Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Действие лигандов рецепторов прогестерона на клетки мононуклеарной фракции периферической крови при гиперпластических процессах эндометрия

На правах рукописи

ТИХОНОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА НА КЛЕТКИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ЭНДОМЕТРИЯ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат па соисканне ученой степени кандидата медицинских наук

15 АП? 2015

Москва 2015

005567285

005567285

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Карева Елена Николаевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сенфулла Рошен Джафаровнч

заведующий лабораторией клинической фармакокинетики Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии»

доктор медицинских наук, профессор Самойлова Татьяна Евгеньевна

профессор кафедры женских болезней и репродуктивного здоровья ИУВ ФГБУ «Национальный медико-хирургический центр им. Н. И. Пирогова» Минздрава России

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_»_2015 г. в_часов на

заседании диссертационного совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу, 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан « 2, » йпрСАЛ 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Духанин Александр Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Лечение гиперпластических процессов эндометрия до настоящего времени остается одной из наиболее актуальных задач современной медицинской науки. Это связано с высокой распространенностью данной патологии (Howlader N., 2014; Reed S.D., 2009), неуклонным ростом заболеваемости, особенно в постменопаузальном периоде (Савельева Г.М., 2013; Чиссов В.И., 2012; Howlader N., 2014), частым бессимптомным течением, малигнизациен и низкой эффективностью существующих методов консервативной терапии (Савельева Г.М., 2012). Недостаточная эффективность медикаментозного лечения гиперпластическнх процессов эндометрия может быть следствием отсутствия полной картины этиопатогенеза этого заболевания и ограниченным спектром, разрешенных к применению, лекарственных средств.

Патогенетически обоснованной тактикой медикаментозного лечения гиперпластических процессов эндометрия является снижение эстрогенного влияния на ткань слизистой оболочки матки. С этой целью используют гестагены, аналоги гонадолиберинов и комбинированные пероральные контрацептивы, одним из механизмов действия которых является снижение концентрации гонадотропинов в крови и, в конечном итоге, продукции яичниками эстрогенов. Однако, наличие эстрогенного компонента в комбинированных перорапьных контрацептивах и тяжелые побочные эффекты гонадолиберинов ограничивают их применение в клинической практике (Самойлова Т.Е., 2013). Поэтому, гестагены, с их оптимальным профилем безопасности, являются одной из наиболее востребованных групп препаратов для этой цели (Шимановский Н.Л., 2010).

Поиск и изучение новых лекарственных средств, в частности, лигандов рецепторов прогестерона (чистых агонистов и селективных модуляторов рецепторов прогестерона) остается одним из важнейших фундаментальных и прикладных направлений в фармакологии (Яворский А.Н., 2010). К настоящему

1Г х

времени синтезированы новые синтетические производные прогестерона -прегна-О'-пентараны - соединения с дополнительным карбоциклом в 16,17-положениях стероидного скелета, перспективные для изучения структурно-функциональных свойств стероидных лигандов рецепторов прогестерона и поиска новых активных молекул для применения в клинической практике.

Современный системный подход в изучении этиопатогенеза, на основании которого формируется тактика медикаментозного лечения, диктует необходимость анализа взаимодействия эндокринной и иммунной систем, влияния стероидных гормонов на функционирование иммунокомпетентных клеток в норме и при патологии (Enninga Е.А., 2014, Witkiewicz А.К., 2010). Тесная взаимная регуляция этих двух контролирующих систем организма давно известна (Сейфулла Р.Д., 1999). Так, развитию гормон-зависимых опухолей тканей репродуктивного тракта женщины сопутствуют нарушения иммунной системы (Кулаков В.И., 2009; Учакин П.Н., 2007; Enninga Е.А., 2014), с другой стороны — саногенез любого патологического процесса обеспечивается совокупностью усилий локального и системного звеньев иммунитета (Добротина H.A., 2012). Поэтому для повышения эффективности гормональной терапии при гиперпластических процессах эндометрия необходимо изучить функциональное состояние иммунных клеток, которые можно рассматривать в качестве терапевтической мишени действия препаратов стероидных гормонов.

Цель исследования: изучение фармакодинамических свойств новых синтетических лигандов рецепторов прогестерона в клетках-мишенях стероидных гормонов.

Задачи исследования

1. Определить уровень специфического связывания прегна-О'-пентаранов с прогестерон-связывающими участками мононуклеарной фракции периферической крови.

2. Изучить влияние прегна-О'-пентаранов на продукцию ФНО-альфа клетками мононуклеарной фракции крови.

3. Оценить действие прегна-Б'-пентаранов на жизнеспособность неизмененных (МНФК) и опухолевых клеток (НеЬа, МОЬТ-4).

4. Исследовать влияние прегна-Б'-пентаранов на экспрессию генов рецепторов половых стероидных гормонов в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток постменопаузального возраста без гинекологической патологии, а также у больных с гиперпластнческими процессами эндометрия.

