Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Экспериментальное обоснование роли эндотоксина и дисбиоза кишечника в патологии печени

Ил правах рукописи

АБДУЛХАКОВ САЙЯР РУСТАМОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ РОЛИ ЭНДОТОКСИНА И ДИСБИОЗА КИШЕЧНИКА В ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ

14.00.16 - патологическим физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань, 2004

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории, на кафедрах нормальной анатомии и инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета.

Научный руководитель -доктор медицинских наук, профессор Киясов Андрей Павлович Научный консультант -кандидат медицинских наук, доцент Созинов Алексей Станиславович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Минисбаев Марсель Mиpгаязович кандидат биологических наук. с.н.с. Зинкевич Олег Данилович

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится 5 марта 2004 года в_ .асов на заседании

диссертационного совета Д 208.034.01 при. Казанском государственном медицинском университете (420012. г. Казань, ул. Бутлерова. 49).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного медицинского университета (ул. Бутлерова. 49. корпус «Б»).

Автореферат разослан « 4 » февраля 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного с-----

доктор медицинских наук, профессор

2004-4

20292 | 1

------ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. В последнее время большое внимание уделяется возможному участию эндотоксина грамотрицательных бактерий в патогенезе различных заболеваний печени (Adachi Y.. 1995: Thurman R.G. 1998: Ткачева С.В.. 2001). Основным резервуаром грамотрицательной микрофлоры является кишечник. Любые качественные и количественные изменения кишечного микробиоценоза сопровождаются увеличением проницаемости кишечной стенки, бактериальной транслокацией в портальный кровоток и повышением уровня эндотоксинемии (Obayashi Т.. 1986: Яковлев М.Ю.. 1993). В этом случае главным антиэндотоксиновым барьером становится печень. В связи с этим актуальным является изучение взаимосвязи клеточных реакций в печени и состава микробных сообществ как основного источника эндотоксина, а также влияния дисбиотических изменений в кишечнике на регенерацию печени и фиброгенез. Более подробного исследования требует, на наш взгляд, характер клеточных реакций в печени, вызванных введением эндотоксина.

Одна из классических моделей для изучения клеточных реакций в печени при воспалении и фиброзе — повреждение ее хлорированными углеводородами, в частности, четыреххлористым углеродом (ЧХУ) (Nakatsukasa H.. 1990; Geerts А., 1991; Dabeva M.D., 1993). Повреждающее действие ЧХУ принято связывать не только с влиянием самого препарата на печень, но и с альтерацией ее эндотоксином (Rivera С.A. et al.. 2001). Эндотоксин может участвовать также и в развитии фиброза печени (Broitman S.A.. 1964). Вместе с тем не изучены причины повышения уровня эндотоксина при повреждении печени ЧХУ.

Актуальным остается поиск лекарственных препаратов, уменьшающих фиброгенез или способствующих его обратному развитию. Во многих работах показано антифиброгенное действие интерферонов (Dufour J-F F., 2000: Friedman S.L.. 2001: Safadi R.. 2002). Продолжается изучение клинической эффективности индукторов интерфероногенеза, однако, данных о влиянии этой группы препаратов на активацию клеток Ито и развитие фибргуп нет

i рос национальная!

I библиотека |

| СПетерви* ПЧ \

« оэ K»Y««t7r !

1 1 II гмФ

Тб/Ш

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение клеточных реакций в печени при повреждении четыреххлористым углеродом, однократном введении эндотоксина в кровоток и экспериментальном дисбиозе кишечника для обоснования роли эндотоксина и дисбиоза кишечника в патологии печени.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить клеточные реакции в печени лабораторных крыс на фоне однократного введения эндотоксина в системный кровоток и экспериментального дисбиоза кишечника, вызванного введением канамицина.

2. Изучить состав микрофлоры тонкой и толстой кишки крыс в норме, при экспериментальном дисбиозе кишечника и на фоне введения четыреххлористого углерода.

3. Выявить закономерности активации клеток Ито, пролиферативной активности клеток печени и реакции холангиоцитов при хроническом повреждении печени четыреххлористым углеродом.

4. Изучить влияние амиксина на процессы активации клеток Ито, пролиферативную активность клеток печени и состав микрофлоры кишечника крыс на модели токсического повреждения печени четыреххлористым углеродом. Изучить особенности активации клеток Ито и реакции холангиоцитов при хроническом поражении печени человека алкоголем на аутопсийном материале.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые дана характеристика микрофлоры тонкой и толстой кишки крыс в норме, на фоне введения четыреххлористого углерода и индуктора интерфероногенеза амиксина, а также при экспериментальном дис-биозе, вызванном введением канамицина. Впервые проведен сравнительный анализ клеточных реакций в печени при однократном введении эндотоксина, экспериментальном дисбиозе кишечника у крыс, экспериментальном повреждении печени крыс четыреххлористым углеродом и хроническом поражении печени человека алкоголем. Установлена взаимосвязь дисбиоза кишечника и морфологических изменений печени. Показано, что активация клеток Ито и регене-

рация гепатоцитов на фоне однократного введения эндотоксина и экспериментального дисбиоза кишечника носят однотипный характер. Новыми являются данные о корригирующем влиянии амиксина на микрофлору кишечника крыс при дисбиозе, вызванном введением ЧХУ. Впервые в эксперименте показано, что амиксин модулирует процессы активации клеток Ито и их трансдифферен-цировки в миофибробласты, однако, не препятствует повреждению печени ЧХУ.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные результаты позволяют говорить о важной роли кишечной микрофлоры и эндотоксина в патогенезе заболеваний печени и необходимости учитывать состояние микрофлоры кишечника при назначении терапии больным с патологией печени. Проведенные исследования способствовали раскрытию закономерностей активации клеток Ито, их трансдифференцировки в миофиброб-ласты и клеточных механизмов регенерации печени на фоне введения четырех-хлористого углерода, амиксина и при экспериментальном дисбиозе кишечника. Использование иммуногистохимических методов исследования печени в клинической практике дает возможность осуществлять контроль за течением патологического процесса и эффективностью терапии.

Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения проблем регенерации печени, оценки гепатотропных эффектов новых лекарственных препаратов, а также в морфологической диагностике и прогнозировании. хронических заболеваний печени человека, в учебном процессе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Повышенный уровень эндотоксина в крови запускает в печени каскад клеточных реакций, характерный для ее регенерации после токсического повреждения.

2. Введение ЧХУ приводит к нарушению состава микрофлоры кишечника. Повреждающее действие ЧХУ на печень является многофакторным и складывается как из альтерации гепатоцитов самим токсином, так и влияния эндотоксина, повышение уровня которого обусловлено развитием дисбиоза кишечника.

