Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Экспресс-метод определения содержания преднизолона и циклофосфана в лекарственных формах и изучения их фармакокинетических показателей у животных и онкобольных

На правах рукописи

4846662

Лигостаев Александр Валерьевич

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА И ЦИКЛОФОСФАНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ И ИЗУЧЕНИЯ ИХ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У ЖИВОТНЫХ И ОНКОБОЛЬНЫХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 9 МАЙ 2011

Санкт-Петербург - 2011

4846662

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Ивановская Елена Алексеевна Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Поспелова Татьяна Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Абышев Азад Зиядович

доктор фармацевтических наук, профессор Белоусов Михаил Валерьевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 7 июня 2011 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.088.01 при ГОУВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Росздрава по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14

М

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14

Автореферат разослан

__^ Се^^ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.088.01 кандидат фармацевтических наук, доцент Н. В. Марченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В медицинской практике для лечения опухолевых процессов, в частности для лимфом, широко практикуют периодическое применение цитостатшсов и глюкокортикоидов. Так, например, в схемы лечения онкологических больных включены препараты: циклофосфан, имеющий противоопухолевый эффект, и преднизолон, обладающий противовоспалительным действием. При курсовом применении цитостатики вызывают ряд осложнений: снижение иммунитета, присоединение бактериальных, вирусных, грибковых инфекций, что приводит к удлинению сроков лечения, а нередко, и к угрозе жизни.

Мониторинг (постоянное наблюдение) за содержанием лекарственных веществ в биологических средах организма позволяет осуществлять своевременную коррекцию фармакотерапии, особенно у категории лиц с онкозаболеваниями.

Представляет интерес изучение возможности использования спектрофотометрии как ключевого метода в контроле качества и для целей терапевтического мониторинга циклофосфана и преднизолона.

Для количественного определения преднизолона Государственная фармакопея (ГФ) предлагает методику спектрофотометрического определения в различных лекарственных формах. В существующей методике используются сильнодействующие органические растворители высокой степени очистки (метанол). Этот факт осложняет выполнение исследований по данной методике из-за проблем с приобретением растворителя, в особенности для рутинных анализов.

Для количественной оценки циклофосфана в ГФ описана методика обратного аргентометрического титрования, которая длительна по времени определения и имеет невысокую чувствительность.

Таким образом, разработка экспресс-методик. количественного определения циклофосфана и*преднизолона спектрофотометрическим методом,

а также проведение на их основе фармакокинетических исследований и мониторинга концентраций позволят не только расширить показания к назначению данных лекарственных средств, создать оптимальные алгоритмы их использования для онкобольных, но и во многом реализовать индивидуальный подход при подборе терапии в каждом конкретном случае.

Цель работы. Изучение возможности применения спектрофотометрического анализа количественного экспресс-метода определения циклофосфана и преднизолона для анализа лекарственных форм и биологических объектов, проведение фармакокинетических исследований у животных и у онкобольных для мониторинга концентраций лекарственных веществ.

Задачи исследования

1. Подобрать условия количественного спектрофотометрического определения преднизолона и циклофосфана на модельных растворах (субстанциях).

2. Сравнить разработанные методики количественного определения лекарственных средств с фармакопейными методиками.

3. Применить разработанные методики преднизолона и циклофосфана для готовых лекарственных форм.

4. Адаптировать спектрофотометрические методики преднизолона и циклофосфана для биологических объектов, подобрать условия пробоподготовки.

5. Применить разработанные экспресс-методики для фармакокинетических исследований на животных и сравнить их с данными в научной литературе.

6. Провести фармакокинетические исследования и рассчитать параметры у онкобольных с помощью разработанных спектрофотометрических методик.

Научная новизна

1. Впервые разработаны методики количественного

спектрофотометрического экспресс-определения циклофосфана и модифицирована методика определения преднюолона в модельных растворах (субстанциях).

2. Разработанные методики адаптированы для целей контроля качества лекарственных препаратов (таблетки, растворы, лиофилизированный порошок; для инъекций).

3. Впервые определены оптимальные условия пробоподготовки сыворотки крови и мочи (объем пробы и концентрация осадителей) при количественном определении циклофосфана и преднизолона.

4. На основе разработанных спектрофотометрических экспресс-методик проведены фармакокинетические исследования для преднизолона и циклофосфана на животных, определены следующие параметры: начальная и поддерживающая дозы, период полувыведения, константа скорости элиминации, константа скорости всасывания. Полученные параметры подтверждены данными в научной литературе.

5. Впервые проведены фармакокинетические исследования и рассчитаны основные показатели у групп онкологических больных с лимфомой для дальнейшего использования этих показателей в мониторинге концентраций лекарств и для подбора индивидуальных доз лекарственных средств.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России по теме «Разработка методик количественного определения лекарственных препаратов в биологических средах и проведение фармакокинетических исследований» (номер государственной регистрации 01200956813).

Практическая значимость. Впервые разработаны экспрессные методики количественного определения циклофосфана и преднизолона, которые могут использоваться для количественной оценки в объектах: сыворотке, моче, таблетках, растворах, лиофилизированном порошке. Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы и Производственного объединения

000 «Диафарм» (г. Бердск).

Полученные параметры фармакокинетических исследований лекарственных веществ с помощью предложенных методик позволят проводить мониторинг в терапии препаратами «Циклофосфан» и «Преднизолон» для пациентов с онкологическими заболеваниями крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Условия спектрофотометрического определения циклофосфана и преднизолона, позволяющие регистрировать спектральные кривые лекарственных средств в стандартных растворах и биологических объектах.

2. Прямолинейная зависимость между величиной оптической плотности и концентрацией препарата говорит о незначительном влиянии компонентов крови на величину аналитического сигнала. Минимально определяемая концентрация составляет 1 • 10~7 г/мл.

