Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение противопаркинсонического действия фактора роста нервов, сорбированного на поли(бутил)цианоакрилатных наночастицах

Курахмаева Камила Башировна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ, СОРБИРОВАННОГО НА ПОЛИ(БУТИЛ)ЦИАНОАКРИЛАТНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

0034В 13•«

МОСКВА - 2009

003481378

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова РАМН и ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

Доктор медицинских наук,

профессор Воронина Татьяна Александровна

Доктор медицинских наук,

профессор Аляутдин Ренад Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Ганыпина Тамара Сергеевна

Доктор медицинских наук,

профессор Сейфулла Рошен Джафарович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный

медико-стоматологический университет

Защита состоится 26 ноября 2009 года в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д.001.024.01 при Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части Научно-исследовательского института фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последние годы проблема нейродегеиеративных заболеваний стала особенно острой в связи с ухудшающейся экологической ситуацией, более ранними проявлениями скрытой генетической патологии и увеличением продолжительности жизни в развитых странах Запада (Benjamin C.L. et al. 2001; Elbaz A.et al. 2008). Существующие на сегодняшний день подходы к медикаментозной коррекции не всегда позволяют тормозить прогрессирование заболевания, а лишь устраняют их симптоматику (Левин О.С., 2005; Alexi Т. et al., 2000), а длительпое применение большинства противопаркинсонических средств сопровождается значительными побочными эффектами со стороны различных органов и систем, что, в свою очередь, еще больше снижает качество жизни пациентов (Кучеряну В .Г. и соавт., 2001; Иллариошкин С.Н., 2004; Угрюмов М.В., 2007; Артемьев Д.В., 2008).

Одним из путей воздействия на процесс развития нейродегеиеративных заболеваний и, в частности, болезни Паркинсона (БП) является применение нейротрофического фактора роста нерва (ФРН) (Yuen Е.С. et al. 1996; Mufson E.J. et al. 1999; Rattray M., 2001), который вовлечен в модуляцию нейромедиаторных систем, в том числе дофаминергической передачи в мозге (Hardy J. et al. 1999; Pedre L.L. et al., 2002), регулирует выживаемость нейронов (Bibel M. et al. 2000). Снижение уровня ФРН наблюдается в крови и в структурах чёрной субстанции больных БП (Rinne J.O et. al., 1989; Garcia E. et al., 1992). Существенным моментом, лимитирующим применение ФРН, является его невысокая способность проникать через гематоэнцефалический барьер ввиду высокой гидрофилыюсти и большой молекулярной массы (Castellenos-Ortega М. R. et al., 1999; Banks W. et al, 2002).

В настоящее время наносистемы вызывают все возрастающий интерес, так как они способны транспортировать лекарственные вещества (JIB) внутрь клеток и при их циркуляции содержащееся в них биологически активное вещество защищено от инактивации и его действие пролонгируется (Сейфулла Р.Д. и соавт., 2008; Чехонин В.П. и соавт., 2009; Kreuter J., 2002; Alyautdin R. et al., 1998; Piotrovsky L.B., et al. 2004; Ringe К. et al. 2004). Одним из способов доставки ЛВ в мозг является использование наночастиц (НЧ) на основе бутилцианоакрилата (Kreuter J., 1991; Vauthier С. et al., 2003). Поли(бутил)цианоакрилатные НЧ (ПБЦА-НЧ) обладают высокой сорбционной

емкостью, подвергаются биодеградации, обеспечивают доставку и высвобождение JIB, имеют низкую острую и хроническую токсичность (Grislain L. et al., 1983; Kreuter J. et al., 1984; Gelperina S.E., et al., 2002; Pereverzeva E. et al. 2008). Синтез НЧ на оспове бутилцианоакрилата впервые был описан в 1977 г. (Couvreur P. et al., 1977), а позднее были изучены и свойства этих НЧ в Institut für Pharmazeutische Technologie, Goethe-Universität (Франкфурт-на-Майне, Германия) и кафедре фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Kreuter J., 1994, Alyautdin R. et al., 1997, 2001). При системном введении ПБЦА-НЧ покрывают сурфактантами (например, полисорбатом-80-ПС-80), что приводит к уменьшению захвата НЧ клетками ретикулоэндотелиальной системы и, следовательно, к пролонгированию циркуляции НЧ в системном кровотоке и увеличению их концентрации в сосудах головного мозга (Kreuter J. et al., 1997; Brigger I. et al., 2002).

Ранее ПБЦА-НЧ уже использовались в качестве трапепортпых систем для целенаправленной доставки таких веществ, как лоперамид (Alyautdin et al., 1997), тубокурарин (Alyautdin R. et al., 1998), даларгин (Alyautdin R. et al., 1995), мет-энкефалин (Sabel B.A. et al 1998), лей-энкефалин (Kreuter J. et al., 2003), ФРН при изучении его антиамнестического эффекта (Джипждихашвили И.А. и соавт., 2008), феназепам (Развижина В.А., 2008) и доксирубицин (Gelperina S. et al., 2002), который в настоящее время находится на III фазе клинического изучепия в США (Nicolas J., Couvreur P., 2009).

Целью исследования явилось экспериментальное изучение противопаркипсонического действия фактора роста нервов, сорбированного на поли(бутш1)цианоакрилатных наночастицах, покрытых ПС-80 (ФРН-НЧ-ПС-80)

Задачи исследования:

1. Разработать состав и технологию получения наносомальной формы ФРН-НЧ-ПС-80, определить размер ПБЦА-НЧ и процент сорбции ФРН на ПБЦА-НЧ.

2. Определить концентрацию ФРН-НЧ-ПС-80 в сравнении с ФРН в субстанции, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо в гомогенатах мозга мышей C57BL/6 методом иммуноферментного анализа.

3. Исследовать противопаркинсопическое действие ФРН-НЧ-ПС-80 в сравнении с действием ФРН в субстанции, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо на поведенческие проявления паркинсонического синдрома (ПС), вызванного нейротоксином МФТП у мышей C57BL/6.

4. Провести сравнительное изучение антипаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80 при введении до и после развития ПС.

5. Изучить динамику развития ПС (в течение 21 дня), вызванного МФТП у мышей С57В1/6, и выявить особенности эффектов ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на разных стадиях формирования ПС.

6. Изучить влияние ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на биоэлектрическую активность мозга мышей линии С57В1/6 на различных стадиях формирования ПС, вызванного МФТП.

Научная повизна. Разработан состав и технология получения ФРН на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 для системного введения. Установлено, что ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, обнаруживаются в контакте с сосудистой стенкой, что указывает на их взаимодействие с эндотелием сосудов головного мозга и последующее проникновение в мозг.

Впервые показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 при системном введении проникает в мозг мышей С57В1/6 и вызывает достоверное увеличение концентрации ФРН в гомогенатах мозга, тогда как субстанция ФРН, ФРН с ПБЦА-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо при системном введении не вызывают достоверного эффекта. Показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 при системном введении оказывает антипаркинсоническое действие на модели МФТП-вызванного ПС у мышей С57В1/6, при этом эффект вещества выявляется как на этапах формирования паркинсонического синдрома (90 мин и 24 часа), так и в отдалённые сроки (через 7 дней и 21 день). Показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 оказывает эффект на МФТП-вызванный ПС как при внутривенном, так и внутрибрюшшшом введении. При этом, ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в) влияет в наибольшей степени на показатели олигокинезии в открытом поле на первых этапах (90 мин и 24 часа) развития ПС.

Впервые проведён апализ ЭЭГ мышей С57В1/6, получавших МФТП, ФРН-НЧ-ПС-80 или гимантан после МФТП при длительной регистрации (в течение 21 дня) биопотенциалов мозга животных. Анализ электрофизиологических механизмов реализации антипаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на мышах С57ВЬ/6 выявил различия в динамике развития эффектов этих препаратов: активность ФРН-НЧ-ПС-80 более выражена в первые дни, а гимантана через 7 дней после введения нейротоксина.

Научно-практическая значимость. Выполненная работа подтверждает возможность доставки ФРН в мозг с помощью наночастиц при системном

введении. Полученные данные -об антипаркинсоническом действии ФРН, сорбированного на ПБЦА-наночастицах, покрытых ПС-80 при разных путях системного введения и результаты, показывающие эффективность ФРН-НЧ-ПС-80 на различных этапах формирования и стабилизации ПС, свидетельствуют о перспективности разработки ФРН на наночастицах в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Паркинсона.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно изготовлепа лекарственная форма ФРН, сорбированного па ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 для системного введения и выполнено сё фармакологическое изучение, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация диссертации. Результаты работы были доложены на межлабораторных конференциях НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, Научно-практической конференции «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы» (Москва, 2008 год), Международном форуме по напотехнологиям "Rusnanotech" (Москва, 2008), Научно-методической конференции кафедры фармакологии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, в том числе 4 статьи - в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 1 - в зарубежном журнале и 3 тезиса в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 65 рисунками. Библиографический указатель включает 48 отечественных и 231 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препараты и вещества, используемые в исследовании. Для синтеза ПБЦА-НЧ и получения ФРН-НЧ-ПС-80 использовали следующие вещества: бутилцианоакрилат - мономер (Sichel-Werke, Германия); декстран 70000 (Seca med 6000, "Henkel"); 0,1 М раствор соляной кислоты; 0,1 М раствор гидроокиси натрия; флуоресцеина изоцианат; 1% раствор глюкозы; официнальпый физиологический раствор (0.9% раствор хлорида натрия) («Мосхимфарм»);

полисорбат-80 («ЛАБТЕХ»); ФРН (CALBIOCHEM®, Германия); ПБЦА-НЧ (лиофилизированный порошок, Институт Молекулярной Медицины ММА им. И.М. Сеченова; Institut fur Pharmazeutische Technologie, Goethe-Universität, Франкфурт-на-Майне, Германия). Для моделирования паркинсонизма использовали 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТИ) (порошок, "Research Biochemical Inc.", США); гимантан - в качестве препарата сравнения (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН). Субстанцию ФРН (0,25 мг/кг), ПБЦА-НЧ плацебо (0,9 мг полимера на мышь), ФРН (0,25 мг/кг) с ПБЦА-НЧ (0,9 мг полимера/мышь), ФРН (0,25 мг/кг) с ПС-80, ФРН (0,25 мг/кг) с ПБЦА-НЧ (0,9 мг полимера/мышь) и ПС-80 вводили однократно (в/б, за 10 мин до или через 10 мин после МФТП или в/в через 30 мин после МФТП) мышам линии C57BL/6 с ПС, вызванным МФТП (30 мг/кг, в/б, однократно). Гимантан вводили однократно, в/б в дозе 20 мг/кг через 30 мин после МФТП.

