Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эффективность наносомальной формы фактора роста нервов при экспериментальной ишемии головного мозга

0046

ХОСРАВАНИ МАСУД

ЭФФЕКТИВНОСТЬ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

14.03.06-фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2010

- 3 ЛЕИ ?ПЮ

004616728

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первом московском государственном медицинском университете имени И. М. Сеченова Министерства Здравоохранения и социального развития РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Аляутдин Ренад Николаевич

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН Доктор медицинских наук

Профессор Шимановский Николай Львович

доктор медицинских наук,

профессор Чиченков Олег Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «7? » декабря 2010 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д. 208.040.13 при ГОУ ВПО Первый МГМУ им.И.М. Сеченова Минздравсоцразвития по адресу: 109240 Москва, ул.Яузская, дом 11, в ГКБ № 23, 5 корпус , 7 этаж .

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 117418, Москва, Нахимовский просп., 49

Автореферат разослан » */"/ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Архипов Владимир Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Профилактика и лечение цереброваскулярных заболеваний является актуальной проблемой современной медицины во всем мире. Основное место среди них занимают инсульты, которые каждый год поражают до 16 млн. человек из которых 5,7 млн. погибают от постинсультных осложнений. Смертность от цереброваскулярных заболеваний уступает лишь смертности от заболеваний сердца и опухолей всех локализаций и достигает в экономически развитых странах 11-12% (Strong К. et al., 2007; Bonita R, et al.,1994; Kaste et al, 1998, ВОЗД999). Из выживших пациентов до 60 % больных становятся тяжелыми инвалидами, 30 % имеют стойкие остаточные изменения и только 10 % возвращаются к полноценной жизни.

Расходы на лечение и восстановительный постинсультный период относятся во всем мире к наиболее затратным статьям, как государственного сектора здравоохранения, так и личных средств граждан и составляют от 880 млрд. до 1,2 трлн. долларов ежегодно (ВОЗ). По прогнозам Strong К. et al. к 2015 г. число лиц, перенесших инсульт, составит 62 млн. человек , что приведет к многократному росту расходов до 4,5 трлн. долларов ежегодно.

Особую актуальность профилактика и лечение инсультов имеет для РФ. Россия занимает второе место в мире после Болгарии по числу ежегодно случающихся инсультов. Каждый год в России регистрируется более 500 тыс. случаев острых нарушений мозгового кровообращения . В первый месяц после развития заболевания умирает 35 %, а в течение года еще-15%. Инсульт поражает все более молодое население - каждый пятый - это пациент моложе 50 лет. При этом темпы роста смертности наиболее высоки у пациентов в трудоспособном возрасте от 30 до 50 лет.

Вместе с тем эффективность лечения геморрагических инсультов, гипоксических повреждений головного мозга с неврологическим дефицитом до сих пор остается малоэффективным и симптоматическим, в связи с практическим отсутствием патогенетической терапии, а также из-за проблем транспорта потенциально эффективных препаратов, например, фактора роста нервов(ФРН), через гематоэнцефалический барьер(ГЭБ) в головной мозг. Применение ФРН рассматривается рядом авторов как перспективное направление в терапии ряда патологий ЦНС : болезни Альцгеймера, деменции (Jonhagen, М.Е. 2000; Rattray, М. 2001). Основным лимитирующим моментом клинического применения ФРН является его весьма ограниченное проникновение через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что объясняется гидрофильным характером и высокой молекулярной массой ФРН (W. Banks et al.,2000. М. R. Castellenos-Ortega et al., 1999.).

Существующие методы, позволяющие повысить прохождение ФРН через ГЭБ не лишены недостатков. Так, непосредственное введение ФРН в мозг, имеет свои ограничения, связанные с инвазивностью, болезненностью процедуры и возможными последующими осложнениями (J.L. Venero et al., 1996); технически сложно и малопригодно для широкого клинического

применения. Интраназальное введение ФРН в экспериментах на мышах, не выявило достоверного увеличения прохождения фактора роста нервов через ГЭБ (R. De Rosa et al.,2005). Перспективы конъюгированных форм ФРН; осмотическое открывание ГЭБ, подавление функций Р-гликопротеина, применение генетически модифицированных векторов вирусов и липосомальных систем доставки и другие способы преодоления ГЭБ обсуждаются (Y. Xie et al., 2004; X. В. Zhang et al.,2005).

К одним из наиболее перспективных и физиологичных направлений облегчения транспорта ФРН через ГЭБ относится применение нанотранспортных систем, таких как полимерные наночастицы( R.G. Thome et al., 2001; Kreuter, J. ,2002; P. H. Аляутдин и др.,2003).