3. Условия пробоподготовки (подбор концентраций осадителей) в биологическом образце и определение объема пробы для количественного анализа.

4. Показатели фармакокинетических исследований при введении циклофосфана и преднизолона у пациентов с онкозаболеванием (лимфома) с помощью разработанных спектрофотометрических методик.

Апробация работы. Основные результаты диссертации обсуждены и одобрены на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010), на научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2007), на научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2010), на межвузовской научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии и фармации», посвященной памяти профессора В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ (Курск, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе

1 статья - в ведущем рецензируемом научном журнале, рекомендуемом ВАК

Минобрнауки России.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описаний материалов и методов исследования, 3-х глав описаний собственных исследований, выводов. Диссертация содержит 28 таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает 126 источников, из которых 37-зарубежных авторов.

Исследование одобрено локальным комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета.

В обзоре литературы (первая глава) рассмотрены вопросы современного' состояния методов анализа стероидных соединений в модельных растворах и биологических объектах.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе отражены результаты подбора условий спектрофотометрического количественного определения преднизолона и циклофосфана в модельных растворах и лекарственных формах.

Четвертая глава посвящена разработке спектрофотометрических методик количественного определения преднизолона и циклофосфана в биологическом объекте (модели).

В пятой главе продемонстрированы результаты фармакокинетических испытаний преднизолона и циклофосфана на лабораторных животных (крысах) и пациентах с онкологическими заболеваниями (лимфома).

Личный вклад автора. Разработка методик количественного определения преднизолона и циклофосфана, работа с лабораторными животными, работа с сывороткой- крови пациентов, расчет фармакокинетических параметров, статистическая обработка полученных результатов, написание диссертации выполнены лично автором.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали:

- стандарт преднизолона (Р 6004, min 99 % Prednisolone. Actual content given on label water <1,5 mol/mol (фактически содержимое флакона в воде), С21Н28О5, FW = 360,5) исполнитель: фирма «Sigma Reference Standart» (США);

-раствор преднизолона (11-бета)-11,17,21-тригидроксипрегна-1, 4-диен-3, 20-дион для внутривенного и внутримышечного введения, с содержанием действующего вещества 25 мг/мл раствора, предоставленный фармацевтической фирмой «Никомед Австрия ГмбХ» (Австрия);

-циклофосфан N, N-бис (2-хлорэтил) тетрагидро-2Н-1, 3, 2-оксазофос-форин-2-амин-2-оксйд, для внутримышечного введения с содержанием действующего вещества 0,2 г, предоставленный фармацевтической фирмой ОАО «Биохимик» (Россия).

Экспериментальные данные получали на однолучевом автоматическом спектрофотометре СФ-56 (Россия) и на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 (Япония).

В качестве растворов сравнения использовали изотонический раствор натрия хлорида (заводской), 96,6 % раствор спирта этилового.

Работа на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 и на хроматографе «Милихром А-02» (колонка диаметром 2 х 75 мм с сорбентом Нуклеосил 100-5 С18 и элюентами: элюент А-0,1 % раствор ТФУ; элюент Б - ацетонитрил KJI 0-1 в режиме градиентного элюирования с многоволновой детекцией) проводилась на модельных растворах в судебно-химическом отделении Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы (заведующий отделением Кокорина Н. О.).

Параллельные измерения циклофосфана (лиофилизированный порошок) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) выполнялись на базе НИИ Твердого тела, под руководством профессора Юхина Ю. М. Результаты экспериментов статистически обработаны согласно ГФ XI вып. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗРАБОТОК МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА И ЦИКЛОФОСФАНА

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ В МОДЕЛЬНЫХ РАСТВОРАХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

Подбор условий количественного определения преднизолона в модельных растворах. Разработку спектрофотометрических исследований проводили на стандарте преднизолона.

В результате проведения исследований оптическим методом в растворе 0,1 моль/л калия хлорида, в 0,9 % растворе натрия хлорида, в воде очищенной и цитратном буферном растворе (рН = 6) наилучшие спектры были получены при /. = 249 нм для раствора преднизолона в 0,9 % растворе натрия хлорида (рис. 1).

Ш-Ш А манник, ог з.о _ а -и..............

....... ' ' ' Л--- 18'° ■V. ^

Примечание. Концентрация измеряемого раствора преднизолона - 2,5 ■ КГ* г/мл

Рис. 1. Аналитическая длина волны преднизолона в изотоническом растворе

натрия хлорида

Далее была определена зависимость оптической плотности от концентрации, которая имела прямолинейный характер, что подтверждало правило Бугера-Ламберта-Бера и возможность использования данных при разработке методики в диапазоне концентраций от 2,5 • Ю-5 г/мл до 1 • Ю-7 г/мл (рис. 2).

1,2000

1,0000

0,8000

§0,6000

н

с

<"0,4000 0,2000

0,0000

0.00Е+00

5.00Е-06

1.00Е-05

1Щ5

2.00Е-05 2.50Е-05 3.00Е-О5

Рис. 2. Зависимость оптической плотности от концентрации

преднизолона в модельном растворе (преднизолон + №01), снятого относительно 0,9 % №01, при X = 249 нм

Для изучения возможного влияния хлоридов на аналитическую длину волны преднизолона получили спектр изотонического раствора натрия хлорида, снятый относительно воды в том же диапазоне, что и преднизолон в 0,9 % растворе натрия хлорида. Отмечено, что хлорид-ионы не оказывали влияния на спектр преднизолона.

Для подтверждения сходимости разработанной методики провели эксперимент по методу «Введено-Найдено». Сходимость результатов методом «Введено-Найдено» составила 7 %, а при концентрации преднизолона 5 ■ Ю-7 г/мл - ошибка среднего от концентрации не превышала 2,7 %.