Животные. Эксперименты проводили на 258 мышах линии C57BL/6 -самцах массой 20-25 г (питомник «Столбовая», РАМН).

Метод получения ПБЦА-НЧ и ФРН-НЧ-ПС-80. ПБЦА-НЧ синтезировали методом кислотной полимеризации с добавлением декстрана 70000 (Seca med 6000, "Henkel") в качестве стабилизатора. Последующую оценку качества ПБЦА-НЧ проводили по показателям стабильности, ресуспендируемости и размеров НЧ методами фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K,) и электронно-микроскопического изучения (трансмиссионный электронный микроскоп HU-12, Hitachi, Japan). Степень сорбции ФРН определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора реактивов («Nerve Growth Factor Sandwich ELISA kit», ChemiKine, США). Раствор ФРН объединяли с суспензией ПБЦА-НЧ, инкубировали, затем добавляли раствор ПС-80 и инкубировали. Получали суспензию ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 и содержащих 45 мкг ФРН.

Транспорт ФРН через ГЭБ с помощью ПБЦА-НЧ оценивали при морфологическом изучении образцов тканей мозга мышей после введения ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в), используя методы флуоресцентной (люминесцентный Photomicroscope III,"С. Zeiss", Германия) и электронной микроскопий (электронный микроскоп ЕМ 410 EM, "Philips", Голландия).

Определение концентрации ФРН в тканях мозга мышей линии С57В1/6 проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) в гомогенатах

ткани головного мозга с использованием набора реактивов «Nerve Growth Factor Sandwich ELISA kit» (ChemiKine, США).

Фармакологические методы исследования. Моторно-двигательные нарушения при ПС, вызванные МФТП (30 мг/кг, однократно) у мышей C57BL/6, оценивали по показателям ригидности (изменение длины шага у мышей), тремора, олигокинезии (в тесте «открытого поля» и актометре), согласно методам, описанным в методических рекомендациях для оценки веществ с антипаркинсоническим действием (Воронина Т.А. и соавт., 2005). Регистрацию проводили сразу после введения МФТП и затем через 90 мин, 24 часа и на 7 и 21 дни после введения нейротоксина и ФРН в разных лекарственных формах.

ЭЭГ исследования. Для регистрации биоэлектрической активности с использованием стереотаксиса вживляли долговременные электроды мышам С57В1/6 под нембуталовым наркозом, (40 мг/кг, в/м) в сенсомоторную область коры (CK), хвостатое ядро (ХЯ), гиппокамп (ГПК) и черную субстанцию (ЧС) мозга. Индифферентный электрод вживляли в носовую кость черепа. Регистрацию ЭЭГ проводили в специальной экранированной камере в условиях свободного поведения животных. Первую запись ЭЭГ (фоновая активность) проводили через 5-6 дней после операции по вживлению электродов, затем вводили МФТП (30 мг/кг, в/б) и опять регистрировали ЭЭГ. После этого вводили ФРН-НЧ-ПС-80 или гимантан (в/б, однократно) и проводили запись электрической активности через 90 минут, 24 часа, 7 дней и 21 день после их введения. Компьютерный анализ характеристик ЭЭГ осуществляли с использованием программных средств Нейро-КМ (программа «Brainsys»).

Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена с помощью компьютерной программы BioStat for Windows. Достоверность различий оценивали с помощью вышеуказанной программы по t-критерию Стьюдента и Фишера (при р < 0.05). Сравнение показателей ЭЭГ для каждого животного проводили по критерию Стьюдента двух связанных групп ЭЭГ файлов: файла фонового (до введения МФТП) и файлов через 90 мин, 24 часа, 7 дней и 21 день после введения МФТП и затем ФРН-НЧ-ПС-80 или гимантана.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение экспериментальной лекарственной формы ФРН-НЧ-ПС-80 и её стандартизация. ПБЦА-НЧ были приготовлены методом кислотной полимеризации в среде, содержащей декстран 70000 (Seca med 6000, "Henkel") в качестве стабилизатора (декстран 70000 в 0,1 М растворе соляной кислоты).

Показано, что оптимальная скорость перемешивания при полимеризации - 500 об/мин, оптимальным стабилизатором является декстран-70 в диапазоне концентраций от 0,5% до 2,5%. Выявлена зависимость между уровнем pH полимеризационной среды и размерами ПБЦА-НЧ - размер ПБЦА-НЧ увеличивается при снижении pH от 3 до 1,9. Показано, что наносуспензия остается стабильной в течение 24 часов.

Методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K) определили, что размеры ПБЦА-НЧ лежат в пределах от 190 до 300 нм. Такие частицы представляют собой коллоидные образования и относятся группе НЧ с размерами от 1-1000 нм (Kreuter J., 2004; Brian H. Kaye., 2006). Согласно определению ГК «Роснанотех» «НЧ - аморфная или полукристаллическая структура, имеющая хотя бы один характерный размер в диапазоне 1-100 нм». Вместе с тем, для материалов, создаваемых для медицинских и фармацевтических целей существует иная классификация, которую используют многие исследователи (Geiser M, 2005; Garnett, M. С., 2006; Zohri M., 2009) и, согласно которой в медицине наноматериалами считают частицы с размерами от 10 до 1000 нм. Наиболее часто для системного введения в экспериментах in vivo используются НЧ с размерами от 50 до 300 нм, поскольку размер таких частиц превышает размер фенестров капилляров печени и они наиболее длительно циркулируют в системном кровотоке (Ilium L.et al. 1984; Torchilin V.P., 1998; Harivardhan R.L.et al. 2003; Nicolas J., Couvreur P., 2009 ].

Наносомальную форму ФРН получали путем сорбции ФРН на поверхности ПБЦА-НЧ с последующим покрытием поверхности ПС-80. Установлено, что процент сорбции ФРН на НЧ составляет 96,6% в случае суспензии НЧ без ПС-80 и 95,9% в случае с суспензией НЧ, покрытых ПС-80. 2. Изучение транспорта ФРН-НЧ-ПС-80 через ГЭБ. Методами флуоресцентной и электронной микроскопии установлено, что флуоресцентные ПБЦА-НЧ без покрытия ПС-80 через 45 мин после в/в введения располагаются свободно в просвете сосуда, чаще находясь в центре просвета. ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, обнаружены в контакте с сосудистой стенкой, что указывает на их возможное взаимодействие с эндотелием сосудов головного мозга. Выраженная флуоресценция была отмечена в телах клеток Пуркинье мозжечка. При этом для НЧ, не покрытых ПС-80, флуоресценция в нейронах головного мозга не выявлялась.

В проникновении ФРН через ГЭБ с использованием ПБЦА-НЧ может быть задействован такой механизм, как рецептор-зависимый эндоцитоз (Gulyaev А.Е. et al., 1999; Kreuter J., 2002). Сочетание НЧ с определенными лигандами приводит к их специфическому взаимодействию с соответствующими рецепторами с последующим эндоцитозом (Kreuter J., 2002). ПС-80, покрывающий ПБЦА-НЧ, адсорбирует аполипопротеин Е, содержащийся в плазме крови (Kreuter J. et al., 2003). Тем самым ПБЦА-НЧ приобретают характерные черты липопротеинов низкой плотности и взаимодействуют с ЛПНП - рецепторами, локализованными на поверхности эндотелиальных клеток капилляров мозга, благодаря чему НЧ захватываются эндотелиальными клетками путем рецептор-зависимого эндоцитоза (Dehouck В. et al., 1997; Moghimi S.M. et al., 2001). После деградации ПБЦА-НЧ в лизосомах эндотелиальных клеток, ФРН диффундирует в ткани мозга.

Количественное определение ФРН в тканях мозга мышей С57В1/6. В контрольных группах мышей, получавших 0.9% раствор натрия хлорида и ПБЦА-НЧ плацебо, отмечались значения концентрации ФРН в гомогенатах тканей мозга равные эндогенной концентрации ФРН, что согласуется с данными литературы (Fernandez S.M. et al. 1997; TakeiN. et al. 1998; Liao G.S. 2001). При введении субстанции ФРН было отмечено недостоверное увеличение концентрации ФРН в тканях мозга на 45 минуте и через 24 часа относительно контрольной группы (табл. 1). Как известно, ФРН весьма ограниченно проникает в ЦНС (Backman С., et al., 1996, Tuszynski M.N. Et al., 1996). ФРН-НЧ и ФРН-ПС-80 (в/в, однократно) также не вызывали достоверного увеличения концентрации ФРН в гомогенатах тканей мозга мышей.

350

Группы животных

□ р-р NaCI

■ ПБЦА-НЧ

□ р-р ФРН

□ ФРН-ПС-80

■ ФРН-НЧ

□ ФРН-НЧ-ПС-80

Рисунок 1. Концентрация ФРН в тканях мозга мышей линии С57В1/6 через 45 мин после ведения разных лекарственных форм, содержащих ФРН.

Таблица 1. Концентрации ФРН в гомогенатах тканей мозга мышей С57В1/6 после в/в

введения ФРН в разных лекарственных формах

Время 15 мин 45 мин 90 мин 24 часа

Группы жнвотпых^^^ Концентрация ФРН, пкг/мл

0.9% раствор натрия 49.3±15.3 55.8±6.6 48.6±4.7 38.3±5.4

хлорида; 0, 2 мл

ПБЦА-НЧ плацебо 53.7±21.4 43.27±23.7 50.9±16.5 45.1±19.4

0,2 мл

Субстанция ФРН 64.5±6.1 110.9±27.3 70.6±3.0 100.5±14.8

0,25 мг/кг, 0,2 мл

ФРН-ПС-80 39.3±16.7 100.1±32.8 93.7±29.0 57.2±11.6

0,25 мг/кг, 0,2 мл

ФРН-НЧ 44.4±17.2 101.4±33.5 74.5±26.1 64.Ш3.0

0,25 мг/кг, 0,2 мл

ФРН-НЧ-ПС-80 69,0±3.8 311.6±16.5* 108.5±8.0* 88.9±3.8*

0,25 мг/кг, 0,2 мл

*- (р<0.05) - статистически достоверное отличие от группы животных, получавших раствор натрия хлорида.

Данные иммуноферментного анализа показали, что при системном введении ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в, 0,25 мг/кг) концентрация ФРН в гомогенатах тканей мозга у мышей линии С57В1/6 в разные промежутки времени постепенно увеличивается, достигает максимума на 45 минуте, сохраняется на высоком уровне в течение 90 мин и затем постепенно снижается (табл. 1, рис. 1). 3. Изучение эффектов ФРН-НЧ-ПС-80 на модели МФТП-вызванного ПС у мышей С57В1/6

ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг) изучали в сравнении с субстанцией ФРН (0,25 мг/кг), ФРН-НЧ (0,25 мг/кг), ФРН-ПС-80 (0,25 мг/кг) и ПБЦА-НЧ плацебо (0,9 мг полимера, 0,2 мл). В качестве контроля были использованы животные, которым вводили 0.9% раствор натрия хлорида и МФТП.