5. Выявить соединения в ряду прегна-Б'-пентаранов, обладающие наиболее высокой специфической связывающей активностью в отношении прогестерон-связывающих участков мононуклеаров периферической крови, подавлением жизнеспособности опухолевых клеток при отсутствии токсического действия на неизмененные клетки, перспективные для использования в клинической практике.

Научная новизна исследования

Впервые было изучено влияние прегна-Б'-пентаранов на мононуклеарную фракцию клеток периферической крови у пациенток с гинекологической патологией, определена экспрессия генов подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарах периферической крови у женщин постменопаузального возраста без гинекологической патологии и выявлены изменения рецепторного профиля МНФК при развитии гиперпластических процессов эндометрия.

Практическая значимость

На основании полученных данных было показано, что для углубленных доклинических испытаний наиболее перспективными соединениями класса прегна-Б'-пентаранов являются 6(£)-гидрокси-имино-16а, 17а-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион) и 16а, 17а-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион, которые обладают высокой специфической связывающей активностью с прогестерон-связывающими участками клеток мононуклеарной фракции периферической крови, снижают выработку мононуклеарами крови ФНО-альфа, угнетают жизнеспособность опухолевых клеток (НеЬа и МОЬТ-4) и не

оказывают токсического действия на неизмененные клетки периферической крови.

Выявлено, что при развитии гиперпластических процессах у женщин с продолжительностью менопаузапьного периода до 10 лет в мононуклеарной фракции периферической крови увеличивается уровень экспрессии гена рецептора эстрадиола подтипа альфа по сравнению с пациентками без гинекологической патологии в 4 раза (р<0,001). Превышение уровня экспрессии данного гена более 0,314 (по формуле 0,5"ЛС|* 100 относительно гена СЛРЭН) может свидетельствовать о развитии гиперпластических процессов слизистой оболочки матки у пациенток старшей возрастной группы.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту Исследуемые представители гомологического ряда прегна-О'-пентаранов обладают достаточно высокой специфической связывающей активностью в отношении прогестерон-связывающих участков клеток мононуклеарной фракции периферической крови, по-разному влияют на цитокинопродукцию мононуклеарами периферической крови, способны подавлять жизнеспособность культур опухолевых клеток, при этом не оказывая цитотоксического действия на фракцию мононуклеарных клеток периферической крови, и влияют на стероидно-рецепторный транскриптом МНФК у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия по сравнению с женщинами без гинекологической патологии.

Внедрение полученных результатов исследования в практику Результаты внедрены в практику гинекологической клиники кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Материалы используются в курсе лекций для студентов кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на совместном заседании коллектива сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева и сотрудников научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России № 10 от 10 декабря 2013 г.

Личное участие автора

Автор лично анализировал существующие источники литературы по теме исследования, принимал участие в планировании схемы экспериментов, проводил экспериментальные исследования и анализировал полученные результаты.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, отражающих ее основное содержание, из которых - 6 в рецензируемых научных журналах.

Объем н структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 111 источников. Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 8 рисунками, содержит 22 таблицы, 15 диаграмм и 1 схему.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях использованы восемь прегна-Б'-пентаранов, которые были синтезированы и предоставлены сотрудниками лаборатории химии стероидов и оксилипинов N. 22 д.х.н., профессором Левиной И.С. и д.х.н., профессором Камерницким A.B. Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (зав. - д.х.н. И.В. Заварзин). Структуры исследуемых лигандов рецепторов прогестерона представлены в таблице 1.

Таблица 1. Положение и структура заместителей в прегна-О'-пентаранах.

о 1» сн3 1 19 Гп 13 17\/ СН3 с Б \у Га ,0 в 1?,

Стероид Б' (16а,17а) X У «1

К-1044 б^-гидроксиимино- 16а, 17а-циклогексано-прегн-4-ен-ЗР-ол-20-он -(СН2)4- н,он с (£) N011

К-1045 6(£")-гидрокси-имино- 16а,17а-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион -(СН2)4- о с (£•) кон

К-1046 6(£)-метокси-имино-16а, 17а-циклогексано-прегн-4-еп-Зр-ол-20-он -(СН2)4- н,он с (Е) 1ЧОСНз

К-1047 6(£)-метокси-имино- 16а, 17а-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион -(СН2)4- О с (Е) ЫОСНз

К-338 16а,17а-циклопропано-прегн-4-ен-3,20-дион -сн2- о с н2

К-1036 16а,17а-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион -(СН2)4- О о н2

К-1030 3 '-фенил [ 16а, 17а]-циклопропанопрегн-4-ен-3,20-дион -СН2-С6Н5 о с н2

К-1039 3 '-п-фторфенил-[ 16а, 17а]-цикло-пропанопрегн-4-ен-3,20-дион -СН2-СвН4¥ о с н2

В исследовании использованы образцы периферической крови 110 пациенток постменопаузального возраста, наблюдавшихся в 2008-2014 годах в гинекологической клинике кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (зав. - академик РАН, профессор Савельева Г.М.) врачами Мартиросян К.А. и Ивановской Т.Н., и пациенток, проходивших плановое обследование в отделении гинекологической эндокринологии ГБУЗ МО МОНИИАГ (директор - чл.-корр. РАН, профессор Краснопольский В.И.) у

врача Горенковой О.С. Перед включением в исследование пациенток у каждой получено информированное согласие на участие.