Методика количественного определения преднизолона в модельных растворах. В практической деятельности для лечения онкозаболеваний в терапевтических схемах чаще всего применяют растворимый препарат преднизолона для инъекций, выпускаемый в ампулах по 1 мл с содержанием водорастворимой соли преднизолона. Исходя из этого, предположили, что данная форма преднизолона может быть растворима в солях и буферных растворах.

Для инъекционного раствора провели эксперимент, аналогичный

10

5 !

)

эксперименту со стандартным раствором. Правильные и воспроизводимые результаты были получены в диапазоне интервала концентраций для инъекционного раствора от 2,5 • 10~5 г/мл до 5 • 10"7 г/мл.

Наиболее распространенным препаратом в совместных схемах лечения онкозаболеваний является циклофосфан. Существующая методика титриметрического определения, описанная в ГФ, малочувствительна для определения количественного состава вещества особенно в присутствии других биологически активных веществ. Поэтому нами была разработана методика определения циклофосфана (субстанция фирмы «Биохимик», Россия) в модельных растворах на основе спектрофотометрического метода в ультрафиолетовой области.

На начальном этапе осуществили подбор оптимального растворителя для циклофосфана. В работе был использован спирт: 40 %, 50 %, 60 % и 96,6 %. В результате чего свой выбор остановили на 96,6 % растворе спирта этилового, что отражено на рис. 3.

Рис. 3. Спектры циклофосфана на спиртовых растворах с различной концентрацией: 1-40 % раствор, 2 - 50 % раствор, 3-60 % раствор,

4 - 96,6 % раствор

Прямолинейная зависимость для циклофосфана сохраняется в интервале концентраций 1 • 10~2-1 • Ю-7 г/мл и рост оптической плотности идет

11

пропорционально концентрации препарата, что говорит о правильном выборе растворителя и аналитической длины волны.

Данные показывали, что при концентрации циклофосфана 5 • КГ6 г/мл ошибка не превышала 2,78 %.

Методика количественного определения циклофосфана в модельных растворах. Готовили растворы с различными концентрациями путем последовательного разбавления исходного раствора циклофосфана в 96,6 % растворе спирта этилового с концентрацией 1 ■ 10"2 г/мл. Определяли аналитическую длину волны циклофосфана в режиме «Сканирование» при 211 нм.

Для сравнения разработанной нами методики определения циклофосфана в модельных растворах использовали фармакопейную титриметрическую методику и ВЭЖХ, описанную в научной литературе. Результаты представлены в табл. 1.

В результате полученных данных различными методами (табл. 1) мы можем сделать выводы о том, что разработанная спектрофотометрическая методика сопоставима с уже известными методиками, но, в сравнении с ВЭЖХ и титриметрией, она более экспрессная и простая в применении.

Таблица!

Сравнительная характеристика результатов определения циклофосфана

Методики X Sr 8,96 Д, нм

Спектрофотометрия 0,4269 (А) 0,0085 2,0050 211

ВЭЖХ 3,8471 (А) 0,0102 1,5200 210

Обратное аргентометрическое титрование 99,3204 0,3593 0,4498 -

Следующим этапом нашей работы было перенесение данных методик на лекарственные формы. Для анализа использовали 3 серии (80505,90505, 90605) таблеток по 5 мг (ЗАО «Северная звезда» (Россия).

Для преднизолона провели методику на таблетках. Методика

определения заключалась в следующем. Брали точную навеску 0,24 г, что эквивалентно 5 мг действующего вещества, из растертых в порошок 20 таблеток, помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 30 мл изотонического раствора натрия хлорида, встряхивали ei течение 5 мин и доводили до метки. Перемешивали, а затем отфильтровывали в сухую колбу, ; отбрасывая первые 15 мл фильтрата. Аликвоту 25 мл фильтрата доводили раствором натрия хлорида до объема 50 мл, перемешивали и измеряли оптическую плотность полученного раствора. Раствором сравнения служил изотонический раствор натрия хлорида.

В результате применения • разработанной методики количественного определения преднизолона на таблетках ошибка составила не более 3,05 %.

В качестве объекта исследования на циклофосфан использовался порошок циклофосфана по 0,2 г во флаконах, в виде трех серий: 81106, 80106, 80406.

При определении циклофосфана на порошках линейная сходимость составила 4,55 %. Следовательно, разработанные методики могут использоваться для анализа лекарственных форм.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗРАБОТКИ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА И ЦИКЛОФОСФАНА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ В БИОЛОГИЧЕСКОМ

ОБЪЕКТЕ

Подбор условий количественного определения преднизолона в биологических объектах (модели). Для начала провели измерение чистой сыворотки крови и показали, что спектр сыворотки не влияет на определение преднизолона.

Вещества, ' содержащиеся в сыворотке и имеющие свой максимум в области X. = 411 нм, не мешали определению преднизолона, спектр которого был записан при X = 250 нм.

Сыворотку, полученную с помощью стандартных процедур, брали' из биохимической лаборатории и готовили 20 разведений. Из них

v 13

10 разведений - сыворотка в изотоническом растворе натрия хлорида без преднизолона и 10 разведений - сыворотка с преднизолоном, разбавленная изотоническим раствором. По полученным данным строили график. Линейная зависимость оптической плотности от концентрации для растворов, содержащих сыворотку, сохранялась до концентрации 1 • 10"5 г/мл, при концентрациях менее 1 • 10"5 г/мл результаты искажались из-за мешающего влияния белков в сыворотке крови.

С целью увеличения чувствительности методики и воспроизводимости результатов решили использовать методику осаждения белков.

Были использованы классические методы осаждения белка. Выбор объема пробы осуществлялся, исходя из данных в научной литературе.