3. При токсическом повреждении печени ЧХУ амиксин модулирует фенотип клеток Ито, поддерживает их число на уровне, необходимом для полноценной регенерации органа и регулирует процесс их трансдифференцировки в мио-фибробласты.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе при изучении токсических повреждений печени и последующей ее регенерации в ЦНИЛ КГМУ. на кафедрах нормальной анатомии, патологической физиологии и инфекционных болезней КГМУ, включены в учебный процесс на кафедрах патологической физиологии и инфекционных болезней КГМУ. По результатам исследования опубликовано 15 работ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ состоялась на совместном научном заседании сотрудников кафедр патологической физиологии, инфекционных болезнен и нормальной анатомии КГМУ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: пленумах Научного общества гастроэнтерологов России (Москва. 1998. Пермь. 1999). IV и VII Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 1999. 2002). III и IV научно-практических конференциях молодых ученых КГМУ (Казань, 1998, 1999). международных симпозиумах "Alcohol and Liver" (Будапешт. Венгрия. 1998). "Progress in Basic. Applied and Diagnostic Histochemistry" (Братислава, Республика Словакия. 1998). "Liver Cirrhosis and its Development" (Базель.. Швейцария. 1999). "Hepatology 2000" (Мюнхен. Германия. 2000). "Progress in Gastroenterology and Hepatology" (Ганновер, Германия. 2001), "37th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver" (Мадрид. Испания. 2002). "XII Falk Liver Week" (Фрайбург: Германия. 2003).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 278 источников: 41 отечественный и 237 иностранных. Диссертация содержит 32 рисунка и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена патофизиологическими, гистологическими, иммуноги-стохимическими и микробиологическими методами. Для выполнения поставленных задач были использованы модели системной эндотоксинемии, экспериментального дисбиоза кишечника и токсического поражения печени лабораторных животных ЧХУ, а также аутопсийный материал больных хроническими алкогольными поражениями печени.

Для моделирования системной эндотоксинемии и изучения влияния эндотоксина (ЭТ) на морфологическую структуру печени 68 белым лабораторным крысам (200 г. самцы) линии Вистар внутрибрюшинно вводили высокоочищен-ный лиофилизированный липополисахарид (ЛПС) E.coli OIII (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) в 1 мл стерильного физиологического раствора в различных дозировках: 0.5, 2.5, 10, 25 и 50 мг/кг веса животного. Эндотоксиновый шок со смертельным исходом в течение 6 ч развивался при дозировке ЛПС 5 мг/крысу (25 мг/кг). Забой крыс и забор материала проводили на сроках 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 ч., 1 и 2 недели после введения ЭТ. Срезы печени окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохимически антителами к ЭТ, десмину, а-ГМА и PCNA (DAKO. Denmark).

Эксперименты по моделированию токсического поражения печени и эндогенного дисбиоза проводили на 78 белых лабораторных крысах линии Вистар весом 180-220 г. Животных разделили на 6 групп (n - количество животных в группе). Животным 1 группы вводили ЧХУ в течение 4 недель. Забой крыс и забор материала производили через 2 и 4 недели введения ЧХУ, а также через 2 и 4 недели после прекращения введения препарата (n= 12). Животным II группы («амиксин-лечение») в течение 4 недель вводили ЧХУ, а затем в течение 4 недель - амиксин. Забор материала проводили через 2 и 4 недели введения амикси-на (n=6). Животным III группы («амиксин-профилактика») вводили ЧХУ в течение 2 недель, далее - 2 недели ЧХУ в сочетании амиксином, затем только амик-син на протяжении 4 недель. Забор материала - через 4, 6 и 8 недель от начала

эксперимента (n=9). У животных IV группы выбывали развитие дисбиоза кишечника введением канамицина в течение 2 недель. Материал для исследований забирали через 24 ч после последнего введения и через 2 недели после окончания курса (n=6). Пятую, контрольную группу, составили интактные животные, получавшие "плацебо": вместо раствора ЧХУ вводили подкожно соответствующий, объем растворителя, вместо лекарственных средств - аналогичное количество физиологического раствора (n=39).

ЧХУ разводили в оливковом масле и вводили подкожно в область бедра в дозе 0.1мг/100 г веса два раза в неделю (Seifert W.F.. 1994). Развитие дисбиоза кишечника вызывали ежедневным введением в желудок через зонд канамицина сульфата ("Брынцалов А". Россия), растворенного в физиологическом растворе, в дозе 1,4 мг/100 г веса животного в течение 2 недель. Амиксин («Лэнсфарм», Россия) растворяли в физиологическом растворе и вводили крысам per gaster через зонд в дозе 0,2 мг/100 г веса животного три раза в неделю.

Парафиновые срезы печени окрашивали гематоксилин-эозином и смесью Ван-Гизона для оценки морфологической картины, а также иммуногистохимиче-ски антителами к десмину, (t-гладкомышечному актину (а-ГМА), ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) и цитокератину 19 (DAKO, Denmark).

Микробиологическими методами* изучали микрофлору тонкой и толстой кишки, мезентериальных, лимфатических узлов, крови из полостей сердца, портальной крови (из области ворот печени), ткани печени крыс. Методом дисков определяли чувствительность культур, выделенных из кишечника интактных крыс, к ЧХУ. амиксину и канамицину (Поздеев O.K.. 2001).

Для изучения морфологической структуры печени при хроническом алкогольном поражении, использовали аутопсийный материал (25 образцов печени больных, погибших от различных форм алкогольной болезни печени), который был получен из архивных источников Бюро судебно-медицинской экспертизы г.

* Микробиологические исследования выполнены совместно с сотрудниками кафедры микробиологии (чап.каф. - проф. О.К.Почдеев) Казанской государственной медицинской академии O.K. Поздеевым, Г. 11. Лапшиной, МП. Шулаевой.

Казани. Срезы печени окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохими-чески антителами к (Х-ГМА и цитокератину 1 (DAKO. Denmark).