Возраст пациенток репродуктивного возраста составил в среднем 39,1 ± 11,9 года. Возраст больных постменопаузального возраста составил в среднем 63,7 ± 9,2 года, длительность менопаузы варьировала от 2 до 40 лет.

Пациентки были разделены на две группы: в контрольную (I) были включены 40 больных без гинекологической патологии, тяжелых соматических заболеваний и выраженных метаболических нарушений; в основную (II) вошли 53 пациентки с полипами, гиперплазией и аденокарциномой эндометрия.

Культуры клеток HeLa и MOLT-4 получены из банка клеток Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (директор — чл.-кор. РАН, профессор Северин Е.С.).

Методы исследования

Мононуклеарную фракцию клеток (МНФК) выделяли из периферической крови в градиенте плотности фиколла (р=1,077 г/смЗ, («ПанЭко», Россия) (Boyum А., 1968). Подсчет мононуклеарных клеток производили в камере Горяева под микроскопом Биолам П2-1 («ЛОМО», Россия) с помощью красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия).

Инкубацию химических соединений с клетками осуществляли в ламинарном боксе («LS», Россия), в полной среде DMEM (содержащей 100 мкг/мл L-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина сульфата и 20 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) («ПанЭко», Россия). Количество клеток в лунке составило 0,1-0,5 млн. клеток. Клетки инкубировали в термостате ТС-80М («МЕДЛАБОРТЕХНИКА», СССР) при 37 "С в условиях 5% С02, в течение 72ч. После инкубации 100 мкл супернатанта использовали для определения концентрации ФНО„, оставшиеся клетки - для постановки МТТ-теста и выделения мРНК.

Определение специфического связывания [1,2,6,7]3Н-прогестерона («GE Healthcare Ltd», Англия) с прогестерон-связывающими участками МНФК проводили конкурентным радиолигандным методом (Бассалык Л., 1987). Специфическое связывание прегна-Б'-пентаранов с рецепторами прогестерона

МНФ оценивали согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., 2012). Радиоактивность образцов регистрировали на жидкостном сцинтилляционном альфа-бета радиометре «Tri-carb 3110» («Perkin Elmer», США).

Уровень ФНОа измеряли иммуноферментным методом согласно инструкции, прилагаемой к набору реагентов «альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ» («Вектор-БЕСТ», Россия), на анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 («Пикон», Россия).

Влияние прегна-Б'-пентаранов на жизнеспособность клеток HeLa, MOLT-4 и МНФК периферической крови изучали методом МТТ согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Фисенко В.П., 2000).

Получение мРНК из клеток МНФ проводили с помощью набора "Рибо-преп" (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью набора "Реверта-L" (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с «Реакционной смесью 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» («Синтол», Россия) и соответствующими праймерами («Синтол», Россия) на приборе iCycler iQ5 realtime PCR («BioRad», Германия). В качестве контрольного гена использовался ген GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).

Для оценки числа копий мРНК применяли ДО-метод по формуле 1/2"дп и 2"ЛЛС(, где Ct — пороговый цикл, ACt — разница между пороговым циклом исследуемого гена и геном сравнения (GAPDH), ДДО — сравнение значений ACt контрольного и опытного образцов (Schmittgen T.D., 2008).

Все данные исследования обрабатывали с использованием программ Microsoft Office Excel 2007 и GraphPad Prism 5.0. Для проверки гипотезы о принадлежности наблюдаемой выборки нормальному закону распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова, для сравнения средних значений применяли критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимали р=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение специфического связывания прегна-Б'-пентаранов с ирогестерон-связывающими участками МНФК периферической крови женщин репродуктивного возраста без гинекологической патологии

Средняя концентрация прогестерон-связывающих участков в МНФК периферической крови пациенток репродуктивного возраста без гинекологических патологий составила 347±171 фемтомоль/млн. клеток. Эти данные отражают суммарное специфическое связывание 3Н-прогестерона с МНФК. Специфически связывать прогестерон в клетках могут рецепторы суперсемейства ЫЯ3Сз, а также плазмамембранные и сигма - рецепторы.

Специфическое связывание 8 прегна-Б'-пентаранов оценивали по конкурентному вытеснению эндогенного лиганда из связи с рецепторами прогестерона. Полученные нами результаты специфической связывающей активности изучаемых соединений с клетками МНФ периферической крови представлены в таблице 2.