Из различных вариантов опробированных осадителей мы предпочли методику с использованием в качестве раствора А: 12,5 г гпБС^ • 7Н20 + 125 мл 0,125 М Н2804 и раствора Б: 0,75 М ЫаОН.

Процедура разбавления центрифугата 0,9 % №С1 необходима для снижения фона сыворотки.

Методика с осаждением белков

Для анализа брали в лаборатории 11 различных сывороток.

1. Приготовление раствора сравнения.

К 1 мл сыворотки добавляли 8 мл раствора А и 1 мл раствора Б. Перемешивали и помещали в центрифугу на 10 мин при 3000 об/мин. После осавдения белков из центрифугата брали 0,1 мл и добавляли 2,9 мл 0,9 % №С1.

2. Приготовление анализируемых образцов (10).

К 1 мл сыворотки добавляли 0,1 мл раствора преднизолона (2,5 • 10~2 г/мл), 8 мл раствора А и 1 мл раствора Б. Перемешивали и помещали в центрифугу на 10 мин при 3000 об/мин. Из центрифугата брали аликвоту 0,1 мл и добавляли 2,9 мл 0,9 % №С1. Измеряли оптическую плотность раствора на СФ-56 при X = 249 нм. Процент ошибки составил 2,69 %.

Использование условий пробоподготовкй для анализа преднизолона в моче. Для мочи аналогично использовали ту же методику количественного

определения преднизолона, что и в сыворотке крови (рис.4).

Рис. 4. Спектр преднизолона в моче (С = 2,5 • 10"2 г/мл)

Длина волны преднизолона в моче составляла 245 нм (в сыворотке 249 нм). Провели статистическую обработку результатов 10 измерений преднизолона в моче, где процент ошибки составлял 3,24 %.

Следовательно, можно сделать вывод, что предлагаемая обработка биообъекта перед измерением подходит для любого объекта: сыворотки крови, мочи.

Подбор условий количественного определения циклофосфана в биологических объектах (модели). Измеряли оптическую плотность циклофосфана без осаждения белков. Образцы спектра не давали. Были получены спектры растворов различных концентраций циклофосфана в сыворотке в диапазоне концентраций от 1 ■ Ю-2 г/мл до 1-10-7 г/мл, но они имели нестабильную длину волны от X = 214 до X = 220 нм.

Поэтому, аналогично методике с преднизолоном, применили методы осаждения белков в различных вариациях и для циклофосфана.

Используя различные осадители только на варианте с 10 % раствором Ка2^Ю4-2Н20 и 0,335 М раствором Н2504, мы получили спектр (циклофосфан + сыворотка) при длине волны 210 нм. Спектр был сопоставим со спектром, полученным для циклофосфана в модельном растворе. Следовательно, можно предположить, что вариант подобранных концентраций

осадителей позволял наиболее полно осаждать белки в биологическом объекте и являлся оптимальным для нахождения аналитического сигнала циклофосфана.

Для вьыснения объема добавки препарата воспроизводили методику с осаждением белка при введении в сыворотку различных объемов циклофосфана.

В итоге максимальный объем был равен 0,6 мл циклофосфана в спирте этиловом с концентрацией 1 • 10~4 г/мл.

При добавлении больших объемов препарата (0,7 мл; 0,8 мл и т. д.) мы наблюдали смещение спектра, что связано с изменением соотношений концентраций (образование ассоциатов, агрегатов, т. е. образование коллоидного раствора, так как был превышен лимит растворимости циклофосфана в растворителе) и нарушением линейной зависимости Бугера-Ламберта-Беера.

Разработанные методики количественного определения циклофосфана и преднизолона в сыворотке крови (модели) и сравнение их с другими методиками. В таблице 2 представлено последовательное описание количественного определения лекарственных средств в биообъектах спектрофотометр ическим методом.

Таблица 2

Методики количественного определения препаратов в биообъектах

Методика с осаждением на преднизолон Методика с осаждением на циклофосфан

1. Приготовление раствора сравнения: К 1 мл сыворотки + 8 мл раствора А (гп304 • 7Н20 + 0,125 М Н28 04) и 1 мл раствора Б (0,75 М раствор №ОН). Центрифугирование проводили при 3000 об/мин., 10 мин. После осаждения белков из центрифугата брали 0,1 мл и добавляли 2,9 мл 0,9 % ШС!. 1. Приготовление раствора сравнения: К 1 мл сыворотки + 8 мл воды очищенной, 0,5 мл раствора А (10 % раствором №2\\Ю4 • 2Н20) и 0,5 мл раствора Б (0,335 М раствор Н2Э04). Перемешивали и помещали в центрифугу на 10 мин при 3000 об/мин. Из центрифугата брали аликвоту 0,1 мл и добавляли 2,9 мл 96,6 % спирта этилового.

Продолжение таблицы 2

2. Приготовление анализируемого образца:

К 1 мл сыворотки + 0,1 мл раствора -г

преднизолона (2,5 -10 г /мл), 8 мл раствора А и 1 мл раствора Б. Перемешивали и помещали в центрифугу на 10 мин при 3000 об/мин. Из центрифугата брали аликвоту 0,1 мл и добавляли 2,9 мл 0,9 % №С1. Измеряли оптическую плотность раствора при К = 249 нм.

2. Приготовление анализируемого образца:

К 1 мл сыворотки + 0,1 мл раствора

-2

циклофосфана в спирте (С = 1 • 10 г/мл), 8 мл воды очищенной, 0,5 мл раствора А, 0,5 мл раствора Б. Перемешивали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Из центрифугата брали аликвоту 0,1 мл и добавляли 2,9 мл 96,6 % спирта этилового. Раствор измеряли при длине волны 211 нм.