На кафедре фармакологии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. Сеченова разработана оригинальная комплексная лекарственная форма фактора роста нервов, сорбированного на полибутилцианакрилатных наночастицах (ПБЦА-НЧ), покрытых полисорбатом-80(ПС-80) , позволяющая увеличивать прохождение ФРН в мозг через ГЭБ и показавшую высокую эффективность при лечении экспериментального постгемморагического инсульта.

Актуальной задачей фармакологии является проведение сравнительных биофармацевтических исследований, устанавливающих зависимость эффективности ФРН от состава и строения наноформы, которые создают фундамент для последующих углубленных теоретических и прикладных изысканий в этой области. Цель исследования.

Целью данного исследования является оценка эффективности наносомальной формы фактора роста нервов при экспериментальной ишемии головного мозга, а также изучение возможности направленного транспорта ФРН в мозг при внутривенном введении с помощью ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80. Задачи исследования.

1. Получить экспериментальную наносомальную форму ФРН на основе ПБЦА-наночастиц, покрытых полисорбатом-80;

2. Изучить степень сорбции ФРН на поверхности ПБЦА-наночастиц с/без последующего покрытия их полисорбатом-80;

3. Провести определение наночастиц и концентрации ФРН в тканях мозга экспериментальных животных после системного введения наносомальной формы ФРН, на основе ПБЦА-наночастиц, без покрытия полисорбатом 80 и покрытых ПС-80.

4. Исследовать нейропротекторное действие наносомальной формы ФРН на основе ПБЦА-наночастиц, без покрытия полисорбатом 80 и покрытых ПС-80 на модели гемморагического инсульта.

Научная новизна.

Впервые проведены измерения концентрации ФРН в тканях мозга экспериментальных животных после внутривенного применения ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80.

Впервые показана эффективность наносомальной формы ФРН на основе ПБЦА - наночастиц при экспериментальном геморрагическом инсульте. Практическое значение работы.

Показана возможность доставки ФРН в мозг с помощью ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 при внутривенном введении.

Проведенные исследования и полученные результаты в дальнейшем могут служить основой для разработки инновационных лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний ЦНС, обусловленных нарушением кровообращения.

Работа внедрена в учебный процесс на кафедре фармакологии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Полученные в работе данные использовались при написании учебника «Общественное Здравоохранение», использующегося в Тегеранском Государственном медицинском Университете (Иран). Основные положения, выносимые на защиту.

1. ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, обеспечивают доставку ФРН в ЦНС при внутривенном введении;

2.Концентрация ФРН в тканях мозга экспериментальных животных при внутривенном введении ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, достоверно увеличивается по сравнению с данными группы интактных животных.

3.ФРН при нанотехнологический доставке в ЦНС обеспечивает протекторное действие при экспериментальном геморрагическом инсульте. Апробация материалов диссертации.

Основные материалы диссертации были доложены на:

-научно-практической конференции кафедры фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ,2010

- на 1-st Iran-Russia Joint Seminar&Workshop on Nanotechnology, 2005

- на Iran-India Workshop on Nanotechnology, 2006

Связь задач исследования с проблемным планом медицинских и фармацевтических наук.

Работа выполнена на кафедре фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И. М. Сеченова. Минздравсоцразвития РФ в соответствии с темой НИР: «Разработка экспериментальных и клинических методов оценки фармакологической активности лекарственных средств и их лекарственных форм как основа для получения новых знаний в подготовке провизоров». Публикации.

По теме диссертации написана 1 статья в периодическом издании, рекомендованном ВАК МО и науки РФ; 2 статьи в периодических

зарубежных журналах, 1 тезисы в Материалах Всероссийской научно-практической конференции.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 162 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 225 источников, из которых 214 в иностранных изданиях. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 29 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для синтеза полибутилцианоакрилатных наночастиц использовали бутилцианоакрилат - мономер (Sichel-Werke, Германия); декстран 70000 (Seca med 6000, "Henkel"); 0,1 М раствор соляной кислоты; 0,1 М раствор гидроокиси натрия; флуоресцеина изоцианат; 1% раствор глюкозы; магнитную мешалку; стеклянный фильтр (размер пор 10 мкм); вакуумную низкотемпературную сушку (Lyovac, GT 2, «Leybold AG", Германия). ПБЦА-наночастицы с использованием перечисленных реактивов и приборов готовили методом кислотной полимеризации с добавлением декстрана 70000 в качестве стабилизатора.