Таблица 2. Специфическое связывание прегна-О'-пентаранов с прогестерон-связывающими участками в мононуклеарах периферической крови женщин репродуктивного возраста (\liSE, в процентах от связывания 3Н-прогестерона, значение которого принимаем за 100%).

стероид специфическое связывание, % Р

К-338 106,9 ±30,8 0,941

К-1030 26,9 ±21,4 0,049

К-1039 104,2 ±35,7 0,941

К-1036 80,6 ± 42,6 0,162

К-1045 57,0 ± 37,3 0,162

К-1047 75,2 ± 42,7 0,162

К-1044 95,1 ±35,9 0,941

К-1046 95,6 ± 33,3 0,941

Примечание: р - достоверность отличия значения от контрольных показателей.

Согласно нашему исследованию, практически все исследуемые соединения обладают достаточно высоким сродством к рецепторам прогестерона, за исключением прегна-Б'-пентарана К-1030 (р=0,049).

Однако, связывание стероидов с рецепторами не может служить единственной тест-системой в отборе активных препаратов, так как соединения могут проявлять различную эффективность при условии высокого аффинитета к рецепторам прогестерона.

2. Анализ влияния прегна-О'-пентаранов на уровень продукции ФНО„ мононуклеарной фракцией периферической крови

Результаты оценки влияния лигандов рецепторов прогестерона на уровень продукции ФНОа мононуклеарами периферической крови женщин репродуктивного возраста представлены на диаграмме 1.

Диаграмма 1. Концентрация ФНО„ в клетках мононуклеарнойй фракции периферической крови при инкубации с прегна-О'-пентаранами

(М±БЕ, в % от контроля, концентрация соединений - 10"8М).

Примечание:- значение отличается от контроля (р < 0,05).

Из приведенных на диаграмме 1 данных видно, что прегна-О'-пентараны К-338, К-1036 и К-1045 снижают выработку мононуклеарами ФНО„ на 11%, 10% и 20% (р<0,05), соответственно, тогда как соединение К-1044 -увеличивает ее на 11% (р=0,014) по сравнению с контролем. Остальные соединения не показали значимого влияния на цитокинопродукцию МНФК.

Известно, что полипы эндометрия часто сочетаются с воспалительными процессами слизистой матки, и для их терапии актуальны препараты, обладающие помимо антипролиферативного еще и противовоспалительным

эффектом (Кулаков В.И., 2009). Поэтому можно предположить, что соединения К-338, К-1036 и К-1045 имеют дополнительное преимущество при лечении полипов эндометрия, а соединение К-1044 перспективно при терапии опухолей, поскольку стимулирует продукцию противоопухолевого цитокина.

3. Влияние прегна-Э'-пентаранов на жизнеспособность неизмененных и опухолевых гормон-чувствительных клеток

Результаты исследования действия прегна-Б'-пентаранов на клетки МНФ пациенток репродуктивного и постменопаузального возрастов представлены в таблице 3.

Таблица 3. Уровни жизнеспособности клеток мононуклеарной фракции периферической крови после инкубации с прегна—Б'-пеитаранами и прогестероном по сравнению с контролем (М±5Е, % от контроля, концентрация соединений - 10"8М).

клетки/ соединения МФНК пациенток

репродуктивного возраста постменопаузального возраста

без патологий эндометрия без патологий эндометрия с полипами эндометрия

прогестерон 92,9 ± 4.9 117,0 ±6,8 102,4± 0,5

К-338 95,5 ± 4,4 113,5± 3,6 106,4± 1,7

К-1030 97,0 ± 3,8 121,5± 2,6 87,8± 1,0

К-1039 95,4 ±2,1 117,9± 1,3 99,3 ± 1,7

К-1036 94,4 ± 3,5 114,1± 2,4 104,8± 1.3

К-1045 92,4 ± 3,2 110,8± 2,1 106,2± 1,6

К-1047 101,1 ±4,2 110,3± 1,8 105,1± 1,0

К-1044 102,4 ±3,7 101,8± 1,5 99,9 ± 0,8

К-1046 97.0 ± 5,2 95, 0 ± 0,5 98,2± 0.5

Таким образом, исследуемые соединения, включая прогестерон, не оказывают значимого эффекта на жизнеспособность мононуклеарных клеток периферической крови больных как с неизмененным эндометрием, так и с полипами эндометрия по сравнению с контролем.

Результаты исследования действия прегна-О'-пентаранов на опухолевые клетки (НеЬа и МОЬТ-4) представлены на диаграмме 2.

Диаграмма 2. Жизнеспособность клеток НеЬа и МОЬТ-4 после инкубации с прегна-О'-центарамами и прогестероном (% от контроля, концентрация соединений - 10"7М при инкубации с НеЬа, 10"8М - с МОЬТ-4).

соединения

Примечание: значение отличается от контроля (р<0,05).

