Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Экспериментальные модели в патогенезе холеры

РГб од

' " ' КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНИТАРНО-ЗГВДЕШОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

На правах рукописи БАРДЩ Ирина Дмитриевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ШДЕЛИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ХОЛЕРЫ

14.00.16 - патофизиология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 1993

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук, доцент В.П.Авроров Доктор медицинских наук, профессор Ю.Ы.Ломов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент Российской Академии Технических наук, заслуженный изобретатель РСФСР А.К. Адамов

Кандидат медицинских наук Л.В.Саяпина

Ведущая организация:

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Автореферат разослан "/?-" „^^ е<. --¿: — 1993 г.

Защита состоится "18 " июня_ 1993 г. на заседании

специализированного Совета- К 074 32 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Ш^роб" (410071, г.Саратов, Университетская ул., 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Шкроб".

Ученый секретарь специализированного Совета

к.м.н.

З.Л.Девдариани

■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Холера - острое кишечное заболевание, которое относится к особо опасным инфекциям. В основе патогенеза лежит колонизация холерными вибрионами тонкого кишечника и выработка ими экзо- и эндотоксинов. Ведущее значение принадлежит экзотохсицу, белковому комплексу, состоящему из нетокснчес-. ких и токсических субъединиц, суммарное действие которых направлено на активацию аденилатциклазной системы эпителия кишечника, что ведет к интенсивному выделению этими клетками в просвет кит- -ки солей и воды.

Другие токсины холерного вибриона и токсические субстанции способствуют развитию инфекционного процесса на различных этапах болезни и обусловливают ряд клинических СИМПТОМОВ (Holmgren, 1981; Mekalanos, 1988; West, 1989).

Ведущим симптомом в заболевании холерой является огромная потеря организмом жидкости со рвотой и диареей, что приводит к водно-элеггролитному расстройству - основной клинический синдром этой инфекции. Патология водно-электролитного обмена, ее правильная диагностика и оценка представляют одну из самых сложных проблем клинической медицины.

Для изучения патогенеза холеры необходимо рассматривать инфекционный процесс во взаимодействии макро- и микроорганизма, где наглядно проявляет свое действие закон единства и борьбы противоположностей. С одной стороны организм человека восприимчив к заражению холерой, с другой стороны обладает рядом факторов специфической и неспецифической защиты: кислая ср»да желудка, к которой чрезвычайно чувствителен холерный вибрион, строение эндотелия тонкого кишечника, включающего гликокаликс, слизь, бактерицидные вещества плюс сильная перистальтика кишечника -все это составляет естественный барьер против инфекции ( Schi-raldi et ai., 1975; Авроров В.П. с соавт.,1977; Адамов А.К., 1985; Семиотрочев В.Л.,1991).

Холерный вибрион, способный вызвать заболевание, обладает патогенностью - это сложный процесс, слагающийся из нескольких факторов, каждый из которых действует на определенном этапе развития инфекции. Наиболее важные - хематоксис, подвижность, адгезивность, целый ряд ферментов, создающих дополнительные условия для проникновения и прикрепления микроорганизмов к эндо-

телию кишечника и дальнейшей продукции ими экзотоксина (Kaper et ai., 1981; Гинцбудг А. JI. с соавт., 1987).

Несмотря на то, что в естественных условиях холерой болеют только люди, моделирование инфекционного процесса воспроизводят на животных, подбирая более чувствительные виды, снижая резистентность макроорганизма, отрабатывая, различные способы заражения и применяя вирулентные штаммы холерных вибрионов в необходимых дозах.

Цель работы. Модифицировать существующие экспериментальные модели холеры на различных видах животных, провести оценку каждой из них с точки зрения соответствия холере у человека и сравнить наиболее информативные показатели в клинике и эксперименте.

Задачи исследования. Моделировать процесс инфицирования и развития холеры на экспериментальных животных для изучения ее патогенеза, сопоставляя с клиническими наблюдениями и исследованиями : 1

1. Проанализировать клинические материалы, полученные в результате обследования и лечения больных холерой и обобщить факторы, нарушающие защитные механизмы организма к этой инфекции.

2. Изучить на лабораторных животных факторы риска, способствующие заражению холерой людей.

3. Исследовать адгезию холерных вибрионов к-энтероцитам кишечника и роль кишечного сока и кишечной микрофлоры у экспериментальных животных в зависимости от вирулентности штаммов микроорганизмов.

4. Установить роль гипокалиемии в механизме заражения холерой на модели холерной инфекции кроликов-сосунков и других лабораторных животных.

5. Изучить энтеротоксигенно'сть штаммов холерных вибрионов, используя мышей-сосунков.

6. Апробировать модель "опечатанной" взрослой мыши для определения интенсивности развития инфекционного процесса и проверки профилактических препаратов против холеры.