Влияние веществ на олигокинезию. Известно, что МФТП вызывает избирательное повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции и триаду основных симптомов БП: олигокинезию, ригидность, тремор и ряд вегетативных нарушений (Крыжановский Г.Н. и др., 1995; Неробкова и соавт., 2000; Przedborski S, Vila М., 2001; Кучеряну В.Г., 2001; Воронина Т.А. и др., 2005; Капица И.Г. и др., 2008). В наших исследованиях однократное введение МФТП (30 мг/кг, в/б) мышам С57В1/6 вызывает у животных выраженную олигокинезию, которая проявляется резким достоверным уменьшением

горизонтальной и вертикальной двигательной активности в открытом поле. Максимальное достоверное уменьшение горизонтальной активности (более чем в 20 раз) отмечается через 90 мин после введения МФТП, затем двигательная активность увеличивается. Достоверное снижение горизонтальных и вертикальных перемещений сохраняется через 24 часа и на 7 и 21 сутки после введения МФТП (рис. 2). Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо при внутривенном введении мышам линии С57В1/6 после нейротоксина не вызывают достоверного увеличения двигательной активности, сниженной МФТП, в тесте открытое поле и в актометре (рис. 3). Среди этих веществ наибольшей способностью увеличивать двигательную активность обладал ФРН-НЧ, однако, и его эффект был статистически недостоверным.

Рисунок 2. Влияние ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг), субстанции ФРН, ФРН-НЧ и ФРН-ПС-80, ПБЦА-НЧ плацебо при внутривенном введении на олигокинезию (горизонтальные перемещения) в тесте «открытое поле». # - статистически значимое отличие от группы интактных животных при (р<0.05); *- статистически значимое отличие от группы контроля МФТП при (р<0.05)

Рисунок 3. Влияние ФРН-НЧ-ПС-80, субстанции ФРН, ФРН-НЧ и ФРН-ПС-80, ПБЦА-НЧ плацебо на олигокинезию у мышей С57В1/6 при регистрации в актометре в течение 10 минут. # - статистически значимое отличие от группы интактных животных при (р<0.05); *-статистически значимое отличие от группы контроля МФТП при (р<0.05)

ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг), введенный в/в после МФТП, существенно и статистически достоверно повышает двигательную активность мышей, сниженную МФТП. Так, в тесте открытое поле, через 90 мин после введения ФРН-НЧ-ПС-80 горизонтальная активность увеличивается в 8,3 раза, а вертикальная активность - в 8,5 раза. Достоверное повышение (примерно в 2 раза) двигательной активности в открытом поле и в актометре ФРН-НЧ-ПС-80 вызывает через 24 часа, на 7 и 21 сутки после создания ПС (рис.2-3).

Таким образом, ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг, в/в) обладает выраженной способностью устранять олигокинезию, вызываемую МФТП у мышей С57В1/6. При этом эффект вещества выявляется как на начальных этапах формирования паркинсонического синдрома (через 24 часа), так и в отдалённые сроки (через 7 и 21 день) после введения МФТП. Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ не оказывают эффекта на олигокинезию, вызванную МФТП.

Влияние веществ на тремор. Однократное введение МФТП в дозе 30 мг/кг (в/б) мышам С57В1/6 уже через 10 мин после введения вызывает тремор головы и всего тела мыши. Тремор достигает максимума выраженности (3 балла) и наблюдается у всех животных (100%) через 90 мин после введения нейротоксина, а через сутки и на 7 день выраженность тремора снижается, но он сохраняется у 60% мышей. ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в, после МФТП) через 90 мин и сутки после введения достоверно уменьшает % животных с тремором (в 2 раза), а через 7 дней более чем в 10 раз по сравнению с контролем (введение МФТП) (рис. 4). Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ достоверно не изменяют выраженность тремора, вызванного МФТП и не снижают % животных с тремором.

Рисунок 4. Влияние ФРН-НЧ-ПС-80, субстанции ФРН, ФРН-НЧ и ФРН-ПС-80, ПБЦА-НЧ плацебо при внутривенном введении на тремор мышей линии С57ВЬ/6, вызванный МФТП. # - р< 0,05 достоверность различий по ^критерию Стьюдента относительно группы интактных животных; *- р< 0,05 достоверность различий по критерию Стьюдента относительно группы животных, получавших только МФТП.

Влияние веществ на ригидность. Однократное введение МФТП в дозе 30 мг/кг (в/б) мышам С57В1/6 вызывает выраженную ригидность, которая характеризуется скованностью движений и достоверным укорочением длины шага. Эти изменения наблюдаются через 90 мин после введения нейротоксина и сохраняются в течение 21 дня. Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ достоверно не изменяют показатели ригидности, вызванные МФТП, у мышей С57В1/6 (табл. 2). ФРН-НЧ-ПС-80, введённый в/в после МФТП, снижает олигокинезию у животных, что выражается в достоверном увеличении длины шага мышей, в уменьшении скованности и горбатости. Уменьшение ригидности наблюдается через 90 мин, 24 часа, на 7 и 21 сутки после введения ФРН-НЧ-ПС-80 и МФТП.

Таблица 2. Влияние ФРН-НЧ-ПС-80, субстанции ФРН, ФРН-НЧ и ФРН-ПС-80, ПБЦА-НЧ плацебо при внутривенном введении на ригидность мышей линии С57В176, вызванную

^^^^^^ Время Группы животных 90 минут 24 часа 7 дней 21 день

0.9% раствор натрия хлорида 0,2 мл 7,1±0,2 7±0,2 7,2±0,17 7,3±0,14

МФТП 30 мг/кг 0,2 мл 4,1±0,5" 5,5±0,25# 6,5±0,1# 6,6±0,19*

ПБЦА-НЧ 0,9 мг полимера 0,2 мл 4,7±1,3 4,7±1,2 4,8±0,8* 6,3±0,5*

ФРН 0,25 мг/кг, 0,2 мл 4,6±1,2 5,1±0,4 6,3±0,3 6,5±0,2*

ФРН-ПС-80 0,25 мг/кг, 0,2 мл 4,9±1,1 6,1 ±0,4 6,6±0,9 6,8±0,2

ФРН-НЧ 0,25 мг/кг, 0,2 мл 4,5±0,9 5,8±0,4 6,1±0,7 6,4±0,38

ФРН-НЧ-ПС-80 0,25 мг/кг ФРН в 0.2 мл 6,1 ±0,23* 6,8±0,06* 7,0±0,1* 7,1±0,1*

# - р< 0,05 достоверность различий по ^критерию Стьюдента относительно группы интактных животных; *- р< 0,05 достоверность различий по 1-критерию Стьюдента относительно группы животных, получавших только МФТП.

Сравнительное изучение антипаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80 при введении до и после развития ПС. Установлено, что ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг, в/б) оказывает сходный эффект на олигокинезию при введении как до, так и после МФТП при регистрации эффектов через 90 мин и 21 день (после введения МФТП). ФРН-НЧ-ПС-80 при введении до МФТП оказывает более

выраженный эффект, чем ФРН-НЧ-ПС-80, введённый после МФТП, через 24 часа и 7 дней после введения (рис. 5-6). Различий в эффектах ФРН-НЧ-ПС-80 на ригидность в течение всего периода наблюдения (21 день) при его введении как до, так и после МФТП выявлено не было.

k

Ж

I

й

А - число горизонтальных перемещений Б - Число вертикальных перемещений Рисунок 5. Влияние ФРН-НЧ-ПС-80 на олигокинезию, вызванную МФТП, у мышей С57ВЬ/6 в тесте «открытое поле». 1 - физиологический раствор; 2-МФТП; 3- ФРН-НЧ-ПС-80 до МФТП; 4-ФРН-НЧ-ПС-80 после МФТП. # - статистически значимое отличие от группы интактных животных при (р<0.05); *- статистически значимое отличие от группы контроля МФТП при (р<0.05)

Через 90 нин Через 24 часл Через 7 дне«

1 2 3 4 1234 1234

12 3 4

Рисунок 6. Влияние ФРН-НЧ-ПС-80 на олигокинезию, вызванную МФТП, регистрируемую в актометре (10 мин), у мышей С57ВЬ/6. 1-физиологический раствор; 2-МФТП; 3-ФРН-НЧ, покрытые ПС-80 до МФТП; 4-ФРН-НЧ, покрытые ПС-80 после МФТП. # - статистически значимое отличие от группы интактных животных при (р<0.05); *- статистически значимое отличие от группы контроля МФТП при (р<0.05)

Влияние гимантана на динамику формирования МФТП-вызванного ПС.

Гимантан (20 мг/кг, в/б) вводили через 30 мин после введения МФТП.

Установлено, что при регистрации эффектов через 90 минут после введения

МФТП гимантан вызывает усиление двигательной активности мышей в

условиях «открытого поля»: суммарный показатель двигательной активности в

открытом поле в 8,5 раза превышал показатель после введения только МФТП

(рис. 7). Через 24 часа после введения МФТП гимантан вызвал повышение

двигательной активности, измеряемой в актометре - в 1,9 раза по сравнению с

животными, получавшие только МФТП, а через 7 суток - в 1,8 раза (рис. 7).

15

Достоверное изменение двигательной активности в группе животных, получавших гимантан относительно группы МФТП отмечается и в актометре (62,8±13,2 перемещений и 27,2±7,47 перемещений соответственно). На 21 день после инъекции гимантана двигательная активность была в 1,67 раза выше, чем у мышей с МФТП (рис. 7). Сохранялся достоверным и показатель олигокинезии в группе мышей, получавших гимантан, определяемый в актометре. Ранее было показано, что гимантан при предварительном однократном и в большей степени повторном (5 дней) введении внутрь в дозе 10 мг/кг достоверно снижает выраженность олигокинезии, вызываемой МФТП (регистрация эффектов через 90 мин после МФТП), у мышей линии С57ВЬ/6 (Вальдман Е.А. и соавт., 2004). Наряду с влиянием на олигокинезию, гимантан достоверно уменьшает ригидность у мышей С57В1/6 с ПС через 90 мин и 24 часа после введения МФТП (рис. 8)

Рисунок 7. Влияние гимантана и ФРН-НЧ-ПС-80 при внутрибрюшинном введении на двигательную активность у мышей С57В1/6 в «открытом поле». *- статистически значимое отличие от группы контроля МФТП при (р<0.05); # - статистически значимое отличие от группы интактных животных при (р<0.05)

Рисунок 8. Влияние гимантана и ФРН-НЧ-ПС-80 при внутрибрюшинном введении на ригидность у мышей С57В1/6. *- статистически значимое отличие от группы контроля МФТП при (р<0.05); # - статистически значимое отличие от группы интактных животных при (р<0.05).

