Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Экспериментальное обоснование применения лигандов рецепторов прогестерона в терапии гиперпластических процессов тканей матки

На правах рукописи

□□3493123

МАНЯХИНА Анна Евгеньевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА В ТЕРАПИИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ТКАНЕЙ МАТКИ.

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 1 ШР 2Щ

Москва 2010

003493123

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор медицинских паук, профессор Карева Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Арзамасцев Евгений Вениаминович Доктор медицинских наук, профессор Яворский Александр Николаевич

Ведущее учреждение:

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Защита состоится «_»_2010г. в _часов на заседании

диссертационного Совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан «_»_2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Джанашия Платон Харитонович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Проблема лечения гиперпластических процессов тканей матки остается актуальной до настоящего времени, что связано, с одной стороны, с широким распространением данной патологии (Кулаков В.И., Прилепская В.Н.,2009) и, с другой стороны, с недостаточной эффективностью существующих способов консервативной терапии (Вихляева Е.М., 2006).

В структуре гинекологической заболеваемости наиболее частыми нозологиями являются гиперплазии эндометрия (ГПЭ) и миома матки (ММ). Эпидемиологические данные о частоте ГПЭ отсутствуют, по данным обращаемости частота их варьирует в зависимости от нозологической формы и возраста пациенток от 10 до 30%. Наиболее часто ГПЭ выявляют у женщин в возрасте 45—55 лет (Кулаков В.И., Серов В.Н., 2005). По мнению некоторых авторов, гиперплазией эндометрия страдают до 50% женщин позднего репродуктивного возраста (Кулаков В.И., Прилепская В.Н. 2009).

Эндометрий представляет собой гормоночувствительную ткань, находящуюся под влиянием эстрогенов и прогестерона. Эстрогены оказывают митогенный эффект на эндометрий, обеспечивая его рост и пролиферацию, прогестерон — антипролиферативное действие. В развитии ГПЭ играет роль как абсолютная, так и относительная гиперэстрогения. Предлагаемые в настоящее время подходы к медикаментозной терапии ГПЭ направлены на нормализацию состояния эпдометрия и регуляцию ритма менструаций. Основное место в лечении ГПЭ принадлежит гормональной терапии, оказывающей как местное воздействие на эндометрий, направленное на подавление пролиферации клеток слизистой оболочки матки, так и центральное действие, состоящее в ингибировании секреции гонадотропинов, приводящее к торможению стероидогенеза в яичниках. При лечении ГПЭ применяют лекарственные средства следующих групп: гестагены, монофазные комбинированные пероральные контрацептивы, антигонадотропины.

Медикаментозное лечение является патогенетическим и направлено на снижение влияния на ткань эстрогена. При простых и рецидивирующих ГПЭ основное предпочтение отдается синтетическим гестагенам (Кулаков В.И., Серов В.Н., 2005). При этом эффективность гестагенотерапии ГПЭ остается не достаточно высокой (Хохлова И.Д., Кудрина Е.А. 2004). На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии РГМУ было доказано, что гиперплазия тканей матки сопровождается не только количественными, но и качественными изменениями параметров рецепции половых стероидов (Сергеев П.В., 1989; 2003). В частности, показано, что способность рецепторов прогестерона (РП) тканей матки связывать синтетические гестагены значительно варьирует как среди

1

нозологических групп, так и среди пациенток, что, по нашему мнению, является резервом повышения эффективности лечения. Проверка данной гипотезы явилась одной из задач нашего исследования.

Если ГПЭ являются фоновыми состояниями для развития рака тела матки, то миома матки практически никогда не несет угрозы озлокачествления (Fleischer R.,

2008). Тем не менее, ММ представляет социально значимое заболевание: частота встречаемости данной нозологии может достигать 11 - 47,3 % женщин в возрасте от 18 до 60 лет (Вихляева Е.М., 1982; Okolo S., 2009). При этом риск развития заболевания существенно возрастает после 35-40 лет (Вихляева Е.М., 2006). Лечение симптомной ММ в основном хирургическое, при этом операция связана со значительной кровопотерей, высоким травматизмом и угрозой бесплодия. При отсутствии показаний к оперативному лечению или невозможности его проведения, применяют медикаментозное лечение, которое включает использование аналогов гонадолиберинов и гестагены. Центральная блокада гонадотропной функции гипофиза высокоэффективна, но ограничена во времени проявлением такого побочного эффекта как изменение костного метаболизма (гипоэстрогения - остеопороз). Гестагенотерапия зачастую не дает эффекта, так как при несомненной гормональной зависимости роста ММ, возможен как эстрогенный, так и прогестероновый контроль пролиферации узлов (Okolo S.,

2009). Тип гормональной зависимости процесса необходимо знать для рационального выбора препаратов: гестагены при эстрадиол-зависимом росте и антигестагены при прогестероп-зависимой пролиферации. Таким образом, особенности патобиоза ММ ставят перед исследователями как минимум две задачи. Во-первых, это - диагностика типа гормональной зависимости роста узлов. В настоящее время в мировой практике отсутствуют утвержденные методы такой диагностики, поэтому, поиск критериев гормональной зависимости ММ является актуальным. Нами в качестве потенциального маркера гормональной зависимости ММ выбрана мононуклеарная фракция клеток периферической крови (МНФК). Обоснованием этого явилось: наличие рецепторов половых стероидов в указанных клетках (McDonnell D.P., Lobo R.A., 2000) и данные об изменении иммунного статуса пациенток с гиперплазиями тканей репродуктивного тракта (Kamada М., Irahara М., 2001). К тому же, использование МНФК в качестве тест-системы снимает необходимость получения биоптата ткани-мишени.

Второй проблемой, которая касается прогестерон-зависимых миом, является паличие лишь одного антигестагенного препарата на фармацевтическом рынке РФ - мифепристона. Учитывая возможность вариации аффинитета РП к мифепристону (Сергеев П.В., 2003), необходим поиск и создание высокоселективных отечественных антигестагенов, перспективных для использования в клинической практике.

В ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН синтезирован ряд синтетических гестагенов -прегпа-D '-пентаранов, представляющих класс 3,20-дикетопрегнанов с дополнительным 16а, 17а-карбоциклом, содержащим от трех до семи атомов углерода и их производных. ПрегнаФ'-пентараны являются селективными модуляторами РП, т.е. обладая высоким аффинитетом к рецепторам, проявляют свойства агонистов/антагонистов в зависимости от гормонального фона и клеточного контекста. Гестагенная активность данных соединений, оцененная in vivo, в 3-9 раз выше, чем у прогестерона (Levina I.S., 2008). Антигестагенное действие может варьировать от 0 до 100% в зависимости от заместителей. Таким образом, прегна-О'-пептарапы являются высокоактивными соединениями, с разделенными биологическими функциями, что делает их перспективными для поиска новых селективных лигандов РП.