Научная новизна; . ,

- проведенные систематические исследования клинических параметров у больных холерой в остром периоде и, спустя 7-8 месяцев после перенесенной инфекции, позволили выявить и проанализировать данные, способствующие заражению холерой, воспроизвести и изучить процесс инфицирования на различных видах лабораторных

животных в сравнительном аспекте с клиническими исследованиями;

- изучение развития холерного процесса в кишечнике, позво-лйло установить бактерицидное действие кишечного сока на холерные вибрионы и.его роль.в размножении возбудителей в зависимости от степени их вирулентности;

- впервые показано влияние состояния водно-электролитной системы организма, а именно гипОкалиемии, на развитие холеры.

Теоретическая и практическая значимость. Проведен анализ клинических материалов больных холерой и реконвалесцентов и изучены факторы, способствующие заражению и развитию этой инфекции, с учетом этих данных моделирован процесс холеры на животных с целью изучения ее патогенеза.

- Установлено, что гипокалиемия способствует заражению холерой.

- Показано бактерицидное и- бактериостатическое действие кишечного сока на холерные вибрионы в зависимости от их вирулентности на модели холеры на кроликах-сосунках.

- Использована модель "взрослой" опечатанной мыши ,аля воспроизведения инфекционного процесса холеры и исследования профилактических и иммунологических препаратов' против холеры.

По материалам исследований составлены и внедрены в практику работы научно-исследовательских учреждений "Мзтодические рекомендации для оценки вирулентности холерных вибрионов по степени дегидратации кроликов-сосунков", "Методические рекомендации по внутрижелудочному заражению кроликов-сосунков и лабораторных животных холерными вибрионами", "Методические рекомендации по использованию мышей-сосунков для определения энтеротоксигенности холерных вибрионов", "Методические рекомендации по получению адгезии холерных вибрионов методом люминисцентной микроскопии на модели одномесячных кроликов", "Методические рекомендации по определению токсигенности холерных вибрионов 01 и не 01 групп на модели взрослых "опечатанных" мышей". -

Положения, выносимые на защиту:

1. Гипо- и анацидные состояния желудочной секреции человека способствуют заражению холерой, разработанные на основании этих данных модели холеры на кроликах и щенках,позволяют изучить факторы риска, предрасполагающие к этой инфекции.

2. Адгезия холерных вибрионов к энтероцитам кишечника кроликов, бактерицидное и бактериостатическое'действие кишечного сока и размножение микроорганизмов зависит от их вирулентности и

- б -

влияет на развитие инфекционного процесса.

3. Количество белка в образовавшемся секрете кишечника кроликов-сосунков, зараженных взвесью холерных вибрионов, коррелирует с вирулентностью микроорганизмов.

4. Конкурирующую роль кишечной микрофлоры при заражении холерой позволяет изучить модель изолированной петли тонкого.кишечника щенков по методу Тири-Велла.

5. Наличие гипокалиеыии у кроликов-сосунков способствует заражению холерой этих животных за счет ослабленной перистальтики. кишечника.

6. Характеристика штаммов холерных вибрионов с количественной оценкой возможна при заражении мышей-сосунков.

7. Модель'холеры на "опечатанных" взрослых мышах позволяет использовать их для воспроизведения холерной инфекции и апробации профилактических препаратов против холеры.

Апробация работы, фрагменты диссертации•доложены■на областной конференции "Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города" в 1987 г., на Всесоюзной школе-семинаре, патофизиологов Ъ Калуге в 1985, 1987 гг., на научных конференциях Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, в Институте профилактической медицины в Братиславе в 1989 г., в Департаменте медицинской микробиологии и иммунологии Университета г.Гётеборга, Швеция в 1991 г., на Всесоюзной конференции по холере в Ростовском противочумном институте в 1992 г;

Публикации. В результате выполнения работы получено два авторских свидетельства (№ 795015, 1980г.; № 1674217, 1991г.). Содержание диссертации отражено в 12 опубликованных статьях, 7 тезисах.'

■ Объем и структура работы. Текст работы изложен на 143 страницах машинописи, иллюстрирован 28 таблицами, 5 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы., описания материалов и методов исследования, изложения собственных исследований, состоящих из 4 глав, заключения и выводов. Библиографический указатель содержит 83 источника отечественной и 101 зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Для исследования использованы: беспородные кролики 1-дневные - 20-дневные, массой 80 г - 200 г, 1-2

месячные - 800 г - 2000 г; беспородные щенки, массой 2000 г; ыыши-сосунки - 2-3 г, взрослые мыши, беспородные и Ва1Ъ-с, массой .16—18 г.