Оценку стабильности полученного лиофилизата ПБЦА определяли по размеру наночастиц после растворения 2 мл в бидистиллированной воде(5 мл) при комнатной температуре через 5 мин, 1ч, Зч, 5ч, 8ч, 24ч методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K) при рабочих параметрах : scattering angle 900, температура 250С, вязкость 0,01 пуаз., показатель преломления 1,333. Ресуспендируемость контролировали визуально, добавляя к лиофилизату примерно равный объем бидистиллированной воды: нормальный образец при добавлении воды образует гомогенную суспензию, коллоидный опалесцирующий раствор без осадка и видимых агломератов. Для оценки качества ПБЦА-наночастиц по форме и размерам использовали метод трансмиссионной электронной микроскопии (трансмиссионный электронный микроскоп HU-12 (Hitachi, Japan).

Для получения наносомальной формы ФРН использовали: официнальный физиологический раствор (0.9% раствор хлорида натрия) («Мосхимфарм»); полисорбат-80 («ЛАБТЕХ»); фактор роста нервов из слюнных желез мышей (7S) (CALBIOCHEM®, Германия); ПБЦА-наночастицы. Наноформу ФРН, содержащую 5 мкг ФРН в 0,2 мл, получали методом сорбции на поверхности ПБЦА-наночастиц.

Суспензию наночастиц с сорбированным ФРН, покрытых ПС-80 изготавливали, добавляя к 1.8 мл 1% суспензии ПБЦА-НЧ, содержащей 45 мкг ФРН (5 мкг ФРН в 0.2 мл суспензии) 1. 8 мкл 1% раствора ПС-80 и инкубируя 30 мин при той же температуре. В результате получали суспензию ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80,содержащую 5 мкг ФРН в 0.2 мл суспензии. Степень сорбции ФРН на поверхности наночастиц определяли по формуле как отношение количества ФРН, связанного с наночастицами, к общему количеству ФРН в лекарственной форме после разделения свободной и

связанной фракции методом ультрацентрифугирования (центрифуга BECKMAN MODEL L5, USA):

Степень „, Сисход-Ссвоб ,„„„,

сорбции % = -*

F С исход где С исход - исходная

концентрация ФРН в суспензии, С своб - концентрация ФРН в супернатанте.

Концентрацию ФРН в супернатанте определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Исследования выполнены с помощью набора реактивов для ИФА «Nerve Growth Factor Sandwich ELISA kit» (ChemiKine, США). Анализ осуществлялся по стандартному протоколу.

Изучение проникновения ПБЦА наночастиц через ГЭБ проводили с помощью морфологического исследования наночастиц в головном мозге с помощью стандартных методик флуоресцентной и электронной микроскопии.

Для увеличения контрастирования наночастич в качестве контрастирующего вещества использовали 1% водный уранилацетат.

К исходной суспензии наночастиц добавляли водный уранилацетат(1% раствор) в соотношении 1/3, тщательно перемешивали и выдерживали в холодильнике при температуре около 40С в течение 2-3 суток. Затем образцы несколько раз промывали физиологическим раствором путем центрифугирования при 14000 g при комнатной температуре. Отмытые от уранилацетата образцы наносили на предметные сетки, покрытые формваровой пленкой, и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе. Сравнение препаратов, представленных на рисунках 1 и 2, показывает резкое увеличение плотности наночастиц после их обработки водным уранилацетатом.

Рис. 1. Вид полибутилцианакрилатных частиц(ПБЦА-НЧ) без оттенения.

ЗР- "Щ^г

Рис. 2 . Уплотнение ПБЦА-НЧ после обработки водным

уранилацетатом(эффект оттенения).

Изучение возможности направленного транспорта ФРН через ГЭБ с помощью ПБЦА-наночастиц, покрытых ПС-80 проводили на нелинейных половозрелых мышах-самцах массой 18-22 г из расчета 25 мкг/кг массы животного в/в. Все животные проходили период предварительной адаптации к условиям лаборатории в течение одной недели до начала эксперимента. Животных содержали группами в пластиковых клетках по 10 мышей в каждой, при температуре в помещении 18-20 °С и влажности 50-60%. Животные имели свободный доступ к воде и пище. Для минимизации возможных сбоев циркадианных ритмов, и исключения хронофармакологических влияний введение лекарственных препаратов проводили в утренние часы. Количественное определение содержания фактора роста нервов в мозге проводили через 15, 45, 90 минут и через 24 часа после введения тестируемых веществ в гомогенатах-лизатах ткани головного мозга с помощью стандартного набора реактивов для иммуноферментного анализа «Nerve Growth Factor Sandwich ELISA kit» (ChemiKine, США) по стандартному протоколу.