Цель работы: оптимизация гормональной терапии гиперпластических процессов тканей матки на основании данных рецепторного анализа и поиск новых лигандов РП, перспективных для клинического использования.

Задано:

1. На основании результатов исследования специфического связывания гестагенов с РП в эндометрии при гиперплазиях у женщин позднего репродуктивного периода осуществить подбор индивидуальной гестагенотерапии, оценить ближайшие и отдаленные результаты лечения.

2. Провести сравнительный анализ рецепции женских половых стероидов в цитозоле тканей матки при гиперплазиях и МНФК периферической крови у этих пациенток.

3. Изучить фармакологические свойства новых синтетических лигандов РП:

a) определить специфическое связывание прегна-О'-пентаранов с РП цитозоля тканей матки при гиперплазиях и культур клеток МНФК и HeLa;

b) определить влияние прегна-О'-пентаранов на выживаемость клеток HeLa и МНФК;

c) исследовать влияние прегна-О'-пентаранов на продукцию ФНО-а в МНФК;

d) провести структурно-функциональный анализ в ряду изученных прегна-О'-пентаранов и выявить наиболее перспективные соединения для дальнейших доклинических испытаний.

Научная новизна:

Впервые было определено специфическое связывание новых синтетических гестагенов с РП эндометрия, миометрия и МНФК периферической крови у женщин позднего репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами тканей матки.

Продемонстрирована тесная положительная корреляция между специфическим связыванием синтетических прогестинов с РП эндометрия при гиперплазии и их фармакологической активностью.

Показана высокая эффективность дифференцированной гестагенотерапии ГПЭ, основанной на результатах рецепторного анализа эндометрия (снижение частоты рецидивов заболевания в 9 раз по сравнению с исходными данными).

Предложен новый способ диагностики гормональной зависимости патологии гениталий, основанный на малоинвазивном методе определения уровня рецепторов половых стероидов в МНФК.

Проведен анализ влияния новых лигандов РП на продукцию ФНО-а и выживаемость культур клеток МНФ и НеЬа.

Практическая значимость работы.

Разработаны основы дифференцированной гестагенотерапии ГПЭ с учетом специфического связывания гестагенов с рецепторами прогестерона конкретной пациентки.

Предложен новый способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий с помощью определения уровня рецепторов половых стероидов в МНФ клеток периферической крови у пациенток позднего репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами тканей матки (патент на изобретение №2312354).

В результате фармакологического скрининга новых пентаранов отобраны два наиболее перспективных соединения (16а,17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион и 19(£)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а,17а-циклогексанопрегн-4-ен) для дальнейших доклинических испытаний.

Апробация работы: Апробация работы состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии МВФ, аспирантов и сотрудников научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии РГМУ.

Публикации: Материалы работы доложены и обсуждены па I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (2006), на XIII (2006), XIV (2007), XV (2008) и XVI (2009) Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», на 9-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (2007). По материалам диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описапию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 230 источников. Работа изложена на 124 страницах, иллюстрирована 19 рисунками, 11 таблицами и 2 схемами.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Персонализированная гормональная терапия ГПЭ, основанная на результатах исследования связывающей активности синтетических гестагепов с рецепторами прогестерона эндометрия конкретной пациентки, позволяет повысить эффективность лечения.

2. Уровни рецепторов эстрадиола-17р и прогестерона в МНФК периферической крови тесно и положительно коррелируют (г= 0,77 и 0,9, при р< 0,05 соответственно) с аналогичными параметрами в цитозоле эндометрия пациенток с гиперплазиями.

3. 16а,17а-циклогексано-5аН-прептп-3,20-диоп и 19(£)-19-мстоксиимино-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексапопрегн-4-ен - селективные антигестагены с антипролиферативной активностью, которые можно отнести к перспективным соединениям для терапии прогестерон зависимых гиперпластических процессов тканей матки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В экспериментах использованы соединения, синтезированные в лаборатории химии стероидов и терпеноидов ИОХ имени Н.Д. Зелинского РАН (зав. - проф., д.х.н. Камерницкий А.В.) - 16а,17а-спиропентанопрогестерон (I), 3-оксим 16а,17а-циклогексано-прогестерона (II), 19(£)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16 а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен (III), 16а,17а-циклогексано-5аН-прегпан-3,20-диоп (IV), ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5 аН-прегнан-3,20-дион (V), ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5рН-прегнан-3,20-дион (VI). (рис.1, табл.1).

Рис. 1. Общая структурная формула 6 производных прогестерона ряда

пентаранов.

Таблица 1. Структура исследованных производных пентарана.

N Стероид D' (16а,17а) X Двойная связь R R,

Р» прогестерон - О 4,5 СНз н2

I 16а, 17а-спиропентанопрогестерон XI о 4,5 СН3 Н2

II 3-оксим-16а, 17а-циклогексано-прогестерона -(сад4- (£)NOH 4,5 СН, Н2

III 19{Е)-19-метоксиимюю-3,20- диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен чснж- О 4,5 (£)СН= NOMe н2

IV 16а, 17а-цшслогексано-5аН-прегнан-3,20-дион -(СН2)4- О 5аН СНз Н2

V ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион -(СН2)4- О 5аН СН3 Н, аСНз

VI ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5рН-прегнан-3,20-дион -(СН2)4- о 5ßH СНз Н, аСН3

В работе использован клинический материал (кровь и биопсии) 183 пациенток с различными вариантами гиперпластических процессов тканей матки, проходивших обследование и получавших лечение в отделении гинекологической эндокринологии МОНИИАГ (дир. - член-корр. РАМН, проф. Краснопольский В.И., зав. отделением гинекологической эндокринологии - д.м.н. Гаспаряп Н.Д.). Все пациентки подписали информированное согласие на забор биологического материала для клинико-лабораторных исследований. В ходе работы использована ткань эндометрия, полученного при гистероскопии и диагностическом выскабливании и ткань миометрия, полученная в ходе консервативной миомэктомии и гистерэктомии.

Клеточная культуры HeLa (эпителиоидный рак шейки матки человека) предоставлена Институтом Вирусологии им. И.И. Мечникова.

Для анализа специфического связывания с РП использованы гестагены, представители трех основных структурных групп: дидрогестерон (дюфастон), производное 19-норстероидов (норэтистерона ацетат) и производное 17-ОПК (депо-провера), а также 6 новых прегна-О'-пентаранов.

Контрольную (I) группу составили 38 женщины с неизмененным эндометрием, во П группу вошли 51 пациентки с железистыми полипами эндометрия (ПЭ), III группа представлена 47 больной с простой железистой гиперплазией эндометрия (ГЭ) и IV группу составили 47 пациентки с лейомиомой матки. Неизмененную ткань миометрия получали при гистеротомии па расстоянии 3 см от миомного узла (МУ). Возраст пациенток всех групп был сопоставим и составил в среднем 41,3 ± 1,5 лет. Условиями включения в исследование являлось: не использование гормональных препаратов в течение 3 последних месяцев, отсутствие тяжелой соматической

патологии и выраженных метаболических нарушений у пациенток всех групп. Забор крови из локтевой вены и биоптатов тканей матки производился в день операции в первую фазу менструального цикла.

