.что увеличение доли меченных клеток идет параллельно с интенсификацией биосинтеза в них. Для всей популяции , независимо от стадии ХЛЛ и места выделения клеток,интесивность синтеза РНК возрастает е. 3 раза по сравнению с нормой. Для группы больших лимфоцитов лимфоузлов и крови в начале заболевания интенсивность синтеза РНК увеличивается в 4-5 раз,для лимфоцитов среднего размера-в 2-3 раза вне зависимости от стадии ХЛЛ, малые лимфоциты практически не изменяют интесивность синтеза РНК,что согласуется с литературными данными С. Раска(1981)по минимальному изменению синтеза РНК в ядрышках зрелых(малых) лимфоцитов и уменьшению синтетической активности ядерной РНК при созревании клеток. Кроме того,по данным литературы, увеличение размеров ядра и клеток приводит к изменению ядерно-цитоплазматического отношения, усилению синтеза ядерных ДНК и РНК(Р. НауЬое,1983). По нашим данным прирост наиболее активно синтезирующих РНК клеток преимущественно про исходит за счет лимфоцитов большого размера(менее зрелых), показана линейная зависимость увеличения индекса метки в популяции и числа больших меченных клеток в начале и при прогрессировании заболевания,что предполагает активацию у этой части лимфоцитов определенных биосинтетических процессов при ХЛЛ. 06-нарушна прямая корреляция усиления интенсивности синтеза РНК и увеличения размеров клеток. Интенсификация суммарного ядерного биосинтеза РНК в трансформированных лимфоцитах может являться подтверждением генетических перестроек при их лейкозном перерождении.

3. 3. Представляется перспективным сочетание методов,позволяющих исследовать особенности метаболической активности отдельно взятых из лимфоузлов и крови клеток с экстраполяцией результатов на бою популяцию лимфоцитов. Одновременно изучали суммарный • синтез ядерных ДНК и РНК в одних и тех же лимфоцитах и определяли характер изменений пролиферативного процесса при развитии ХЛЛ,что стало возможным при комбинации морфологического и авторадиографического методов о добавлением ин витро в клеточную по-

пуляцию НЗ тимидина и НЗ уридина. Установлена гетерогенность популяции лимфоцитов лимфоузлов и крови в начальной стадии ХЛЛ обнаружена популяция клеток,активно пролиферирующих, синтезирующих ядерные ДНК и РНК; и популяция-активно синтезирующая РНК,но не включающая НЗТ.

3.3. а. При исследовании клеток,активно пролиферирующих (большого и среднего размера),обнаружены изменения в биоси нтезе ядерных ДНК и РНК -значительному увеличению интенсивности синтеза РНК соответствует малое изменение синтеза ДНК(лимфоциты лимфоузлов и крови в начале лейкозного процесса. Предполагается, что интенсификация биосинтеза ядерной РНК является выражением усиленной транскрипции в клетках определенных генов для реализации синтеза специфических белков,что согласуется с данными литерату-ры(и. Тоге11 у, 1966, Э. <3иаё11 по, 1983) по усилению синтеза РНК в лейкозных лимфоцитах в связи с увеличении белкового синтеза в них,высокой активности синтеза РНК в незрелых В-лимфоцитах и интенсификации белкового синтеза в плазматических клетках. При прогрессировании ХЛЛ обнаружены немногочисленные лимфоциты с интенсивным синтезом ДНК и РНК,характеризующиеся морфологией незрелых клеток,большими размерами и являющиеся наименее зрелыми клетками лимфоузлов и крови,за счет которых идет дальнейший рост популяции при прогрессировании ХИЛ.

3. 3. б. Популяция лимфоцитоь, активно синтезирующая РНК и нъ включающая НЗ тимидин,состоит из клеток,у которых,по-видимому пресинтетическал фазаГЭП и фаза 3 относительно увеличены по продолжительное™' по сравнению о нормальными клетками и лимфоцитами первой группы),что не противоречит данным литературыС Ь. Лай-та.Б. Воп.:1.1969,Р. Оопгег, 1986). Показано нами усиление суммарного синтеза ядерной РНК практически во всей гетерогенной популяции лимфоцитов лимфоузлов и крови, находящихся в разных периодах ми-тотического цикла при хлл,что согласуется с работами Г. Нау1',о*с 1983:.обнаружившего биосинтез ядерной РНК в лейкозных клетках на протяжении всего интермитотического периода. Обнаружено© нами существование в лимфоузлах и крови нескольких групп лимфоцитов, различных по включению НЗ тимидина , подтверждается данными литературы.' д. и 111,1982). Временные изменения синтетической и пресинтетической фаз ведут к удлинению всего клеточного

цикла,что,мы предполагаем,может быть одной из причиной "долгсжи-тельства"и накопления лейкозных лимфоцитов.

При сравнении с нормой выявлен однотипный характер изменений процессов пролиферации в клетках лимфоузлов и крови в начальной стадии и при прогрессировании ХЛЛ. Как и в норме,определены лимфоциты, активно синтезирующие ядерные ДНК и РНК. Обнаруженная такого рода немногочисленная популяция лимфоцитов(с интенсивным синтезом ДНК и короткой 3 фазой)является субстратом,за счет которого прогрессирует лимфопролиферативный процесс. С увеличением размеров клетокС уменьшением зрелости их) при ХЛЛ,как и в норме, увеличивается интенсивность синтеза ядерных нуклеиновых кислот, что может свидетельствовать о подобности корреляции морфологической трансформации и процессов биосинтеза нуклеиновых кислот в норме и при лейкозе. Однако,усиление интенсивности синтеза ДНК в 2 раза в менее зрелых,чем в норме,больших лимфоцитах предполагает повышение биосинтеза ДНК, характерное развитию ХЛЛ.

Очевидно,что в основе злокачественной трансформации лимфоцитов при лейкозе,исходя из моноклональной гипотезы, лежат нарушения процессов пролиферации и дифференцировки их,что подтверждается полученными нами экспериментальными результатами. По данным литературы такого рода изменения могут происходить при блоке дифференцировки в лимфоидной клетке-мишени,которая может находиться в разных фазах клеточного цикла и давать развитие патологическому клону/3. А. Бутенко, 1984/. Отсюда-возможная гетерогенность популяции лимфоцитов по степени дифференцировки, обнаруженная нами.

3. 4. Получены данные о наличии лимфоцитов лимфоузлов и крови при ХЛЛ на разных стадиях дифференцировки и прослежена взаимосвязь процессов пролиферации и дифференцировки в них. Был применен комплекс физико-химических методов-сканирующей микроспектроцито-метрии и радиоизотопии с меченными предшественниками нуклеиновых кислот.