Таким образом, полученные результаты подтверждают, что собственно ФРН при его системном введении плохо проникает в ЦНС, что согласуется с данными литературы (Castellenos-Ortega М. R. et al., 1999; Banks W. et al., 2002]. Однако при введении ФРН непосредственно в желудочки мозга животных, наблюдается значительное увеличение содержания дофамина и гомованилиновой кислоты в стриатуме (Garcia Е. et al., 1992). Показано также, что ФРН оказывает антипаркинсоническое действие у пациентов с ПС при введении в желудочки мозга (Randerson J., 2003).

Сопоставление действия ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на различные этапы формирования ПС показывает, что эффект ФРН-НЧ-ПС-80 на олигокинезию был более выражен, чем у гимантана через 90 мин и 24 часа после введения. На 7-й день показатели двигательной активности у мышей, получавших гимантан, превышали таковые у мышей с ФРН-НЧ-ПС-80, а через 21 день оба препарата оказывали сходный эффект.

4. Анализ электрофизиологических механизмов антииаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на модели МФТП-вызваиного ПС у мышей линии C57BL/6

Показано, что ПС, вызванный МФТП (30 мг/кг, в/б) у мышей С57В1/6, сопровождается появлением на ЭЭГ пароксизмальных разрядов высокоамплитудных медленных волн в ЧС, ХЯ, СМ и ГПК. Максимальное проявление пароксизмальной активности наблюдается через 90 мин (рис. 9А) и 7 суток после МФТП; через 21 день ее выраженность несколько снижается и сохраняется только в ХЯ и ГПК.

Статистический анализ спектрограмм показал, что через 90 минут после введения МФТП в электрограммах отмечается снижение мощности спектра в диапазоне тета-1 частот и увеличение - в диапазоне бета-1 и бета-2 частот, при этом в электрограммах ХЯ, СК и ЧС эти изменения достигают уровня достоверности. В этот период в ГПК выявляется лишь тенденция к снижению мощности спектра в диапазоне тета-1, тета-2 и бета-1 частот и к увеличению мощности спектра в диапазоне бета-2 частот, но через 24 часа эти изменения достигают достоверных значений (рис. 10). МФТП достоверно снижает спектр мощности в диапазоне дельта частоты через 24 часа (в ЧС, ХЯ, СК и ГПК) и 7 суток (СК), а через 21 день усиливает её в диапазонах 1 и 3 кол/сек во всех исследуемых структурах мозга мышей С57В1/6 (рис. 10).

^fW^Vf/VW

flM/V

ШЬ

Рис 9. А - Биоэлектрическая активность мозга мыши №6 через 90 мин после введения МФТП, 30 мг/кг. Б - Биоэлектрическая активность мозга мыши №2 через 90 мин после введения МФТП и ФРН-НЧ-ПС-80.

90 мин 24 часа 7 дней 21 день

ХЩ4СТОМ *ДР4

1

Хмепгмадро

F----------" I f--

•29 . . .-j----, .7? I--------------

1 I 1 4 ! I J 3 1 I

lilt s

q[ Книги ИДО»

1TI i П и

li- 'Ч-.

9 1 I 1 4 S

ЗДкчмпрммгем

С—имтоцм topi

' i J j « » г-*"! г г

l

J C»HI>M»r«pHM

12) 4 3

1 2 J 4

J-

f

Чарам drUmau

_I-1-

«VCCTMIDHI

Ч*»«ая су*«тмшия

№...........nijiji.;;:;"!!

2 ) < I « " I I 1 •.....

12 1« 9

t Z 1 4 •

-uu

' I » J *

I'm

11) 4 5

T-r-

5

, i-Tiiiptnr;

VST

1 1 Э I I

Диапазоны частот: 1- дельта, 2-тета 1,3-тста 2,4-бета 1,5-бета2.

Рис. 10. Изменение автоспектра процентной мощности через 90 мин, 24 часа, 7 дней и 21 день после введения МФТП.

Визуальный анализ изменений биоэлектрической активности мозга

мышей С57В1/6 после введения ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг, в/б) показал, что

вещество ослабляет выраженность пароксизмальной активности в ЧС, ХЯ, СМ и

ГПК, возникающей после введения МФТП, при этом максимальный эффект

отмечается на начальных этапах формирования ПС (рис. 9Б).

Статистический анализ изменений спектра мощности ЭЭГ показал, что в

сравнении с фоновой записью через 90 мин у животных, получавших ФРН-НЧ-

ПС-80, отмечалось достоверное снижение дельта и тета-1 активности в электрограммах ХЯ, СК и ГПК, а в электрограммах ЧС достоверные изменения в сторону увеличения мощности спектра наблюдались в узком диапазоне тета-2 активности (12 Гц). Изменения в спектре мощности бета-1 активности отмечались в ХЯ, а в остальных структурах не достигали достоверных величин (рис. И). Через 24 часа после введения нейротоксина и ФРН-НЧ-ПС-80 во всех исследуемых структурах опытных мышей С57В1/6 в противоположность контрольной МФТП - группе отмечалось снижение мощности спектра в диапазоне бета-частот, однако достоверных значений эти различия достигали лишь в электрограммах ЧС; в ГПК наблюдалось достоверное снижение тета2-частоты. На 7 сутки после введения нейротоксина и ФРН-НЧ-ПС-80 изменения спектра мощности в дипазоне бета-частот не достигали достоверных значений по сравнению с фоновой записью ЭЭГ. На 21 день в спектрограммах ХЯ отмечалось статистически значимое увеличение мощности спектра в тета-2, бета-1,2-диапазоне, а в ЧС - снижение тета-1,2 и бета-1,2. ФРН-НЧ-ПС-80 уменьшал спектр мощности в диапазоне дельта частоты через 90 мин, 24 часа и 21 день.

90 мин 24 часа 7 дней 21 день

ХЮСШМЖИ

-Г"! I * г — \ 2 3 * t ;

I-1 г - от --5------

Г-

Проект* ядро

ч п_

1.1

С»и«*м*1«рш к»м

2

7.

С -6601 я

""<♦•>»*» 7*епи!м | £ з ■ : 5

2.0"

г л

12 3« С

Ч»и» »(еммя

Ч«мм «ъбегаиим

» II

-21,-

1 п

О ■_

Диапазоны частот: 1- дельта, 2-тета 1,3-тета 2,4-бета 1, 5-бета2.

Рис. 11. Изменение автоспектра процентной мощности через 90 мин, 24 часа, 7 дней и 21 день после введения ФРН-НЧ-ПС-80 после МФТП.

Изменения спектров мощности ЭЭГ у животных, получавших ФРН-НЧ-ПС после МФТП, были близки к фоновым записям ЭЭГ мышей С57В1/6 с максимальным эффектом на начальных этапах формирования ПС, что позволяет предполагать усиление в этот период процесса нейрогенеза, в который вовлечены многие нейротрофические факторы (ФРН, ВЭОТ и др). При снижении количества нейротрофических факторов нарушается пролиферация и митоз клеток (Ьшип Мао, 2003). Показано, что ФРН при внутрижелудочковом введении пациентам с гипоксической ишемией стимулирует перфузию головного мозга и нейрогенез, вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток и снижает неврологический дефицит (АпКтеШ А е1 а1., 2008). Установлено также, что ВООТ усиливает нейрогенез и улучшает функциональное восстановление крыс с инсультом (БсЬаЬкг \У.11. Л а1., 2007).

Гимантан (20 мг/кг, в/б) устраняет пароксизмальную активность, вызванную МФТП в ЧС, ХЯ, СМ и ГПК, оказывая максимальный эффект через 7 суток после введения МФТП. Статистический анализ спектрограмм животных показал, что через 90 минут после введения МФТП и гимантана на ЭЭГ всех исследуемых структур отмечается увеличение мощности спектра в диапазоне бета-1 и бета-2 частот, при этом в электрограммах ХЯ, ЧС и ГПК эти изменения достигают уровня достоверности и, кроме того, выявлена тенденция к снижению мощности спектра в диапазоне дельта - и тета-1 частот. В электрограммах этих структур отмечается также тенденция к увеличению мощности спектра в диапазоне тета-2 частот. Через 24 часа после введения гимантана в электрограммах СК и ХЯ отмечается реверсия эффектов в диапазоне бета-1 и бета-2 частот, однако этот эффект не достигает уровня достоверности. Характер изменений мощности спектра в диапазоне тета-1 и бета-частот в электрограммах ЧС и ГПК снижается мощность спектров по сравнению с записью через 90 мин (рис. 12).

Статистический анализ спектрограмм на 7 день после введения гимантана и МФТП показал, что в электрограммах ХЯ, СК и ГПК отмечается уменьшение мощности спектра в диапазоне бета-1,2 частот, однако, уровня достоверных значений эти различия достигают лишь в ГПК (рис. 12). В электрограммах ЧС отмечается увеличение мощности спектра в узком диапазоне дельта и тета-2 частот. На 21 день после введения нейротоксина и гимантана в электрограммах ХЯ и ГПК отмечается увеличение мощности спектра в диапазоне бета-1 и бета-

2-частот, в электрограммах ЧС - усиление мощности спектра в диапазоне тета-2 и бета-1 частот, а в СК - снижение тета-2, бета-1 и бета-2 частот.

90 мин

24 часа

7 дней

21 день

К1«т ппгт _ I | мам

Я

с«м«м*т*р*м г*^ а

Хмсптмядр*

I., ""П.Г1 и .;1' ! ,

Г

5 -Щ 1 .

' ' ■ 1.0

т>

7

'2-29

^ ^ стшпцмчя ну» |

Ц Г М'^'Т^З 5 8<1-1

Чарм* «уЬтмцка 1 „.» ■

• 1 '!" | г' ......:

£

•ш

1£

ч*им <к*стмнм

ггР-

2,Г

51

'МШ'

шу

в:

Диапазоны частот: 1-дельта, 2-тета 1,3-тета 2,4-бета 1,5-бета2.

Рис. 12. Изменение автоспектра процентной мощности через 90 мин, 24 часа, 7 дней и 21 день после введения гимантана после МФТП.