Методы исследования. Цитозоль тканей матки получали с помощью ультрацентрифугирования при 105 тыс. g. В цитозольных фракциях биоптатов и МНФК периферической крови связывание 3Н-эстрадиола и 3Н-прогестеропа проводили радиолигандным методом (Бассалык Л.С., 1987). МНФ клеток из периферической крови получали стандартным методом по Boyum А. (1968).

Определение специфического связывания синтетических стероидных гормонов с РП проводилось согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под ред. Фисснко В.П., 2000).

Анализ уровня ФНО-а в МНФК периферической крови проводился с использованием стандартных ИФА-наборов («Вектор-Бест»). Влияние стероидных гормонов на жизнеспособность клеток оценивалось методом МТТ (3(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый), рекомендованным «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ».

Содержание В- и Т-лимфоцитов и моноцитов в МНФК оценивали с помощью проточного цитофлюориметра сортера FACSAria (Becton Dickenson Со), показатели клеточного состава находились в пределах референсных значений.

Количество мРНК подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола определяли методом RT-PCR согласно стандартным протоколам на амплификаторе iQ5 (BioRad). Праймеры синтезированы в компании «Синтол», схема амплификации подобрана с помощью программы Primer Express Software (Applied Biosystems).

Статистическую обработку материала проводили с помощью программы "Biostat" версия 6.0 и GraphPad Prism 5. Достоверность различий между группами по изучаемым параметрам оценивалась с помощью непараметрических критериев статистики (Уилкоксона, Манна-Уитни).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование специфического связывания гестагенов с рецепторами прогестерона в цитозоле эндометрия при гиперплазиях у женщин позднего репродуктивного периода.

Уровень специфического связывания прогестерона и эстрадиола в эндометрии у женщин основных групп с ГПЭ значительно варьировал. Средняя концентрация рецепторов прогестерона и эстрадиола (РЭ) в цитозоле эндометрия контрольной группы (24 пациентки) составляла 28,24 ± 7,08 и 24,72 ± 5,31 фемтомоль/мг белка,

при полипах эндометрия (34 пациентки) - 17,44 ± 2,64 и 16,90 ± 3,33 фемтомоль/мг белка, при железистой гиперплазии (31 женщина) - 20,26 ± 4,47 и 21,54 ± 5,71 фемтомоль/мг белка соответственно. При этом наблюдалась тенденция к снижению уровня рецепторов половых стероидов при гиперплазии эндометрия. В частности, средние значения специфического связывания половых стероидов в группе с полипами эндометрия были в 1,5 раза ниже, чем в контрольной группе, а в группе с железистой гиперплазией ~ в 1,2 раза.

На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии РГМУ (зав. - чл.-корр. РАМН, проф. Шимановский Н.Л.) была показана вариабельность силы связывания РП с селективными лигандами при ГПЭ, которая, по-видимому, отражает полиморфизм гена стероидного рецептора (в лиганд-связывающем домене) (Сергеев П.В., 2003, 2008). Так как сила связывания лигавда с рецептором определяет его действие, то выявленный феномен, по нашему мнению, является очевидным резервом повышения эффективности гестагенотерапии (снижения количества рецидивов). Для проверки данной гипотезы нами был проведен анализ специфического связывания доступных в клинической практике гестагенов с РП при ГПЭ (диаграмма №1). В качестве тестируемых препаратов нами выбраны наиболее типичные представители трех основных групп гестагенов, используемых в терапии ГПЭ: дидрогестерон, норэтистерона ацетат и медроксипрогестерона ацетат (МПА).

Диаграмма № 1. Специфическое связывание синтетических гестагенов с цитозольными рецепторами прогестерона в эндометрии при ГПЭ у женщин позднего репродуктивного возраста (%).

250 200 150 100 50 0

контрольная группа полипы эндометрия гиперплазия

эндометрия

в дидрогестерон ПМПА □норэтистерон ацетат

у - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной группы (р < 0,001).Специфическое связывание 3П-прогестерона принято за 100%.

Из представленных данных видно, что при ГПЭ наибольшую силу связывания с РП в среднем проявил МПА (61,21 ± 4,23% при ПЭ и 75,33 ± 3,91 % при ГЭ), далее по убыванию следуют норэтистерона ацетат и дидрогестерон. Надо отметить, что сила связывания РП с гестагенами является индивидуальной характеристикой, в частности, у 2-х пациенток с ГПЭ наибольшую специфичность связывания проявил норэтистерона ацетат.

Всем пациенткам с ГПЭ (65 женщин) методом слепой выборки назначалась гормональная противорецидивная терапия. Надо отметить, что основная часть пациенток, обратившихся в клинику, имела в анамнезе рецидивы ГПЭ (54%). Пациенткам после раздельного диагностического выскабливания под контролем гистероскопии (биоптат забирали для рецепторного анализа) назначали дюфастон 10, норколут или примолют-нор с 5 по 25 день цикла в течение 6 месяцев или депо-провера 150 в/м через 28 дней в течение 3 месяцев. Распределение по группам и эффективность лечения (рецидивы в течение 6 месяцев после окончания лечения) представлены на диаграмме №2.

Диаграмма №2. Распределение по группам (количество пациенток) и эффективность гестагенотерапии ГПЭ методом слепой выборки.

Суммарно на фоне и после проводимого лечения дидрогестероном и норэтистероном ацетатом были отмечены рецидивы ГПЭ у 10 (15,4%) пациенток основных групп, из них - у 6 (17,6%) женщин из группы с ПЭ и у 4 (13,0%) - из группы с ГЭ.

Сравнительный анализ эффективности гормональной терапии и результатов связывающей активности используемых гестагенов с РП в цитозоле эндометрия выявил тесную положительную корреляцию этих параметров (г=0,985 при полипах, р=0,05; г=0,801 при простых железистых гиперплазиях, р=0,05). Очевидно, что препараты с низкой силой связывания с РП оказались менее эффективными в терапии ГПЭ.

Лечение полученных рецидивов заболевания (10 пациенток) осуществлялось с учетом результатов связывающей активности гестагенов с РП цитозоля эндометрия конкретной пациентки, В среднем терапию проводили в течение 3-6 месяцев в соответствии со стандартными схемами с использованием рекомендованных нами препаратов. Предложенная гестагенотерапия оказалась эффективной у 6 пациенток, тогда как у 4-х - выявлены отдаленные рецидивы. При этом надо отметить, что данные пациентки получали неоднократно гормональную терапию без эффекта. Таким образом, общая эффективность гестагенотерапии 65 пациенток составила 94%.