В опытах использовано 20 штаммов холерных вибрионов, из них I классического биотипа, 19 биотипа эльтор: 10 штаммов были холерогенными, типичными по всем свойствам; 10 нехолероген-ные, а та*кже 5 штаммов холерных вибрионов не 01 группы.

В работе пользовались методами для определения клинических параметров:

- определение электролитного состава крови проводили на пламенном фотометре ФПЛ-I г. Киев, согласно инструкции;

- хлорида сыворотки крови осуществляли титриметрическим методом по Раппопорт (Тодороз И., 1968);

- исследование секреторной функции желудка производили титриметрическим способом с предварительным пробным завтраком по Боас-Эвальду при одномоментном заборе желудочного содержимого или употреблением спиртового завтрака при фракционном заборе желудочного содержимого (Тодоров И., 1968);

- удельный вес сыворотки и цельной крови определяли по методу R.A.Phillips (1963);

- гематологические показатели изучали по общепринятым методикам: подсчет-количества лейкоцитов и эритроцитов осуществляли в камере Горяева (Тодоров И., 1968); .

- количество белка в содержимом кишечника определяли по методу Лоури (Тодоров И., 1968).

Для изучения влияния желудочной секреции на холерные вибрионы кроликов-сосунков заражали вцутрижелудочно по методу В.П. Авророва с соавт. (1977) с предварительной нейтрализацией 3-6% содой и без нее.

Адгезию холерных вибрионов определяли несколькими способами: .

-ПО методу J.W.BhQttaoharjee, ■ B.S.Sriwastava (1979);

- путем подсчета числа вибрионов, содержащихся в гомогена-те, полученном из резецированного отрезка кишечника кроликов-сосунков, зараженных взвесью холерных вибрионов различной вирулентности;

- люминисцентным - при просмотре и подсчете вибрионов, ад-гезированных к энтероцитам 1-месячных кроликов в мазках,.окрашенных люминесцентной сывороткой.

. Влияние специфических сывороток на адгезию холерных вибрио-

нов изучали по методике Chitnis с соавт. (1982). Использовали сыворотки: 0-холерную диагностическую агглютинирующую Саратовского института "Микроб" (серия 117), антитоксическую к токсину-сырцу холерного вибриона Vieltor 1310, по.цученцую ■ в лаборатории патофизиологии (авторское свидетельство № 792931).

Для исследования действия кишечного сока н§ холерные вибрионы изолировали петли тонкого кишечника взрослых кроликов по Тири в модификации Е.В.Глянько (1981). При постановке опытов инкубировали смесь с различным разведением кишечного сока (в 5-10 раз) и различной концентрацией холерных вибрионов (10^-10® м.к./мл) с последующим высевом на пластины агара Мартена. Контролем служила взвесь холерных вибрионов в физиологическом раст- -воре с соответствующей концентрацией,, инкубируемой в тех же условиях, что и опытные пробы и. высев вибрионов для определения количества жизнеспособных клеток в исходной посевной дозе.

•Для определения интенсивности размножения вибрионов в просвете кишечника кроликов-сосунков использовали холерные вибрионы различной вирулентности в дозах от 10^ до 10® м.к../мл. Животных забивали через 1,4 и 18 часов-после заражения, резецировали отрезок подвздошной кишки длиной I см и помещали в I мл физиологического раствора и раститроэывали методом 10-кратных разведений. Остальных животных вскрывали по мере гибели. В содержимом кишечника определяли количество белка по Лоури .(Тодоров И., 1958).

Щенков заражали взвесью холерных"вибрионов по методу sack-Carpenter (1969), для снижения резистентности перед заражением некоторым животным подкожно вводили актиномицин Д в дозе 0,10,15 мг/кг веса.- Другой партии щенков внутрижелудочно перед заражением вводили 60% этиловый спирт из расчета 10 мл/кг веса животного для изучения возможности заражения холерой без предварительной нейтрализации содой.

Действие холерных вибрионов и токсинов на секрецию кишечника изучали на модели изолированной петли кишечника щенков по способу Тири-Велла.

(Ai шей-сосунков использовали для оценки энтеротоксигенных свойств вибрионов по методике Dean с соавт. (1972

Для воспроизведения холерной инфекции и апробации профилактических препаратов против холеры была применена модель "опечатанные" взрослые мыши ( Richarelson et al., 1984,1986) в нашей модификации (авторское свидетельство № I6742I7, I99I).-

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЭДЕНИЕ

В настоящей работе были проведены систематические исследо- ' вания показателей крови и водно-электролитного обмена,- которые -. нарушаются при заражении этой инфекцией у больных, вибриононоси-'телей и реконвалесцентов.1 Всего было обследовано 500 человек.

Особое внимание мы уделили изучению роли желудочного барье- ■ ра в заражении холерой и факторам риска, снижающим этот защит-' ный механизм, таким, как алкоголизм, хронические заболевания желудочно-кишечного тракта и среде, в которой холерный вибрион попадает в желудок.