Моделирование интрацеребральной посттравматической гематомы (ИПГ), геморрагического инсульта (ГИ) проводилось на крысах в области внутренней капсулы правого полушария согласно методике А.Н.Макаренко и соавторов (2002).

В исследовании были использованы половозрелые крысы- самцы линии Wistar массой 200-250 г, в начале эксперимента, содержащиеся в специальной экспериментальной комнате при свободном доступе к пище и воде и обычном световом режиме.

Для оценки нарушения поведения и состояния животных после

геморрагического инсульта и влияния наноформ ФРН на течение инсульта

были использованы сертифицированные методики, рекомендуемые

«Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых

фармакологических веществ, Москва, 2005, МЗ РФ».

Животные были разделены на следующие группы:

Контроль (интактные животные) - 10 крыс

Контроль (ложно оперированные крысы) - 10 крыс

Животные с геморрагическим инсультом - 10 крыс

Инсульт + ФРН (путь введения, доза разовая, суточная и т п,) - 10 крыс

Инсульт + ФРН+ПБЦА - 10 крыс Инсульт + ФРН+ПБЦА+ПС80 - 10 крыс

ФРН и его препараты вводились животным внутривенно из расчета 25 мкг/кг.

Регистрация поведения и состояния животных проводилась через: 1, 7 и 14 дней после операции по следующим показателям:

1. оценка неврологического статуса с использованием шкалы Мс Grow;

2. изучение координации движений и мышечного тонуса животных в тестах вращающегося стержня (установка фирмы Ugo Basile);

3. влияние препаратов на выживаемость крыс;

4. исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности крыс в установке открытое поле (фирма изготовитель «НПК Открытая наука», Россия)

5. оценка уровня тревожности на модели приподнятого крестообразного лабиринта (фирма изготовитель «НПК Открытая наука», Россия);

6. влияние веществ на выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) в установке фирмы "Lafayette Instrument Со" (США).

7. влияние веществ на динамику весов крыс с геморрагическим инсультом.

Статистическую обработку результатов проводили по программе "Biostatistics III" с использованием параметрических и непараметрических методов Стьюдента, Вилкоксона, Манна - Уитни, хи-квадрат, Крускала-Уолиса, ANOVA. и программы Sigma-plot for Windows. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение экспериментальной лекарственной формы и оценка ее качества.

Для оптимизации процесса получения и стандартизации ПБЦА-наночастиц нами были проведены опыты, в результате которых мы определили наиболее оптимальные условия синтеза. Экспериментально установлена оптимальная скорость перемешивания-500 об/мин. При таком режиме эмульсия мономера на первом этапе исчезала, с образованием суспензии; полимеризационный процесс происходил с минимальным вспениванием, а наночастицы, полученные при перемешивании полимеризационной среды с данной скоростью, были относительно однородны по размеру частиц.Для определения оптимальной концентрации и подходящего стабилизатора провели исследование, в котором наночастицы синтезировали с добавлением декстрана -10 и декстрана-70 в концентрациях 0,1%, 0,5%, 2,5%, 5%. В ходе исследования наблюдали, что добавление 0,1% раствора стабилизатора не приводило к уменьшению процесса коагуляции. Также отметили, что при использовании в качестве стабилизатора низко-молекулярного декстрана-10 в процессе синтеза образуются слишком крупные частицы, в какой бы концентрации стабилизатор не добавлялся. В случае, когда концентрация декстрана-70 составляла 5%, процесс полимеризации становился неэффективным, полимеризационная среда становилась очень вязкой, что затрудняло перемешивание среды в результате чего суспензия оказывалась

неоднородной. Оптимальным стабилизатором при синтезе ПБЦА-наночастиц, согласно нашим исследованиям, является декстран-70 в диапазоне концентраций от 0,5% до 2,5%, что позволяло получать на выходе уменьшение наночастиц.

Нами изучен еще один параметр, влияющий на процесс получения наночастиц - рН полимеризационной среды. Для определения оптимального уровня рН провели опыты, в ходе которых полимеризацию осуществляли в диапазоне рН 0.5; 2,0 и 5,0.

При рН < 1.0 полимеризация происходила очень медленно, а наночастицы, полученные в данных условиях имели большие размеры вследствие необратимого процесса коагуляции.