а. Определяли содержание и интенсивность синтеза ДНК в клетках, принадлежащих различным группам лимфоцитов в начале и при прогрессировании заболевания. В группе малых лимфоцитов преобладают клетки с содержанием ДНК около 2с(как и в норме). Б группах средних и больших лимфоцитов происходит статистически значимое

увеличение доли клеток с относительно высоким содержанием ядерной ДНК: для средних- 62+/-0.5Х гипердиплоидных клеток с увеличением числа триплоидных и гипертриплоидных;для больших- увеличение числа гипердиплоидных и триплоидныхГ25+/-0,3% вместо 7+/-0,1%в норме)и появление тетраплоидов. Изменения содержания ядерной ДНК среди равных групп лимфоцитов идентичны для клеток лимфоузлов и крови при ХЛЛ. (рис2)Очевидно , при развитии лейкоза происходит увеличение числа незрелых лимфоцитов с относительно высоким содержанием ядерной ДНКГпроцесс дедифференцировки клеток) . Параллельно наблюдается интенсификация биосинтеза ДНК в меченных НЗ тимидином клетках,которые относятся к гипер триплоидам и располагаются в двух интервалах синтетической фа-8ы(3,6с-3,9с;3,9с-4,2с) б отличии от трех интервалов их нормальных аналогов. При прогрессировании лейкоза продолжается увеличение доли клеток с высоким содержанием ДНК в группах больших и средних лимфоцитов: среди средних- в 70+/-0,4% обнаружены гипердиплоидные и триплоидные клетки; среди больших- наростание количества гипертриплоидов и тетраплоидов,причем меченными по НЗ ти-мидину оказались клетки в интервале 3 фазы и в постсинтетическом периоде-3,9с-4,2с с интенсивностью синтеза ДНК более 70 гранул на клетку. Прогрессия ХЛЛ сопровождается дальнейшим снижением дифференцировки клеточной популяции,по-видимому, с измененными по продолжительности фазами 3 и вФСмечение НЗ тимидином характерно не для всех незрелых клеток),что является выражением нарушений процесса биосинтеза ядерной ДНК при лейкозной трансформации. Следовательно,при развитии лейкоза показано наличие мало дифференцированных клеток с высоким содержанием ядерной ДНК,не включающих НЗ тимидин, и немногочисленная популяция лимфоцитов с высоким содержанием и интенсивным синтезом ядерной ДНК, что может служить характеристикой гетерогенности лейкозной популяции и свидетельствует о взаимосвязи степени дифференцировки и биосинтеза ядерной ДНК в клетках при ХЛЛ.

б. Изучен вопрос о соотношении содержания ДНК и интенсивности синтеза суммарной ядерной РНК в одних и тех же лимфоцитах,характеризующихся высоким содержанием ДНК,не включающих НЗ тимидин,с интенсивным синтезом РНК. Такие клетки составляют основную массу лейкозных лимфоцитов при ХЛЛ. Оказалось.что малые лимфоциты,явля-

ясь диплоидами.в 50+/-0.5" активно синтезируют РНК(идентично для клеток лимфоузлов и крови);в средних и больших лимфоцитах проявляется четкая тенденция повы шения интенсивности синтеза РНК в связи с увеличением количестваДНК. Вычисленный по экспериментальным данным коэффициент корреляции г(характерезующий близость точек к теоретически предполагаемой прямой) равен 0,96 для начальной стадии лейкоза , 0,97-при прогрессии заболевания и 0,87-для нормы. При этом угловой коэффициент этой линейной зависимости оказался равным 7,04 для начальной стадии ХЛЛ и 12,7-при прог-рессировании болезни,т. е. при увеличении в начальной стадии пло-идности(содержание ДНК) в лейкозном лимфоците на 1 интенсивность синтеза РНК увеличивается на 7 и 12 гранул на клетку. Наблюдаемая между этими величинами •зависимость очевидно выражена намного сильнее в период развернутых проявлений заболевания. В клетках такого типа .вероятно, процесс биосинтеза ядерной ДНК более продолжителен по времени,по сравнению с нормой,а биосинтез РНК активизирован.

На модели отдельно взятых клеток лимфоузлов и крови при ХЛЛ дан сравнительный детальный анализ различных групп лимфоцитов по количественному содержанию ядернойДНК и соотношению биосинтеза ядерной 'РНК,по плоидности клеток и процесса биосинтеза ядерной ДНК в них,в результате - установлена гетерогенность популяции лейкозных клеток по этим параметрам, что важно для определения доли пролиферирующих и количества дифференцированных лимфоцитов в начале и при развитии ХЛЛ.

в. Обнаружено незначительное количество средних и больших лимфоцитов, активно синтезирующих ядерные ДНК и РНК с определенной интенсивностью синтеза и находящихся в интервале от 3,6с до 4,5с. Показано,что,по сравнению с нормой,совместный синтез ядерных нуклеиновых кислот при лейкозе происходит в других интервалах синтетической фазы,отличаясь своей,присущей каждому интервалу интенсивностью синтеза ядерных ДНК и РНК. У такого рода клеток идет,по-видимому,укорочение Фазы 3,которое может.быть,как абсо лютным,так и относительным ,за счет удлинения других фаз клеточного цикла,что согласуется данными литерату-ры( 3. Ю11 ¡пап, 1969;, Р. Нау1~юе, 1933). На удлинение (фазы 01 указывает • появление клеток,активно синтезирующих РНК,с плоидностью около

2с при одновременном отсутствии включения НЗ тимидина. Лимфоциты с высоким содержанием ДНК( Зс-3,6с), на,; включающие НЗ тимидин и синтезирующие яде рную РНК,представляются клетками задерживающимися в 3 фазе или выходящими из нее,что согласуется с данными И. Блока и К. Гольдмана( 1935),определившими факт нарушения при лейкозах синтеза гистонов( удлинение по времени),ведущего к торможению репликации ДНК. Лимфоциты с содержанием ДНК 3,9с-4,5с, с активным синтезом РНК. при отсутствии включения НЗтимидииа могут считаться клетками,задержавшимися 3 или 02 фазах,что указывает на удлинение и постсинтетического периода клеточного цикла. Все обнаруженные изменения процессов пролиферации и дифференцкров-ки,включая гетерогенность лимфоцитов,характерную ХЛЛ, являются экспериментальным подтверждением нарушений,например,блока диффе-ренцировки у клеток-мишеней в нескольких фазах жизненного цикла^, 3,02), что описано в работах с при менением злектронномик-роскопических и биохимических методовСМ. Н. Блинов, 1975, К. П. 3ак,3. А. Еутенко, 1985, И. Ф. Сейц 1986). Установленное нами удлинение. некоторых фае клеточного цикла,приводящее к увеличению всего жизненного цикла лимфоцитов,служит экспериментальным доказательством "долгожительства" лейкозноизмененных клеток. Нахождение большинства лимфоцитов в пресинтетической фазе является экспериментальным подтверждением возможности процес са рециркуляции долгоживущей популяции лейкозных клеток при ХЛЛ, т. к. по литературным даннымС А. И. Воробьев, 1982,3. А. Бутенко, 1984) только лимфоциты в пресинтетической фазе способны к рециркуляции.

Раздел 4. Особенности нестабильности структуры ядерной ДНК лимфо цитов при ХЛЛ.

Еще одним экспериментальным подтверждением важнейшей роли перестроек генетического аппарата лимфоцитов при раз витии лейкозов является обнаруженная нестабильность ядерной ДНК лимфоцитов. Сравнительное исследование ДНК клеток при ХЛЛ проводилось кинетическим формальдегидным методом высокой чувствительности,позволяющим регистрировать наличие одного изменения в структуре ДНК на 100С0 пар нуклеотидов. Установлено для лимфоцитов крови больных вне зависимости от стадии заболевания значительное повышение числа таких участков цеспирализации ядерной ДНК. В начале и при прогрессии ХЛЛ количество нарушений возрастает в 2-10 рав по

Таблица 2

Показатели нестабильности вторичной структкры ДНК лимфоцитов крови больных хроническим лимфолейкозом на разных стадиях и в курсе химиотерапии (М±ш)

Груша больных Кол-во больных Кол-во лейкоцитов, »10 /л Кол-во лимфоцитов, »10 /л I Препарат -3 -1 J*10 мин 1 ±Sx Кол-во ОР на 20 т.п.н.