Из данных клинических обследований и изучения анамнеза нами установлено, что у лиц,.перенесших холеру, гипо- и анацидные состояния желудочной секреции составляли 58,7%; лица с нормальной секрецией 'желудочного сока употребляли алкоголь непосредственно перед заражением - 25% или постоянно - 40%, что является предрасполагающим фактором для заражения холерой, так как спирт в высоких концентрациях повреждающе действует на слизистую желудка и тормозит выработку желудочного сока, снижая таким образом естественно функционирующий барьер для проникновения холер" ных вибрионов (табл.1).

Проведенные исследования водно-электролитного обмена и некоторых гематологических показателей у больных холерой в остром периоде определили типичные нарушения, возникающие при этой инфекции, те же параметры, изученные у пациентов, перенесших холеру, спустя 7-8 месяцев, нормализовались.'

Как известно, у животных существует видовой иммунитет к холере и получить инфекционный процесс, адекватный клинике человека на одной модели не представляется возможным, поэтому мы разработали и модифицировали существующие модели для изучения различных сторон патогенеза холеры.

На модели холеры у новорожденных и взрослых кроликов был разработан внутрижэлудочный метод заражения и подтверждена роль желудочного барьера для развития процесса. Нами установлено, что без нейтрализации желудочного сока содой заражение невозможно. При сопоставлении результатов заражения per os и по способу 'Jutta и НаЪЬи получены аналогичные результаты;■оп-,■ ределена чувствительность метода при внутрижелудочном заражении взвесью вирулентного штамма холерного вибриона. Определены критерии заражения холерой взрослых кроликоб при внутрижелудочном способе инфицирования.

Таблица I

Состояние желудочной секреции у переболевших хрлерой и вибриононосителеЯ в процентах к общему количеству -обследованных

% гипоацид-j% .пациентов\% перенес-ных гастри-j со снижен- ;ших опера-

TOB '""" "

Группы обследованных больных

¡ной кислотностью в

анамнезе

нулевая кислотность

I

сниженная

.1

i об-. ! сле-!до-

■! вано

не об-сле-

до-вано

ции

на желудке

на кишечнике

% лиц с нормальной кислотностью, употр.алкоголь

ч-

по- j перед сто- ¡зара-янно ¡же-j нием

i

1. Перенесшие холеру и вибриононо-

сительство 23,1 33,5 18,9 2,1 4,2 8,4 25,0 '40,0

2. Лица в остром периоде холеры

3. Выделители

16,7 33,3 16,7 0 0 25,0 50,0 33,3

холерных вибрионов не 01 гр. (в остром периоде)

6,7 41,6 12,9 0 1,6 19,3 11,5 23,0

На модели кроликов изучена адгезия холерных вибрионов к клеткам кишечника тремя способами: с использованием дисков тонкого кишечника, микробиологическим и люминесцентным. Установлено, что вирулентные холерные вибрионы приживляются к энтероци-там кишечника в большей степени, чем невирулентные, их индекс на дисках кишечника взрослых кроликов составлял 34-23$ и 5,1%- . 2%, а у кроликов-сосунков - 12% и 7% соответственно: Шкробио-. логический метод исследования адвдзии к слизистой кишечника кроликов-сосунков также подтвердил способность вирулентных холерных вибрирнов в большей степени адгезироваться к энтероци-там по сравнению с невирулентными штаммами: 'I*10^—1*10^ м.к. на

I г веса кишечАжа кролика у вирулентных и IrIO-6-IO — I-10— -9-iO м.к. - у невирулентных. Люминесцентный способ исследования показал аналогичные результаты: на поверхности эпителиоци- 'тов из кишечника месячных кроликов наблюдается прикрепление ви-

рулентных холерных вибрионов во всем поле зрения и единичных -у невирулентного штамма.

Нашими исследованиями было показано антиадгезивное свойство -антитоксической сыворотки при ее предварительном введении в кишечник кроликов перед заражением.их взвесью вирулентного штамма холерных вибрионов.

Далее было изучено бактерицидное и бактериостатическое действие кишечного сока кроликов на размножение и колонизацию... кишечника холерными вибрионами различной вирулентности. Установлено, что цельный кишечный сок взрослых кроликов действовал ' бактерицидно, независимо от вирулентности штаммов и их концентрации. Сок, разведенный в 5 раз, действовал бактёриостатически на'оба штамма, а при разведении в 10 раз его бактериостатическое действие проявлялось лишь на авирулентном штамме холерных вибрионов. Было определено, что существует'термостабильный фактор кишечного сока, оказывающий бактерицидное действие (табл.2).

Кишечный сок кроликов в возрасте 8-12 дней оказывал■более слабое бактерицидное действие по сравнению с соком взрослых животных.