Как следует из диаграммы 2, жизнеспособность клеток НеЬа подавляется прогестероном, К-1039, К-1036, К-1045, К-1047, К-1044 (р<0,05), а жизнеспособность клеток МОЬТ-4 подавляется прогестероном, К-1036, К-1045 и К-1047 (р<0,05). При этом выявлено, что соединение К-1045 подавляет жизнеспособность клеток Не1_а сильнее, чем прогестерон (р=0,013).

Таким образом, максимальное подавление жизнеспособности опухолевых клеток - НеЬа и МОЬТ-4 — оказывают прогестерон и пентараны К-1045, К-1036, К-1047. Это делает их перспективными при лечении гормон-зависимых опухолей, в том числе гиперпластических процессов эндометрия.

4. Влияние прегна-Б'-пентаранов на экспрессию генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия

4.1. Экспрессии генов ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов в МНФК у женщин постменопаузального возраста без гинекологической патологии

Результаты анализа уровней мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток постменопаузального возраста без гинекологической патологии представлены на диаграмме 5.

Диаграмма 3. Уровни экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК у пациенток контрольной группы (в качестве контрольного гена использовался ген ОАРБН). 60-1

I

§ 3-

о

я 2-

и> 1-о

О

р<0,0001

р=0,0023

гр=0,0039-

ОП

гр=0,0237.

О ^

рецепторы эстрадиола и прогестерона

Как видно из диаграммы 3, уровни мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках мононуклеарной фракции периферической крови у пациенток постменопаузального возраста без гинекологической патологии уменьшается в ряду: гпЕЯ » Р11-В > ЕЯР, РЯ-А, РСКтС1 > тРЯ > ЕЯ,,.

Полученные данные продемонстрировали широкий разброс значений уровней экспрессии, которые могут зависеть от многих параметров, в частности, длительности менопаузы. Поэтому мы разделили исследуемых женщин без гинекологической патологии с учетом длительности менопаузы.

Индивидуальный анализ экспрессии отдельных типов рецепторов в МНФК в динамике позволил впервые выявить некоторые закономерности экспрессии стероидных рецепторов. Так, уровень мРНК РЛ-А в МНФК у пациенток

контрольной группы с продолжительностью менопаузы до 10 лет (15 пациенток) ниже в 4 раза, чем количество мРНК PR-A при продолжительности менопаузы более 10 лет (р<0,05) соответственно. Это изменение экспрессии гена явилось обоснованием для дальнейшего разделения основной группы на две подгруппы - с периодом менопаузы до 10 лет и после 10 лет.

Выявленное нами повышение уровней экспрессии рецепторов прогестерона в МНФК у женщин без гинекологических заболеваний в постменопаузе может иметь несколько причин, одной из которых является адаптивная перестройка рецепторного аппарата клеток мишеней при длительной недостаточности стероидного фона.

4.2. Экспрессия генов ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов у' пациенток посптенопаузального возраста с гиперпластическими процессами эндометрия

Для изучения экспрессии генов рецепторов половых стероидов группа пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия была разделена в зависимости от длительности менопаузы.

При анализе уровней мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток с полипами эндометрия были выявлены следующие изменения рецепторного профиля: увеличение уровня экспрессии генов ER(1 и PR-A в 53 и 11 раз соответственно по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы при продолжительности менопаузапьного периода до 10 лет (8 пациенток), тогда как при продолжительности менопаузы более 10 лет (22 пациентки) — увеличение уровня мРНК ERj, и ERp в 31 и 12 раз соответственно (р<0,05). Таким образом, увеличения экспрессии гена PR-A, уменьшающего уровень рецепторов эстрадиола, и гена ERp, тормозящего эффект ERq, может быть компенсаторной реакцией клеток МНФ на гиперэстрогению. Эти результаты совпадают с литературными данными об уровнях рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани полипов эндометрия (De Carvalho S., 2011; Gui A., 2010), что позволяет говорить об однонаправленных изменениях рецепторного профиля при данной патологии

как в ткани эндометрия, так и на иммунокомпетентных клетках периферической крови.

Анализ стероидно-рецепторного транскриптома МНФК периферической крови пациенток с железистой и железисто-кистозной гиперплазией эндометрия показал, при периоде менопаузы до 10 лет (5 пациенток) наблюдается увеличение уровня экспрессии гена ЕЯ« и снижение - ЕЯР в 4 и 37 раз, соответственно (р<0,05), по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы; при периоде менопаузы более 10 лет (4 пациентки) — увеличение уровня мРНК РЯ-В в 2 раза (р<0,05). Таким образом, у пациенток с менопаузой до 10 лет при гиперплазиях эндометрия в МНФК наблюдается снижение уровня экспрессии антипролиферативного гена ЕЯр на фоне увеличенного уровня митогенного гена ЕЯ,,, при периоде менопаузы более 10 лет — отмечено увеличение уровня мРНК РЯ-В. Эти изменения в МНФК могут говорить об активно протекающих гормональных изменениях у пациенток с менопаузальным периодом до 10 лет, а также об усугублении патологического процесса за счет нарушений механизмов контроля пролиферации клеток.