Оценка полученных результатов

Морфологическую картину печени оценивали, используя индекс гистологической активности (ИГА) (Киясов А.П. и др.. 2001). Морфометрическое исследование проводили для определения числа клеток Ито и пролиферирующих ге-патоцитов в печени крысы на фоне введения ЧХУ и амиксина. Для этого подсчитывали десмин- и PCNA-позитивные клетки в шести неперекрывающих друг друга полях зрения. На каждом сроке исследования изучали препараты не менее трех лабораторных животных. Результат представляли в виде среднего числа клеток Ито или пролиферирующих гепатоцитов в поле зрения при увеличении х400. В связи с невозможностью количественного определения числа миофиб-робластов в составе фиброзных септ при оценке иммуногистохимического окрашивания антителами к была использована балльная градация выраженности экспрессии данного маркера: 1 балл - норма, а-ГМА экспрессируется только в клетках сосудов портальных трактов; 2 балла - единичные миофиброб-ласты в очагах воспалительной инфильтрации и некрозов паренхимы; 3 балла -то же + признаки формирования фиброза в паренхиме печени; 4 балла - слабо-выраженный фиброз; 5 баллов - умеренный фиброз; 6 баллов - выраженный фиброз.

Статистический анализ результатов морфометрических исследований проводили с помощью статистического пакета BIOSTAT. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Системная эндотоксинемия. Для того, чтобы оценить влияние ЭТ на структуру печени, ее регенерацию и клетки Ито, был проведен эксперимент по моделированию системной эндотоксинемии.

Однократное введение ЭТ приводило к увеличению числа перипортально расположенных клеток Ито, которое начиналось с 6 часов после инъекции и дос-

тигало максимума к 48-72 часам независимо от дозы ЭТ. Возможно, это связано с тем, что бактериальный ЛПС поступает в печень по системе воротной вены и печеночной артерии и захватывается в первую очередь клетками Купфера (Freudenberg M.A., 1984; Lichtman S.N., 1996), большая часть из которых располагается перипортально (Wisse E., 1974; 1977). Несмотря на выраженную активацию клеток Ито, однократное введение ЭТ не приводит к их трансдифференцировке в миофибробласты. По-видимому, альтерация печени, вызванная однократным введением бактериального ЛПС, недостаточна для трансдифференцировки клеток Ито в миофибробласты. Число пролиферирующих клеток увеличивалось, начиная с 24 часов после введения ЭТ и достигало максимального значения через 72 часа после введения препарата. PCNA был обнаружен в ядрах гепатоцитов и си-нусоидных клеток. Усиление пролиферативной активности клеток также наблюдалось преимущественно в 1-й зоне ацинуса. Таким образом, активация клеток Ито и регенераторный ответ гепатоцитов, который мы наблюдали на фоне введения бактериального ЛПС, подтверждают возможность участия ЭТ в альтерации паренхимы печени.

2. Микрофлора кишечника крыс и системная эндотокеннемия. При изучении микрофлоры здоровых животных бактерии не были обнаружены в крови из полостей сердца, портальной вены, паренхиме печени и мезентериальных лимфатических узлах. В тонкой кишке здоровых крыс были обнаружены микроорганизмы 3-6 таксонов, представленные Е. coli (103-105 КОЕ/г), Е. agglomerans (0-104 КОЕ/г), бактериями родов Moraxella (105-108 КОЕ/г) и Alcaligenes (0-106 КОЕ/г), Staphylococcus saprophiticus (102-103 КОЕ/г) и Streptococcus haemoliticus (104 КОЕ/г). В толстой кишке контрольных крыс выделялось от 3 до 10 таксонов микроорганизмов: Е. coli (103-107 КОЕ/г), Е. agglomerans (105-109 КОЕ/г), бактерии родов Moraxella (108-1010 KOE/г), Citrobacter (104-105 КОЕ/г), Alcaligenes (106 КОЕ/г), Corynebacterium (106 КОЕ/г), Clostridium (106 КОЕ/г) и Staphylococcus разных видов (102-107 КОЕ/г). В условиях in vitro методом дисков было показано, что выделенные из кишечника здоровых крыс культуры микроорганизмов чувствительны к канамицину, ЧХУ и не чувствительны к амиксину.

Проведенные исследования показали, что введение крысам канамицина приводит к количественным и качественным изменениям кишечной микрофлоры, а в ряде случаев- к прорыву микроорганизмов в мезентериальные лимфатические узлы и ткань печени (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика микрофлоры тонкого и толстого кишечника крыс в различных экспериментальных группах

11оказ;пс:ш ЧХУ 1 группа о-'12 ЧХУ 4 пел.1 амиксин II группа п=6 + -< о 1. О . Ц ¡1 = .г! = ' = ™ I а <N=4-5 £ -*& I ° >> X ГГ - и <-) = - й = с 3 > 1 & I > (3 — Здоровые крысы V группа. п=39

ЧХУ 2 нед. | ЧХУ 4 нед. ЧХУ 4 нед. + «отдых» 2 нед. Амиксин 2 нед. Амиксин 4 нед.

Микрофлора тонкой кишки здоровых крыс* + - ± - ± + ± +

Микрофлора толстой кишки здоровых крыс* + - ± ± + + ± +

Появление несвойственной микрофлоры + - ± ± ± ± ± -

Преобладание гемолитических форм бактерий + - ± ± - - - -

Обнаружение бактерий в печени, мезентериальных лимфатических узлах . ± ± - - -- — ± -

Примечание: * - характеристика микрофлоры тонкого и толстого кишечника здоровых крыс дана в тексте.

"+" - признак присутствует у всех крыс; "±" - признак присутствует у ряда крыс; "-" - признак отсутствует.

Дисбиотические изменения в кишечнике крыс приводили к незначительной активации клеток Ито без трансдифференцировки в миофибробласты и резкому повышению пролиферативной активности гепатоцитов. Поскольку в литературе нами не было найдено данных о гепатотоксичности канамицина, обнаруженные изменения морфологической структуры печени мы связали с влиянием препарата на микрофлору кишечника (Страчунский Л. С . 2002) и избыточным поступлением бактериального ЛПС в портальный кровоток.

Учитывая, что активация клеток Ито и пролиферация гепатоцитов являются типичными реакциями печени на повреждение, можно предположить, что нарушение состава микрофлоры кишечника приводит к альтерации печеночной паренхимы без выраженных морфологических изменений. В случае повреждения печени, вызванного экспериментальным дисбиозом, регенерация идет в основном за счет пролиферации гепатоцитов: в меньшей степени она связана с активацией клеток Ито, что предопределяет отсутствие возможности быстрого фибро-зообразования.

3. Роль четыреххлористого углерода в повреждении печени и дисбиозе кишечника. После двухнедельного введения ЧХУ видовой состав микрофлоры тонкой и толстой кишки уменьшился с 3-10 таксонов до 2-3 видов, при этом выделяли не свойственные здоровым животным микроорганизмы. У части крыс бактерии были обнаружены в мезентериальных лимфатических узлах и в ткани печени. Через 4 недели введения ЧХУ из содержимого тонкого и толстого кишечника бактерий выделено не было.