На модели кроликов-сосунков определена интенсивность размножения холерных вибрионов в зависимости от их вирулентности и установлено, что вирулентные вибрионы уже через 4 часа после заражения интенсивно размножаются в кишечнике, по сравнению со штаммами со сниженной вирулентностью, а в накопившейся в кишечнике прозрачней -жидкости содержится 0,01%-0,7% белка, в то время, как непрозрачная кишечная жидкость в результате жизнедеятельности штаммов со сниженно::вирулентностью содержит от 0,8 до 6,(У/о белка.

Dutta и Наъъи установили естественную связь восприимчивости кроликов-сосунков к заражению холерой в зависимости от их возраста. Так, при внутрикишечном заражении взвесью холерных вибрионов в дозе 1*10 -м.кл. можно воспроизвести холерный процесс у кроликов до 16-дневного возраста в 100% случаев.

Заинтересовавшись причинами этого явления при определении у интактных кроликов-сосунков электролитного'состава плазмы мы нашли, что содержание ионов калия в ней снижено.

- А ведь известно, что одним из клинических симптомов при недостатке этого электролита является нарушение деятельности со стороны гладких мышц кишечника,, что приводит к замедлению перистальтики, вплоть до его пареза. . _ - -

Таблица 2

Действие кишечного сока взрослых кроликов на _холерные вибрионы различно Г. вирулентности

штаммы, Количество выр ^ с □::/. КОЛОНИЙ

дозы КишечныР цельны:" сок Т. йишечны:: сок,-разведенный о о раз опшечныГ: сок, раз воден: ц]"' 10 раз

о к с поз п и л я

• 2; 4 ; 24 часа;часа;часа о ! ! часа; 4 1 часа; 24 часа 2 часа ! 4 ! 1 4 1 ¡часа; 24 часа

7.еГ;6г р-5379

10° 0х 0 0 С** С С п ^ - С П

."ю5 0 0 0 С С С С С г

Ю4 0 0 . 0 п Ч./ С - г> С С п Ь

Ю3 0 0 С) 250 215 С с С С

ю2 0 0 0 37 ' 30 С 100 С с

Контиоль ' * 102 , ' 322 С с 322 с г 322 п. V.» с

V. с11;ог С-18Э9

10° 0 0 0 . С с с С С п

ю5. 0 ' 0 0 С с 52 С , с п-^ -

ю4 0 0 ' 0 505 410 52 500 с с

ю3 0 0 '0 165 125 10 155 120 400

; ю2 0 'о 0 20 25 -0 С5 100

Контроль Ю2 .123 200.' о 123 200 С 123 200 С

Контроль - количество жизнеспособных .клеток,

;высев из Ю2 - у.сЗ.-сог ?-5Ь79 - 100 м.кл.

У.'е1-Ьог С-1899 - 65 м.кл. '

0* - отсутствие роста.

С*к - сплошной рост.

В связи с" этим .было проведено систематическое определение ионов калия в плазме крови здоровых кроликов в возрасте от I ' дня до 20чдней, 1-2 месяцев и взрослых животных.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии гипокалие-мии у кроликов-сосунков в возрасте от I до 17 дней, средняя ве-личина'ионов калип у этих животных составляет 12,4 мг%/л,вмес-то 20-24 мг^/л. Начиная с 18-дневного возраста, содержание ионов калия повышается, достигая 18-20 мг%/л.

Калий является основным внутриклеточным электролитом. Катионы калия играют важную роль в различных видах обмена. Он имеет прямое отношение к синтезу белка, ряду ферментных систем, обмену глюкозы. В обмене углеводов калий пршимает участие в процессах фосфорилирования, сопровождая абсорбцию1углеводов. Некоторые из этих процессов фиксируют калий, другие выводят его в кровоток, откуда он -выделяется почками. В печени калий соединяется с глюкозой, а-затем переходит в мышцы и возвращается с молочной кислотой. Участием в обмене углеводов он влияет на сокращение мышечного волокна. Из данных ?г1пг!г.с*а1 с соавт.(1050) следует, что глюкоза проникает в клетку только вместе с калием, поэтому любое нарушение' обмена калия влияет и на углеводный обмен в клетке. Наличие калия в клетке благоприятствует накоплению в не-" энергии, а отдача калия ведет к ее потере.

Клинические симптомы, появляющиеся при недостатке ионов • калия, - ослабление рефлексов, вплоть до их полного исчезновения, мышечная и общая слабость, астения. Яюечная деятельность резко снижается. Нарушение деятельности со стороны гладких мышц кишечника приводит к нарушению перистальтики кишечника и его парезу, метеоризму, рвоте, расширению желудка и кишечника. Парез желудка и кишечника нередко сочетается с парезом мочевого пузыря.