Преимуществами предложенных методик была экспрессность, время единичного анализа составляло 1мин (с проведением пробоподготовки 15 мин, включая пробоподготовку от 2 до 10 биологических объектов одномоментно). Более того, сама пробоподготовка оказалась универсальной для любого биологического объекта: крови, мочи (что было описано выше на примере преднизолона).

Также провели сравнение определения препаратов в биологических объектах (сыворотка крови) на циклофосфан и преднизолон методами спектрофотометрии и титриметрии, предложенными в научной литературе.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИК ДЛЯ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Данная глава посвящена изучению возможности применения разработанных методик спектрофотометрического количественного определения циклофосфана и преднизолона для целей фармакокинетических исследований у пациентов с лимфомой.

Для апробации разработанных методик определения преднизолона и циклофосфана фармакокинетические исследования на начальном этапе проведены на лабораторных животных крысах-самцах массой 300 - 400 г при

17

внутрибрюшинном введении лекарственных препаратов в дозе 0,63 мг (для преднизолона) и 8,4 мг (для циклофосфана).

После экспериментов с использованием лабораторных животных исследования продолжили на образцах сыворотки крови, полученных от пациентов с лимфомой, которые были госпитализированы в гематологическое отделение для проведения программной полихимиотерапии.

Данный фрагмент научной работы выполнен на базе Муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 2» под руководством д-ра мед. наук, проф. Т. И. Поспеловой.

В фармакокинетические исследования по каждому препарату было включено 8 пациентов для циклофосфана и 5 - для преднизолона в возрасте от 22 до 70 лет, с массой тела от 54 до 82 кг. От всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Забор крови осуществляли до введения препарата и через определенные интервалы времени для преднизолона (через 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 24 ч) и для циклофосфана (через 1 ч, 3 ч, 5 ч, 8 ч, 12 ч) после внутривенного капельного введения препаратов в виде инъекционных растворов.

Наиболее пригодной для анализа концентрации препарата в крови, плазме и сыворотке является одночастевая модель, при которой организм представляют в виде единой, гомогенной камеры.

Результаты фармакокинетических исследований преднизолона и циклофосфана на животных и пациентах. Пробоподготовку сыворотки крови осуществляли путем подобранного метода осаждения.

На рисунке 5 представлены индивидуальные фармакокинетические кривые (фармакокинетический профиль) преднизолона и циклофосфана для животных и пациентов.

Индивидуальные фармакокинетические кривые (фармакокинетический профиль) циклофосфана для животных и пациентов характеризуются присутствием двух максимумов, при этом второй максимум превышает первый. Первый максимум расположен в области 1 - 3 часов, второй максимум

расположен в области 5-8 часов. Таким образом, можно предположить, что препарат может частично связываться с белками крови, одновременно поступая во внутреннюю среду лимфоцита, при этом первый пик соответствует концентрации лекарственного средства, присутствующего непосредственно в кровяном русле. Второй пик соответствует концентрации циклофосфана,; присутствующего в кровяном русле, а также количеству циклофосфана, вышедшего из разрушенного лимфоцита в соответствии с механизмом действия препарата (циклофосфан разрушает лимфоциты и поступает обратно в кровяное русло).

Время, ч

Примечание. Фармакокинетические кривые:

1 - преднизолона, вводимого пациентам (через 1 ч после введения, 2,3,4,24 ч);

2 - преднизолона, вводимого животным (через 1 ч после введения, 2, 3,4,24 ч);

3 - циклофосфана, вводимого пациентам (через 1 ч после введения, 3, 5, 8,12 ч);

4 - циклофосфана, вводимого животным (через 1 ч после введения, 3,5, 8,12 ч);

Рис. 5. Фармакокинетические кривые преднизолона и циклофосфана при исследовании на животных и пациентах

При анализе результатов фармакокинетических параметров, представленных в таблице 3, необходимо отметить следующее: период полуэлиминации, практически так же, как и у животных, составляет 12,24 часа,

19

но это касается только того количества препарата, который в неизменном виде циркулирует в кровяном русле. Константа скорости абсорбции выше, а время наступления максимального эффекта составляет порядка двух часов. Высокое значение данного параметра можно объяснить тем, что людям вводили преднизолон внутривенно капельно, тогда как животным - внутрибрюшинно.

Таблица 3

Результаты оценки фармакокинетических параметров преднизолона и

циклофосфана при парентеральном введении животным и пациентам

Фармакокинетические параметры ПРЕДНИЗОЛОН ЦИКЛОФОСФАН

животные пациенты животные пациенты

tm, ч 11,97 12,24 5,66 5,53

1мах>4 1,48 2,0 3,77 4,09

кзт мин'1 0,15 0,46 0,39 0,48

ка, мин 1,51 0,97 0,77 0,80

Cs, мг/л 0,09 0,07 1,64 0,48

Сер, мг/л 0,05 0,006 1,03 0,002

Сфмг/л 0,06 0,04 1,09 2,34

Смах, мг/л 0,10 0,07 1,72 0,51

Со, мг/л 0,07 0,35 1,89 1,03

Vi, л 1340,56 5273,52 18,50 2045,80

С1ь л/мин 232,54 718,69 6,80 850,31

г,ч 7,52 9,63 4,48 5,92

DH,M2 2,53 3343,16 26,04 1418,08

•Опод, мг 0,53 40,30 6,17 348,24

S 2,10 2,65 3,10 3,18

AUC, мг-мин/мл 0,01322 1,3800 9,77 2,6835

Если сравнивать фармакокинетические кривые и значения фармакокинетических параметров, то необходимо отметить: препарат, метаболизируясь в тканях организма, снова может поступать в кровь, но это не оказывает влияния на фармакокинетические параметры, так как глюкурониды и сульфаты окисленных форм не обладают фармакологической активностью.