Учитывая схожесть дисбиотических изменений в кишечнике при введении кана-мицина и ЧХУ и наличие в обоих случаях бактериальной транслокации, можно предположить, что повреждение печени ЧХУ является смешанным и складывается из влияния самого гепатотоксина и ЭТ, поступающего из кишечника с портальным кровотоком в печень. Эти предположения подтверждаются данными Rivera С.А. и соавт. (2001). которые показали значительное увеличение содержания ЭТ в портальной крови на фоне длительного введения ЧХУ. Дисбиотические изменения в кишечнике при введении ЧХУ могут быть связаны как с нарушени-

ем функции печени в результате поражения ее токсином, так и с повышенной проницаемостью кишечного эпителия на фоне дисбиоза, обусловленного бактерицидным действием препарата, не подвергшегося полной детоксикации в поврежденной печени (Chuang J.H.. 1997: Lora L.. 1997).

4. Влияние амиксина на микрофлору кишечника и структуру печени. На фоне введения амиксина в течение четырех недель наблюдалось практически полное восстановление состава микрофлоры тонкой и толстой кишки. Можно предположить, что эффект амиксина, не оказавшею in vitro никакого воздействия на актуальные микроорганизмы, опосредуется восстановлением функции печени. В то же время корригирующее действие амиксина на микрофлору кишечника может быть связан с индукцией синтеза интерферонов в энтероцитах (Турьянов М.Х.. 2000) и стимуляцией таким образом факторов местного иммунитета. Полученные нами данные подтверждают предположения Adawi D. с со-авт. (1997) о том. что стимуляция системного и местного иммунитета играет важную роль в поддержании микробного гомеостаза в кишечнике и уменьшает бактериальную транслокацию в портальный кровоток

Результаты морфологической оценки ткани печени с учетом ИГА показали, что особенностью воздействия на печень ЧХУ является развитие центролобу-лярных некрозов. Полученные нами данные позволяют утверждать, что введение амиксина в сочетании с ЧХУ («амиксин-профилактика») не препятствует альтерации печени гепатотоксином: в то же время сам амиксин не оказывает дополнительного повреждающего действия на печень.

5. Динамика клеточных реакции при повреждении печени четырех-хлористым углеродом и введении амиксина. Во многих работах показано ан-тифиброгенное действие интерферонов, механизм которого связывают со способностью подавлять активацию клеток Ито и их трансдифференцировку в мио-фибробласты (Rockey D.C.. 1993; Sakaida I.. 1998; Zhang Q.. 1999; Vendemiale G.. 2001: Shen H.. 2002). Учитывая то, что амиксин является индуктором синтеза эндогенных интерферонов, одной из задач исследования была оценка влияния препарата на клетки Ито и развитие фиброза в печени.

5.1. Активация клеток Ито. При окрашивании антителами к десмину печени контрольных крыс было обнаружено небольшое число десминпозитивных клеток Ито с овальным ядром (4.4± 1.5 в поле зрения), которые были расположены преимущественно в первой зоне печеночного ацинуса. Динамика изменения числа клеток Ито на фоне введения ЧХУ и амиксина представлена на рис. 1.

ас

О 2 неде/м 4 недели 6 недель в недель

сроки от начала эксперимента

Qrpynnal(ЧХУ) □ группа II (амиксин-лваеиие) Qrpynna 111(амиксин-профилактиха)

Рис. 1. Динамика числа клеток Ито на фоне введения ЧХУ и амиксина (р<().05).

Менее выраженная активация клеток Ито на фоне сочетанного введения ЧХУ и амиксина по сравнению с введением только ЧХУ может быть связана с ингибирующим влиянием интерферонов на процессы активации и пролиферации клеток Ито (Baroni G.S., 1996; Shen H.. 2002). С другой стороны, на фоне введения амиксина не происходит быстрого уменьшения числа клеток Ито после прекращения введения ЧХУ. По-видимому, амиксин поддерживает количество клеток Ито на уровне, необходимом для полноценной регенерации печени. Это является своего рода защитной реакцией органа, поскольку клетки Ито - основной клеточный тип, который участвует в восстановлении нормальной структуры печени. Конечный результат влияния амиксина на число клеток Ито не зависит от того, назначался препарат после прекращения введения ЧХУ или же в сочетании с ним.

5.2. Трансдифференцировка клеток Ито. Для того, чтобы выяснить, насколько выражен процесс трансдифференцировки клеток Ито в миофибробласты

на фоне введения ЧХУ и амиксина, была изучена экспрессия <х-ГМЛ клетками печени. Введение ЧХУ приводит к трансдифференцировке клеток Ито в мио-фиброласты, что проявляется повышением экспрессии u-ГМА клетками печени. Относительно меньшая экспрессия данного маркера на фоне сочетанного введения ЧХУ и амиксина связана со способностью интерферонов ингибировать трансдифференцировку клеток Ито в миофибробласты. Однако они не блокируют ее совсем, поскольку трансдифференцировка в миофибробласты - это защитная реакция, направленная на заполнение дефектов ткани (Friedman S.L.. 2001).

Результаты исследования показали, что снижение экспрессии а-ГМА в клетках печени на фоне введения амиксина происходит параллельно с ростом числа десминпозитиных клеток Ито. Уменьшение числа -позитивных

клеток может быть связано с обратным переходом миофибробластов в фенотип покоящихся клеток Ито, с гибелью миофибробластов путем апоптоза (Mathew C.L.. 1994) либо с необратимым превращением миофибробластов в фибробла-сты, обладающие фенотипом десмин-Ах-ГМА-. Поэтому задачей следующего этапа работы была оценка количества соединительной ткани в печени при воздействии ЧХУ и амиксина.

Введение ЧХУ сопровождалось появлением небольшого количества соединительно-тканных структур, локализующихся перипортально и вокруг центральной вены. Незначительное усиление позитивного окрашивания может быть связано как с превращением части миофибробластов в истинные фибробласты и накоплением компонентов соединительной ткани, так и с синтезом соединительной ткани фибробластами портальных трактов. При последующем введении амиксина картина печени сохранялась без изменений.

5.3. Пролиферативный ответ клеток печени. Для оценки регенераторного ответа гепатоцитов было проведено иммуногистохимическое окрашивание антителами к PCNА.