Таким образом, определенная в наших опытах гипокалиемия у , кроликов-сос.унков является причиной замедленной перистальтики кишечника у этих животных. Наблюдаемая картина на вскрытии кроликов, погибших от введения им взвеси холерных вибрионов,весьма характерна: переполненный прозрачной жидкостью тонкий и толстый кишечник, заполненный мочевой пузырь, что также является следствием развития инфекционного процесса холеры на фоне гипокалие-мии.

Установленная в наших экспериментах низкая подвижность ки-

шечника кроликов-смунков за счет гипокалиемии, может компенсировать. относительно слабую способность бактерий соединяться со слизистой у других лабораторных животных. Так, ?ге1ег (1955) отмечает, что экспериментальные модели холеры - это либо новорожденное животные, "чья кишечная перистальтика, по-видимому, медленная", либо изолированные петли кишечника. Взрослые'животные требуют назначения очень больших инфицирующих доз, или искусственного снижения резистентности макроорганизма.

Используя собственные (Авроров В.П. с соавт.,1973;1977) и данные других авторов (Ахыетов-И.З., 1981; игу В1ас1тап, 1974) о содержании ионов калия в плазме крови лабораторных животных, мы составили таблицу 3, отражающую эффективность воспроизведения экспериментальной холеры у этих животных в зависимости от количества ионов калия. Из таблицы следует, что наблюдается закономерность ; заболевания животных холерой в зависимости, от содержания калия в их организме.

Таблица 3

Содержание ионов калия у экспериментальных животных и результаты их заражения культурой холерных вибрионов

№ п/п

Вид животного

Кол-во ионов калия ¡Результаты зараже-плазмы крови,выраж.¡ния культурой хо-в мг%/л ¡лерных вибрионов

1. .Кролики-сосунки

2. Шиншиллы

3. Белые мыши *

4. Белые крысы

5. Взрослые кролики

6. Морские свинки

7. Собаки

12,4 13,2 30-31 20-26 18-20 26-35 20-22

положит.

положит.

отрйц.

отриц.

отриц.

отриц.

отриц.

Исследования shehi (1939) показали, что содержание калия у взрослых людей составляет 2,65 г на I кг обезжиренного веса и около 1,9 г на I кг веса у новорожденных. Этот факт может объяснить большую восприимчивость детей к заражению кишечными инфекциями.

На этом же принципе основана предложенная Richardson • с соавт. (1984,1985) модель холеры "опечатанной" взрослой.мыши,

которая была применена нами для воспроизведения холерной инфекции. Механизм заражения мышей связан с тем, что за счет обтура-ции кишечника холерный вибрион может длительнее контактировать с его слизистой, прикрепляться к энтероцитам и колонизировать кишечник.

■ Преимущества этой модели состоят в том, что она дает возможность использовать половозрелых животных, заражать их путем внутрижелудочного введения взвеси холерных вибрионов. При заклеивании анального отверстия мышей мы пользовались клеем МК-7-М, экспериментальные серии которого нам были любезно предоставлены сотрудником Московского Всесоюзного научно-исследовательского испытательного института медицинской техники Г.М.Дер-кач, за что мы 'ей весьма благодарны. Клей приготовлен в очень удобной упаковке в виде шприца-пипетки с иглой, что позволило использовать его дозировано.

Путем вычисления коэффициента накопления жидкости в кишечнике мышей в ответ на заражение взвесью холерных вибрионов, га смогли определить интенсивность развития инфекционного процесса.

При введении взвеси холерных вибрионов вирулентного штамма коэффициент накопления жидкости- составлял 120-125 ед. При бактериологическом исследовании содержимого тонкого кишечника количество живых клеток вибрионов составляло 2>10^ - 5-10° м.к. в I мл содержимого тонкого кишечника, что свидетельствовало об интенсивном размножении возбудителя. •

Эта же модель оказалась пригодной для .апробации профилактических препаратов против холеры.

Изученная нами модель холеры на щенках показала, что в определенных- условиях холерный вибрион приживляется и размножается в тонком кишечнике щенков. Непременным условием заражения животных было временное нарушение защитной функции желудочного барьера содой или другими способами. Проникновению вибрионов в кишечник способствовало введение в желудок 60-70% алкогрля, который оказывает некротическое действие на слизистую, что приводило к заражению животных. Это является для нас дополнительным аргументом, подтверждающим наши клинические наблюдения о том, что этот механизм заражения имеет место у людей.

Определенное значение имеет и голодание,, снижающее общую резистентность организма и нарушающее нормальную работу пищеварительных желез. Нам также удалось нарушить защитный механизм

макроорганизма предварительным введением животным актиномици-.на Д, что приводило к значительному возрастанию процента заражения животных.