I 11 70+4,4 б2±4;8 - 5,2±0,6 0,16

II 7 171±82 154±7,1 Хлорбутин 6,4±0,6 0,43

8 15316,1 145±ф Циклофосфан 5,6±0,7 0,32

1 162 152,3 Пафенцил 2,6±0,3 0

III 7 861^4 79±7,1 Хлорбутин 3,5±0,5 0

4 73±65 66±53 Циклофосфан 3,6±0,5 0,12

2 30±7 26±7 Циклофосфан+ 3,0±0,5 0

1 +винкристин 2,6±0,3

87 81,8 Пафенцил 0

2 68±ЗР 62±2,6 Циклофосфан 8,6±0,4 0,30

норма 30 6,8±0,5 22±5,6 - 0,6±0,3 -

I группа - начальная стадия заболевания, излеченные

II группа - стадия развернутых клинических проявлений болезни в курсэ химиотерапии

III группа - стадия развернутых клинических проявлений болезни по окончании курса лечения

сравнению с нормой(табл2 /,что свидетельствует о дестабилизации ДНК при развитии лейкоза и согласуется с данным литерату-рь^К. А. Авакян,1979; Г. П. Жижина,1986) Причинами таких изменений ДНК могут быть локальные конформации,разрывы сахаро-фосфатных цепей и пр. Нами методом горизонтального электрофореза в 0,4% агаровном геле установлен факт отсутствия одноцепочечных разрывов структуры ядерной ДНК лимфоцитов в начальной стадии и при развитии лейкозаСбез применения химио терапии).Б начальной стадии ХЛЛ обнаружено 5-10 кратное увеличение числа деспирализован-ных участков в ДНК/от 5,9 до 9,5.10 мин,7,2+/-0,5*10 мин ) и отсутствие корреляции количества обнаруженных дефектов с увеличением общего числа лейкоцитов,содержанием лимфоцитов,их жизнеспособностью и временем,прошедшим от первичного установления диагноза. Полученные на начальных стадиях лейкозной трансформации результаты свидетельствуют о возникающей нестабильности ядерной ДНК лимфоциов при ХЛЛ и подтверждают выдвинутую гипотезу об определенной роли генетических нарушений при возникновении и развитии лейкоза,что согласуется с литера турными данными( Л. Кол-линс,1982; Н. А. Федоров, 1983). На стадии кли нических проявлений заболевания без проведения химиотерапии (табл. 2) получены идентичные с начальной стадией'показатели нестабильности ДНК: число измененных участков колеблется от 4,9 до 8,3.10 мин (.6,9+/_0,1*10 мин. ).В дальнейшем обнаружена линейная зависимость между повышением числа измененных участков ДНК лимфоцитов и на-ростаюшим лимфоцитозом периферической крови'при лимфоцитозе более 80%).

Исследовано воздействие на вторичную структуру ядерной ДНК лимфоцитов химиотерапеБтических препаратов( табл. 2). Через 12 час. после'приема обнаружены нарушения в структуре ДНК лейкозных кле-ток-число измененных участков колебалось от 2,7 до 6,9 на 10 мин (6,0-1-/-0,4*10 мин ),в последуюаемГчерез 2-60 суток) количество таких участков в лимфоцитах уменьшается от 2,5до 4,6.10 мин. (3.4+/-0,1*10 мин ), что свидетельствует о присутствии в крови популяции лимфоцитов с менее дестабилизироваванной структурой ДНК При электрофоретическом исследовании наблюдаются одно- и двуцепочечные разрывы ДНК,что является результатом действия применяемой химиотерапии и согласуется с данными литерату-

ры(Е А. Федоров, 1986). Через сутки после приема препарата регистрируется увеличенное число измененных участков в ДНК,что об"яс-няется повышенным исходным уровнем числа деспирализованных участков ДНК в лейкозных лимфоцитах и присоединившимися нарушениями в результате действия химиотерапии. Уменьшение числа лимфоцитов с измененной структурой ядерной ДНК у больных,леченных 2мес. тому назад,предполагает химиотерапевтическое воздействие на часть клеточной популяции с менее стабильной структурой ДНК; оставшиеся лимфоциты характеризуются меньшим числом измененных участков в структуре ДНК,в это а» время наблюдается улучшение клинико-гема-тологических показателей леченых больных. В более отдаленные сроки после химиотерапии; бмес. -1-3 года) наблюдается увеличение числа измененных участков е структуре ДНК лимфоцитов(8,2-10,0 наЮ мин . '1 и отсутствие одно цепочечных разрывов ДНК; преобладает популяция лейкозных лимфоцитов о повышенным числом деспирализованных участков ДНК,что не влияет на жизнеспособность и продолжительность жизни клеток. Обнаруженная нестабильность структуры ядерной ДНК лимфоцитов показана на начальных стадиях ХЛЛ и не изменяется с прогрессирюванием заболевания,что,согласно монокло-нальной теории, предполагает возникновение такого рода изменений ДНК на уровне предшественников- клеток-мишеней,за счет которых в дальнейшем идет формирование лейкозной популяции с характерными, обнаруженными нами.изменениями структуры ядерной ДНК. Предполагается, что присутствие деспирализованных участков в ДНК лейкозных клеток необходимо для согласованного функционирования генетической и метаболической систем лимфоцитов и поддержания специфического гомеостаза клеток.

Раздел 5. Особенности изменений липилсе цитоплазматических мембран лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных заболевай;!;1;: изучение суммарной ненасыщенности жирных кислот ¿ипилок плазмы и лимФо цитов крови при гемоб-ластозах.

В настоящее время установлено,что процессы опухолевой трансформации тесно связаны с биохимическими и молекулярными перестройками цитоплазматических мембран клетокС Г. '.'аггеп, 1930, Л. Д. Бергельсон, 1932, Е. Б. Бурлакова, 19351. Мембраны лимфоцитов - одна из наиболее важных систем.влиявшая на ¿.уккциокальные свойства кле-

ток,поэтому очевидным становится изучение особенностей молекулярной структуры цитоплазматических мембран в норме и при злокачественном перерождении. При лимфопролиферативных заболеваниях лимфоциты крови,являясь клетками дифференцированными со способностью к пролиферации,осуществляют,по-видимому,лейкозную трансформацию на молекулярно-генетическом уровне,приводящую к изменениям химического состава,структуры и функций мембран.