При окрашивании печени контрольных крыс антителами к PCNA были обнаружены единичные позитивно окрашенные гепатоциты: при морфометриче-

ском анализе их число составило 1.7+1.1 пролиферирующих клеток в поле зрения. На сроках две и четыре недели введения ЧХУ число пролиферирующих клеток составило 22.4+0.9 и 20.1+1.3, соответственно (р<0.05). К окончанию эксперимента число PCNA-позитивных клеток на фоне введения амиксина достигло нормальных значений и составило во II и III группах 1.8+1.0 и 1.7+0.9 клеток, соответственно. Несколько большее число PCNA-позитивных клеток через две недели введения ЧХУ может быть связано как с повреждающим действием гепа-тотоксина, так и с альтерацией печени ЭТ, повышенное поступление которого в кровоток обусловлено развитием дисбоза кишечника. С другой стороны, учитывая важную роль ЭТ в стимуляции синтеза цитокинов макрофагами печени и клетками Ито, нельзя исключить прямое стимулирующее влияние бактериального ЛПС на пролиферативную активность гепатоцитов (Schmidt С. 1995; Michalopoulos G.K., 1997: Toda К., 2000).

6. Алкогольное поражение печени. Учитывая, что в последние годы в патогенезе алкогольных поражений печени большое внимание уделяется роли эндотоксина (Mathurin P. et al., 2000: Tsukamoto H. et al.. 2001), были изучены закономерности активации клеток Ито в печени человека на аутопсийном материале больных хроническими алкогольными поражениями печени.

При окрашивании аутопсийного материала было обнаружено, что макрове-зикулярный стеатоз, который мы наблюдали во всех случаях, наиболее характерен для хронического алкогольного поражения печени. Порто-центральный характер формирования фиброза печени связан, по-видимому, с преимущественной локализацией повреждения в 3-й зоне ацинуса, где происходит трансдифферен-цировка клеток Ито в миофибробласты, и миофибробластной трансформацией портальных фибробластов (Tang L, 1994). Обнаружение а-ГМ А-позитивных клеток преимущественно в очагах микровезикулярного стеатоза и некрозов печеночной паренхимы является подтверждением того, что микровезикулярный стеатоз является более тяжелой и прогностически менее благоприятной формой поражения печени (Шерлок Ш. и др.. 1999).

7. Участие холангиоцитов в регенераторном ответе печени. При изучении экспрессии холангиолярных маркеров при токсическом поражении печени ЧХУ, дисбиозе кишечника и хроническом алкогольном поражении печени человека мы наблюдали развитие дуктулярной реакции, которая заключается в увеличении числа желчных протоков и холангиоцитов в пределах портального тракта. Это явление можно рассматривать, во-первых, как ответную реакцию на повреждение, затрагивающее не только гепатоциты, но и клетки желчных протоков. Во-вторых, такая реакция желчных протоков может быть ответом на нарушение экскреции желчи, возникающее вследствие повреждения гепатоцитов. Наконец, нельзя исключить, что дуктулярная реакция является проявлением активации регионарного стволового резерва, расположенного в пределах канальцев Геринга и необходимого для регенерации паренхимы железы (Alison M.R.. 2001).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что экспериментальная альтерация печени ЧХУ сопровождается развитием дисбиоза кишечника и имеет эндотоксиновый компонент (обуславливающим наличие эн-дотоксинового компонента повреждения). Повышение уровня эндотоксина в крови и развитие дисбиоза кишечника принимают участие в формировании клеточных реакций при повреждении печени.

ВЫВОДЫ

1. Однократное введение ЭТ приводит к увеличению числа десминпозитив-ных клеток Ито без их трансдифференцировки в миофибробласты и повышению пролиферативной активности гепатоцитов и синусоидных клеток печени.

2. Введение лабораторным крысам канамицина в течение двух недель приводит к дисбиозу кишечника, активации клеток Ито без трансдифференцировки их в миофибробласты и усилению пролиферативной активности гепатоцитов.

3. Повреждение печени ЧХУ приводит к активации клеток Ито, их тране-дифференцировки в миофибробласты, усилению пролиферативной активности гепатоцитов и сопровождается дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры.

4. На фоне повреждения печени ЧХУ и эндогенного дисбиоза кишечника развивается дуктулярная реакция: в паренхиме печени появляются клетки, позитивные по холангиолярным цитокератинам..

5. Амиксин способствует поддержанию числа клеток Ито на уровне, необходимом для полноценной регенерации печени, не приводя при этом к их транс-дифференцировке в миофибробласты.

6. При хроническом повреждении печени человека алкоголем наблюдается появление -позитивных миофибробластов в очагах микровезикулярного стеатоза и развитие дуктулярной реакции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активация перисинусоидальных клеток (клеток Ито) у больных с хроническими поражениями печени / С.Р.Абдулхаков, А.П. Киясов, А.С.Созинов, Р.А.Абдулхаков: Тез. докл. науч. конф. // Российский гастроэнтерологический журнал. - 1998. - №2. - С. 83.

2. Изменения перисинусоидальных клеток (клеток Ито) в ответ на однократное введение эндотоксина / С.Р.Абдулхаков, А.П.Киясов, А.С.Собинов и др.: Тез. докл. науч. конф. // Российский журнал Гастроэнтерологии. Гематологии и Колопроктологии. - 1999. - Т. IX. №1.-С. 78.

3. Абдулхаков С.Р. Влияние эндотоксина на пролиферативную активность клеток печени / С.Р.Абдулхаков, А.П.Киясов. А.С.Собинов: Тез. докл. науч. конф. // Российский гастроэнтерологический журнал. - 1999. - № 2. - С. 78.

4. Однократная эндотоксиновая агрессия вызывает дозонезависимую обратимую активация клеток Иго печени крыс без трансдифференцировки их в миофибробласты / И.М.Салахов. А.С.Созинов, С.РАбдулхаков и др. // Бюллетень -экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - Т. 130, № 10. - С. 449-452.

5. Опыт применения индуктора интерфероногенеза Амиксин в лечении больных хроническими вирусными гепатитами В и С (сравнительное экспериментально-клиническое исследование) / А.С.Созинов, Д.Ш.Еналеева. Д.В.Бакеев, С.Р.Абдулхаков и др. // Гепатит С (Российский консенсус): Матер, науч.-практ. конф. - М., 2000. - С. 8-30.

6. Микрофлора кишечника крыс в условиях хронического токсического поражения печени / А.С.Созинов, О.К.Поздеев, Г.Н.Лапшина, М.П.Шулаева, С.Р.Абдулхаков и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2002. - №3. - С. 60-63.

7. Альтерация печени при экспериментальном дисбиозе у крыс / А.С.Созинов. С.Р.Абдулхаков, А.П.Киясов, А.А.Гумерова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2003. -Т 136, №7.-С. 23-26

S. Activation of Ito cells in alcoholic liver disease / S.Abdulchakov, A Sozinov, R Abdulchakov. A.Kiassov // Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry. Тез. докл. межд симпозиума. - Bratislava, 1998. - С. 39.