При рН полимеризционной среды равной 5.0, полимеризация происходила слишком быстро, что препятствовало формированию стабильного полимера, в результате наночастицы не формировались, процесс приводил к образованию агрегатов и аморфной полимерной массы. При рН равной 2.0 первичная эмульсия мономера исчезала в течение 30-60 мин. Полимер, полученный при указанных условиях, был стабильным, не образовывал агломератов, процесса коагуляции также не наблюдали, а наночастицы, образованные при рН 2.0 были однородны по размеру. Таким образом, нами экспериментально установлено, что оптимальный диапазон рН полимеризационной среды при синтезе ПБЦА-наночастиц, находится в пределах от 1.5 до 3.0. Схема синтеза ПБЦА-наночастиц представлена ниже(рис. 3)._

Водный раствор0.1 N ней 1% Декстран 70000

»-..с»

МО®. СЦ-С _

чсо,я

но-см -г®—. — —1 СО,В

Мономер 1% бутипиизнозкрилата

Г СМ | с» .

I со,я!. ср,„ I ¿<у, |п+1

прв«*»а4внивдшл.»«Аивгорост» потм«|»

СМ )

4 часа перемешивания при 500 об/тн Нейтрализация МзОН (рН 6-7) Фильтрация на стеклянном фильтре СЗ или С4 5% маннитол 1% глюкоза

Суепенэия наночастиц

Лиофипизацмя в течение 24-48 ч

Лиофипиэировэнные нзночастицы

Рис.3 Схема синтеза ПБЦА-наночастиц. 10

Как следует из схемы наночастицы были приготовлены методом кислотной полимеризации в среде, содержащей декстран 70000 (Seca med 6000, "Henkel") в качестве стабилизатора (декстран 70000 в 0,1 М растворе соляной кислоты). Бутилцианоакрилат ("Sichel-Werke", Германия) добавляли по каплям в раствор до получения 1% суспензии. Для равномерной полимеризации полученную композицию перемешивали с помощью магнитной мешалки при скорости 500 об/мин в течение 4 ч. Образовавшуюся суспензию нейтрализовали с помощью 0,1 М раствора гидроокиси натрия и фильтровали через стеклянный фильтр (размер пор 10 мкм) для удаления крупных агломератов. В ряде экспериментов в среду одновременно с мономером добавляли флуоресцеина изоцианат (FITC), который встраиваясь в полимерную матрицу служил ее флуоресцетным маркером. Для облегчения последующего ресуспендирования наночастиц добавляли 1% раствор глюкозы. Полученную суспензию лиофилизировали посредством вакуумной низкотемпературной сушки (Lyovac, GT 2, «Leybold AG", Германия). Контроль качества полученных ПБЦА -наночастиц по показателям стабильности, ресуспендируемости, размера наночастич, показал сохранение исходных размеров 190-300 нм наночастиц даже после ресуспендирования на протяжении 24 часов.

Изучение абсорбции полисорбата-80 на поверхности ПБЦА-наночастиц с помощью электронномикроскопического анализа образцов выявило, что на поверхности наночастиц, обработанных полисорбатом-80, формируется слой тонковолокнистого материала, особенно четко видимый в зонах контакта частиц (Рис. 4).

Рис.4 Абсорбция полисорбата 80 на поверхности ПБЦА-наночастиц

ИЗУЧЕНИЕ_НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО_ДЕЙСТВИЯ

НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ФРН

Морфологическое исследование наночастиц_в головном мозге

экспериментальных животных

Методы флуоресцентной и электронной микроскопии позволили выявить изменение свойств наночастиц, при сорбции на их поверхности полисорбата-80. Так, флуоресцентные наночастицы без покрытия полисорбатом-80 через 45 мин после введения располагаются свободно в просвете сосуда, чаще находясь в центре просвета. Наночастицы, покрытые полисорбатом-80, обнаружены в контакте с сосудистой стенкой, что указывает на их возможное взаимодействие с эндотелием сосудов головного мозга. Выраженная флуоресценция была отмечена в телах клеток Пуркинье мозжечка . При этом для наночастиц, не покрытых полисорбатом-80, флуоресценция в нейронах головного мозга не характерна. Полученные данные позволяют предположить, что наночастицы с измененной полисорбатом-80 поверхностью, подвергаются эндоцитозу эндотелием сосудов головного мозга в неизмененном виде. Изучение неврологического статуса крыс с ИПГ.

По шкале Stroke-index Мс Grow установлено, что в группе ложнооперированных крыс после введения физиологического раствора в объеме 0,5 мл в/в количество животных с легкими неврологическими нарушениями (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор) составляло 10 процентов на 1 и 7 сутки после операции и эти нарушения полностью проходили на 14 сутки.(табл.1). Экспериментальный геморрагический инсульт значительно увеличивал неврологические нарушения на 1-е, 7-е и 14 сутки после начала эксперимента, резко увеличив количество легких неврологических нарушений до 77%; 71,4% и 75 % соответственно.