Таким образом, ПС, вызванный МФТП, при длительной регистрации биоэлектрической активности мышей С57В1/6 проявляется стойкими динамичными нарушениями ЭЭГ в различных структурах мозга в определённые периоды времени. Наиболее значимые изменения наблюдаются в диапазонах бета- и дельта-частот. Полученные данные подтверждают и расширяют представления о значении бета-активности в реализации ПС. ФРН-НЧ-ПС-80 устраняет, вызванную МФТП, пароксизмальную активность и ослабляет изменения спектра мощности в тета-1,2, бета-1,2 диапазонах. Сравнительное изучение влияния ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на биоэлектричекую активность мозга мышей С57В1/6 выявляет различия в динамике развития эффектов этих препаратов: активность ФРН-НЧ-ПС-80 более выражена в первые дни, а гимантана через 7 дней после введения нейротоксина.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что размер полученных ПБЦА-НЧ, лежит в пределах от 190 до 300 нм. Выявлена зависимость между уровнем рН полимеризационной среды и размерами ПБЦА-НЧ - размер НЧ увеличивается при снижении рН от 3 до 1,9. Процент сорбции ФРН на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, составляет 95,9%.

2. Методом иммуноферментного анализа показано, что после однократного введения ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в) концентрация ФРН в гомогенатах мозга мышей линии С57В1/6 сначала увеличивается и сохраняется на высоком уровне в течение 90 мин и затем постепенно снижается. Введение субстанции ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо не приводит к достоверному увеличению концентрации ФРН в гомогенатах мозга мышей.

3. Методами электронной микроскопии и флуоресцентного анализа показано, что после внутривенного введения ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, НЧ обнаруживаются в эндотелиоцитах сосудов головного мозга и клетках мозга. При введении ПБЦА-НЧ плацебо без ПС-80 флуоресценции в клетках мозга не наблюдается.

4. Показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 при системном (в/в, в/б) введении обладает выраженным антипаркинсоническим действием на модели МФТП-вызванного ПС у мышей С57В1/6, что проявляется в достоверном уменьшении олигокинезии, ригидности и тремора. Эффект вещества выявляется как на начальных этапах формирования ПС, с наиболее выраженным влиянием на олигокинезию, так и в отдалённые сроки. Эффект ФРН-НЧ-ПС-80 на олигокинезию выражен в большей степени при введении вещества до, чем при его введении после нейротоксина. ФРН-НЧ-ПС-80 по антипаркинсонической активности не уступает гимантану. Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо при системном введении не вызывают достоверного снижения проявлений ПС.

5. ПС, вызванный МФТП у мышей С57В1/6, сопровождается появлением на ЭЭГ пароксизмальных разрядов в ЧС, ХЯ, СМ и ГПК с максимальным проявлением через 90 мин и 7 суток после МФТП и достоверным усилением спектра мощности в эти периоды в диапазонах тета-2, бета-1,2 в ЧС, ХЯ и СМ. Через 21 день после МФТП выявлено достоверное снижение спектра мощности в тета-1,2, бета-1,2 диапазонах и усиление в дельта диапазоне во всех исследуемых структурах.

6. ФРН-НЧ-ПС-80 (в/б) и гимантан устраняют пароксизмальную активность, вызванную МФТП, и ослабляют изменения спектра мощности в тета-1,2, бета-1,2 диапазонах. Выявлены различия в динамике развития эффектов ФРН-НЧ-ПС-80 и гимаптана на спектры мощности ЭЭГ: активность ФРН-НЧ-ПС-80 более выражена в первые дни, а гимантана - через 7 дней после введения нейротоксина.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Курахмаева, К.Б. Изучение антипаркинсонического действия фактора роста нервов на модели болезни Паркинсона, вызываемой введением МФТП [Текст] / К.Б. Курахмаева, В.Ю. Балабаньяп, Т.А. Воронина, Р.Н. Аляутдин // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; Концепции болезней цивилизации». Москва, 14-17 ноября 2007 г., РУДН. -М., 2007.-С. 368-369.

2. Курахмаева, К.Б. Антипаркинсоническое действие фактора роста нервов, сорбированного на полибутилцианоакрилатных наночастицах, покрытых полисорбатом-80 [Текст] / К.Б Курахмаева., Т.А. Воронина, И.Г. Капица, Йорг Кройтер, Л.Н. Неробкова, С.Б. Середенип, В.Ю. Балабаньяп, Р.Н. Аляутдин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145, № 2. -С. 221-224.

3. Курахмаева, К.Б. Нейропротекторное действие фактора роста нервов у животных [Текст] / К.Б. Курахмаева, Т.А. Воронина, И.Г. Капица, Йорг Кройтер, Л.Н. Неробкова, В.Ю. Балабаньян, Р.Н. Аляутдин // Фармация. - 2008. -№ 2. -С. 38-40.

4. Джинджихашвили И.А. Оценка возможности доставки ФРН в мозг в эксперименте in vivo [Текст] / И.А. Джинджихашвили, К.Б Курахмаева, М. Хосравани, О.П. Попова, В.Ю. Балабаньян, В.Е. Петров, Р.Н. Аляутдин // Фармация. - 2008. - № 5. - С. 51-54.

5. Курахмаева, К.Б. Изучение антипаркинсонического действия наносомального фактора роста нервов на модели МФТП-вызванного паркинсонического синдрома [Текст] / К.Б. Курахмаева, Т.А. Воронина, В.Ю. Балабаньян, В.Е. Петров, Р.Н. Аляутдин //Материалы научно-практической конференции «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний

нервной системы». Москва, 29-30 мая 2008 г., ММА им. И.М. Сеченова. - М., 2008.-С. 112-113.

6. Аляутдин, Р.Н. Направленный транспорт лекарственных веществ в мозг с помощью нанотранспортпых систем [Текст] / Р.Н. Аляутдин, И.А. Джинджихашвили, К.Б. Курахмаева, В.Ю. Балабаньян, В.Е. Петров, Т.А Воронина // Молекулярная медицина. - 2008. - № 3. - С. 17-24.

7. Курахмаева, К.Б. Наносомальный транспорт нейротропных средств в ЦНС [Текст] / К.Б. Курахмаева, И.А. Джинджихашвили, В.А. Развижина, Я.М. Хамди, В.Ю. Балабаньян, Р.Н. Аляутдин // Сборник тезисов докладов международного форума по нанотехнологиям "Rusnanotech". Москва, 3-5 декабря 2008 г. - М., 2008. - С. 388.

8. Kurakhmaeva К.В. Brain targeting of nerve growth factor using poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles [Текст] / K.B. Kurakhmaeva, I.A. Djindjikhashvili, V.E. Petrov, V.U. Balabanyan, T.A. Voronina, S.S. Trofimov, J. Kreuter, S.E. Gelperina, D. Begley, R.N. Alyautdin //Journal of Drug Targeting. - 2009. - V. 17. -№8.-P. 564-574.

Список сокращений:

БП - болезнь Паркинсона в/б - внутрибрюшинное введение в/в — внутривенное введение ГПК - гиппокамп

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПНП - Липопротеины низкой плотности

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропириридин

НЧ - наночастицы

ПБЦА-НЧ - поли(бутил)цианоакрилатные наночастицы

ПС - паркинсонический синдром

ПС-80 - полисорбат-80

CK - сепсомоторная кора

ФРН - фактор роста нервов

ФРН-НЧ - фактор роста нервов, сорбированный на поли(бутил)цианакрилатных наночастицах

ФРН-НЧ-ПС-80 -фактор роста нервов, сорбированный на

поли(бутил)цианакрилатных наночастицах, покрытых полисорбатом-80

ХЯ — хвостатое ядро

ЧС - чёрная субстанция

ЭЭГ - электроэнцефалограмма

BDNF - мозговой нейротрофический фактор

Подписано в печать 15.10.2009 г. Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 2014. Объем 1,3 п.л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д. 6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Актуальность темы

В последние годы проблема нейродегенеративных заболеваний стала особенно острой в связи с ухудшающейся экологической ситуацией, более ранними проявлениями скрытой генетической патологии и увеличением продолжительности жизни в развитых странах Запада [Benjamin C.L., Tsui К.С. 2001; Elbaz A, Moisan F. 2008]'. Существующие на сегодняшний день подходы к медикаментозной коррекции не всегда позволяют тормозить прогрессирование заболевания, а лишь устраняют их симптоматику [Левин О.С., 2005; Alexi Т. et al., 2000], а длительное применение большинства противопаркинсонических средств сопровождается значительными побочными эффектами со. стороны различных органов и систем, что, в свою очередь, еще больше снижает качество жизни пациентов [Кучеряну В.Г. и соавт., 2001; Иллариошкин С.Н., 2004; Угрюмов М.В., 2007; Артемьев Д.В., 2008].

Одним из путей воздействия на процесс развития нейродегенеративных i заболеваний и, в частности, БП является применение нейротрофического фактора роста нерва (ФРН) [Yuen Е.С., Molbey W.C 1996; Mufson E.J. et al. 1999; Rattray M., 2001], который вовлечен в модуляцию нейромедиаторных систем, в том числе дофаминергической передачи в мозге [Hardy J., Gwinn-Hardy К. 1999; Pedre L.L. et al., 2002], регулирует выживаемость нейронов [Bibel М., Barde Y., 2000]. Снижение уровня ФРН наблюдается в крови и в структурах чёрной субстанции больных БП [Rinne J.O et. al., 1989; Garcia E. et al., 1992]. Существенным моментом, лимитирующим применение ФРН, является его невысокая способность проникать через гематоэнцефалический барьер ввиду высокой гидрофильности и большой молекулярной массы [Castellenos-Ortega М. R. et al., 1999; Banks W. et al., 2002].

В настоящее время наносистемы вызывают все возрастающий интерес, так как они способны транспортировать лекарственные вещества (ЛВ) внутрь клеток и при их циркуляции содержащееся в них биологически активное вещество защищено от инактивации и его действие пролонгируется [Сейфулла Р.Д. и соавт., 2008; Чехонин В.П. и соавт., 2009; Piotrovsky L.B., et al. 2004; Ringe К. et al. 2004; Kreuter J., 2002; Alyautdin R. et al., 1998]. Одним из способов доставки JIB в мозг является использование наночастиц (НЧ) на основе бутилцианоакрилата [Kreuter J., 1991; Vauthier С. et al., 2003]. Поли(бутил)цианоакрилатные НЧ (ПБЦА-НЧ) обладают высокой сорбционной емкостью, подвергаются биодеградации, обеспечивают доставку и высвобождение JIB, имеют низкую острую и хроническую токсичность [Grislain L. et al., 1983; Kreuter J. et al., 1984; Gelperina S.E., et al., 2002; Pereverzeva E. et al. 2008]. Синтез НЧ на основе бутилцианоакрилата впервые был описан в 1977 г. [Couvreur Р. et al., 1977], а позднее были изучены и свойства этих НЧ в Institut für Pharmazeutische Technologie, Goethe-Universität (Франкфурт-на-Майне, Германия) и кафедре фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова [Kreuter J., 1994, Alyautdin R. et al., 1997, 2001]. При системном введении ПБЦА-НЧ покрывают сурфактантами, что приводит к уменьшению захвата НЧ клетками ретикулоэндотелиальной системы и, следовательно, к пролонгированию циркуляции НЧ в системном кровотоке и увеличению их концентрации в сосудах головного мозга [Kreuter J. et al., 1997; Brigger I. et al., 2002].