9. Expression of cytokeratin 7 in chronic alcoholic liver / S.Abdulchakov, A.Kiassov, A.Sozinov, R. Abdulchakov // Alcohol and Liver. Тег докл. межд симпозиума. -Budapest, 1998.-P. 1.

10. Perisinusoidal cell proliferation and activation in liver regeneration / S.Abdulchakov, A.Gumerova. A.Kiassov, A.Sozinov // Liver Cirrohosis and its Development: Тез. докл. XI межд. конгресса по заболеваниям печени. - Basel, 1999. - Р. 1.

11. Abdulchakov S.R. The role of perisinusoidal cells in restoring of liver tissue after injury / S.R.Abdulchakov, A.S.Sozinov, A.P.Kiassov // Hepatology 2000: Тез. докл. межд. симпозиума. - Мюнхен, 2000. - Р. 41.

12. Endotoxin causes reversible activation of Ito cells of the rat liver without transdifferentiation in myofibroblasts / I.M.Salachov, A.S.Sozinov, S.R.Abdulchakov et al. // 6th IES Conference: Тез. докл. межд. конф. - Paris, 2000. - P. 8.

13. Abdulchakov S. The influence of the inductor of interferonogenesis amiksin on hepatic stellate cells and liver fibrosis / Abdulchakov S.R, Sozinov A.S., Kiassov A.P. // Progress in Gastroenterology and Hepatology: Тез. докл. межд. симпозиума. - Ганновер, 2001. - Р . 1.

14. Abdulchakov S. The inductor of interferonogenesis amiksin in reducing of liver fibrosis and hepatic stellate cell activation / Abdulchakov S.R., Sozinov A.S., Kiassov A.P. // 37th Annual Meeting ofthe European Association for the Study ofthe Liver: Тез. докл. межд. конф. - Мадрид, 2002. - Р. 226.

15. Abdulchakov S.R. Peculiarities of liver regeneration and hepatic stellate cell activation in experimental intestinal dysbiosis / S.R.Abdulchakov, A.S.Sozinov, A.P.Kiassov // XII Falk Liver Week: Тез. докл. межд. симпозиума. - Фрайбург, 2003 - Р. 1.

Подписано в печать 4.02.2004 Бумага офсетная 60x84/16 Ризография Объем 1.0 усл.-печ. л. Тираж 100

Заказ№ 13

420012, г.Казань. Бутлерова. 49. типография КГМУ

АКТУАЛЬНОСТЬ. В последние годы продолжается рост числа заболеваний печени, в первую очередь, вирусных гепатитов и алкогольных поражений [6, 37, 38]. Прогноз и исход заболевания во многом зависят от ранней диагностики и своевременно проведенного лечения. Однако хронические заболевания печени редко удается диагностировать на начальных этапах в связи со скудностью клинической симптоматики. Это приводит к сложности изучения клеточных механизмов развития повреждения и регенерации органа. Кроме того, морфологическое исследование ткани печени у человека требует проведения инвазивной процедуры - биопсии печени. Наиболее приемлемый путь для решения этой проблемы - моделирование поражения печени на животных, однако, экспериментальные модели повреждения должны максимально точно воспроизводить картину заболеваний печени у человека.

Известно большое количество экспериментальных моделей, позволяющих изучать клеточные механизмы повреждения и регенерации печени. Чаще всего используется частичная гепатэктомия, предложенная Higgins и Anderson [204]. В основе другой классической модели лежит повреждение печени хлорированными углеводородами, в частности, четыреххлористым углеродом (ЧХУ) [205, 258, 261]. В клинической практике часто встречаются заболевания печени смешанной этиологии, когда одним из компонентов повреждения является токсический. В связи с этим модель повреждения печени ЧХУ является, на наш взгляд, наиболее близкой к заболеваниям печени у человека.

В последнее время большое внимание уделяется возможному участию эндотоксина (ЭТ) грамотрицательных бактерий в патогенезе различных заболеваний печени [34, 48, 257]. Существует мнение, что ЭТ играет важную роль и в развитии фиброза печени [70, 255]. Повреждающее действие ЧХУ также принято связывать не только с влиянием самого препарата на печень, но и с альтерацией ее ЭТ [53]. Основным источником ЭТ является грамотрицательная микрофлора кишечника. Любые качественные и количественные изменения кишечного микро биоценоза сопровождаются увеличением проницаемости кишечной стенки, бактериальной транслокацией в портальный кровоток и повышением уровня эндотоксинемии [40]. В этом случае главным антиэндотоксино-вым барьером становится печень. В связи с этим актуальным является изучение взаимосвязи клеточных реакций в печени и состава микробных сообществ как основного источника эндотоксина, а также влияния дисбиотических изменений в кишечнике на регенерацию печени и фиброгенез. Более подробного исследования требует, на наш взгляд, характер клеточных реакций в печени, вызванных введением эндотоксина.

Актуальным остается поиск лекарственных препаратов, уменьшающих фиброгенез или способствующих его обратному развитию [4, 58, 96, 127]. Применение препаратов а-интерферона (ИФН-а) для лечения вирусных гепатитов позволило выявить наличие у них антифиброгенного действия [96, 127, 239]. Продолжается изучение препаратов - индукторов интерфероногенеза [25], однако, данных об их влиянии на клеточные механизмы развития фиброза практически нет. Очевидно, что разработка новых препаратов и внедрение их в клиническую практику невозможны без понимания клеточных механизмов развития фиброза, а также процессов, происходящих в печени на фоне приема лекарственных средств.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение клеточных реакций в печени при повреждении ее четыреххлористым углеродом, однократном введении эндотоксина в кровоток и экспериментальном дисбиозе кишечника для обоснования роли эндотоксина и дисбиоза кишечника в патологии печени. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить клеточные реакции в печени лабораторных крыс на фоне однократного введения эндотоксина в системный кровоток и экспериментального дисбиоза кишечника, вызванного введением канамицина.

2. Изучить состав микрофлоры тонкой и толстой кишки крыс в норме, при экспериментальном дисбиозе кишечника и на фоне введения четыреххлористо-го углерода.

3. Выявить закономерности активации клеток Ито, пролиферативной активности клеток печени и реакции холангиоцитов при хроническом повреждении печени четыреххлористым углеродом.

4. Изучить влияние амиксина на процессы активации клеток Ито, пролифе-ративную активность клеток печени и состав микрофлоры кишечника крыс на модели токсического повреждения печени четыреххлористым углеродом.