5.1.Определение динамического состояния липидов цитоплазматических мембран лимфоцитов. Были изучены нативные ' лимфоциты крови больных ХЮ1,злокачественными лимфомами с лейкемизацией.миокорди-том(как заболевания неопухолевого характера с лейко- и лимфоци-тозом).болезни Маркиафава(как заболевания опухолевого генеза с изменениями на уровне эритроцитов). Характер изменений динамического состояния липидов мембран клеток определяли методом Н-ЯМР спектроскопии высокого разрешения на частотах 250 Мг и ЗбОМг. По литературным данным( С. Е. Mountford et al 1,1930,1982) при изучении лимфоцитов периферической крови человека показано,что основной вклад в спектрограмму вносят липиды мембран,обладающие высокой подвижностью; уменьшение подвижности молекул липидов при ли-пид-липидных или липид-белковых взаимодействиях приводят к значительному уширению сигналов вплоть до исчезновения^ JL Д. Бергельсон, 1982). Для характеристики молекулярных изменений липидов использовали параметры Р0,89 и Р3,2(рис. 1).отражающие различия в липидном составе мембран (соответственно протоны метильных и ме-тиленовых групп жирнокислотных цепей липидов и метильных групп полярных головок фосфатидилхолина) и являющиеся по данным И. М. Молотковской( 1935) косвенной характеристикой их текучести. Интенсивность сигналов определяется долей соответствующих протонов,находящихся в расторможенном состоянии, и числом липид-ных групп- с достаточной подвижностью. Для каждой исследованной патологии обнаружены специфические особенности спектров и найдена гетерогенность,характерная для популяций лимфоцитов всех названных заболеванийГрис. 1). Спектрограммы клеток при миокордите и в норме мало отличаются друг от друга;при ХЛЛ и ЗЛ обнаружены изменения амплитуд названных сигналов и наличие разрешенных сигналов, интенсивность которых,по сравнению с нормой, увеличивается, что указывает на присутствие в мембранах лимфоцитов липидов

Солее высокой молекулярной подвижности. По данным Мэлотковс-койПЭЗЗ) изменения подвижности липидов такого рода,какие были получены на спектрограммах при ХЛЛ,сопровождаются обычно ли-пид-белковыми латеральными сдвигами. Анализ обнаруженных нами изменений б структуре липидов мембран клеток и литературные данные по изменению содержания фосфолипидов( уменьшение в два раза количества холестерола, сфингомиелина и др.) при ХЩ Б. Д. Готфрид, 19711,дают основания предположить возможное увеличение текучести мембран клеток при развитии ЛПЗ. Такие спектрограммы характерны для мембран лимфоцитов на начальных стадиях и не изменяются при прогрессировании ХЛЛ. Химиотерапия не отражается на величине укат занных сигналов; не обнаружено различий в спектрах в зависимости от Еозраста и пола больных,времени суток и года при взятии анализов, что согласуется с данными литературы( С. МошиГог<1,1982). При сравнительном анализе спектрограмм лейкознотрансформированных и Нормальных лимфоцитов обнаружено сужение сигнала протонов групп /СН£ в лейкозных клеткахСсигнал имеет ширину на половине высоты= 32Гц, в норме=60Гц!. Такой характер изменений,возникающих в начале заболевания и не зависящий от прогрессии процесса,может быть вызван структурными перестройками липидов мембран лимфоцитов при их лейкозной трансформации ,что подтверждается работой Д. Фоссе-ла( 1983'). При графическом изображении полученных результатов Г рис. 2) установлены две строго ограниченные,не пересекающиеся области,характеризующие наличие экспериментальных данных для нормы и ХЛЛ. Результаты других опухолевых заболеваний не попадают в названные области и не имеет строго ограниченных, интервалов.

Проведен математический анализ спектрограмм мембран лимфоцитов трех групп-доноров,больных ХЛЛ и злокачественными лимфомами с лейкемизацией; значение различий относительных амплитуд сигналов А1 и А2 служит показателем молекулярной подвижности протонов жирнокислотных цепей липидовГА1) и полярных головок фосфатидил-холинаС А2). Сигналы,полученные от нормальных и лейкозных лимфоцитов? ХЛЛ) отличаются по А1 и не различаются по А2,разность настолько четкая.что позволяет рассчитать оптимальное граничное значение?Ао=0,65)амплитуды А1,необходимое для диагностики ХЛЛ и дифференциальной диагностики ХЛЛ и ЗЛ. В область А1 меньше Ао фиксированы значения спектрограмм при ЗЛ и обнаружена линейная

Рисунок I.

Н*-ЯМР спектр /360 Жц/ лимфоцитов крови больного в начальной стадии ХЛД /I/ и здорового донора /2/.

¡ 4 3 2 1 0 и.д..

- сигнал с хим. сдвигом 0,89 - протоны метшгьных групп жирно-кислотных цепей лшщцов

- при 1,30 - протоны метиленовых групп тех же цепей

- при 2.05 - протоны метиленовых груш, связанных с группами -С1£ в цепи

- при 2,8 - протоны метиленовых групп -СНо/СН^СН/г, меаду двойными связями

- при 3,21 - протоны метальных групп полярных головок фосюо-тидилхолина

- при 5,3 - протоны олефиновых групп, имеющих двойные связи

Рисунок 2.

Параметры спектров Н^-ЯМР лимфоцитов в норме и при различных

лимфопродиферативных заболеваниях. 1-норма,2-хронический. лимфо-

лейкоз, З-злокачественная лимТюма, 4-ПНГ-синдром <

/

/л

¿01

л*.

е. г

е.и

Рп на - отношение г.мшштуд сигналов протонов °»8Э групп СН3 и /СН^

ление аг-щчктуд сигналов протонов пМ /СНо/о и /СНо/.

?о о - отдои 0,<4 групп I

корреляция!; р=0,01) между А1 и А2, служащая доказательством согласованного изменения молекулярной подвижности протонов метильных групп жирнокислотных цепей липидов и полярных головок фосфати-дил^олина. Такие изменения характерны для клеток,находящихся в 3 фазе,по данным данным С. МоипЬГогЪ"а(1982) и является экспериментальным ' подтверждением ( методом Ш ЯМР спектроскопии.) нахождения большинства клеток при лимфоме в синтетической фазе клеточного цикла,что согласуется с данными литературы, полученными другими цитоморфологическими методами( Д. Ф. Глузман.1982). Сравнительный анализ полученных нами спектрограмм и опубликованных в работах других авторов позволил заключить о нахождении большинства лимфоцитов при ХЛЛ в фазе в!,что согласуется с полученными раннее данными по характеристике этих клеток в процессах пролиферации и дифференцировки. В связи с наличием таких спектрограмм лимфоцитов в начальной стадии заболевания и неизменности их при прогрессии ХЛЛ, предполагается, что регистрируемые методом Ш-ямр спектроскопией нарушения динамического состояния мембран являются результатом изменений подвижности липидов мембран на уровне клеток-предшественников, из которых формировался в дальнейшем лейкознкй клон,а предполагаемое изменение текучести цитоплазма-тических мембран клеток при ХЛЛ необходимо для более активного проявления метаболических процессов в долгоживущих, накапливающихся в большом количестве лейкозных лимфоцитов. Для сравнительной характеристике особенностей клеточной трансформации при ХЛЛ методом 31Р-ЯМР спектроскопии была изучена функциональная активность эритроцитов больных и показана степень неоднородности клеток в норме и лейкозе по остаточному насыщению кислородом.

5. 2. Злокачественная трансформация лимфоцитов при лимфопроли-феративных заболеваниях сопровождается определенными сдвигами биохимических характеристик липидов лимфоцитов. Существенный вклад в наступающие изменения структуры липидов лимфоцитов крови вносит увеличение числа двойных связей!ДС) в ненасыщенных жирных кислотах. Исходя из данных по 1Н-ЯМРспектроскопии( собственных и литературных) об установлении различий в величине амплитуд сигналов протонов углерода рядом с двойной связью!хим. сдвиг-2,0) .между двойными связями!хим. сдвиг-2,3) и олефиновых групп!хим. сдвиг-5,3) при ХЛЛ и в норме,была поставле-

на задача определения суммарной ненасыщенности жирных кислот ли-пидоб лимфоцитов при гемобластозах на начальных стадиях и при прогрессировании заболеваний. Изменения суммарной ненасыщенности жирных кислот липидов проводили методом озонирования на приборе АДС-5.