Обращает на себя внимание очень низкий показатель концентрации препарата в крови, среднее значение которого составляет 0,07 мг/л (рис. 5), что можно объяснить сопутствующими заболеваниями обследованных пациентов, а также тем, что терапия преднизолоном проводилась не в виде монотерапии, а в сочетании с противоопухолевыми препаратами.

ВЫВОДЫ

1. Впервые определены оптимальные условия (X, растворитель, Т 'С, диапазон определяемых концентраций) спектрофотометрического анализа на субстанциях:

- для циклофосфана X, = 211 нм, растворитель 96,6 % спирт этиловый

(Т 'С +2-6), диапазон определяемых концентраций от 1 • 10~2 до 1 • 10"7 г/мл;

- для преднизолона X = 249 нм, растворитель 0,9 % натрия хлорид

(Т °С +20-25), диапазон определяемых концентраций от 2,5 • 10~5 до 2,5 • 10"7 г/мл.

На основе данных условий разработаны методики их количественного определения в модельных растворах и биологических объектах.

2. Проведен сравнительный анализ результатов количественного определения лекарственных веществ для модельных растворов циклофосфана методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофотометрии и титриметрии. Разработанная спектрофотометрическая методика для циклофосфана сопоставима с уже известной методикой ВЭЖХ, где X = 210 нм, и с результатами тигриметрической методики (ГФ), но в сравнении с ВЭЖХ и титриметрией более экспрессна. Модифицирована методика спектрофотометрического анализа преднизолона (>» = 249 нм, растворитель 0,9 % натрия хлорид), которая также сопоставима с известной спектрофотометрической методикой (ГФ), где X = 242 нм и растворитель метанол.

3. Разработанные методики преднизолона и циклофосфана

адаптированы для готовых лекарственных форм:

- таблетки (преднизолон) - погрешность методики не более 3,05 %; -порошок лиофилизированный (циклофосфан) - погрешность методики не более 4,55 %.

4. Подобраны оптимальные условия пробоподготовки сыворотки крови для определения циклофосфана и преднизолона, при этом объем анализируемых образцов составил от 0,5 до 1,0 мл, что позволит проводить фармакокинетические исследования пациентов в щадящем режиме. Также определены оптимальные концентрации осадителей, при которых наиболее полно происходит осаждение белков в исследуемой биологической пробе (сыворотке крови, моче).

5. Рассчитаны фармакокинетические параметры (начальная и поддерживающая дозы, период полувыведения, константа скорости элиминации, константа скорости всасывания, токсическая и эффективная концентрации) преднизолона и циклофосфана на основе разработанного спектрофотометрического экспресс-метода при анализе сыворотки крови животных. Полученные параметры согласуются с данными в научной литературе.

6. Проведены фармакокинетические исследования и рассчитаны параметры преднизолона и циклофосфана у больных с лимфомой. Данные параметры могут быть использованы для мониторинга концентраций и подбора индивидуальных доз лекарственного средства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лигостаев А. В., Ивановская Е. А., Кокорина Н. О., ОсинцевД. И., Терентьева С. В. Спектрофотометрическое определение преднизолона и циклофосфана // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - Т. 25, № 1. - С. 49 -51.

2. Лигостаев А. В., Ивановская Е. А., Терентьева С. В. Сравнительное изучение фармакокинетики преднизолона и циклофосфана // Вопросы

22

патогенеза типовых патологических процессов: труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Новосибирск, 2010. - С. 214 - 216.

3. Лигостаев А. В. Количественная оценка преднизолона с помощью спектрофотометрического метода // Авиценна - 2007 : материалы ежегодной; конкурс-конференции студентов и> молодых ученых. - Новосибирск : Сибмедиздат, 2007. - С. 478.

4. Лигостаев А. В. Спектрофотометрический анализ преднизолона и циклофосфана // Авиценна - 2009 : материалы ежегодной конкурс-, конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск: Сибмедиздат, 2009.-С. 359-360.

5. Лигостаев А. В., Ивановская Е. А. Фармакокинетическое исследование онкопрепаратов в биологических объектах // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С. 362 - 363.

6. Лигостаев А. В., Ивановская Е. А. Количественный анализ преднизолона и циклофосфана в биологических объектах // Авиценна - 2010 : материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск : Сибмедиздат, 2010. - С. 359 - 360.

л

На правах рукописи Лигостаев Александр Валерьевич

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНА И ЦИКЛОФОСФАНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ И ИЗУЧЕНИЯ ИХ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У ЖИВОТНЫХ И ОНКОБОЛЬНЫХ

Специальность 14.04.02 —■ фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Я. В. Андриановой

Подписано к печати 28.04.2011. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф. _Гарнитура «Тайме». Печ. л.3,0. Тираж 100 экз. Заказ 936_

Санкт-Петербург 2011

Актуальность проблемы

В медицинской практике для лечения опухолевых процессов, в частности для лимфом, широко практикуют периодическое применение цитостатиков и глюкокортикоидов. Так, например, в схемы лечения онкологических больных включены препараты: циклофосфан, имеющий противоопухолевый эффект, и преднизолон, обладающий противовоспалительным действием [10; 11; 19; 50; 68; 113]. При курсовом применении цитостатики вызывают ряд осложнений: снижение иммунитета, присоединение бактериальных, вирусных, грибковых инфекций, что приводит к удлинению сроков лечения, а нередко, и к угрозе жизни. Только в поддерживающую терапию входит 4 курса индукции препаратами: цитарабин, 6-меркаптопурин, циклофосфан, винкристин, преднизолон, доксорубицин. Схемы лечения лимфом отрабатываются в специализированных гематолого-онкологических клиниках, что позволяет корректировать программы лечения [122].