5. Изучить особенности активации клеток Ито и реакции холангиоцитов при хроническом поражении печени человека алкоголем на аутопсийном материале.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые дана характеристика микрофлоры тонкой и толстой кишки крыс в норме, на фоне введения четыреххлористого углерода и индуктора интерфероногенеза амиксина, а также при экспериментальном дисбиозе, вызванном введением канамицина. Впервые проведен сравнительный анализ клеточных реакций при однократном введении эндотоксина, экспериментальном дисбиозе кишечника у крыс, экспериментальном повреждении печени крыс четыреххлористым углеродом и хроническом поражении печени человека алкоголем. Установлено взаимосвязь дисбиоза кишечника и морфологических изменений печени. Показано, что активация клеток Ито и регенерация гепатоцитов на фоне однократного введения эндотоксина и экспериментального дисбиоза кишечника носят однотипный характер. Новыми являются данные о корригирующем влиянии индуктора интерфероногенеза амиксина на микрофлору кишечника крыс при дисбиозе, вызванном введением четыреххлористого углерода. Впервые в эксперименте показано, что амиксин модулирует процессы активации клеток Ито и их трансдифференцировки в миофибробласты, однако, не препятствует повреждению печени четыреххлористым углеродом.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты позволяют говорить о важной роли кишечной микрофлоры и эндотоксина в патогенезе заболеваний печени и необходимости учитывать состояние микрофлоры кишечника при назначении терапии больным с патологией печени. Проведенные исследования способствовали раскрытию закономерностей активации клеток Ито, их трансдифференцировки в миофибробласты и клеточных механизмов регенерации печени на фоне введения четыреххлористого углерода, амиксина и при экспериментальном дисбиозе кишечника. Использование иммуногистохимических методов исследования печени в клинической практике даст возможность осуществлять контроль за течением патологического процесса и эффективностью терапии.

Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения проблем регенерации печени, оценки гепатотропных эффектов новых лекарственных препаратов, а также в морфологической диагностике и прогнозировании хронических заболеваний печени человека, в учебном процессе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Повышенный уровень ЭТ в крови запускает в печени каскад клеточных реакций, характерный для ее регенерации после токсического повреждения.

2. Введение ЧХУ приводит к нарушению состава микрофлоры кишечника. Повреждающее действие ЧХУ на печень является многофакторным и складывается как из альтерации гепатоцитов самим токсином, так и влияния эндотоксина, повышение уровня которого обусловлено развитием дисбиоза кишечника.

3. При токсическом повреждении печени ЧХУ индуктор интерфероногене-за амиксин модулирует фенотип клеток Ито, поддерживает их число на уровне, необходимом для полноценной регенерации органа, и регулирует процесс их трансдифференцировки в миофибробласты.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе при изучении токсических повреждений печени и последующей ее регенерации в ЦНИЛ КГМУ, на кафедрах нормальной анатомии, патологической физиологии и инфекционных болезней КГМУ, включены в учебный процесс на кафедрах патологической физиологии и инфекционных болезней КГМУ. По результатам исследования опубликовано 15 работ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ состоялась на совместном научном заседании сотрудников кафедр патологической физиологии, инфекционных болезней и нормальной анатомии КГМУ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на пленумах Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 1998, Пермь, 1999), IV и VII Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 1999, 2002), III и IV научно-практических конференциях молодых ученых КГМУ (Казань, 1998, 1999), международных симпозиумах "Alcohol and Liver" (Будапешт, Венгрия, 1998), "Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry" (Братислава, Республика Словакия, 1998), "Liver Cirrhosis and its Development" (Базель, Швейцария, 1999), "Hepatology 2000" (Мюнхен, Германия, 2000), "Progress in Gastroenterology and Hepatology" (Ганновер, Германия, 2001), "37th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver" (Мадрид, Испания, 2002), "XII Falk Liver Week" (Фрайбург, Германия, 2003).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 277 источников: 41 отечественный и 236 иностранных. Диссертация содержит 32 рисунка и 4 таблицы.

6. ВЫВОДЫ

1. Однократное введение ЭТ приводит к увеличению числа десминпози-тивных клеток Ито без их трансдифференцировки в миофибробласты и повышению пролиферативной активности гепатоцитов и синусоидных клеток печени.

2. Введение лабораторным крысам канамицина в течение 2 недель приводит к дисбиозу кишечника, активации клеток Ито без трансдифференцировки их в миофибробласты и усилению пролиферативной активности гепатоцитов.

3. Повреждение печени ЧХУ приводит к активации клеток Ито, их транс-дифференцировке в миофибробласты, усилению пролиферативной активности гепатоцитов и сопровождается дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры.

4. На фоне повреждения печени ЧХУ и эндогенного дисбиоза кишечника развивается дуктулярная реакция; в паренхиме печени появляются клетки, позитивные по холангиолярным цитокератинам.

5. Амиксин способствует поддержанию числа клеток Ито на уровне, необходимом для полноценной регенерации печени, не приводя при этом к их трансдифференцировке в миофибробласты.

6. При хроническом повреждении печени человека алкоголем наблюдается появление а-ГМА-позитивных миофибробластов в очагах микровезикулярного стеатоза и развитие дуктулярной реакции.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ключевым этапом, определяющим возможность восстановления печени после повреждения, принято считать активацию перисинусоидальных клеток Ито [107, 127, 138, 141, 201], которая приводит к повышенному синтезу компонентов межклеточного матрикса и факторов роста, необходимых в процессе регенерации печени. При хронической, а в ряде случаев и острой альтерации печеночной паренхимы происходит трансдифференцировка этих клеток в миофибробласты - клеточный тип, ответственный за синтез коллагена. Причем даже на этом этапе процесс является обратимым, поскольку возможна обратная трансформация миофибробластов в покоящиеся клетки Ито.

Одним из патогенетических факторов многих заболеваний печени является системная эндотоксинемия, которая развивается в результате дисбиотических изменений в кишечнике, повышения проницаемости кишечной стенки, снижения детоксикационных возможностей печени и, как следствие, избыточного поступления ЭТ в кровоток [34, 48, 257]. Именно поэтому состояние кишечного микробиоценоза может играть важную роль в повреждении печени.

Одной из наиболее часто используемых моделей повреждения печени является введение экспериментальным животным ЧХУ. Принято считать, что альтерация печени при введении ЧХУ связана с повышением перекисного окисления липидов и развитием выраженного воспаления паренхимы печени [167], следствием чего являются некрозы гепатоцитов преимущественно 3-й зоны ацинуса. Вместе с тем в исследованиях Rivera СЛ. и соавт. было показано, что длительное введение ЧХУ сопровождается повышением содержания ЭТ в крови [53]. Однако не проводилось изучение микрофлоры кишечника как возможного источника эндотоксина при введении ЧХУ.