Эффективность гормональной терапии с учетом и без учета связывающей активности РП с синтетическими гестагенами представлена на диаграмме №3.

Диаграмма №3. Эффективность гормональной терапии у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия.

после проведенного печения после проведенного лечения с

по методу слепой выборки учетом результатов

чувствительности РП эндометрия к синтетическим гестагенам

о эффективность ГГ в рецидивы ГПЭ

Из приведенных данных видно, что после лечения полученных рецидивов ГПЭ с учетом результатов связывающей активности РП эндометрия с гестагенами, частота рецидивов уменьшилась в 2,5 раза (с 15,4% до 6%). Следовательно, подтверждена выдвинутая нами ранее гипотеза о возможности повышения эффективности гормонального лечения ГПЭ за счет использования рецепторного анализа.

2. Сравнительный анализ рецепции женских половых стероидов в цитозоле тканей матки при гиперилазиях и МНФК периферической крови.

А) Уровень специфического связывания 3Н-прогестерона и 3Н-эстралиола с МНФК периферической крови пациенток с ГПЭ имел значительные вариации как между нозологическими группами (таблица 2), так и у отдельных пациенток.

Индивидуальный сравнительный анализ специфического связывания 3Н-эстрадиола-17р и 3Н-прогестерона в МНФК периферической крови выявил тесную и положительную корреляцию с аналогичными параметрами в цитозоле эндометрия у пациенток с гиперплазиями (г = 0,77 и 0,9 соответственно, р <0,05).

Таблица 2. Уровень специфического связывания 3Н-прогестерона и 3Н-эстралиола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациенток с гиперплазиями эндометрия (M±mt).

N РЭ (фемтомоль/млн. клеток) РП (фемтомоль/млн. клеток)

Контрольная группа 14 0,81±0,25 2,35±1,52

Полипы эндометрия 17 1,97±1,01 8,37±4,41

Железистая гиперплазия эндометрия 16 1,21±0,87 4,76±2,57

Учитывая корреляцию между уровнем рецепторов половых стероидов в МНФК и цитозоле биоптата эндометрия пациенток с гиперплазиями, считаем правомерным использование параметров рецепции эстрадиола и прогестерона в МНФК для косвенной оценки гормональпой зависимости патологического процесса в ткани матки. Полученные результаты оформлены в виде патента «Способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий» (№ 2312354, 2007).

Б) Для аналогичного исследования при миоме матки с целью уменьшения вариативности получаемых данных нами проведена предварительная работа, которая заключалась в определении оптимальных условий забора биоптата. Недавно опубликованы данные о существовании градиента уровня экспрессии

11

рецепторов эстрадиола в миомном узле от центра к псевдокапсуле (Wei JJ., 2005). Полученные нами методом RT-PCR данные об уровне мРНК подтипов рецепторов половых стероидов в МУ размерами до 5 см приведены на диаграмме №4.

Диаграмма №4. Распределение мРНК подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола в зависимости от локализации в миомном узле (п=8).

4- - значение статистически достоверно отличается от показателем промежуточной зоны (р <0,05)

Из приведенных данных видно, что наибольшие концентрации мРНК рецепторов приходятся на центральную область узла и псевдокапсулу, что соответствует литературным данным (Wei JJ., 2005). При этом если рецепторы эстрадиола в центре представлены преимущественно альфа-подтипом, то среди РП доминируют РП типа В. Необходимо отметить, что именно эти подтипы рецепторов половых стероидов выступают в роли активаторов транскрипции зависимых генов, в отличие от своих напарников - трансдоминантных ингибиторов транскрипции. Таким образом, для исключения влияния локализации биоптата в миомном узле на получаемые параметры, нами в качестве наиболее информативной зоны выбран центр МУ (узел не более 5 см без некроза), что неукоснительно соблюдалось в дальнейшей работе.

Результаты рецепторного анализа биоптатов МУ и гистологически неизмененной ткани миометрия (>3 см от узла) представлены на диаграмме № 5.

Как видно из представленных на диаграмме данных среднее количество РП в цитозоле МУ было более чем в 2 раза выше по сравнению с неизмененной тканью миометрия (р<0,001), что согласуется с литературными данными (Rein MS., 2007).

Несмотря на существование прогестерон-зависимых миом матки (Fleischer R., 2008), общепринятые критерии лабораторной диагностики специфичности гормональной зависимости миомы отсутствуют. Поэтому общая популяция

12

Диаграмма №5. Уровень рецепторов половых стероидов в цитозоле гистологически неизмененного миометрия и миомного узла пациенток позднего репродуктивного возраста (п=39, фемтомоль/мг белка цитозоля).

ткань миомного узла

гистологически неизмененный миометрий

О

2 3 4 5

фемтомоль/мг белка цитозоля

6

■ цРЭ РцРП

+ - значение статистически достоверно отличается от показателя в неизмененном миометрии

пациенток с ММ нами была рандомизирована с учетом результатов рецепции половых стероидов в биоптатах на две группы: в группе А соотношение РП/РЭ составляло в среднем 1,84 (18 пациенток), в группе Б (12 пациенток) - 0,34 соответственно. 5-тикратное превышение уровня РЭ в миоме у пациенток группы Б по сравнению с группой А позволило предполагать зависимость роста миомного узла от эстрадиола в данной группе (Бассалык Л.С., 1987).

После рандомизации средний уровень специфического связывания 3Н-прогестерона и 3Н-эстрадиола в МНФК периферической крови в группе А был более чем в 10 раз выше, чем в группе Б (р < 0,001 и р< 0,05 соответственно) (диаграмма №6). На основании полученных данных можно предположить, что одним из косвенных признаков гормональной зависимости миомы матки может выступать рецепция половых стероидов в МНФК периферической крови. В качестве проверки предложенной гипотезы нами в общей выборке пациенток с ММ проанализирована связь между уровнем рецепции половых стероидов в МНФК периферической крови и специфичностью гормональной зависимости миомы матки. Надежность критериев гормональной зависимости ММ составила для РП МНФК - 89,5% и для РЭ - 57,9%. Следовательно, наиболее информативным для определения специфичности гормональной зависимости ММ является содержание РП в МНФК периферической крови.

(р <0,001).

Диаграмма 6. Уровень специфического связывания 3Н-прогестерона и 3Н-эстрадиола в МНФ клеток периферической крови у пациенток с миомой матки.

14

J2 о »0

§8

14

е;

°2

го

S

ф

■fr

1

-

группа А

□ РП

группа Б

+ - значение статистически отличается от показателя группы А (р <0,05) ++ - значение статистически отличается от показателя группы А (р <0,001)

По предложенному критерию в нашем исследовании у 60% пациенток выявлена зависимость роста ММ от прогестерона. Препаратами выбора в этом случае являются антигестагены. Однако до настоящего времени, единственным препаратом с антигестагенной активностью разрешенным к использованию в РФ является мифепристон, что делает актуальным поиск новых антигестагенных соединений.