Анализ результатов исследования уровней экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола у пациенток с аденокарциномой эндометрия с периодом менопаузы до 10 лет (8 пациенток) в МНФК периферической крови выявил увеличение уровней экспрессии генов ЕЯа и РЯ-А в 8 и 4 раза (р<0,05), соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы. Таким образом, при аденокарциноме эндометрия наблюдается изменение рецепторного профиля, сходное с полипами, что может говорить, с одной стороны, о возможных генетических мутациях рецепторного аппарата клетки или, с другой стороны, о реакции иммунной системы на агрессивно развивающуюся опухоль эндометрия. Полученные результаты по изучению рецепторного профиля МНФК периферической крови при развитии гиперпластических процессов эндометрия представлены в таблице 4.

Таблица 4. Динамика экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК пациенток постменопаузального возраста с патологиями эндометрия по сравнению с контрольной группой.

Менопауза/патология Полип Гиперплазия Аденокарцинома

До 10 лет Е1М РЯ-А Т ЕЯЛ ЕЯа ЕН„ Т РЯ-А Т

После 10 лет Е1*« Т ЕЯ„ Т ря-в т -

Таким образом, у пациенток с длительностью менопаузы более 10 лет изменения рецепторного аппарата МНФК наблюдаются только в случае развития полипов эндометрия. Это может являться следствием снижения секреции эстрадиола и прогестерона на фоне прекращения работы яичников и гормональной перестройки. Если рассматривать уровни экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК у пациенток с периодом менопаузы менее 10 лет, то можно отметить повышенный уровень мРНК ЕЯ„ при всех изучаемых патологиях — полипах, гиперплазии и аденокарциноме эндометрия.

При анализе потенциального маркера развития гиперпластических процессов эндометрия у пациенток постменопаузального возраста — ЕЯа- нами была получена ЯОС-кривая (диаграмма 4).

Диаграмма 4. ЯОС-кривая экспрессии гена ЕКа у пациенток постменопаузального возраста с гиперпластическими процессами эндометрия.

КОС - анализ

Специфичность

В результате ЯОС-анализа выявлено, что увеличение уровня экспрессии гена ЕЯа в мононуклеарах периферической крови более 0,314 (0,5"лс'*100,

относительно гена САРОН) может быть надежным маркером наличия гиперпластических процессов у пациенток постменопаузального возраста. Чувствительность данного маркера составляет 82%, а специфичность - 75%.

Таким образом, при развитии гиперпластических процессов эндометрия наблюдается изменение рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток периферической крови преимущественно за счет гиперэкспрессии гена ЕЯа. Кроме того, увеличенный уровень экспрессии гена ЕЯа может стать молекулярным скрининговым маркером в периферической крови для выявления гиперпластических процессов у пациенток постменопаузального возраста, что, однако, требует дополнительных исследований.

4.3. Влияние прегна-О'-пентаранов на экспрессию генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК.

Результаты исследования действия прегна-В'-пентаранов на уровень экспрессии гена ЕЯа в МНФК 4 женщин контрольной группы и 4 - с полипами эндометрия представлены на диаграмме 5.

Диаграмма 5. Экспрессия генов ЕЯ« в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с гиперпластпческимн процессами эндометрия и без гинекологических патологий после инкубацин с прегна-Б'-пентаранами (концентрация соединений - 10~8М, в качестве контрольного гена использовали ген ОАРБН).

И МНФК пациенток без гинекологической патологии □ МНФК пациенток с гинерпластическнмим процессами эндометрия

Примечание: значение отличается от контроля (р<0,05).

Таким образом, прогестерон и прегна-Б'-пентараны не оказывают значимого влияния на экспрессию гена рецептора эстрадиола альфа в МНФК периферической крови пациенток контрольной группы, за исключением соединений К-338, К-1036, которые снижают уровень мРНК гена ЕЯа в 12 и 21 раз по сравнению с контролем (р<0,05). При этом все исследуемые соединения снижают экспрессию гена ЕЯа в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с гиперпластическими процессами эндометрия: К-338 - в 4,3 раза, К-1030 - в 19,0 раз, К-1039 - в 52,0 раза, К-1036 - в 21,9 раз, К-1045 - в 5,4 раза, К-1047 - в 4,9 раз, К-1044 - в 7,8 раз, К-1046 - в 36,3 раз (р<0,05), тогда как изменения экспрессии гена под действием прогестерона не наблюдается.

Таким образом, изучаемые прегна-Б'-пентараны снижают экспрессию генов рецепторов Е11„, повышенную при развитии гиперпластических процессов эндометрия, что может привести к нормализации функционирования иммунокомпетентных клеток периферической крови при данной патологии.