Определение состояния водно-электролитного равновесия у щенков, зараженных взвесью холерных вибрионов с наличием поноса, показали, что в основе патогенеза экспериментальной Холеры у животных лежат потери воды и электролитов, что соответствует патофизиологическим нарушениям, наблюдаемым в клинике.

Для изучения действия холерного токсина, приживления и размножения холерных вибрионов нами была выбрана модель холеры на изолированных по способу Тири-Велла отрезках кишки щенков.

Из анализа полученных данных следует, что в петле щенков . холерные.вибрионы, не размножаясь, вытесняются посторонней мик-. рофлорой к 3-ему часу. Количество содержимого кишечника нарастает но 2-3 часу, постепенно понижаясь к II часам. Электролитный состав содержимого кишечника соответствует таковому при холерной инфекции.

Для определения энтеропатогенности холерных вибрионов были использованы мыши-сосунки в возрасте 5-6 дней. На-этой модели дана количественная оценка через 9, часов после заражения путем вычисления коэффициента расширения тонкого кишечника.

Таким о<5разом, изученные нами факторы, способствующие и противодействующие развитию холеры в.клинике-позволили модели-.ровать инфекционный процесс на различных видах животных и получить" дополнительные сведения о механизме заражения и взаимодействия макро- и микроорганизма на определенных стадиях развития болезни.

ВЫВОДЫ

1. Анализ клинических исследований больных холерой явился основой для выбора экспериментальных моделей. Разработанный внутрижелудочный способ заражения взвесью холерных вибрионов кроликов и щенков позволил воспроизвести и изучить факторы риска, способствующие инфицированию -холерой у людей.

2. Опыты на кроликах и щенках показали, что заражение холерой возможно после снижения кислотности желудочного.сока путем нейтрализации ее содой или воздействия алкоголем. Снижение общей резистентности организма путем голодания или введения ак-тиномицина Д также делает этих животных пригодными для зараже-

ния холерой. ■ .

3. ]Модель холеры на кроликах-сосунках позволила установить,, что вирулентные штаммы вибрионов по сравнению с авирулентными более устойчивы к бактериостатическому и бактерицидному действию кишечного сока, интенсивнее адгезируются и размножаются в кишечнике с накоплением прозрачной жидкости, содержащей 0,010,7% белка. Определена антиадгезивная функция антитоксической сыворотки на холерные вибрионы;

4. Гипокалиемия у кроликов-сосунков .определяет пониженную перистальтику кишечника, что является одним из факторов, предрасполагающим к заражению холерой.

5. Модель изолированной петли тонкого кишечника собаки по методу Тири-Велла позволяет изучить секрецию кишечника в ответ на введение взвеси холерных вибрионов и холерных токсинов, а также определить конкурирующую роль кишечной микрофлоры на холерные вибрионы.

6. Модель мышей-сосунков позволяет изучить энтеротоксиген-ность большого количества штаммов холерных вибрионов с количественной оценкой по степени накопления жидкости в кишечнике и дать предварительную характеристику изучаемых штаммов череп 9 часов после заражения.

7. В основе механизма заражения "опечатанных" мышей лежит длительное взаимодействие слизистой кишечника с холерными вибрионами. "Опечатанные" мыши - высокочувствительная модель для воспроизведения холерной инфекции и апробации профилактических . препаратов против холеры.

- СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ,ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Авроров В.П., Саямов P.M., Илюхин В.И., Глянько Е.В., Бардых И.Д. К вопросу о факторах, способствующих развитию экспериментальной холеры у щенков //Бюл.эксперим.биол.и мед.-1972.- № 6,- СЛ8-20.

2. Авроров В.П., Саямов P.M., Илюхин В.И., Бардых И.Д., Глянько Е.В: и,др. Экспериментальная,модель холеры на щенках// Пробл.особо опасн.инф.- Саратов, 1972,- Вып.6.-- С.91-96.

3.,Авроров В.П., Бардых И.Д., Лобанов В.В.- Внутри'жедудочное заражение холерой кроликов различных возрастных групп // Пробл.особо опасн.инф.- Саратов, 1977,- Вып.З,- С.70-71.

4. Лобанов B.B.,, Авроров В.П., Бардах И.Д., Глянько Е.В. Исследование содержимого кишечника инфицированных кроликов на наличие холерного экзотоксина //Пробл.особо опасн.инф.- Саратов, 1978.- Вып.5.- С.46-48.

5. Авроров В.П., Милютин В.Н., Бардах И.Д. Способ определения степени вирулентности холерных вибрионов. A.c. № 795015. Заявка № 2682460; заявл.09.11.78; МКИ С12к 1/00; опубл. 30.01. 92 //Б.И. - 1982.- № 4.- С.78. '

6. Терновой В.И., Козырева ¡H.A., Бардах И.Д., Гольдберг A.M. Количественный метод оценки энтеротоксигенных свойств вибрионов на мышах-сосунках, зараженных через рот и ректально// Патофизиология особо опасн.инф.- Саратов, 1981.- С.45-49.'