Длительность поддерживающей терапии составляет 2 года и в настоящее время проводится амбулаторно с учетом мониторинга.концентрации вводимых лекарственных средств.

При выборе оптимальной тактики лечения онкобольных необходимо принимать во внимание индивидуальные особенности организма, возраст, образ жизни и сопутствующие заболевания. Известно, что стандартная дозировка лекарственного средства (ЛС) не всегда позволяет достичь желаемого результата, а в некоторых случаях, наряду с положительным эффектом, вызывает обширные побочные явления, поэтому проведение фармакокинетических исследований с терапевтическим мониторингом содержания лекарственных средств в биологических средах организма (сыворотке или плазме крови, слюне, моче и т. д.), является одним из основных способов оптимизации индивидуальной терапии, что особенно важно при комбинированном применении лекарств, неясных причинах их неэффективности или плохой переносимости [17; 53; 59; 65; 72].

Мониторинг (постоянное наблюдение) за содержанием лекарственных веществ в биологических средах организма позволяет осуществлять своевременную коррекцию фармакотерапии, особенно у категории лиц с онкозаболеваниями.

Благодаря внедрению в медицинскую практику высокочувствительных методов определения концентрации ЛС в биологических средах: хроматографических, ферментохимических, спектрофотометрических [6; 18; 30; 61; 70; 108], стало возможным изучение фармакокинетики. На основании данных о фармакокинетике определяют дозы, оптимальные пути введения, режим и длительность назначения препаратов. Внедрение в медицинскую практику вышеуказанных методов дало возможность качественно и количественно оценить поведение препарата в организме человека, а также своевременно откорректировать тактику комплексной фармакотерапии. К сожалению, не все описанные в литературе методики количественного определения лекарственных средств можно отнести к экспресс-методам, которые, на сегодняшний день, становятся все более востребованными для мониторинга концентраций, поскольку проведение скрининговых исследований для каждого пациента помогает врачу подобрать оптимальную терапевтическую дозу с учетом особенностей организма. Экспрессность метода зависит от методического обеспечения, приборной базы, наличия реактивов, условий выбора и проведения пробоподготовки биологического объекта. Кроме того, не только сочетание высокой точности, воспроизводимости, а также экспрессности крайне востребовано на фармацевтических производствах, где качество изготовленных лекарственных форм определяют поточным методом.

Всем перечисленным характеристикам отвечают оптические методы анализа, в частности, спектрофотометрические (СФМ), которые нашли широкое применение при анализе объектов окружающей среды, продуктов питания, в фармацевтической деятельности [96; 111].

Несложное и недорогое лабораторное оборудование, более легкая, по сравнению с другими методами, пробоподготовка делают спектрофотометрию очень перспективной для количественного экспресс-определения ЛС как в стандартных растворах, так и в биологических средах. При этом особое внимание следует обратить на целесообразность использования одного метода и одной и той же методики для анализа лекарственного средства в виде субстанции, в составе лекарственной формы, а также как ксенобиотика, поступившего во внутреннюю среду организма [24]. Перечисленные аспекты явились определяющими факторами в выборе научной и практической направленности данной работы.

Представляет интерес изучение возможности использования спектрофотометрии как ключевого метода в контроле качества и для целей терапевтического мониторинга циклофосфана и преднизолона.

Для количественного определения преднизолона Государственная фармакопея (ГФ) предлагает методику спектрофотометрического определения в различных лекарственных формах [13; 15]. В существующей методике используются сильнодействующие органические растворители высокой степени очистки (метанол). Этот факт осложняет выполнение исследований по данной методике из-за приобретения растворителя, в особенности для рутинных анализов.

Для количественной же оценки циклофосфана в ГФ описана методика обратного аргентометрического титрования, которая длительна по времени определения и имеет невысокую чувствительность [13].

Таким образом, разработка экспресс-методик количественного определения циклофосфана и преднизолона спектрофотометрическим методом, а также проведение на их основе фармакокинетических исследований и мониторинга концентраций позволят не только расширить показания к назначению данных лекарственных средств, создать оптимальные алгоритмы их использования для онкобольных, но и во многом реализовать индивидуальный подход при подборе терапии в каждом конкретном случае.

Цель работы

Изучение возможности применения спектрофотометрического анализа количественного экспресс-метода определения циклофосфана и преднизолона для анализа лекарственных форм и биологических объектов, проведение фармакокинетических исследований у животных и у онкобольных для мониторинга концентраций лекарственных веществ.

Задачи исследования

1. Подобрать условия количественного спектрофотометрического определения преднизолона и циклофосфана на модельных растворах (субстанциях).

2. Сравнить разработанные методики количественного определения лекарственных средств с фармакопейными методиками.

3. Применить разработанные методики преднизолона и циклофосфана для готовых лекарственных форм.

4. Адаптировать спектрофотометрические методики преднизолона и циклофосфана для биологических объектов, подобрать условия пробоподготовки.

5. Применить разработанные экспресс-методики для фармакокинетических исследований на животных и сравнить их с данными в научной литературе.

6. Провести фармакокинетические исследования и рассчитать параметры у онкобольных с помощью разработанных спектрофотометрических методик.

Научная новизна

1. Впервые разработаны методики количественного спектрофотометрического экспресс-определения циклофосфана и модифицирована методика определения преднизолона в модельных растворах (субстанциях).

2. Разработанные методики адаптированы для целей контроля качества лекарственных препаратов (таблетки, растворы, лиофилизированный порошок для инъекций).

3. Впервые определены оптимальные условия пробоподготовки сыворотки крови и мочи (объем пробы и концентрация осадителей) при количественном определении циклофосфана и преднизолона.