3. Изучение фармакологических свойств новых синтетических лигандов рецепторов прогестерона.

А) Определение специфического связывания прегна-D '-пентаранов с РП HeLa и МНФК периферической крови.

Уровень специфического связывания 3Н-прогестеропа в культуре клеток HeLa составлял в среднем 15,82 ± 4,43 фемтомоль/млн. клеток. Результаты анализа специфического связывания новых синтетических гестагенов с РП клеток HeLa (конкурентное иигибирование связывания с 3Н-прогестероном) представлены в таблице 3. В качестве препарата сравнения использовали прогестерон, связывающую активность которого принимали за 100%.

Все соединения показали высокое сродство к рецепторам прогестерона. Максимальная связывающая активность с РП была у соединения V, далее по убыванию следуют III, IV, VI и П.

Таблица 3. Специфическое связывание прегна-О'-пентаранов с рецепторами

прогестерона в культуре клеток HeLa (%).

соединение Культура клеток HeLa

16а, 17а-спиропентапопрогестерон I 55,31 ±5,82

3-оксим 16а,17а-циклогексано-прогестерона II 60,93 ± 5,61

19{Е)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен Ш 86,62 ± 7,45

16а, 17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион IV 82,42 ±8,51

ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион V 88,00 ±8,42

ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5рН-прегнан-3,20-дион VI 76,00 ±6,33

Наименее активным оказалось соединение I, его специфическое связывание составило 55,3 ± 5,8 %. Учитывая зависимость эффекта стероида от силы связывания с РП, перспективными для дальнейшего изучения являются соединения V, III и IV.

Результаты изучения специфического связывания прегна-О'-пентаранов с рецепторами прогестерона МНФ клеток периферической крови у пациенток с миомой матки представлены в таблице 4.

Как видно из представленных данных максимальная связывающая активность с РП была у веществ I и IV, далее по убыванию следуют соединения 1П, V, VI и II. Надо отметить, что все изученные прегна-О'-пентараны превосходили мифепристон (32,12±4,88%) по связывающей активности с РП.

Таблица 4. Специфическое связывание прегна-В'-пентаранов с рецепторами прогестерона в МНФ клеток периферической крови у пациенток с миомой

матки (%).

Соединение МНФ клеток периферической крови

16а, 17а-спиропентанопрогестерон I 104,31 ±16,95

3-оксим 16as 17а-циклогексано-прогестерона II 67,00 ±5,52

19(Е)-19-метоксиимшга-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен Ш 99,00 ±8,91

16а, 17а-циююгексано-5аН-прегнан-3,20-дион IV 102,82 ±19,34

ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5 аН-прегнан-3,20-дион V 77,31 ±6,14

ба-метил-16а, 17а-циклогексано-5 ßH-прегнан-3,20-дион VI 71,72 ±6,68

Структурно-функционалышй анализ показал, что пентараны с неароматическим кольцом А (кето-группой в положении 3 и двойпой связью между атомами С-4 и С-5) в инвертированной конформации 1р,2а (I и III) проявляют высокую активность в связывании с РП МНФК, а введение оксимного радикала в С-3 (вместо кето-) резко' снижает связывающие свойства соединения (П). При введении метоксиимино радикала в С-19 (III) и интактной кето-группе в С-3 связывающая активность восстанавливается. Таким образом, подтверждается участие в специфическом связывании кето-радикала в С-3. При этом восстановление двойной связи в кольце А не всегда сопровождается снижением связывающей активности (IV). Следовательно, в данном случае в связывание IV с РП вносит свой вклад Б'-кольцо. Дальнейшая модификация молекулы пентарапа — введение метальной группы в С-6 - приводит к значимому снижению активности связывания, которое принципиально не зависит от ориентации водорода у С-5 (V, VI).

Таким образом, прегна-Б '-пентараны проявляют высокое сродство к РП МНФК, которое зависит от: 1) наличия кето-группы в С-3 и дополнительного карбоцикла С16-С17; 2) отсутствия двойной связи между С-4 и С-5 и заместителя в С-6.

Связывание стероида с рецептором не может служить единственной тест-системой в отборе активных препаратов, так как соединения проявляют как агонистическую, так и антагонистическую активность при условии высокого аффинитета. Поэтому, рецепторный анализ всегда должен сочетаться с изучением влияния препаратов на функционирование клетки-мишени, в частности на жизнеспособность клеток-мишеней и цитокинопродукцию.

Б) Влияние прегна-В '-пептарапов на жизнеспособность клеток НеЬа и МНФК периферической крови.

Воздействие новых соединений на жизнеспособность клеток НеЬа и МНФ периферической крови определяли с помощью МТТ-теста. Результаты представлены на диаграмме №7. Оптическая плотность контрольного образца принималась за 100%.

Из приведенных данных видно, что наиболее эффективно подавляли жизнеспособность клеток НеЬа соединения IV и III (на 48 и 44%), что соответствовало их высокой связывающей активности с РП.

Изученные вещества не влияли на пролиферативную активность МНФК, за исключением пентарапа II, который стимулировал ее на 40%. Следовательно, все изученные соединения не оказывали отрицательного влияния на жизнеспособность «здоровых» клеток (МНФК).

Диаграмма №7. Влияние цикло-О'-пентаранов на жизнеспособность клеток HeLa и МНФ периферической крови (%).

+ -значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,01)

Таким образом, вероятность проявления побочных эффектов, в частности иммуносупрессии, при использовании этих соединений в противоопухолевых целях, мала. Однако для подтверждения этого предположения требуются дополнительные исследования в условиях irt vivo.

Одним из доступных параметров функционирования МНФК является цитокинопродукция, в частности выработка ФНО-а. Поэтому целесообразно оценить эффект тестируемых стероидов на этот показатель.

В) Влияние новых синтетических гестагенов на уровень ФГА-стимулированной продукции ФНО-а в МНФ клеток периферической крови у пациенток с миомой матки.

Результаты анализа влияния цикло-О'-пентаранов на уровень продукции ФНО-а мононуклеарной фракцией клеток периферической крови (72 ч, 37°С, 5% СО2) у пациенток с миомой матки представлены на диаграмме №8.

Как видно из представленных данных прогестерон (препарат сравнения) уменьшал выработку ФНО-а клетками МНФ, стимулированных ФГА, на 17%, что совпадает с литературными данными (Мапю Т., 2003). Добавление к культуре клеток соединений IV и П1 увеличивало секрецию ФНО-а на 25 и 20% соответственно. Остальные соединения не вызывали значимых изменений.

Диаграмма №8. Влияние цикло-В'-пентаранов на концентрацию ФНО-а в культуралъной среде МНФ клеток периферической крови пациенток с миомой

матки.