Ранее ПБЦА-НЧ уже использовались в качестве транспортных систем для целенаправленной доставки таких веществ, как лоперамид [Alyautdin et al., 1997], тубокурарин [Alyautdin R. et al., 1998], даларгин [Alyautdin R. et al., 1995], мет-энкефалин [Säbel B.A. et al 1998], лей-энкефалин [Kreuter J. et al., 2003], ФРН при изучении его антиамнестического эффекта [Джинждихашвили И.А. и соавт., 2008], феназепам [Развижина В.А., 2008] и доксирубицин [Gelperina S. et al., 2002], который в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США [Nicolas J., Couvreur Р., 2009].

Целью исследования« явилось экспериментальное изучение противопаркинсонического действия- фактора роста нервов, сорбированного на поли(бутил)цианоакрилатных наночастицах, покрытых ПС-80 (ФРН-НЧ-ПС-80) Задачи исследования:

1. Разработать состав и технологию получения наносомальной формы ФРН-НЧ-ПС-80, определить размер ПБЦА-НЧ и процент сорбции ФРН на ПБЦА-НЧ.

2. Определить концентрацию ФРН-НЧ-ПС-80 в сравнении с ФРН в субстанции, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо в гомогенатах мозга мышей С57В1У6 методом иммуноферментного анализа.

3. Исследовать противопаркинсоническое действие ФРН-НЧ-ПС-80- в сравнении с действием ФРН в субстанции, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо на поведенческие проявления паркинсонического синдрома (ПС), вызванного нейротоксином МФТП у мышей С57В1У6.

4. Провести сравнительное изучение антипаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80 при введении до и после развития ПС.

5. Изучить динамику развития ПС (в течение 21 дня), вызванного МФТП у мышей С57В1/6, и выявить особенности эффектов ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на разных стадиях формирования ПС.

6. Изучить влияние ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на биоэлектрическую активность мозга мышей линии С57В1/6 на различных стадиях формирования ПС, вызванного МФТП.

Научная новизна. Разработан состав и технология получения ФРН на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 для системного введения. Установлено, что ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, обнаруживаются, в контакте с сосудистой стенкой, что указывает на их взаимодействие с эндотелием сосудов головного мозга и последующее проникновение в мозг.

Впервые показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 при системном введении проникает в мозг мышей С57В1/6 и вызывает достоверное увеличение концентрации ФРН в гомогенатах мозга, тогда как субстанция ФРН, ФРН с ПБЦА-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо при системном введении не вызывают достоверного эффекта. Показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 при системном введении оказывает антипаркинсоническое действие на модели МФТП-вызванного ПС у мышей С57В1/6, при этом эффект вещества выявляется как на этапах формирования паркинсонического синдрома (90 мин и 24 часа), так и в отдалённые сроки (через, 7 дней и 21день). Показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 оказывает эффект на МФТП-вызванный ПС как при внутривенном; так и внутрибрюшинном введении. При этом, ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в) влияет в наибольшей степени на показатели олигокинезии в открытом поле на первых этапах (90 мин и 24 часа) развития ПС.

Впервые проведён анализ ЭЭГ мышей С57В1/6, получавших МФТП, ФРН-НЧ-ПС-80 или гимантан после МФТП при длительной регистрации (в течение 21 дня) биопотенциалов мозга животных. Анализ электрофизиологических механизмов^ реализации антипаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80' и гимантана на мышах С57ВЬ/6 выявил различия в динамике развития эффектов-этих препаратов: активность ФРН-НЧ-ПС-801 более выражена в первые дни, а гимантана через 7 дней после введения нейротоксина.

Научно-практическая значимость. Выполненная работа подтверждает возможность доставки ФРН в мозг с помощью наночастиц при1 системном введении. Полученные данные об антипаркинсоническом действии. ФРН, сорбированного на ПБЦА-наночастицах, покрытых ПС-80 при разных путях системного введения и результаты, показывающие эффективность ФРН-НЧ-ПС-80 на различных этапах формирования и стабилизации ПС, свидетельствуют о перспективности разработки ФРН на наночастицах в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Паркинсона.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно изготовлена лекарственная форма ФРН на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, для системного введения и выполнены её фармакологическое изучение, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация диссертации. Результаты работы были доложены на межлабораторных конференциях НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, Научно-практической конференции «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы» (Москва, 2008 год), Международном форуме по нанотехнологиям "Кизпагк^есИ" (Москва, 2008), Научно-методической конференции кафедры фармакологии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, в том числе 4 статьи - в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 1 - в зарубежном журнале, и 3 тезиса в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 65 рисунками. Библиографический указатель включает 48 отечественных и 231 иностранных источников.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что размер полученных ПБЦА-НЧ, лежит в пределах от 190 до 300 нм. Выявлена зависимость между уровнем рН полимеризационной среды и размерами ПБЦА-НЧ - размер НЧ увеличивается при снижении рН от 3 до 1,9. Процент сорбции ФРН на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, составляет 95,9%.

2. Методом иммуноферментного анализа показано, что после однократного введения ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в) концентрация ФРН в гомогенатах мозга мышей линии С57В1/6 сначала увеличивается и сохраняется на высоком уровне в течение 90 мин и затем постепенно снижается. Введение субстанции ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо не приводит к достоверному увеличению концентрации ФРН в гомогенатах мозга мышей.

3. Методами электронной микроскопии и флуоресцентного анализа показано, что после внутривенного введения ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, НЧ обнаруживаются в эндотелиоцитах сосудов головного мозга и клетках мозга. При введении ПБЦА-НЧ плацебо без ПС-80 флуоресценции в клетках мозга не наблюдается.

4. Показано, что ФРН-НЧ-ПС-80 при системном (в/в, в/б) введении обладает выраженным антипаркинсоническим действием на модели МФТП-вызванного ПС у мышей С57В1/6, что проявляется в достоверном уменьшении олигокинезии, ригидности и тремора. Эффект вещества выявляется как на начальных этапах формирования ПС, с наиболее выраженным влиянием на олигокинезию, так и в отдалённые сроки. Эффект ФРН-НЧ-ПС-80 на олигокинезию выражен в большей степени при введении вещества до, чем при его введении после нейротоксина. ФРН-НЧ-ПС-80 по антипаркинсонической активности не уступает гимантану. Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ плацебо при системном введении не вызывают достоверного снижения проявлений ПС.

5. ПС, вызванный МФТП у мышей С57В1/6, сопровождается появлением на ЭЭГ пароксизмальных разрядов в ЧС, ХЯ, СМ и ГПК с максимальным проявлением через 90 мин и 7 суток после МФТП и достоверным усилением спектра мощности в эти периоды в диапазонах тета-2, бета-1,2 в ЧС, ХЯ и СМ. Через 21 день после МФТП выявлено достоверное снижение спектра мощности в тета-1,2, бета-1,2 диапазонах и усиление в дельта диапазоне во всех исследуемых структурах.

6. ФРН-НЧ-ПС-80 (в/б) и гимантан устраняют пароксизмальную активность, вызванную МФТП, и ослабляют изменения спектра мощности в тета-1,2, бета-1,2 диапазонах. Выявлены различия в динамике развития эффектов ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на спектры мощности ЭЭГ: активность ФРН-НЧ-ПС-80 более выражена в первые дни, а гимантана — через 7 дней после введения нейротоксина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как упоминалось в обзоре литературы, до настоящего времени существует необходимость поиска новых средств лечения БП, позволяющих не только облегчить симптомы заболевания, но приостановить или замедлить прогрессирование болезни путем воздействия на патогенетические звенья процесса.

Тот факт, что некоторые проявления БП возникают и при нормальном старении, заставляет предполагать, что одним из причинных факторов паркинсонизма может быть возрастное снижение количества мозговых нейронов [Riederer Р. et al., 2006]. И действительно, каждые 10 лет жизни человек теряет около 8% нейронов. Компенсаторные возможности мозга настолько велики, что симптомы паркинсонизма появляются лишь при потере 80% нейронной массы. В результате морфологических и молекулярно-биологических исследований установлено участие процессов апоптоза в формировании очагов поражения нервной ткани и влияние нейротрофинов на процессы программированной клеточной смерти [Bibel М., Barde Y., 2000; Dawbarn D and Allen S.J., 2003].

Апоптоз нейрона - это один из механизмов патогенеза при заболеваниях ЦНС. Современный уровень знаний о молекулярных механизмах гибели нейрона при нейродегенеративных заболеваниях недостаточен для понимания всех аспектов их патогенеза, однако представляется весьма вероятным, что одним из индуцирующих факторов при повреждении нервных клеток являются (главным образом в механизмах апоптоза) ростовые факторы [Rabizadeh S., 1993]. В 1993 г. был идентифицирован новый ген, индуцирующий апоптоз исключительно в нервной системе — ген низкоаффинного рецептора к фактору роста нервов (pTSNGFR) [Rabizadeh S., 1993]. Показано, что в нейронах зрелой нервной ткани нет экспрессии P15NGFR, который относится к семейству, включающему и гены рецепторов к Факторам некроза опухоли, однако при нейродегенеративных заболеваниях выявлена его повышенная экспрессия в нейронах головного и спинного мозна. Предполагается, что повышенная экспрессия p75NGFR способствует образованию арахидоновой кислоты, активации перекисного окисления липидов и развитию окислительного стресса. [BredesenD. Е., 1994].

Выявлено антиапоптотическое действие ФРН, которое 1) вызывает морфологическую дифференцировку клеток; 2) участвует в формировании длительного периода выживания клеток; 3) подавляет апоптоз, вызванный дефицитом цилиарного нейротрофического фактора (ciliary neurotrophic factor, CNTF) [Barrett G.L., 2000; Sastry P.S., Rao K.S., 2000].

Получены убедительные данные о вовлечении нейротрофических факторов в модуляцию дофаминергической передачи в мозге и показана способность ФРН препятствовать гибели дофаминергических нейронов [Olson L. et al., 1994; Reader Т.A., Dewar K.M., 1999; Stoof J.C. et al., 1999; Alexi T. et al., 2000].