Образцы, содержащие ФРН и ФРН+ПБЦА, оказывали определенное терапевтическое влияние на легкие неврологические нарушения у крыс с ГИ. Вместе с тем, образец ФРН+ПБЦА+ПС80 оказывал наиболее выраженное из всех наноформ ФРН протекторное действие на легкую неврологическую симптоматику, как в острую фазу развития инсульта на 1 сутки, так и на его отдаленные последствия на 14-е сутки, уменьшая количество крыс с неврологическими нарушениями соответственно до 40% и 28,6% (табл.1).

Тяжелые неврологические нарушения (парезы, манежные движения, параличи) у ложнооперированных животных не наблюдались. Экспериментальный геморрагический инсульт значительно увеличивал процент грубых неврологических нарушении на 1-е, 7-е и 14 сутки после начала эксперимента соответственно до 77%; 71,4% и 75 % . Сравнительное изучение протекторного действия ФРН, ПБЦА-НЧ и ПБЦА-НЧ+ПС-80 при экспериментальном геморрагическом инсульте выявило, что препарат ПБЦА-НЧ+ПС-80 наиболее активно снижал тяжелые неврологические нарушения. Особенно отчетливо разность в эффективности препаратов проявлялась на 14 сутки, при этом тяжесть грубых неврологических

расстройств с помощью ПБЦА-НЧ+ПС-80 удавалось снизить с 50 процентов в контроле до 14,3% в опыте. ПБЦА-НЧ не оказывал защитного действия в этот период и даже проявлял тенденцию к ухудшению тяжелой неврологической симптоматики (табл.1).

Таблица 1.

Итоговые результаты оценки влияния препаратов ФРН, ФРН+ПБЦА-НЧ, ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС-80 на неврологический статус крыс по шкале Мс Grow.

Группа Количество животных с легкими нарушениями

Время после операции, сутки

1-е сутки 7-е сутки 14-е сутки

абсолютный показатель Относительный показа-тель% абсолютный показатель Относительный показать пь% абсолютный показатель Относительный показа- тепь%

ЛО 1/10 10 1/10 10 0/10 0

ГИ 7/9 77,8 5/7 71,4 У* 75

ФРН 6/9 66,7 4/8 50 4/6 66,7

ФРН+ПБЦА 6/10 60 3/7 42,9 2/5 40

ФРН+ПБЦА+ ПС80 4/10 40 4/9 44 2/7 28,6

Количество животных с тяжелыми нарушениями, %

ЛО 0/10 0 0/10 0 0/10 0

ГИ 4/9 44,4 2/7 28,5 2/4 50

ФРН 3/9 55,5 3/8 37,5 2/6 33,3

ФРН+ПБЦА 2/10 20 1/7 14,3 3/5 60

ФРН+ПБЦА+ ПС80 1/10 10 2/9 22 1/7 14,3

Таким образом, образец ФРН+ПБЦА+ПС80 оказывал наиболее выраженный защитный эффект при регистрации неврологических дефицитов у крыс после геморрагического инсульта, уменьшая количество животных как с легкими, так и с тяжелыми нарушениями.

Изучение влияния препаратов ФРН на координацию движений крыс с геморрагическим инсультом.

Определение координации движений на вращающемся стержне через 24 часа после моделирования геморрагического инсульта показало статистически достоверное (Р<0,05) увеличение в 2,76 раза числа падений животных с вращающегося стержня на модели геморрагического инсульта(ГИ) по сравнению с ложнооперированными животными (ДО) (табл.2). Через 7 и 14 суток нарушения координации в группе с инсультом еще более увеличивались в 3,97 и 3,6 раз соответственно. Применение

препаратов ФРН, ФРН+ПБЦА-НЧ, ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС-80 через 24 часа после экпериментального инсульта достоверно (Р<0,05) уменьшало падение животных со стержня соответственно в 1,71; 1,76 и 2,92. Таким образом, препарат ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС-80 значительно превосходил по эффективности ФРН и ФРН+ПБЦА-НЧ в этот промежуток времени. На 7-е и 14-е сутки активность ФРН, ФРН+ПБЦА-НЧ исчезала (Р>0,05). Напротив, эффективность препарата ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС-80 нарастала в эти интервалы времени, достоверно уменьшая (Р<0,05) нарушения координации движений в 4,78 и 10,9 соответственно (Табл.2). Таким образом, препарат ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС-80 проявляет отчетливое нарастающее со временем защитное действие на нарушения координации движений, вызванные ГИ, в то время как препараты ФРН, ФРН+ПБЦА-НЧ обладают слабой активностью, полностью исчезающей по мере продолжения эксперимента.