В результате проведенных нами исследований было показано, что альтерация печени при введении ЧХУ проявляется выраженной внутридольковой дегенерацией и некрозами гепатоцитов, которые локализованы преимущественно в перицентральной зоне, что является характерной чертой токсического действия препарата. На фоне введения ЧХУ мы наблюдали значительное увеличение числа клеток Ито с их трансдифференцировкой в миофибробласты и пролифе-ративиой активности гепатоцитов. Это является косвенным признаком повреждения печени и отражает процесс ее восстановления после введения гепатоток-сина. Вместе с тем нами было выявлено, что введение ЧХУ приводит к выраженным изменениям микрофлоры тонкой и толстой кишки крыс, проникновению бактерий в мезентериальные лимфатические узлы и ткань печени. На фоне сокращения спектра представителей нормальной микрофлоры высевались бактерии, не свойственные здоровым животным. Эти изменения могут быть связаны как с нарушением функций печени в результате поражения ее ЧХУ, так и с повышением проницаемости кишечного эпителия на фоне дисбиоза, обусловленного бактерицидным действием препарата [43,147].

Учитывая, что изменение микробного состава кишечника неизбежно ведет к избыточному поступлению бактериального ЛПС в портальный кровоток, было изучено влияние эндогенного дисбиоза, индуцированного введением канамицина, и однократного введения ЭТ в системный кровоток на морфофункцио-нальные характеристики клеток Ито (активацию клеток Ито и их трансдиффе-ренцировку в миофибробласты) и особенности регенераторного ответа печени.

Нами было установлено, что при однократном введении ЭТ и эндогенном дисбиозе наблюдается активация клеток Ито без трансдифференцировки их в миофибробласты, что исключает возможность развития фиброза. В обоих случаях наблюдалось значительное увеличение числа пролиферирующих клеток, что также является ответной реакцией печени на повреждение. С другой стороны, учитывая важную роль ЭТ в стимуляции синтеза цитокинов макрофагами печени и клетками Ито, нельзя исключить прямое стимулирующее влияние бактериального ЛПС на пролиферативную активность клеток печени [162, 204]. Таким образом, активация клеток Ито и регенераторный ответ гепатоцитов, который мы наблюдали на фоне введения бактериального ЛПС и эндогенного дисбиоза, подтверждают участие ЭТ в альтерации паренхимы печени.

Картина дисбиотических изменений при введении ЧХУ оказалась сходной с состоянием микрофлоры кишечника крыс на фоне введения канамицина. В обоих случаях мы наблюдали выраженные дисбиотические изменения с проникновением бактерий в мезентериальные лимфатические узлы и ткань печени.

Если дисбиотические изменения, вызванные приемом антибактериального препарата, приводят к альтерации паренхимы печени, нельзя исключить наличие аналогичного компонента повреждения печени и при введении ЧХУ. Таким образом, повреждение печени при введении ЧХУ, на наш взгляд, является смешанным и связано как с непосредственным влиянием препарата на клетки печени, так и с эндотоксинемией, вызванной нарушением микробного состава кишечника.

Другим доказательством повреждающего действия ЧХУ и эндогенного дисбиоза на печень была реакция желчных протоков: в обоих случаях наблюдалось развитие дуктулярной реакции, то есть увеличение числа желчных протоков в пределах портального тракта. Последнее может быть как результатом непосредственного повреждения холангиоцитов, так и следствием развивающегося холестаза. Обнаружение единичных клеток, экспрессирующих холангиоляр-ные маркеры, вне портальных трактов позволяет предположить, что увеличение числа желчных протоков может быть связано как с пролиферацией существующих клеток, так и с формированием новых протоков в паренхиме печени.

В многочисленных исследованиях была показана возможность обратного развития фиброза на фоне применения препаратов интерферонов [58, 96]. Нами была предпринята попытка изучить влияние индуктора интерфероногенеза амиксина на процессы регенерации печени, активации клеток Ито и их трансдифференцировки в миофибробласты.

Различные схемы введения препарата показали его влияние на ключевой момент фиброгенеза - активацию клеток Ито. Действие амиксина нельзя оценивать однозначно как стимулирующее или подавляющее активацию клеток Ито. Скорее всего, амиксин посредством интерферонов способствует поддержанию числа этих клеток на уровне, необходимом для полноценной регенерации печени, не приводя при этом к их трансдифференцировке в миофибробласты. Вместе с тем, амиксин не уменьшает, однако, и не усиливает альтерацию печени при введении его в сочетании с ЧХУ. Кроме того, амиксин, несмотря на то, что является индуктором интерфероногенеза, не усиливает течение воспалительной реакции в печени.

Интересно, что при сочетанном введении ЧХУ с амиксином мы не наблюдали полного отсутствия бактерий в кишечном содержимом, хотя количество микроорганизмов, заселяющих кишечник, значительно уменьшилось. По-видимому, сочетанное введение амиксина с ЧХУ приводит к снижению бактерицидного эффекта последнего. Нормализация микробного состава кишечника на фоне введения амиксина может быть связана как с восстановлением структуры и функций печени, так и со стимуляцией синтеза интерферонов энтероци-тами и активацией, таким образом, факторов местного иммунитета [25, 100].

Поскольку в настоящее время в патогенезе алкогольных поражений печени ведущая роль также отводится ЭТ [197, 213, 263], нами была изучена экспрессии а-ГМА и холангиолярных маркеров в аутопсийном материале больных с хроническими алкогольными поражениями печени. Было показано, что в большинстве случаев развитие фиброза при алкогольных поражениях печени происходит в очагах микровезикулярного стеатоза, что подтверждает прогностически более неблагоприятное течение заболевания при этой форме стеатоза. Аналогично экспериментальным моделям повреждения печени наблюдается развитие дуктулярной реакции, которая проявляется в увеличении числа желчных протоков в пределах портального тракта и появлении клеток, экспрессирующих холангиолярные маркеры, среди гепатоцитов. Это говорит о том, что реакция холангиоцитов на повреждение паренхимы печени является стандартной и практически не зависит от этиологии повреждающего фактора.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что экспериментальная альтерация печени ЧХУ сопровождается развитием дисбиоза кишечника, обуславливающим наличие эндотоксинового компонента повреждения. Повышение уровня эндотоксина в крови и развитие дисбиоза кишечника принимают участие в формировании клеточных реакций при повреждении печени.

105