5. Структурно-функциональный анализ соединений гомологического ряда прегна-Б'-пентаранов и выбор наиболее активных соединений

В результате скрининга 8 представителей гомологического ряда прегна-Б'-пентаранов на основании: 1) изучения их специфического связывания с прогестерон-связывающими участками мононуклеарной фракции клеток периферической крови; 2) влияния на жизнеспособность клеток НеЬа, МОЬТ-4 и МНФК; 3) действия на продукцию ФНОа в МНФ клеток периферической крови, были выявлены следующие наиболее активные в отношении опухолевых клеток соединения, обладающие минимальными токсическими свойствами по отношенню к неизменённым клеткам крови: К-1045 (6(£)-гидрокси-имино-16а,17а-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион) и К-1036 (16а, 17а-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион). Эти соединения перспективны для дальнейших углубленных доклинических исследований в качестве препаратов для медикаментозного лечения гормон-зависимых процессов эндометрия.

Анализируя связь между химическим строением гомологического ряда прегна-Б'-пентаранов и их свойствами в неизмененных и опухолевых клетках клеток, мы выявили определенные закономерности.

При исследовании влияния прегна-О'-пентаранов на специфическую связывающую активность соединений с прогестерон-связывающими участками МНФК было установлено, что введение фенильной группы в О'-кольцо стероида снижает его связывание с рецепторами прогестерона МНФК.

При анализе влияния заместителей в ряду прегна-О'-пентаранов на способность подавлять жизнеспособность опухолевых клеток было установлено, что присоединение имино-группы к 6 атому углерода стероидной молекулы способствует угнетению жизнеспособности опухолевых клеток. Таким же эффектом обладает соединение, содержащее атом кислорода вместо 4 атома углерода стероида, что, однако, требует дальнейшей проверки.

Выявленные структурно-функциональные связи в ряду прегна-О'-пентаранов могут помочь в дальнейшем поиске и синтезе новых высокоактивных лигандов рецепторов прогестерона.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ

Результаты диссертации позволяют рекомендовать новые лиганды рецепторов прогестерона - 6(£)-гидрокси-имино-16а,17а-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион и 16а,17а-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион - для дальнейших доклинических испытаний и последующего внедрения в практику в качестве препаратов для лечения гормон-зависимых опухолей тканей матки.

Результаты исследования, полученные в ходе диссертационной работы, позволяют предположить, что увеличение уровня экспрессии гена Е^ более 0,314 (по формуле 0,5"лс'*100 относительно гена САРОН) может свидетельствовать о развитии гиперпластических процессов слизистой оболочки матки у пациенток старшей возрастной группы.

ВЫВОДЫ

1. Прегна-О'-пентараны К-338, К-1039, К-1046, К-1044, К-1036, К-1047, и К-1045 обладают высоким уровнем специфического связывания с прогестерон-

связывающими участками в мононуклеарах периферической крови (57,0 -106,9%).

2. Прегна-В'-пентараны К-338, К-1036 и К-1045 в концентрации 10~8 М при инкубации в течение 72 ч снижают выработку мононуклеарами ФНОа на 11%, 10% и 20%, соответственно, тогда как соединение К-1044 — увеличивает ее на 11% (р<0,05).

3. Все исследуемые прегна-В'-пентараны в концентрации 10~8 М при инкубации в течение 72 ч не оказывают цитотоксического действия на мононуклеарные клетки крови, при этом соединения К-1045, К-1036, К-1047 подавляют жизнеспособность опухолевых клеток: MOLT-4 — на 30%, 15% и 13%; HeLa - на 16%, 14% и 13%, соответственно (р<0,05).

4. В иммунокомпетентных клетках периферической крови пациенток с гиперпластическими процессами слизистой матки (полипами, гиперплазиями и аденокарциномой эндометрия) и постменопаузальным периодом до 10 лет увеличена экспрессия гена рецептора эстрадиола подтипа альфа в 4 раза (р<0,05) по сравнению с женщинами без гинекологической патологии.

6. Все изучаемые прегна-В'-пентараны подавляют экспрессию гена рецептора эстрадиола подтипа альфа более чем в 4 раза (р<0,05) у пациенток постменопаузального возраста с гиперпластическими процессами эндометрия.

7. В результате исследования из 8 представителей гомологического ряда прегна-В'-пентаранов выявлены вещества с оптимальным набором свойств, полезных для дальнейшего изучения возможности их использования в клинической практике — 6(£)-гидрокси-имино-16а,17а-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион и 16а,17а-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Тихонов, Д.А. Цмтотоксический эффект капецитабина в присутствии прегна-В'-пентаранов в культурах Т-клеточного лейкоза человека и тимоцитах крысы / E.H. Карева, A.B. Семейкин, II.С. Левина, Н.Е. Куликова, Д.А. Тихонов // Российский бпотерапевтический журнал. — 2011. - № 1. - С. 30.