Найдены существенные различия по числу двойных связей НЖ липидов клеток и плаэмы крови доноров и больных лейкозами! ХЛЛ,злокачественная лимфома,миеломная болезнь и др) (таблЗ). Число ДО в НЖК липидов клеток резко возрастаете практически в 2-5 раз)в начальные периоды болезни. Так, для ХЛЛ при содержании лимфоцитов около 70% в крови ненасыщенность жирных кислот липидов клеток возрастает в 2-2,5 раза (р=0,001) по сравнению с нормой; при содержании лимфоцитов более 80%(р<0,02)~ ненасыщенность липидов(табл. 3) возрастает в 5-8раз,в то время как число ДО НЖК липидов плазмы крови незначительно увеличивается или уменьшается по сравнению с нормой(табл. 3). Отсутствует корреляция изменений ненасыщенности липидов клеток и увеличения числа лейкоцитов и лимфоцитов в начале ХЛЛ. По-видимому,рост суммарной ненасышенности жирных кислот липидов лимфоцитов происходит в следствии лейкозной трансформации клеток. Некоторые авто-ры( М. К. Гоффман, 1981, В. ДА. Борман, 1984) считают, что повышение ненасыщенности клеток может определяться литературы ускоренным встраиванием НЖК в фосфолипнды клеточных мембран,приводя к повышению их текучести(М. К. Гоффман,1981;Б. Борман,1934). Нами методом H1-HMF спектроскопии были получены изменения динамического состояния мембран лимфоцитов при ХЛЛ и изучена суммарная ненасыщенность ЖК липидов лейкозных клеток -методом озонирования. Анализ собственных и литературных данных(М. Инбар, 1974, Дж. Е Миллер, 1973) показал,что лейкозная трансформация лимфоцитов сопровождается увеличением суммарной ненасыщенности липидов и изменением динамического состояния мембран в сторону увеличения их жидкостнос-ти.что согласуется с биохимическими исследованиями лимфоцитов при лейкозе и.установлением 2-кратного снижения общего количества липидов, ефингомиелина,холестерина( Е. D. Cottfried, 1967). Клетки с такой биохимической характеристикой Р. Корнелл,1977) являются лимфоцитами в G1 фаае.что согласуется с нашими предыдущими данными по биосинтезу ядерных нуклеиновых кислот лимфоцитов при

Таблица 3

Изменение ненасыщенности жирных кислот липидов плазмы и лимфоцитов крови больных гемобластозами на разных стадиях заболевания и при применении химиотерапии (М±т)

Группа больных Кол-во больных Кол-во лейкоцитов, «10 /л Кол-во лимфоцитов, % ДС пл., усл.од. IДС кл., усл.ОД. |Химиопре-парат

ХЛЛ - начальная стадия 11 18±14 60±48 244±20 344+12 —

ХЛЛ - стадия развернутых клинических проявлений болезни (без химиотерапии) 6 52±17 80+21 250+30 375+54

ХЛЛ - стадия развернутых клинических проявлений болезни (в курсе химиотерапии) 7 4 153±61 73±65 175+60 89+8 206±13 270+5 277±25 302+9 ЦФ ЦФ+ВК

ЗЛ - стадия прог-рессирования заболевания (в курсе химиотерапии) 8 7,0±3 50±20 160±6 186±9 ЦФ

МБ - стадия прог-рессирования заболевания (в курсз химиотерапии) 3 4,0±0,8 32+9 140+18 180±40 ЦФ,СЛ;ВК

Контроль 30 5,5±3 27±7 240+20 90+10 —

ЦФ - циклофосфан, ВК - винкристин, СЛ - сарколизин

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз, ЗЛ - злокачественная лимфома в стадии лейквмизации, № - миэломная болезнь

развитии ХЛЛ

Все вышеприведенные результаты позволяют судить об изменении как подвижности некоторых химических групп липидного компонента мембран ,так и суммарной ненасыщенности липидов клеток, а также соответствия этих изменений уровню пролифера тивных процессов ,присущих популяции лимфоцитов при лейкозе.

5. 2. аПроведено изучение ненасыщенности ЖК липидов лимфоцитов при прогрессировании ЛПЗ до начала лечения и при применении химиотерапии табл. 3). В период развернутых клинических проявлений болезни до начала лечения наблюдается дальнейший рост числа ДО ненасыщенных жирных кислот липидов клеток при ХЛЛ. коррелирующий с увеличением процентного содержания лимфоцитов,общего числа лейкоцитов и обьема лимфоидных органов больных. Это свидетельствует о взаимозависимости изменений ненасыщенности ЖК липидов клеток и развитием ХЛЛ при циркуляции в крови более незрелой популяции лейкозных лимфоцитов. Уровень ненасыщенности липидов плазмы крови больных при прогрессировании ХЛЛ такой же,как у доноров (табл. 3). При других гемобластозахГзлокачественной лимфоме и миеломной болезни) ненасыщенность ЖК липидов плазмы крови значительно снижена и достигает от80 до200 усл. ед(149+/-0,1). Суммарное ненасыщенность липидов клеток при этих заболеваниях увеличено в 1,5-2 раз(р=0,001Нтабл. 3). Очевидно, при развитии ЗЛ и МБ наблюдаются иные количественные изменения числа ДО НЖК липидов плазмы и клеток крови,отличные от обнаруженных нарушений ненасыщенности липидов плазмы и лимфоцитов крови при ХЛЛ,что может свидетельствовать о разнокачественности метаболических процессов в лимфоцитах крови при этих патологиях.

2. б. Результаты многократных экспериментов при применении специфической терапии указывают на уменьшение уровня ненасыщенности. ЖК липидов клеток при проведенном лечении. У больных сроки накала проведения химиотерапии и реакция организма при лечении одним и тем же препаратом различались, обшим было то,что время между получением препарата и взятием анализа не превышало 12час. -60 суток. Через 12-24 час. после начала лечения при ХЛЛ обнаружены изменения ненасыщен ности ЖК липидов клеток,достигающие 277+/_25 усл. ед. (при норме 90+/-10 усл. ед. и значениях для клеток без проводимого лечения 390-1100 усл. ед.) Лимфоциты с вы-

Таблица 4

Сравнение характеристик ненасыщенности лшшдов лимфоцитов и плазмы крови в норме и при гемобластозах (при культивировании с ЕНА и при действии гипак-фиколла и перколла)

ДС пла- Клетки крови ДС клеток ДС клеток ДС клеток (РНА)