+ -значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,05)

Корреляционный анализ специфического связывания соединений с рецепторами прогестерона и их действия на секрецию ФНО-а МНФК подтвердил рецептор-опосредованность указанного эффекта (г=0,84, р< 0,05). Таким образом, соединения ГУ и III не только тормозили рост клеток HeLa, но и стимулировали продукцию иммунокомпетентными клетками цитокина, известного своей способностью подавлять пролиферацию опухолевых клеток (Kyurkchiev D., 2007).

В классической фармакологической схеме определение направленности действия соединения осуществляется путем сравнения эффектов исследуемых веществ с эффектом известного агониста (в данном случае прогестерона) на интересующий параметр. В отличие от прогестерона соединения IV и III, стимулировали продукцию цитокина; это позволяет нам предположить, что данные соединения проявляют антипрогестагенную активность, по крайней мере, в данной экспериментальной системе. Антигестагенные свойства IV в других системах (тест на несохранение беременности и сокращение полосок миометрия) были продемонстрированы ранее на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МВФ (Карева E.H., 1999).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, в результате комплексного исследования получены данные, которые позволили предложить способ оптимизации медикаментозного лечения гиперпластических процессов тканей матки, суть которого заключается в подборе гестагенотерапии на основе индивидуальной оценки связывающих свойств РП конкретной пациентки. На основании изучения фармакологических свойств новых производных прогестерона, содержащих пентарановую группу, выявлены два новых селективных лиганда рецепторов прогестерона, перспективных для создания лекарственных препаратов способных избирательно регулировать гестагенные рецепторы.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ специфического связывания гестагенов с РП и эффективности лечения этими препаратами ГПЭ у пациенток позднего репродуктивного периода выявил тесную положительную корреляцию (г=0,985 при полипах, р=0,05; г= 0,801 при простых железистых гиперплазиях, р=0,05), что явилось обоснованием дифференцированного назначения гормональной терапии. В результате предложенной тактики лечения удалось повысить эффективность терапии в 2,5 раза.

2. Выявлена тесная и положительная корреляция между специфическим связыванием 3Н-эстрадиола-17р и 3Н-прогестерона в МНФК периферической крови с аналогичными параметрами в цитозоле эндометрия у пациенток с гиперплазиями (г = 0,77 и 0,9 соответственно, р<0,05).

3. Фармакологический скрининг 6 представителей прегна-Б '-пентаранов позволил выявить два наиболее активных соединения - 19(Е)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогсксанопрегн-4-ен и 16а, 17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион, которые проявили высокую активность в связывании с РП клеток НеЬа (86,62 ± 7,45% и 82,42 ± 8,51% соответственно) и подавлении их жизнеспособности (на 44,1± 5,6%. и 48,2 ± 8,3% соответственно), перспективных для дальнейшего изучения возможности их использования в клинической практике для лечения гиперпластических процессов тканей матки.

4. Тестируемые прегна-Б'-пентараны эффективно подавляли жизпеспособность клеток НсЬа (I > VI = V > II > III = IV) и не влияли на пролиферативную активность МНФК.

5. Из ряда прегна-Б'-пентаранов только соединения \9(Е)-\9-метоксиимиио-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен и 16а, 17а-циклогексано-5 аН-прегнан-3,20-дион влияли на секрецию ФНО-а МНФК, увеличивая ее на 20 и 25% соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты диссертации позволяют рекомендовать новые отечественные лиганды рецепторов прогестерона - 19(E)- 19-метоксиимипо-3,20-диоксо- 16а, 17а-цшшогексанопрегн-4-ен и 16а,17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион - для дальнейших доклинических исследований и последующего внедрения в практику в качестве препаратов для лечения гиперпластических процессов тканей матки.

Результаты комплексного исследования, полученные в ходе выполнения диссертационной работы позволили предложить способ оптимизации медикаментозного лечения гиперпластических процессов тканей матки, суть которого заключается в подборе гестагенотерапии на основе индивидуальной оценки связывающих свойств РП конкретной пациентки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Маняхина А.Е. //Противорецидивная гормонотерапия у женщин позднего репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами эндометрия.// Материалы I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, М., 16 марта 2006, с.397.

2. Гриненко Г.С., Гаспарян Н.Д., Овчинникова Е.В., Горенкова О.С., Карева E.H., Маняхина А.Е.// Специфическое связывание новых гестагенов с рецепторами прогестерона у пациенток с полипами эндометрия.// Сборник материалов XIII Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», М., 3-7 апреля 2006, с. 159.

3. Карева E.H., Левина И.С., Гаспарян Н.Д., Маняхина А.Е., Горенкова О.С.// Синтетические аналоги прогестинов (пентараны) селективно связываются с рецепторами прогестерона патологически измененного эпдометрия.// Российский Биотерапевтический Журпал, М., 24-26 марта 2007, с.45.

4. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Горенкова О.С., Маняхина А.Е..// Анализ отдаленных результатов противорецидивной гестагенотерапии гиперпластических процессов эндометрия у женщин позднего репродуктивного возраста.// Материалы первого регионального научного форума «Мать и дитя», Казань, 20-22 марта 2007, с. 256-257.

5. Гаспарян Н.Д., Карева E.H., Горенкова О.С., Маняхина А.Е., Склянкина И.В.// Отдаленные результаты гестагенотерапии гиперпластических процессов эндометрия у женщин позднего репродуктивного возраста.// Сборник материалов XIV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», М., 16-20 апреля 2007, с.76.

6. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Маняхина А.Е., Горенкова О.С.// Сравнителышй анализ рецепции эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия и в мононуклеарной фракции клеток крови пациенток с гипсрплазиями слизистой матки.// Сборник материалов XTV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», М., 16-20 апреля 2007, с. 111-112.

7. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Горенкова О.С., Маняхина А.Е.//Способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий.// Патент на изобретение № 2312354 от 10 декабря 2007.

8. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Маняхина А.Е., Горенкова О.С.// Рецепторы прогестерона и эстрадиола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток позднего репродуктивного возраста с миомами матки.// Материалы III Съезда фармакологов России, СПб., 23-27 сентября 2007 г., Том 7 4.1 с.1717-1718.

9. Маняхина А.Е., Гаспарян Н.Д., Карева E.H., Горенкова О.С., Баринова И.В., Шагинян Г.Г., Склянкина И.В.// Отдаленные результаты противорецидивной терапии гиперпластических процессов эндометрия у женщин позднего репродуктивного возраста.// Материалы 9-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя», М., 2-5 октября 2007 г., с.359-360.

10. Гаспарян Н.Д., Карева E.H., Горенкова О .С., Баринова И.В., Шагинян Г.Г., Склянкина И.В., Маняхина А.Е.// Оптимизация гормональной противорецидивной терапии гиперпластических процессов в эндометрии у женщин позднего репродуктивного возраста.// Российский Вестник Акушера-Гинеколога, М., май 2007 г., том 7, с. 31-35.

11. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Маняхина А.Е., Горенкова О.С.// Персонализация гормональной терапии гиперпластических процессов эпдометрия.// Материалы Всероссийского научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 17-19 марта 2008 г., с. 41-42.

12. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Маняхина А.Е., Горенкова О.С., Кручинина Е.В.// Связывание мифепристона с рецепторами прогестерона мононуклеарной фракции клеток периферической крови женщин репродуктивного возраста с миомой матки.// Сборник материалов XV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», М., 14-18 апреля 2008 г., с. 456.

13. Карева E.H., Маняхина А.Е., Левина И.С., Семейкин A.B., Евсютина А.М., Евсютина Е.М.// Влияние цикло-О'-пентаранов на уровень продукции ФНО-альфа мононуклеарной фракцией клеток периферической крови у пациенток с миомой матки.// Материалы научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» М., 2008, с.69.

14. Карева E.H., Маняхина А.Е., Левина И.С., Семейкин A.B., Евсютина А.М., Евсютина Е.М.// Левина И.С., Семейкин A.B., Евсютина А.М., Евсютина

21

Е.М..// Материалы научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» М., 2008, с.70.

15. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Мапяхина А.Е., Горенкова О.С., Кручинина Е.В .//Рецепция половых стероидов и специфическое связывания мифепристона с рецепторами прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у женщин с миомой матки.// Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство. Краснодар - 2008», 16-18 октября 2008 г., Краснодар, стр. 43.

16. Гаспарян Н.Д., Карева E.H., Маняхина А.Е., Горенкова О.С.//Результаты дифференцированной терапии гиперпластических процессов эндометрия у женщин позднего репродуктивного возраста.// Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство. Краснодар - 2008», 16-18 октября 2008 г., Краснодар, стр. 14-15.

17. Карева E.H., Гаспарян Н.Д., Кручинина Е.В., Маняхина А.Е., Горенкова О.С. // Влияние прогестерона на цитокинопродукцию в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у женщин с миомой матки. // Сборник материалов XVI Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», М., 2009, с. 387.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Проблема лечения гиперпластических процессов тканей матки остается актуальной до настоящего времени, что связано, с одной стороны, с широким распространением данной патологии [31] и, с другой стороны, с недостаточной эффективностью существующих способов консервативной терапии [12].

В структуре гинекологической заболеваемости наиболее частыми нозологиями являются гиперплазии эндометрия (ГПЭ) и миома матки (ММ). Эпидемиологические данные о частоте ГПЭ отсутствуют, по данным обращаемости частота их варьирует в зависимости от нозологической формы и возраста пациенток от 10 до 30%. Наиболее часто ГПЭ выявляют у женщин в возрасте 45—55 лет [12,14,31,43]. По мнению некоторых авторов, гиперплазией эндометрия страдают до 50% женщин позднего репродуктивного возраста [31, 40].

Эндометрий представляет собой гормоночувствительную ткань, находящуюся под влиянием эстрогенов и прогестерона. Эстрогены оказывают митогенный эффект на эндометрий, обеспечивая его рост и пролиферацию, прогестерон — антипролиферативное действие. В развитии ГПЭ играет роль как абсолютная, так и относительная гиперэстрогения. Предлагаемые в настоящее время подходы к медикаментозной терапии ГПЭ направлены на нормализацию состояния эндометрия и регуляцию ритма менструаций. Основное место в лечении ГПЭ принадлежит гормональной терапии, оказывающей как местное воздействие на эндометрий, направленное на подавление пролиферации клеток слизистой оболочки матки, так и центральное действие, состоящее в ингибировании секреции гонадотропинов, приводящее к торможению стероидогенеза в яичниках [85]. При лечении ГПЭ применяют лекарственные средства следующих групп: гестагены, монофазные комбинированные пероральные контрацептивы, антигонадотропины.

Медикаментозное лечение является патогенетическим и направлено на снижение влияния на ткань эстрогена. При простых и рецидивирующих ГПЭ

- введение предпочтение отдается синтетическим гестагенам [27, 30, 31]. При этом эффективность гестагенотерапии ГПЭ остается не достаточно высокой [62]. На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии РГМУ было доказано, что гиперплазия тканей матки сопровождается не только количественными, но и качественными изменениями параметров рецепции половых стероидов [46, 53]. В частности, показано, что способность рецепторов прогестерона (РП) тканей матки связывать синтетические гестагены значительно варьирует как среди нозологических групп, так и среди пациенток, что, по нашему мнению, является резервом повышения эффективности лечения. Проверка данной гипотезы явилась одной из задач нашего исследования.

Если ГПЭ являются фоновыми состояниями для развития рака тела матки, то миома матки практически никогда не несет угрозы озлокачествления [106]. Тем не менее, ММ представляет социально значимое заболевание: частота встречаемости данной нозологии может достигать 11 - 47,3 % женщин, в возрасте от 18 до 60 лет [9,10, 170]. При этом риск развития заболевания существенно возрастает после 35-40 лет [12]. Лечение симптомной ММ в основном хирургическое, при этом операция связана со значительной кровопотерей, высоким травматизмом и угрозой бесплодия. При отсутствии показаний к оперативному лечению или невозможности его проведения, применяют медикаментозное лечение, которое включает использование аналогов гонадолиберинов и гестагены. Центральная блокада гонадотропной функции гипофиза высокоэффективна, но ограничена во времени проявлением такого побочного эффекта, как изменение костного метаболизма (гипоэстрогения - остеопороз) [74]. Гестагенотерапия зачастую не дает эффекта, так как при несомненной гормональной зависимости роста ММ, возможен как эстрогенный, так и прогестероновый контроль пролиферации узлов [170]. Тип гормональной зависимости процесса необходимо знать для рационального выбора препаратов: гестагены при эстрадиол-зависимом росте и антигестагены при прогестерон-зависимой пролиферации. Таким образом, особенности патобиоза ММ ставят перед исследователями как минимум две задачи. Во

- введение первых, это - диагностика типа гормональной зависимости роста узлов. В настоящее время в мировой практике отсутствуют утвержденные методы такой диагностики, поэтому, поиск критериев гормональной зависимости ММ является актуальным. Нами в качестве потенциального маркера гормональной зависимости ММ выбрана мононуклеарная фракция клеток периферической крови (МНФК). Обоснованием этого явилось: наличие рецепторов половых стероидов в указанных клетках [146, 148, 157] и данные об изменении иммунного статуса пациенток с гиперплазиями тканей репродуктивного тракта [124, 128]. К тому же, использование МНФК в качестве тест-системы снимает необходимость получения биоптата ткани-мишени.

Второй проблемой, которая касается прогестерон-зависимых миом, является наличие лишь одного антигестагенного препарата на фармацевтическом рынке РФ - мифепристона. Учитывая возможность вариации аффинитета РП к мифепристону [46, 49, 53, 92], необходим поиск и создание высокоселективных отечественных антигестагенов, перспективных для использования в клинической практике [126].

В ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН синтезирован ряд синтетических гестагенов - прегна-О'-пентаранов, представляющих класс 3,20-дикетопрегнанов с дополнительным 16а, 17а-карбоциклом, содержащим от трех до семи атомов углерода и их производных. Прегна-О'-пентараны являются селективными модуляторами РП, т.е. обладая высоким аффинитетом к рецепторам, проявляют свойства агонистов/антагонистов в зависимости от гормонального фона и клеточного контекста. Гестагенная активность данных соединений, оцененная in vivo, в 3-9 раз выше, чем у прогестерона [18]. Антигестагенное действие может варьировать от 0 до 100% в зависимости от заместителей. Таким образом, прегна-О'-пентараны являются высокоактивными соединениями, с разделенными биологическими функциями, что делает их перспективными для поиска новых селективных лигандов РП.

- введение

Цель работы: оптимизация гормональной терапии гиперпластических процессов тканей матки на основании данных рецепторного анализа и поиск новых лигандов РП, перспективных для клинического использования.

Задачи:

1. На основании результатов исследования специфического связывания гестагенов с РП в эндометрии при гиперплазиях у женщин позднего репродуктивного периода осуществить подбор индивидуальной гестагенотерапии, оценить ближайшие и отдаленные результаты лечения.

2. Провести сравнительный анализ рецепции женских половых стероидов в цитозоле тканей матки при гиперплазиях и МНФК периферической крови у этих пациенток.

3. Изучить фармакологические свойства новых синтетических лигандов

РП: a) определить специфическое связывание прегна-О'-пентаранов с РП цитозоля ткани миомного узла и культур клеток МНФК и НеЬа; b) определить влияние прегна-О'-пентаранов на жизнеспособность клеток НеЬа и МНФК; c) исследовать влияние прегна-О'-пентаранов на продукцию ФНО-а в МНФК; с!) провести структурно-функциональный анализ в ряду изученных прегна-О'-пентаранов и выявить наиболее перспективные соединения для дальнейших доклинических испытаний.

Научная новизна:

Впервые было определено специфическое связывание новых синтетических гестагенов с РП эндометрия, миометрия и МНФК периферической крови у женщин позднего репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами тканей матки.

Продемонстрирована тесная положительная корреляция между специфическим связыванием синтетических прогестинов с РП эндометрия при гиперплазии и их фармакологической активностью.

- введение

Показана высокая эффективность дифференцированной гестагенотерапии ГПЭ, основанной на результатах рецепторного анализа эндометрия (снижение частоты рецидивов заболевания в 2,5 раза).

Предложен новый способ диагностики гормональной зависимости патологии гениталий, основанный на малоинвазивном методе определения уровня рецепторов половых стероидов в МНФК.

Проведен анализ влияния новых лигандов РП на продукцию ФНО-а и жизнеспособность культур клеток МНФ и НеЬа.

Практическая значимость работы.

Разработаны основы дифференцированной гестагенотерапии ГПЭ с учетом специфического связывания гестагенов с рецепторами прогестерона конкретной пациентки.

Предложен новый способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий с помощью определения уровня рецепторов половых стероидов в МНФ клеток периферической крови у пациенток позднего репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами тканей матки (патент на изобретение №2312354).

В результате фармакологического скрининга новых пентаранов отобраны два наиболее перспективных соединения (16а,17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион и 19{Е)~ 19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен) для дальнейших доклинических испытаний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Применение персонализированной гормональной терапии ГПЭ, основанной на результатах исследования связывающей активности синтетических гестагенов с рецепторами прогестерона эндометрия конкретной пациентки, позволяет повысить эффективность лечения.

2. Уровни рецепторов эстрадиола-17(3 и прогестерона в МНФК периферической крови тесно и положительно коррелируют (г = 0,77 и 0,9, при р< 0,05 соответственно) с аналогичными параметрами в цитозоле эндометрия пациенток с гиперплазиями.

- введение

3. 1ба,17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион и 19(£)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а,17а-циклогексанопрегн-4-ен - селективные антигестагены с антипролиферативной активностью, которые можно отнести к перспективным соединениям для терапии прогестерон зависимых гиперпластических процессов тканей матки.

Апробация работы: Апробация работы состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ, аспирантов и сотрудников научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии РГМУ.

Публикации: Материалы работы доложены и обсуждены на I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (2006), на XIII (2006), XIV (2007), XV (2008) и XVI (2009) Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», на 9-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (2007). По материалам диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 230 источников. Работа изложена на 124 страницах, иллюстрирована 19 рисунками, 11 таблицами и 2 схемами.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ специфического связывания гестагенов с РП и эффективности лечения этими препаратами ГПЭ у пациенток позднего репродуктивного периода выявил тесную положительную корреляцию (г=0,985 при полипах, р=0,05; г= 0,801 при простых железистых гиперплазиях, р=0,05), что явилось обоснованием дифференцированного назначения гормональной терапии. В результате предложенной тактики лечения удалось повысить эффективность терапии в 2,5 раза.

2. Выявлена тесная и положительная корреляция между специфическим

3 3 связыванием Н-эстрадиола-17(3 и Н-прогестерона в МНФК периферической крови с аналогичными параметрами в цитозоле эндометрия у пациенток с гиперплазиями (г = 0,77 и 0,9 соответственно, р<0,05).

3. Фармакологический скрининг 6 представителей прегна-Б'-пентаранов позволил выявить два наиболее активных соединения — \9(Е)-\9-метоксиимино-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен и 16а, 17 а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион, которые проявили высокую активность в связывании с РП клеток HeLa (86,62 ± 7,45% и 82,42 ±8,51% соответственно) и подавлении их жизнеспособности (на 44,1± 5,6%. и 48,2 ± 8,3%) соответственно), перспективных для дальнейшего изучения возможности их использования в клинической практике для лечения гиперпластических процессов тканей матки.

4. Тестируемые прегна-Б'-пентараны эффективно подавляли жизнеспособность клеток HeLa (I > VI = V > II > III = IV) и не влияли на пролиферативную активность МНФК.

5. Из ряда прегна-Б'-пентаранов только соединения \9(Е)-\9-метоксиимино-3,20-диоксо-16а, 17а-циклогексанопрегн-4-ен и 16а, 17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион влияли на секрецию ФНО-а МНФК, увеличивая ее на 20 и 25% соответственно.

Практическая рекомендации:

Результаты диссертации позволяют рекомендовать новые отечественные антигестагены - 16а,17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион и 19{Е)~ 19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а,17а-циклогексанопрегн-4-ен - для дальнейших доклинических исследований и последующего внедрения в практику в качестве препаратов для лечения гиперпластических процессов тканей матки.

Результаты комплексного исследования, полученные в ходе выполнения диссертационной работы позволили предложить способ оптимизации медикаментозного лечения гиперпластических процессов тканей матки, суть которого заключается в подборе гестагенотерапии на основе индивидуальной оценки связывающих свойств РП конкретной пациентки.