4. На основе разработанных спектрофотометрических экспресс-методик проведены фармакокинетические исследования для преднизолона и циклофосфана на животных, определены следующие параметры: начальная и поддерживающая дозы, период полувыведения, константа скорости элиминации, константа скорости всасывания. Полученные параметры подтверждены данными в научной литературе.

5. Впервые проведены фармакокинетические исследования и рассчитаны основные показатели у групп онкологических больных с лимфомой для дальнейшего использования этих показателей в мониторинге концентраций лекарств и для подбора индивидуальных доз лекарственных средств.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России по теме «Разработка методик количественного определения лекарственных препаратов в биологических средах и проведение фармакокинетических исследований» (номер государственной регистрации 01200956813).

Практическая значимость

Впервые разработаны экспрессные методики количественного определения циклофосфана и преднизолона, которые могут использоваться для количественной оценки в объектах: сыворотке, моче, таблетках, растворах, лиофилизированном порошке. Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы и Производственного объединения ООО «Диафарм» (г. Бердск). Акты внедрения приведены в Приложении А.

Полученные параметры фармакокинетических исследований лекарственных веществ с помощью предложенных методик позволят проводить мониторинг в терапии препаратами «Циклофосфан» и «Преднизолон» для пациентов с онкологическими заболеваниями крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Условия спектрофотометрического определения циклофосфана и преднизолона, позволяющие регистрировать спектральные кривые лекарственных средств в стандартных растворах и биологических объектах.

2. Прямолинейная зависимость между величиной оптической плотности и концентрацией препарата говорит о незначительном влиянии компонентов крови на величину аналитического сигнала. Минимально-определяемая концентрация составляет 1-10 г/мл.

3. Условия пробоподготовки (подбор концентраций осадителей) в биологическом образце и определение объема пробы для количественного анализа.

4. Показатели фармакокинетических исследований при введении циклофосфана и преднизолона у пациентов с онкозаболеванием (лимфома) с помощью разработанных спектрофотометрических методик.

Апробация работы

Основные результаты диссертации обсуждены и одобрены на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010), на научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2007), на научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2010), на межвузовской научной конференции «Актуальные вопросы фармакологии и фармации», посвященной памяти профессора В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ (Курск, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 1 стагжг^ъя — в ведущем рецензируемом научном журнале, рекомендуемом ВАК МиноС^^щрнауки России.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 123 страницах машиноиисного текста и состоит из введения, обзора литературы, описаний матер:1и~^алтов и методов исследования, 3-х глав описаний собственных исследований, пзодов.

Диссертация содержит 28 таблиц и 31 рисунок. Список литературы вьеииочает 126 источников, из котрых 37 — зарубежных авторов.

Исследование одобрено локальным комитетом по этике НовосиС>-Ь=^жгрского государственного медицинского университета. Выписка из пр><^г>-хокола заседания комитета по этике № 20 от 21.01.2010 приведена в Приложешаггинс Б.

Личный вклад автора

Разработка методик количественного определения преднизолшгона и циклофосфана, работа с лабораторными животными, работа с сыв<^1^зэоткой крови пациентов, расчет фармакокинетических параметров, статист:*-!-«ческая обработка полученных результатов, написание диссертации выполнешЕ^гц лично автором.

выводы

1. Впервые определены оптимальные условия (А,, растворитель, Т °С, диапазон определяемых концентраций) спектрофотометрического анализа на субстанциях: для циклофосфана X = 211 нм, растворитель 96,6 % спирт этиловый,

0 ^

Т С +2-6), диапазон определяемых концентраций от 1-10 до 1 • 10 г/мл;

- для преднизолона X = 249 нм, растворитель 0,9 % натрия хлорид,

Т °С +20-25), диапазон определяемых концентраций от 2,5 • Ю-5 до 2,5 • 10~7 г/мл.

На основе данных условий разработаны методики их количественного определения в модельных растворах и биологических объектах.

2. Проведен сравнительный анализ результатов количественного определения лекарственных веществ для модельных растворов циклофосфана методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофотометрии и титриметрии. Разработанная спектрофотометрическая методика для циклофосфана сопоставима с уже известной методикой ВЭЖХ, где А, = 210 нм и с результатами титриметрической методики (ГФ), но в сравнении с ВЭЖХ и титриметрией является более экспрессной. Модифицирована методика спектрофотометрического анализа преднизолона (X = 249 нм, растворитель 0,9 % натрия хлорид), которая также сопоставима с известной спектрофотометрической методикой ГФ, где X = 242 нм и растворитель метанол.

3. Разработанные методики преднизолона и циклофосфана адаптированы для готовых лекарственных форм: таблетки (преднизолон) — погрешность методики не более 3,05 %;

- порошок лиофилизированный (циклофосфан) — погрешность методики не более 4,55 %.

4. Подобраны оптимальные условия пробоподготовки сыворотки крови для определения циклофосфана и преднизолона, при этом объем анализируемых образцов составил от 0,5 до 1,0 мл, что позволит проводить фармакокинетические исследования пациентов в щадящем режиме. Также определены оптимальные концентрации осадителей, при которых наиболее полно происходит осаждение белков в исследуемой биологической пробе (сыворотки крови, моче).

5. Рассчитаны фармакокинетические параметры (начальная и поддерживающая дозы, период полувыведения, константа скорости элиминации, константа скорости всасывания, токсическая и эффективная концентрации) преднизолона и циклофосфана на основе разработанного спектрофотометрического экспресс-метода при анализе сыворотки крови животных. Полученные параметры согласуются с данными научной литературы.

6. Проведены фармакокинетические исследования и рассчитаны параметры преднизолона и циклофосфана у больных с лимфомой, которые могут быть использованы для мониторинга концентраций и подбора индивидуальных доз лекарственного средства.