змы крови без С d=1,052 d=1,052 d=1,052 d=1,052 d=1 ,052 d=1,052

г.ф. г.ф. большие средние малые большие средние малые

240 Лимфо- 117 42 1,3 2,44 0,35 1,1 0,69 0,91

±20 циты крови доноров ±12 ±2 ±0,08 ±0,1 ±0,03 ±0,1 ±0,07 ±0,11

250 Лимфо- 369 56 0,8 0,17 0,095

±30 циты ±28 ±4 ±0,04 ±0,001 ±0,003

крови боль- 585 ±42 143 ±7 - - — - - —

ных

ХЛЛ 338 92

±24 ±6

160 ЛиЩю- 296 66

±6 циты ±22 ±3 — •— — —

крови

боль- 133 38 3,4 0,47 0,37

ных ±9 ±2 ±0,22 ±0,004 ±0,003

НЗЛ

140 Лимфо- 287 72 0,58 2,7

±18 циты крови больных МБ ±20 ±4 ±0,006 ±0,01

ХЛЛ - хронический'лимфолейкоз, НЗЛ - злокачественная лимфома (неходж-кинская), МБ - миеломная болезнь

Ц - плотность раствора перколла; ДС - число двойных связей в ненасыщенных жирных кислотах липидов, выраженное в условных единицах, отнесенное к 10бклеток; г.ф. - гипак-фиколл

сокими значениями ненасыщенности ЖК липидов оказались более чувствительны к химиотерапии. Оставшаяся после проведенного лечения •популяция лимфоцитов характеризовалась меньшим числом ДС ненасыщенных жирных кислот липидов. Аналогичный эффект уменьшения суммарной ненасыщенности ЖК липидов клеток при действии химиотерапии обнаружен при злокачественной лимфоме и миеломной болез-ни(табл. 3).

Очевидно, что при изученных лимфопролиферативных заболеваниях наблюдается определенная для каждого ив них гетерогенность популяции по суммарной ненасыщенности липидов лимфоцитов и чувствительности к химиотерапииУстановлено,что эффект специфической терапии обусловлен действием препаратов на незрелые лейкозные клетки с высокими показателями ненасыщенности Ж липидов. После проведенного лечения преобладают лимфоциты с меньшим чиблом ДС НЖК липидов. В более отдаленные сроки от проведенного лечения вновь регистрируется увеличение ненасыщенности жирных кислот липидов лимфоцитов периферической крови при прогрессировании ге-мобластозов.

ВЫВОДЫ

1. На основе применения комплекса цитоморфологических и физико-химических методов получены важные характеристики процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови при заболевании хроническим лимфолейкозом человека. Установлены нарушения биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот, изменения продолжительности фаз клеточного цикла, дестабилизация структуры ДНК, перестройки в динамическом состоянии цитоплазматических мембран лимфоцитов в начале и при прогрессировании заболевания. Эти процессы во многом определяют патогенез и дальнейшее течение гвмоблзстозов

2. При сравнении пролиферативной активности и степени дифференцировки лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови практически здоровых доноров показано:

-наличие увеличенного вдвое числа ДНК-синтвзирувдих клеток и интенсивности биосинтеза в них для лимфоцитов лимфоузлов; -существование- линейной зависимости изменений интенсивности биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот в клетках крови и лимфоузлов; -расположение клеток такого типа в трех интервалах Б фазы, со своей для каждого интервала интенсивностью синтеза нуклеиновых кислот;

аличие лимфоцитов, активно, синтезируищих РНК, не включающих тимидин, с повышенным содержанием ДНК ("и-клетки"). Для этих клеток выявлена линейная зависимость увеличения содержания ДНК и интенсивности биосинтеза суммарной ядерной РНК (коэффициент корре-ляции-0,8; угловой коэффициент-3,4);

-увеличение интенсивности синтеза ядерных нуклеиновых кислот с

ростом размера лимфоцитов в лимфоузлах и периферической крови; -гетерогенность популяции лимфоцитов по содержанию ДНК с преимущественным преобладанием диплоидов и идентичность распределения по шгоидности лимфоцитов разного размера в лимфоузлах и крови; -идентичность процентного соотношения лимфоцитов разного размера в лимфоузлах и крови.

3. У больных гемобластозами, на модели ХМ, получены значительные вариации процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. Дан сравнительный детальный анализ биосинтеза ядерных нуклеиновых кислот лимфоцитов лимфоузлов и периферической крови на разных стадиях заболевания. Обнаружено:

-снижение числа про лифе рирущих клеток за счет уменьшения с 8% до 0,7$ числа меченных 1гтимидином лимфоцитов в начальной стадии и при развитии болезни;

-увеличение в 2 раза интенсивности синтеза ядерной ДНК по сравнению с нормальными аналогами. При этом сохраняются закономерности изменений процентного соотношения между группами лимфоцитов в лимфоузлах и периферической крови, сравнимые со значениями в норме; -идентичность увеличения в лимфоузлах, по сравнению с кровью, числа ДНК-синтезирупцих клеток и соответственно те же соотношения индекса метки лимфоцитов для крови и лимфоузлов с наибольшим числом меченных клеток среди больших лимфоцитов;

-увеличение интенсивности синтеза ДНК в связи с размером клеток и двухкратное усиление интенсивности в лимфоцитах лимфоузлов по сравнения с кровью. Это свидетельствует о сохранности рециркуляции лимфоцитов при ХШГ.

Показано:

- увеличение числа РНК-синтезирупцих клеток в лимфоузлах и периферической крови за счет лимфоцитов большого размера и интенсификация биосинтеза в них;

- линейная корреляция увеличения размера клеток и интенсивности синтеза суммарной ядерной РНК в них;

- существование в лимфоузлах и крови лимфоцитов, активно синтезирующих ядерные, нуклеиновые кислоты, где 4-5-кратному увеличению интенсивности синтеза суммарной ядерной РНК соответствует 2-кратное усиление интенсивности синтеза ядерной ДНК, что выявлено в начальной стадии заболевания;

- расположение такого рода клеток в двух интервалах э фазы митоти-ческого цикла, со своей для каждого интервала интенсивностью синтеза ядерных нуклеиновых кислот;

- наличие лимфоцитов, активно синтезирующих суммарную ядерную РНК, и не включающих Нтимидин с высоким содержанием ДНК ("и-лимфоциты"). Для этих клеток, по сравнению с нормальными лимфоцитами, установлено изменение параметров линейной зависимости увеличения содержания ядерной ДНК и интенсивности биосинтеза суммарной ядерной РНК в начале и при прогрессировании болезни (коэффициент корреляции-0,96; угловой коэффициент-7 и 12);

- гетерогенность популяции лимфоцитов по содержанию ядерной ДНК с увеличением числа полиплоидов при развитии болезни, приводящим к снижению уровня дифференцировки 70% лимфоцитов лимфоузлов и крови;

- идентичность процентного соотношения лимфоцитов разного размера лимфоузлов и крови в начальной стадии и в период развернутых клинических проявлений болезни, не отличающегося от аналогичных параметров у здорового донора.

4. б начальной стадии ХЛЛ и при прогрессировании заболевания выявлена нестабильность вторичной структуры ДНК лимфоцитов периферической крови, выражающаяся 5-10-кратным увеличением, по сравнению с нормой, числа деспирализованных участков ДНК. Показано отсутствие корреляции количества дефектов ДНК с возрастом больных и степенью распространенности процесса; эффект курса химиотерапии связан с действием на лимфоциты с наиболее измененной структурой ДНК.

5. У больных ХЛЛ, ЗЛ и МБ методом ЯМР-Н -спектроскопии обнаружены изменения динамического состояния цитоплазматических мембран лимфоцитов периферической крови, характеризующиеся различной подвижностью метальных и метиленовых групп липидов. Графически получены две непересекающиеся области экспериментальных точек для результатов, принадлежащих лимфоцитам начальной стадии ХЛЛ и практически здоровым донорам, что может быть использовано для ранней и дифференциальной диагностики.