Однако существенным моментом, лимитирующим разработку ФРН в качестве лекарственного средства, является его неспособность проникать через ГЭБ, поскольку ФРН, а также другие представители семейства нейротрофинов, являются белками - гидрофильными соединениями с высокой молекулярной массой, что и определяет их умеренное проникновение через ГЭБ.

Одной из возможных систем, способных транспортировать лекарственные вещества внутрь клеток является нанотранспортная система. С развитием нанотехнологий все чаще и чаще стали проводиться исследования, связанные с применением наночастиц для направленного транспорта лекарственных веществ. Доставка ФРН в мозг с помощью наночастиц является одним из новых способов поиска средств патогенетической терапии болезни Паркинсона. В рамках этой проблемы и было выполнено настоящее исследование.

В качестве наночастиц были выбраны давно известные (с 1977 г.) [Garnett Couvreur P. et al., 1977] ПБЦА-наночастицы, которые хорошо изучены [Kreuter J., 2007], малотоксичны [Kante et al., 1982; Grislain et al., 1983; Gelperina S.E., et al., 2002; Kreuter J., 2004; Pereverzeva E. et al. 2008], подвергаются быстрой биодеградации [Langer К. et al., 1994], обладают высокой сорбционной емкостью [Kreuter J., 2001], имеют низкую молекулярную массу полимера, в связи с чем полимер быстро выводится из организма. Показано, что ПБЦА-наночастицы эффективны в качестве транспортных систем для целенаправленной доставки таких веществ, как лоперамид [Alyautdin R. et al., 1997], тубокурарин [Alyautdin et al., 1998], даларгин [Alyautdin R. et al., 1995], мет-энкефалин [Sabel, Schroeder, et al 1998], лей-энкефалин [Kreuter J. et al., 2003], ФРН при изучении его антиамнестического эффекта [Джинждихашвили И.А. и соавт., 2008], феназепам [Развижина В.А.,2008] и доксирубицин [Gelperina S. et al., 2002], который в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США [Nicolas J., Couvreur P., 2009].

В наших исследованиях ПБЦА-НЧ были синтезированы методом анионной полимеризации, что позволило получить ПБЦА-НЧ однородные по размеру и пригодные для системного введения. Наносуспензия остаётся стабильной в течение 24 часов. При определении размеров полученных ПБЦА-НЧ методом фотонно-корреляционной спектроскопии, было выявлено, что размеры ПБЦА-НЧ лежат в пределах от 190 до 300 нм. Такие частицы представляют собой коллоидные образования и относятся группе НЧ с размерами от 1-1000 нм [Brian H. Кауе., 2006; J. Kreuter., 2004]. Согласно определению ГК «Роснанотех» «НЧ - аморфная или полукристаллическая структура, имеющая хотя бы один характерный размер в диапазоне 1-100 нм». Вместе с тем, для материалов, создаваемых для медицинских и фармацевтических целей существует иная классификация, которую используют многие исследователи [Geiser M, 2005; Garnett, M. С., 2006; Zohri M., 2009] и, согласно которой в медицине наноматериалами считают частицы с размерами от 10 до 1000 нм. Наиболее часто для системного введения в экспериментах in vivo используются НЧ с размерами от 50 до 300 нм, поскольку размер таких частиц превышает размер фенестров капилляров печени и они наиболее длительно циркулируют в системном кровотоке [Ilium L, Davis SS. 1984; Harivardhan RL, Murthy RSR, 2003; Nicolas J., Couvreur P., 2009].

При электронно-микроскопическом изучении абсорбции полисорбата-80 на ПБЦА-наночастицы было определено, что на поверхности наночастиц, обработанных полисорбатом-80, формируется слой тонковолокнистого материала, особенно четко видимый в зонах контакта частиц. Процент сорбции ФРН на наночастицах составляет 96,6% в случае суспензии НЧ без ПС-80 и 95,9% в случае с суспензией НЧ, покрытых ПС-80. Полученный высокий процент сорбции позволяют сделать вывод, что покрытие поверхности наночастиц полисорбатом-80 не влияет на степень сорбции ФРН.

При оценке антипаркинсонического действия ФРН-НЧ-ПС-80, на модели МФТП-вызванного ПС на мышах линии С57В1/6 установлено, что через 2-4 минуты после инъекции МФТП появлялась пилоэрекция, ретро- или латеропульсия; через 10-15 минут отмечалась ригидность, которая сохранялась в течение 21 дня; олигокинезия достигала пика через 90 мин, сохранялась 24 часа, затем к 7 дню её выраженность снижалась (до недостоверных величин), а к 21 дню вновь отмечалось достоверное снижение двигательной активности; тремор отмечался через 2-3 мин после введения нейротоксина, через сутки его выраженность значительно снижалась, но к 7 дню возникали новые достоверные показатели % животных с тремором. Вышеуказанные эффекты МФТП согласуются с данными литературы. Хорошо известно, что МФТП вызывает избирательное повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции и при его внутрибрюшинном введении у животных возникает триада основных симптомов БП: олигокинезия, ригидность, тремор и ряд вегетативных нарушений [Крыжановский Г.Н. и др., 1995; Przedborski S., Vila М., 2001; Кучеряну В.Г., 2001; Воронина Т.А. и др., 2005; Капица И.Г. и др., 2008].

ФРН-НЧ-ПС-80, введенный в/в после МФТП, существенно и статистически достоверно повышал двигательную активность мышей, сниженную МФТП. Так, в тесте открытое поле, через 90 мин после введения ФРН-НЧ-ПС-80 горизонтальная активность увеличивалась в 8,3 раза, а вертикальная активность в 8,5 раза. Достоверное повышение (примерно в 2 раза) двигательной активности в открытом поле и в актометре ФРН-НЧ-ПС-80 вызывает через 24 часа, на 7 и 21 сутки после создания паркинсонического синждрома.

Таким образом, ФРН-НЧ-ПС-80 обладает выраженной способностью устранять олигокинезию у мышей С57В1/6, вызванную нейротоксином МФТП. При этом эффект вещества выявляется как на начальных этапах формирования паркинсонического синдрома (через 24 часа), так и в отдалённых сроках (через 7 и 21 день) после введения МФТП. Субстанция ФРН, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 и ПБЦА-НЧ не оказывали эффекта на олигокинезию, вызванную МФТП.

ФРН-НЧ-ПС-80, введённый в/в после МФТП, уменьшал олигокинезию у животных, что выражалось в достоверном увеличении длины шага мышей, в уменьшении скованности и горбатости. Уменьшение ригидности наблюдалось через 90 мин, 24 часа, на 7 и 21 сутки после введения ФРН-НЧ-ПС-80 и МФТП.

ФРН-НЧ-ПС-80, введённый в/в после МФТП, через 90 мин и сутки после введения достоверно уменьшал % животных с тремором в 2 раза, а через 7 дней более чем в 10 раз по сравнению с контролем при введении МФТП.

ФРН-НЧ-ПС-80 при внутрибрюшинном введении как до, так и после нёйротоксина уменьшает проявление ПС, вызываемого введением МФТП, как в 1-е сутки, так и 7-е и 21-е сутки эксперимента. ФРН-НЧ-ПС-80 оказывает сходный эффект на олигокинезию при введении как до, так и после МФТП при регистрации эффектов через 90 мин и 21 день (после введения МФТП), но ФРН-НЧ-ПС-80 при введении до МФТП оказывает более выраженный эффект, чем ФРН-НЧ-ПС-80, введённый после МФТП через 24 часа и 7 дней после введения. Различий в эффектах ФРН-НЧ-ПС-80 на ригидность в течение всего периода наблюдения (21 день) при его введении как до, так и после МФТП выявлено не было.

В результате сравнительного изучения действия ФРН-НЧ-ПС-80, введенного в/б и ФРН-НЧ-ПС-80, введённого в/в после МФТП по показателям ПС, выявлено, что на показатели ригидности обе группы влияют в равной степени; на показатели олигокинезии выявлена разница - при внутривенном введении ФРН-НЧ-ПС-80 влияет в большей степени на показатели олигокинезии в открытом поле на ранних этапах наблюдения (90 мин - и 24 часа).

Показано, что внутривенное введение субстанции ФРН мышам линии С57В1/6 с МФТП не приводит к достоверному снижению основных проявлений ПС. Полученные результаты подтверждают, что свободный ФРН при его системном введении не проникает в ЦНС, что согласуется с данными литературы, свидетельствующими о его весьма ограниченном проникновении через гематоэнцефалический барьер [Castellenos-Ortega М. R. et al., 1999; Banks W. et al., 2002], однако при введении ФРН непосредственно в желудочки мозга животных, наблюдается значительное увеличение содержания дофамина и гомованилиновой кислоты в стриатуме [Е. Garcia et al., 1992]. Показано также, что внутрижелудочковых инъекциях пациентам ФРН оказывает отчётливое антипаркинсоническое действие [Randerson J., 2003].

Установлено, что ПБЦА-НЧ плацебо, ФРН-НЧ, ФРН-ПС-80 при внутривенном введении мышам линии С57В1/6 после нейротоксина МФТП не оказывают антипаркинсоническое действие по всем проявлениям ПС: не вызывают достоверного увеличения двигательной активности, снижения ригидности и тремора, вызванных МФТП, в экспериментах. Среди этих веществ наибольшей способностью увеличивать двигательную активность обладал ФРН-НЧ, однако, и его эффект был статистически недостоверным. Отсутствие достоверных изменений в показателях ПС на различных этапах исследования в группе ФРН-НЧ говорит о невозможности транспорта пептида без покрытия НЧ поверхностно-активным веществом — ПС-80. Данный результат согласуется с имеющимися данными литературы об участии ПС-80 в механизме транспорта лекарственных веществ в мозг с помощью полимерных наночастиц [Nerurkar MM et al., 1996; Gulyaev АЕ et al., 1999; Moghimi S.M. et al., 2001 Kreuter J., 2002].

Механизм транспорта лекарственных веществ через ГЭБ при использовании наносистем до конца не изучен. В проникновении ФРН через ГЭБ с использованием полимерных наночастиц могут быть задействованы такие процессы, как трансцитоз через эндотелиальные клетки кровеносных сосудов мозга, подавление функции Р-гликопротеина, открытие плотных контактов между эндотелиоцитами, адгезия наночастиц на стенках сосудов головного мозга и др. Предполагается, что наиболее значимым механизмом является рецептор-зависимый эндоцитоз [Аляутдин Р. Н. 2001; Аляутдин Р. Н и др., 2003; Gulyaev АЕ et al., 1999; Kreuter J., 2002]. Сочетание липосом с определенными лигандами приводит к их специфическому взаимодействию с соответствующими мишенями (например, рецепторами) с последующим эндоцитозом [Kreuter J., 2002]. ПС-80, покрывающий ПБЦА-НЧ, адсорбирует аполипопротеин Е, содержащийся в плазме крови [Kreuter J. et al., 2003]. Тем самым ПБЦА-НЧ приобретают характерные черты липопротеинов низкой плотности и взаимодействуют с ЛПНП - рецепторами, локализованными на поверхности эндотелиальных клеток капилляров мозга, благодаря чему наночастицы захватываются эндотелиальными клетками путем рецептор -зависимого эндоцитоза [В. Dehouck et al., 1997; Moghimi S.M. et al., 2001]. После деградации наносистем в лизосомах эндотелиальных клеток, ФРН диффундирует в ткани мозга. Можно предположить, что антипаркинсонический эффект ФРН, выявленный в настоящем исследовании, обусловлен модулирующим влиянием вещества на дофаминергическую систему мозга.