Таблица 2.

Влияние препаратов ФРН, ФРН+ПБЦА-НЧ, ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС-80 на координацию движений крыс по тесту вращающегося стержня на

Группа животных Число падений за 2 минуты

24 часа 7 суток 14 суток

ЛО 2,04 ±0,81 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

ГИ 5,64 ± 0,73" 3,97 ± 1,30# 3,60 ± 1,92#

ФРН 3,30± 1,31* 2,86 ± 1,97 3,02 ±2,15

ФРН+ПБЦА-НЧ 3,21 ± 1,11* 2,83 ± 0,82 1,91 ±0,75

ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС80 1,93 ±1,23* 0,83 ± 0,54* 0,33 ± 0,20*

# достоверность отличий группы ГИ от группы ложнооперированных животных (ЛО)( Р<0,05).

* достоверность отличий групп, получавших препараты ФРН от группы крыс с геморрагическим инсультом (ГИ)(Р<0,05).

Влияние препаратов ФРН на динамику выживания крыс с интрацеребрапьной посттравматической гематомой (ИПГ).

Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар, массой 200-250 г. Все животные были разбиты на группы по 10 крыс в каждой. В первой группе были ложнооперированные животные , во второй — животные с ГИ, в третьей -животные получавшие ФРН , в четвертой-ФРН+ПБЦА-НЧ , в пятой - ФРН+ПБЦА-НЧ+ПС80. Животным третьей, четвертой и пятой групп вводили ФРН и его наноформы повторно на 1-е, 7-е и 14 сутки после вызывания экспериментального геморрагического инсульта. Гибель крыс от ГИ регистрировали на протяжении всего времени наблюдения в течение 14 дней.

Установлено, что к 14-му дню наблюдения все ложнооперированные крысы выжили, а в группе крыс с ГИ выжило только 42% животных. На

фоне повторного 3-х дневного введения образца ФРН+ПБЦА+ПС80 к концу эксперимента выжило 67% крыс, что на 22% больше, чем в контрольной группе с ГИ. Это свидетельствует о протекторном действии препарата ФРН, покрытого полисорбатом 80. Сходным, но чуть менее выраженным действием обладал препарат ФРН+ПБЦА-НЧ, на его фоне к 14-м суткам выжило 64% крыс. Препарат ФРН практически не влиял на выживаемость крыс с ГИ. Таким образом, наиболее эффективным средством, предупреждающим гибель крыс, был образец ФРН+ПБЦА+ПС80. По степени выраженности протекторного действия препараты располагались в порядке убывания эффекта в следующем порядке: ФРН+ПБЦА+ПС80 > ФРН+ПБЦА-НЧ > ФРН. Исследование влияния ФРН и его нанопрепаратов на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность животных с ИПГ по методике «открытого поля».

Изучение влияния ФРН и его нанопрепаратов на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность проводилось на 50 крысах-самцах линии Вистар на 1-е, 7-е и 14-е сутки после ГИ. Установлено, что у крыс с ГИ в сравнении с ложнооперированными животными в первый день после операции наблюдается статистически достоверное снижение всех показателей поведения в открытом поле: горизонтальной и вертикальной активности, числа обследований отверстий и, особенно, снижение суммарных показателей двигательной активности (табл.3) . На 14-е сутки наблюдения у ложнооперированных крыс наблюдалась естественная для этого теста адаптация к условиям эксперимента, так называемое негативное обучение и регистрировалось снижение ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности по сравнению с первой посадкой (1-е сутки). Иные закономерности наблюдались в группе крыс с ГИ: снижение всех показателей активности в первый день регистрации, значительная активация на 7-е сутки и нормализация поведения в открытом поле к 14-м суткам наблюдения (табл.3). Образец ФРН+ПБЦА+ПС80 уже на 1-е сутки нормализовал поведение крыс с ГИ, увеличивая все показатели поведения до уровня величин ложнооперированных животных (табл.3). Протекторная активность препарата сохранялась и в последующем. Так на 14 сутки от начала эксперимента препарат повышал как исследовательскую активность по показателю обследования отверстий, так и двигательную активность, увеличивая ее в 1,8 раза по сравнению с суммарной активностью животных с ГИ.