6. Получены количественные характеристики ненасыщенности жирных кислот липидов плазмы и лимфоцитов периферической крови при гемобластозах.

- Для проведения сравнительного анализа определен нормативный показатель ненасыщенности жирных кислот липидов плазмы и лимфоцитов практически здоровых доноров разных возрастных групп; при этом-бб-наружено отсутствие изменении ненасыщенности липидов клеток при увеличении их размеров;

- Определены значения нанасшцанности липидов нормальных лимфоцитов крови при действии РНА и изменение этого показателя в связи с морфологическими особенностями клеток.

- При ХЛЛ в начальных стадиях выявлено 2-5-[Кратное увеличение ненасыщенности жирных кислот* липидов лимфоцитов и незначительное уменьшение или нормальные показатели ненасыщенности липидов плазмы крови больных. При развитии заболевания - дальнейший рост ненасыщенности липидов лимфоцитов (в 5-8 раз), коррелирующий с клинико-гемвтологиче'скими показателями. При проведении курса химиотерапии в первую очередь погибают клетки с наибольшими изменениями ненасыщенности жирных кислот липидов.

- Для злокачественной лимфомы с лейкемизацией и миеломной болезни выявлены индивидуальные изменения ненасыщенности жирных кислот липидов плазмы и лейкоцитов крови, характеризующиеся резким уменьшением этого показателя для липидов плазмы крови и незначительным (в 1,5-2 раза) увеличением ненасыщенности липидов клеток периферической крови в начальный период болезни; химиотерапия воздействует аналогично, как при ХЛЛ.

Установление закономерности изменений ненасыщенности липидов плазмы и лимфоцитов крови больных разными видами гемобластозов могут быть использованы для ранней и дифференциальной диагностики, а также для выработки индивидуальной стратегии при лечении больных.

7. Выявленные нарушения пролиферативной активности и диффе-ренцировки лимфоцитов при гемобластозах являются подтверждением высказанного положения о важнейшей роли взаимосвязанных ядерных и мембранных изменений, наступающих при лейкозной трансформации.

Основные результаты работы отражены в' публикациях:

1. Жижина Г. П. , Когарко И. Е , Троицкая Г. Е , Виноградова Ю. Э. /Локальн ая деспирализация ДНК лимфоцитов крови больных при ХИЛ// Журн. Эксперимент, онкол. -1989г. -N5. -С. 54-56.

2. Зедгенидзе М. С. ,Фукс Б. Б. ,Спиранде И. В. .Когарко И. Е .Кулакова А. М. . Шкроб О. С. /Исследование активности нормальных киллеров в крови у женщин, оперированных по раку молочных желез// В кн.: Актуальные вопроси иммунологии. -Москва, Им. ,1981. С. 28

3. Т. Л. Кнубовец, Л. А. Сибельдина, И. Е Когарко/О возможности опенки функциональной активности эритроцитов человека методом

Р-ЯМР//журн. Биофизика. -1984. -Т. 29. -С. 1110-1113.

4. Когарко И. Е.Евсеенко Л. С./Авторадиографическое изучение нуклеиновых кислот в лимфоидной ткани при ХЛЛ человека//ДАН СССР. -1969. -Т. 188. N3. -С. 726-723.

5. Когарко И. Н. .Когарко Б. С. .Евсеенко JL С. ,Фукс Б. Б. /Цитохимическое исследование нуклеиновых кислот лимфоидной ткани при ХЛЛ//Известия АН СССР, сер. бтл. -1970. -N3. -С. 348-355.

6. Когарко И. Е , Когарко Б. С. , Евсеенко Л. С. , Фукс Б. Б. /Изучение биосинтеза ДНК и РНК в нормальных и лейкозных лимфоцитах// В кн.: Метаболизм клеточного ядра и ядерно-цитоплазматические отношения. .Киев,ИВ АН УССР, 1970. -С. 199-200

7. Когарко И. К /Исследование метаболизма нуклеиновых кислот при ХЛЛ человека//В кн.: Патогенез,лечение и эпидемиология лейкозов. . Рига, ЦОЛИПК.РМИ, 1971г. -0. 34-36

8. Когарко И. Е /Некоторые особенности метаболизма нуклеиновых кислот при ХЛЛ//В кн.: Современные проблемы ХЛЛ. Сочи, КГМИ, 1972. -С. 15-17.

9. Когарко И. Е , Когарко Б. С. /Изучение количественных закономерностей биосинтеза нуклеиновых кислот клеточной популяции методами микроспектрофотометрии и авторадиографии//Всесоюзная конференция по клеточным популяциям. Красноярск, 1973г.; Тезисы докл. -Красноярск, 1973г. -С. 34.

10. Когарко И. Е /Цитохимическое количественное исследование лейкозных лимфоцитов методом авторадиографии//2-й Национальный конгресс по онкологии. Бухарест, 1975г.: Тезисы докл.- Бухарест. -Рум. онкол. общ, ,1975г. - С. 47.

11. Когарко И. Н./Некоторые особенности биосинтеза нуклеиновых кислот б лимфоцитах при ХЛЛ Чьловека//Всесоюзный с"езд гематоло-

гов. Баку, 1979.: Тезисы докл. -Москва, ВНИИГПК, 1979. -С. 45.

12. Когарко И. Н. /Изучение комбинированного лечения больных ХЛЛ в эксперименте//в кн.: Синтез и изучение новых отечест венных противолейкозных препаратов. Вильнюс,увод Коорд. Совет по пробл. 0. 69. 05. , 1979. -С. 110.

13. Когарко И. Н. , Круглова Г. Е , Найдич Е И., Мурза Л. И., Богданов Г. В. /Изучение недифференцированных лимфоцитов при ХИЛ и при развитии экспериментального лейкоза методом протонной релакса-ции//9-й Мзждунар. симпоз. по сравнительному изучению лейкоза и родственных заболеваний. Сухуми,(СССР) ,1979г.: Те8исы докл. -Сухуми.-ИЭПиТ, 1979г.-С. 16-17.

14. Когарко И. Е ,Фукс Б. Б. .Спиранде И. В./Обнаружение и исследование полифункционального рецептора Т-лимфоцита//Там же. -С. 32-33.

15. Когарко И. Н. ,Фукс Б. Б./Свойство лейкозных клеток-шгготок-сический эффект при ХИЛ человека//19-й Национ. гемат. Конгр. Будапешт' ВНР), 1932г.: Те8. докл. -Будапешт. -Инст. Гем. Венг. , 1982г. -С.

16. Когарко И. Н , <Хукс Б. Б. , Спиранде И. Е , Золотницкая Р. Н /Изучение некоторых свойств лимфоцитов при ХШ1//В кн.: Рас-познование и меры борьбы с лейкозами человека и животных. -Москва. , ЦОЛИПК, Коорд. Сов. ГКНГ СССР, 1932. -С. 50.

17. Когарко И. Н. ,<Еукс Б. К , Спиранде И. В. ,Зедгинидзе М. С. .Золотницкая Р. П./Исследование феномена цитотоксичности-нового свойства лейкозных клеток изотопным методом//1 Всесоквн. биофиз. Конгр; мэсква, 1982г.: Тез. докл. -Москва: ИВФ АН СССР, 1982,С. 1144.