2. Тихонов, Д.А. Щадящие методы лечения патологических процессов эндометрия у пациенток в постменопаузе / К.А. Мартиросян, Д.А. Тихонов, Я.С. Новикова, И.З. Хамзин, А.Ч. Пак // Актуальные вопросы современной медицины. -2012.-С. 98-99.

3. Тихонов, Д.А. Сравнительный анализ уровней ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов у пациенток в постменопаузе с гиперпластическими процессами эндометрия / A.A. Соломатина, К.А. Мартиросян, E.H. Карева, Д.А. Тихонов // Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний. — 2012. - С. 83-84.

4. Тихонов, Д.А. Изучение экспрессии рецепторов эстрадиола альфа и бета в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у женщин с полипами эндометрия / Д.А. Тихонов, К.А. Мартиросян, Т.Н. Ивановская, E.H. Карева, В.Г. Бреусенко, Г.М. Савельева // Инновации в современной фармакологии. —2012. — С. 179.

5. Тихонов, Д.А. Влияние прегна-О'-пентаранов на клетки Hela и мононуклеарной фракции клеток периферической крови / E.H. Карева, И.С. Левина, Л.Е. Куликова, О.С. Горенкова, А.Е. Маняхина, Д.А. Тихонов // Инновации в современной фармакологии. -2012. - С. 80-81.

6. Тихонов, Д.А. Новая технология противорецидивной гормональной терапии гиперпластнческих процессов эндометрия у женщин позднего репродуктивного возраста / В.II. Краснопольский, Н.Д. Гаспарян, Л.С. Логутова, E.H. Карева, О.С. Горенкова, Д.А. Тихонов // Лечащий врач. — 2012.-№ 11.-С. 12-16.

7. Тихонов, Д.А. Экспрессия генов рецепторов прогестерона в мононуклеарах периферической крови у пациенток постменопаузалыюго возраста с пролифератнвными процессами эндометрия / Д.А. Тихонов, К.А. Мартиросян, H.A. Коцюбинская // Вестник Российского государственного медицинского университета. — 2013. - №1. - С. 256.

8. Тихонов, Д.А. Влияние прегна-О'-пентаранов на культуру клеток Hela и мононуклеарную фракцию клеток периферической крови / E.H. Карева, Н.С. Левина, Л.Е. Куликова, О.С. Горенкова, А.Е. Маняхина, H.A. Коцюбинская, Д.А. Тихонов И Российский онкологический журнал. — 2013. - № 2. - С. 18-22.

9. Тихонов, Д.А. Эстрогены и иммунная система / JI.X. Бехбудова, Д.А. Тихонов, H.A. Коцюбинская, П.П. Акимов, Ю.К. Наполов // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. — 2013. - № 11. - С. 18-37.

10. Тихонов, Д.А. Экспрессия генов рецепторов эстрадпола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у женщин постменопаузального возраста с гиперпластическимн процессами эндометрия / Д.А. Тихонов, H.A. Коцюбинская, Т.Н. Ивановская // Вестник Российского государственного медицинского университета. — 2014. - № 2. - С. 214.

11. Тихонов, Д. А. Синтез и цитостатическая активность ряда прегна-D'-пентаранов на культуре клеток HeLa / А. В. Семейкин, Т. А. Федотчева, И. С. Левина, Л. Е. Куликова, И. В. Заварзин, Д. А. Тихонов, Е. Н. Карева, Н. Л. Шимановский // Химико-фармацевтический журнал. - 2014. - № 6. - С. 9-13.

12. Тихонов, Д.А. Прогестерон и иммунная система / E.H. Карева, JI.X. Бехбудова, Д.А. Тихонов, H.A. Коцюбинская, Т.Н. Ивановская, A.A. Свистунов, В.В. Куваева, Ю.К. Наполов // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. — 2014. - № 11. - С. 3-9.

13. Tikhonov, D. A. Synthesis and cytostatic activity of some pregna-D-pentaranes on HeLa cell culture / A. V. Semeikin, T. A. Fedotcheva, I. S. Levina, L. E. Kulikova, I. V. Zavarzin, D. A. Tikhonov, E. N. Kareva, N. L. Shimanovskii // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2014. - Vol. 48. - № 6. - P. 363-367.

14. Пат. 2534995 Российская Федерация, С 07 J 53/00, А 61 Р 35/00, А 61 К 31/57. 6-оксимы 16а,17а-циклогексанопрегненов, обладающие цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам человека / Карева Е. Н., Одинцова Е. В., Левина И. С., Шимановский Н. Л., Тихонов Д. А., Федотчева Т. А., Семейкин А. В., Заварзин И. В., Куликова Л. Е. / ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И Пирогова Минздрава России. - № 2013131326; заявл. 09.07.13; опубл. 10.12. 14, Бюл. № 34. - 8 с.

Подписано в печать 31.03.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 4265-3-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39