7. Авроров В.П., Глянько Е.В., Бардах И.Д., Оленичева Л.С. Оценка степени вирулентности холерных вибрионов по•накоплению жидкости в кишечнике кроликов-сосунков, летальному действию и интенсивности размножения вибрионов //Эпидемиология, клиника, диагностика и профилактика антропонозных и зоонозных инфекций: Матер.конф.- Астрахань, 1982.- С.185-187.

8. Оленичева Л.С., Лобанов В,В..Авроров В.П., Бардах И.Д., Непомнящая 'Н.Б. Химические и биологические свойства холероге-на /Ростов.ун-т.- Ростов н/Д, 1982,- 3 е.- Деп. в ВИНИТИ 19.07.82, № 3843-82. .

9. Авроров В.П., Глянько Е.В., Бардах И.Д. Действие пищеварительные coköb человека и животных на холерные вибрионы // Актуальные вопр". иммунологии,- аллергологии и мол.биол.: Тез.докл. УП Сев.-Кавк. конф.- Краснодар, 1983.- С.76-77.

10. Козырева Л.А., Голотина Н.Б..Бардах И.Д.,Кирдеев В.К. К вопросу о роли'эндокринных клеток тонкого кишечника кроликов в патогенезе холеры //Обл.науч.-практ.конф. по пробл. "Холера": Тез.докл.- Ростов н/Д, 1984.- С.136-138.

11. Власов В.П.., Монахова"Е.В., Подосинникова Л.С., Марчен-ков В.И., Бардах И.Д., Седых Е.И. Использование.Тох-зонда для изучения холерных вибрионов //Пробл.мед. и сан.микробиол. города: Тез.Обл.конф.- Ростов н/Д, 1987,- С.14-16.

12. Подосинникова Л.С., Новохатский A.C., Власов В.П., Монахова Е.В., Шхась Н.К., Бардах И.Д. Характеристика коллекции холерных вибрионов Ростовского-противочумного института на наличие гена холерного токсина //Актуальные вопр.микробиол.,лаб: диагностики и профилактики холеры: Тез.Всесоюзн.'науч.конф.-Ростов н/Д, 1988.- C.3II-3I4.

13. Божко Г.В., Горбунова Ю. М., Ломов Ю.М., Бардах И. Д., Луковская М.Л. Способ моделирования холерной инфекции. A.c.

№ I6742I7. Заявка № 474I8I8; заявл.06.10.89; Ш CI2 № 1/00; оцубл.1.05.91 //Б.И.- I99L- № 32.- С.75.

14. Королева Г.В., Король В.В., Смоликова Л. М.,Бардах И.Д., Рожков Е.В. Адгезивные свойства вибрионов разных видов адгезивных препаратов /Долера. Вопр.эпидемиол..микробиол. и лаб. диагностики: Матер.Рос.конф.- Ростов н/Д, 1992,- С.88-89.

15. Королева Г.В., Король В.В., Смоликова Л.М., Бардах

И.Д. Эритроцит как модель для изучения адгезивных свойств микроорганизмов и адгезивных препаратов //Генетика, биохимия вирулентности возбудителей особо опасн.инф.: Тез.докл.- Волгоград, 1992.- С.100.

16. Король В.В., Рожков Е.В., Гофман Е.Л., Бардах И.Д. Получение и характеристика адгезина возбудителя холеры //Генетика, биохимия вирулентности возбудителей особо опасн.инф.: Тез. докл.- Волгоград, 1992,- C.I0I.

17. Божко Г.В., Ломов Ю.М., Луковская В.Л., Бардах И.Д. Воспроизведение экспериментальной холеры на половозрелых мышаху7 Холера. Вопр.эпидемиол.,микробиол.и лаб.диагностики: Матер. Рос.науч.конф.- Ростов н/Д,1992.- С.205-206 //Б.И.- 1991.-

№ 32.- С.75.

18. Подосинникова Л.С., Ломов D.M., Власов В.П., Монахова Е.В., Лобанова Л.Н., Бардах И.Д. и др. Вирулентность холерных вибрионов различного происхождения /Долера. Вопр.эпидемиол., микробиол. и лаб.диагностики: Матер.Рос.науч.конф.- Ростов н/Д, 1992,- С.75-78.

19. Рожков Е.В., Король В.В., Гофман E.JL, Бардах И.Д. и др. Экстрацеллюлярный адгезин возбудителя холеры //Холера. Вопр.эпидемиол.,микробиол. и лаб.диагностики: Матер.Рос.науч. конф.- Ростов н/Д, 1992.- С.92-94.