' 13. Когарко И. Н. , Збдгенидзе М. С. , Фукс Б. Б., Спиранде И. Е /Выраженная вариабельность активности НК крови женщин в равные сроки после хирургического вмешательства//Журн. Иммун. 1983. -N3. -

19. Когарко И. Н /Получение цитологических препаратов для ци-тофотометрического и авторадиографического анализа//Штод. ре-кцм. "Проведение биохимических,иммунологических и радйохимиче ских исследований иммуннокомпетентных клеток,клеточных струк тур и их компонентов". -Москва. ,МГУ, АН СССР, 1983г.-С. 41-44.

20. Когарко И. Н /Методика цитофотометрического определения содержания ДНК впрепаратах, окрашенных по <Хельгену//Там же.-С. 44- 50.

21. Кэгарко И. Н./Мэтодика авторадиографического анализа//Там

\ 48

/

же. -С. 50-5?.

22. Когарко ■ И. Е , Юшманов В. Е. , Сибельдина Л. А. , Мокеева Р. А. /Изучение состояния мембран лимфоцитов при ХЛЛ методом ЯМР-высокого разрешения//В кн. : Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. -Ташкент. , ВАСХНИЛ, 1984. -С. 98.

23. Когарко И. Е , Юшманов В. Е., Курушин Е. А., Лукина ,Е. А. , Мокеева Р. А. . Сибельдина Л. А. /К вопросу об использовании метода ЯМР высокого разрешения для тестирования лимфоцитов при лимфопроли-феративных заболеваниях//2 Всесоюзн. съезд гематол. Львов, 1935г. : Тез. докл. -Москва, ЦОЛИПК, 1985г. -С. 192.

24. Когарко И. H , Юшманов В. Е., Курушин Е. А. , Сибельдина Л. А. , йэкеева Р. А. . Лукина Е. А. /Изучение лимфоцитов при ХЛЛ человека методом ЯМР//4 Нац. онкол. Конгр. София! НРБ), 1985г. : Тез. докл. - Со-Ьия, 1985г. -С. 132-133.

25. Когарко И. Е , ЗКижина Г. Е , Конрадов А. А. , Когарко Б. С. , Моке-зва Р. А. , Виноградова ¡0. Э., Шведова Е. Е , Троицкая Г. Е /Некоторые особенности состояния клеточной мембраны и ДНК лимфоцитов при яейкозной трансформации и действии противоопухолевых агентов//В íh. : "Биофизика рака",Черноголовка,ОИХФ, 1987. -С. 69-70.

26. Когарко И. Е , Конрадов А. А. , Когарко Б. С. /Современные метода (цитоиммуноизопопия,протонный ядерный магнитный резонанс при изучении популяции лимфоцитов при лейкозе//В кн. : Теоретические и фактические вопросы ветеринарии. Тарту, САЭ, 1987г.-С. 65.

27. Когарко И. Е ,Жижина Г. Е ,Когарко Б. С. .Конрадов А. А. /Перс-юктива использования физико-химических мётодов в целях диагностики и снижения заболеваемости лейкозом// Коорд. совет ГКНТ по фобл. 0. 69. 05. , Рига, АН Латв. ССР, 1987г. -С. 78.

28. Kogarko I. N. /Appl i cati on of modern physi co-cheini cal nethods in cytopathology//16th European congress of cytology îudapest, Hungary, 1988. : Abstracts. -P. 91.

29. Когарко И. E , Позняк Т. И. , Киселева Е. Е , Лисицин Л. М. /Исс-юдование ненасыщенности липидов плазмы и мембран клеток крови ФИ действии химиотерапевтических препаратов на различного вида 1атологии//4 Всесоюзное Совещание по доклинической токсикологии фотивоопухолевых препаратов. Ленинград, 1983г. : Тез. докл. •Томск, ТМИ.

30. Когарко И. Е /Рабочее совещание "Биофизика рака"//Ин-

форм. бюл. -Пущино.ИБФ АН ССОР, 1989г. -вып. 22. -С. 31-35.

31. Когарко И. а .Позняк Т. И. , Лиоицин Д. М. .Киселева Е. В. ,Кос-миади Г. А. , Виноградова ¡0. Э. /К вопросу о возможности диагностики лимфопролиферативных заболеваний пр изменению структуры липидов цитоплазматических мембран клеток и плазмы крови//0бщесоюзн. кон-фер. Актуальные вопросы в биохимической и ммунологической диагностике злокачественных новообразований. Москва, 1989г. -Тез. докл. -Москва: ВОНЦ,1989г. 0.146-148.

32. Когарко И. а /К вопросу о молекулярных изменениях структуры липидов плазмы и цитоплазматических мембран лимфоцитов при лимфопролиферативных за6олеваниях//Респ. научн. конф. "Механиз мы каннеро- и лейкогенеза". Киев, 1990г.: Тез. докл. -Киев, Инст. пробл. онкол. АН УССР, 1990г.-С. 39-40.

33. Когарко И. Е /Пролиферация и дифференцировка лимфоцитов при ХЯЛ //Журн. Эксперимент, онкол.-1990г.-N5-0. 43-49.

34. Когарко И. а ,Позняк Т. И. .Киселева Е. В. .Лисицин Д. М. .Виноградова Ю. Э. /Исследование ненасыщенности липидов лимфоцитов и плазмы крови при лимфопролиферативных заболеваниях//Журн. Эксперимент. онкол. -1991г. -N6-0. 48-51.

35. Фукс Б. Б. ,Спиранде И. В. ,Когарко И. а .Филатова Т. И. /Т- и О- лимфоциты мыши,конкурентно свызывающие два разных гаптена// Журн. Иммунология. -1930. -N4. -С.

36. Фукс Б. Б., Зедгенидзе М. С. , Спиранде И. В. , Когарко И. а , Стерлина А. Г. /Обнаружение эффекта цитотоксичности опухолевых клеток по отношению к мишеням нормальных килле-ров//Журн. Бюл. зксп. биол. и мед. -1981. -»9. -С. 342-345.

37. Юшманов В. Е. , Курушин Е. А., Когарко И. а , Сибельдина Л А. , Мокеева Р. А. , Лукина е! А. /Изучение мембран лимфоцитов при лимфопролиферативных заболеваниях человека методом Н-ЯМР//Журн. Биол. мембраны. -1984. -Т. 2-Ы2. -С. 170-175.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

хпл- хронический лимфолейкоз

зл - злокачественная лимфома

МБ - миеломная болезнь

ПФ - циклофосфан

ВК - винКрИСТИН

О Л - саркслизин

КФ - кинетический формальдегидный метел

Н1-ЯМР- протонный ядерный магнитный резонанс

РНА- фитогемагглютенин

Г. Ф. - гипак-фиккол

сЬ плотность раствора перколла

АДС-5-- анализатор двойных связей

Фазы клеточного цикла

во - фаза покоя

И - пресинтетическая фаза

3 - фаза зинтеза ДНК

ОТ - постсинтетическая фаза

Статистические показатели

М- среднее значение

т- стандартная ошибка

р- /роьень достоверности различий

¡' - коэффициент корреляции

Пи

7

Подо, в печ. 5.11.91 Объем :.25 п.л.

Формат 60x90/] Зах. 3380 Тираж 120 эк:

Отпечатано на ротапринте