Получены убедительные данные о вовлечении нейротрофических факторов в модуляцию дофаминергической передачи в мозге и показана способность ФРН препятствовать гибели дофаминергических нейронов [Markus A. et al., 2002; Sofroniew M.V. et al., 2001; Olson L. et al., 1994; Salinas M. et al., 2003]. Установлено также, что ФРН зависимо от дозы усиливает высвобождение дофамина (in vitro) [Blochl A., et al. 1994]. Значительное увеличение содержания дофамина и гомованилиновой кислоты показано также в стриатуме мышей с ПС, вызванным МФТП, которым в головной мозг вводили ФРН [Garcia E.et al., 1992].

Выявлено, что у мышей линии С57В1/6 с МФТП-вызванным ПС гимантан (20 мг/кг внутрибурюшинно) вызывает достоверное ослабление основных симптомов паркинсонического синдрома: олигокинезии, тремора и ригидности, а также уменьшает выраженность пилоэрекции. Данные результаты согласуются с резултатами проведённых ранее доклинических исследований гимантана [Вальдман Е.А., 1999; Вальдман Е.А. и соавт., 2004].

Сопоставление действия ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на различные этапы формирования ПС показывает, что эффект ФРН-НЧ-ПС-80 на олигокинезию был более выражен, чем у гимантана через 90 мин и 24 часа после введения. На 7-й день показатели двигательной активности в группе гимантана превышали таковые показатели группы ФРН-НЧ-ПС-80, а через 21 день оба препарата оказывали сходный эффект.

Для изучения возможности транспорта ФРН через ГЭБ с помощью ПБЦА-НЧ были проведено морфологическое исследование наночастиц в головном мозге мышей с помощью флуоресцентной и электронной микроскопий. При флуоресцентной микроскопии было выявлено, что ПБЦА-НЧ-плацебо в большей степени накапливаются в просвете сосудов, а не в эндотелиоцитах. При изучении ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 была зафиксирована выраженная флуоресценция в телах клеток Пуркинье мозжечка. При этом в образцах тканей мозга экспериментальных животных, которым вводили ПБЦА-наночастицы, не покрытые ПС-80, подобного эффекта не наблюдали. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, проникают в эндотелиоциты. Электронная микроскопия показала наличие ПБЦА-наночастиц, покрытых ПС-80 в эндотелиоцитах и клетках Пуркинье, что свидетельствует о том, что ПБЦА-НЧ, модифицированные ПС-80, подвергаются эндоцитозу эндотелиальными клетками сосудов головного мозга. Данные имму но ферментного анализа показали, что при системном введении ФРН-НЧ-ПС-80 (в/в, однократно) концентрация ФРН в гомогенатах тканей мозга у мышей линии С57В1/6 в разные промежутки времени постепенно увеличивалась достигала максимума на 45 минуте (311.6±16.5 пкг/мл), сохранялась на высоком уровне через 90 мин и затем постепенно снижалась, достигая 88.9±3.8 пкг/мл через 24 часа.

Было установлено, что системное введение субстанции ФРН, ФРН с ПБЦА-НЧ и ФРН с ПС-80 не приводит к достоверному увеличению концентрации ФРН в гомогенатах тканей мозга мышей. В результате можно заключить, что ПБЦА-наночастицы, покрытые полисорбатом-80, обеспечивают направленный транспорт ФРН в ЦНС. Увеличение концентрации ФРН (недостоверное) в тканях мозга на 45 минуте и через 24 часа относительно контрольной группы (натрия хлорид) было отмечено при введении раствора ФРН. Известно, что ФРН весьма ограниченно проникает в ЦНС [Backman С., et al., 1996, Tuszynski М. N. et al., 1996]. Однако имеются данные, свидетельствующие о наличии эндогенных транспортных систем для прохождения ФРН через ГЭБ [Anand Р., et al., 1997; Kaplan D.R., et al., 2000]. Эти данные являются предварительными и требуют дальнейшего изучения.

Для углублённого изучения противопаркинсонического эффекта ФРН-НЧ-ПС-80 были выполнены исследования с регистрацией биопотенциалов мозга мышей линии C57BL/6 в условиях свободного поведения животных. Биоэлектрическую активность мозга мышей линии C57BL/6 регистрировали в следующих структурах: сенсомоторной области коры, хвостатом ядре, гиппокампе и черной субстанции.

Было показано, что паркинсонический синдром, вызванный МФТП (30 мг/кг, в/б, однократно) у мышей С57В1/6 сопровождается появлением на ЭЭГ пароксизмальных разрядов высокоамплитудных медленных волн в ЧС,ХЯ, СМ и ГПК. Максимальное проявление пароксизмальной активности наблюдается в период 90 мин и 7 суток после МФТП, а через 21 день ее выраженность несколько снижается и сохраняется только в ХЯ и ГПК.

ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг, 5 мкг/мышь, в/б, однократно) и гимантан (20 мг/кг, в/б, однократно) устраняют пароксизмальную активность, вызванную МФТП в ЧС, ХЯ, СМ и ГПК. ФРН-НЧ-ПС-80 оказывает максимальный эффект на начальных этапах формирования паркинсонического синдрома, а гимантан через 7 суток после введения МФТП.

МФТП вызывает достоверное усиление спектра мощности биоэлектрической активности в диапазонах тета-2, бета-1 и бета-2 частот в ХЯ, ЧС и СМ через 90 минут после введения. Через 24 часа и 7 суток эффект МФТП в этих структурах уменьшается, но появляется в ГПК и на 21 день после введения МФТП наблюдается достоверное снижение спектра в этих диапазонах мощности в ЧС и СК (реверсия эффекта). ФРН-НЧ-ПС-80 (0,25 мг/кг, 5 мкг/мышь, в/б, однократно) и гимантан (20 мг/кг, в/б, однократно) уменьшают мощность спектра биоэлектрической активности, усиленной МФТП, в диапазонах тета-2, бета-1 и бета-2 частот в ХЯ, ЧС и СМ, приближая его к фоновым показателям.

Полученные данные подтверждают и расширяют представления о значении бета-активности в реализации паркинсонического синдрома. В исследованиях на животных показано, что повреждение дофаминергических нейронов среднего мозга 6-OHDA ассоциируется со значительным увеличением мощности спектра и когерентнсти в бета-диапазоне биоэлектрической активности фронтальных отделов коры и субталамических ядер мозга крыс по сравнению с контрольными животными. Характер синхронизации между активностью в коре и субталамических ядрах на модели 6-OHDA - вызванной БП близок к тем, что наблюдается у больных БП. Частота пика когерентной активности в бета-диапазоне увеличивалась во время спонтанных и навязанных движений [Hutchison et al., 2004]. Zhao Ming и др., (2003) было показано, что при однократном введении МФТП крысам (25 мг/кг), увеличивается нейрогенез в чёрной субстанции на 3 неделю после введения, а при подостром введении МФТП (25 мг/кг, в течение 5 дней), нейротоксин вызывал пролиферацию в стриатуме и нигральной областях [Мао L. et al., 2001].

При внутрижелудочковом введении ФРН крысам в течение 3-х недель регистрировали ЭЭГ-активность на 4, 7, 14 и 21 день после введения. У животных, получавших ФРН, наблюдалось увеличение р2-активности. Кроме того, ФРН вызывал умеренное увеличение активности холинацетил-трансферазы в первую неделю наблюдения (4 и 7 дни), что свидетельствует о том, что ФРН вызывает изменения в холинергических нейронах. Существенно значимых изменений в последующие 2 недели не отмечалось [Daniel P. et ah, 1997].

МФТП достоверно снижает спектр мощности биоэлектрической активности в диапазоне дельта частоты через 24 часа (в ЧС, ХЯ, СМ и ГПК) и 7 суток (в ХЯ, СМ) и усиливает в диапазонах 1 и 3 кол/сек (в ХЯ, СМ и ЧС) через 21 день после введения нейротоксина. ФРН (0,25 мг/кг, 5 мкг/мышь, в/б, однократно) уменьшает спектр мощности в диапазоне дельта частоты через 90 мин и 24 часа и 21 день усиливает спектр мощности в этом диапазоне во всех структурах по сравнению с эффектом МФТП.

Изменения спектров мощности ЭЭГ у животных, получавших ФРН-НЧ-ПС после МФТП, были близки к фоновым записям ЭЭГ мышей С57В1/6 с максимальным эффектом на начальных этапах формирования ПС, что позволяет предполагать усиление в этот период процесса нейрогенеза, в который вовлечены многие нейротрофические факторы (ФРН, BDNF и др.). При снижении количества нейротрофических факторов нарушается пролиферация.и митоз клеток [Limin Мао, John Q. Wang, 2003]. Показано, что ФРН при внутрижелудочковом введении пациентам с гипоксической ишемией стимулирует перфузию головного мозга и нейрогенез, вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток и снижает неврологический дефицит [Antonelli A et al., 2008]. Показано также, что BDNF усиливает нейрогенез и улучшает функциональное восстановление крыс с инсультом [Schâbitz W.R. et al., 2007].

Таким образом, ПС, вызванный МФТП, при длительной регистрации биоэлектрической активности мышей С57В1/6 проявляется стойкими динамичными нарушениями ЭЭГ для различных структур мозга в определённые периоды времени. Наиболее значимые изменения наблюдаются в диапазонах бета- и дельта- частот. Полученные данные подтверждают и расширяют представления о значении бета-активности в реализации ПС. ФРН-НЧ-ПС-80 устраняет, вызванную МФТП, пароксизмальную активность и ослабляет изменения спектра мощности в тета-1,2, бета-1,2 диапазонах. Сравнительное изучение влияния ФРН-НЧ-ПС-80 и гимантана на биоэлектричекую активность

154 мозга мышей С57В1/6 выявляет различия в динамике развития эффектов этих препаратов: активность ФРН-НЧ-ПС-80 более выражена в первые дни, а гимантана через 7 дней после введения нейротоксина.