Препараты ФРН и ПБЦА-НЧ не оказывали существенного влияния на поведение крыс с ГИ в открытом поле на протяжении всего времени наблюдения.

Таким образом, в отличие от образцов ФРН и ПБЦА-НЧ образец ФРН+ПБЦА+ПС80 обладал способностью оптимизировать поведение крыс с ГИ в условиях методики открытого поля.

Таблица 3.

Влияние препаратов ФРН на поведение крыс по методике «открытого поля» на модели ГИ.

Группа животных Горизонтальная двигательная активность Вертикаль пая двигательная активность Обследование отверстий Груминг Кол-во болюсов Суммарная двигательная активность:гори-зонтальная. + вертикальная

1-е сутки

ЛО 29,31 ± 4,13 10,87 к 2,09 7,96 ± 2,02 0,43 ± 0,15 1,22 ± 0,10 40,18 ±5,43

ГИ 10,94 ± 7,55" 2,54± 1,03" 2,11 ± 0,54* 3,32 ± 0,87# 0,56 ± 0,27# 13,48 ± 6,08 к

ФРН 15,50 ± 3,58 2,79 ± 1,11 3,43 ± 1,48 2,31 ± 0,41 0,85 ± 0,26 19,08± 4,13

ФРН+ ПБЦА 16,31 1:6,32 5,64 ± 2,77* 3,75 ± 1,63 1,75 ± 0,96 0,24 ± 0,10 21,95 ±4,88

ФРН+ ПБЦА +ПС80 30,55 ± 4,82* 8,31 ± 0,92* 6,33 ± 1,12* 0,92 ± 0,27* 0,87 ± 0,33 38,86 ± 5,16*

7-е сутки

ЛО 25,31 ± 2,64 1,73 к 1,04 2,35 ± 0,68 0,00 ± 0,00 0,77 ± 0,55 27,04 ±4,51

ГИ 22,73 ± 4,55 1,53 к 0,45 4,66 ± 1,74# 2,30 ± 1,02# 0,00 ± 0,00# 24,26 ±3,79

ФРН 24,54 ± 5,83 2,56 ± 0,96 3,70 ± 0,55 0,65 ± 0,18 0,51 ± 0,40* 27,10 ±6,64

ФРН+ ПБЦА 26,77 ± 3,92 3,02 к 0,95 3,58 ± 0,96 1,74 ± 0,60 0,81 ± 0,14* 29,79 ± 3,85

ФРН+ ПБЦА +ПС80 27,37 ± 8,21 2,64 £ 1,31 7,56 ± 1,95 0,15 ± 0,10* 0,34 ± 0,22* 30,01 ± 6,25

14-е сутки

ЛО 11,32 ± 4,45 ),82 ь ),22 5,33 ± 0 »,30 0 ,00 ± 0 ,00 0 ,00 ± ,00 2,14 ±2,98

ГИ 17,11 ± 3,98# >,04 ,40# >,71 ± ,04# 0 ,70 ± 0 ,90# 0 ,60 ± ,45# 1,09 ± 4,15#

ФРН 16,75 ± 9,05 1,31 к 0,75 2,10 ± 0,89 0,25 ± 0,15* 1,04 ± 0,37 18,06 ±8,93

ФРН+ ПБЦА 19,69 ± 5,30* 2,73 £ 1,17 3,07 ± 1,48 1,19 ± 0,65 0,91± 0,15 22,42 ±4,54

ФРН+ПБЦ А+ПС80 31,65 ± 5,17* 7,33 ± 1,05* 7,40 ^ 2,94* 0,00 ± 0,00* 2,50 ± 1,63 38,98 ±6,21*

¿/-достоверность отличий от группы ЛС)(Р<0,05);

* достоверность отличий групп, получавших препараты ФРН от группы с ГИ (Р<0,05).

Влияние ФРН и его нанопрепаратов на обучение и память крыс с ГИ на модели условной реакции пассивного избегания(УРПИ).

Обучение животных УРПИ проводили через сутки после операции, а воспроизведение - через 6 часов, 7 и 14 суток после обучения. Изучение влияния веществ на обучение УРПИ показало, что животные во всех пяти группах обучились условному рефлексу, т к. при его воспроизведении через 6 часов после обучения 100% животных помнили об ударе током в темной камере и не заходили туда в течение всего времени наблюдения (табл.4) При воспроизведении УРПИ через 7 дней после обучения в группе ложнооперированных животных все 100% крыс помнили о ситуации и не заходили в темную камеру, где получили обучающий удар током, а в контрольной группе крыс с ГИ только 50% животных осуществляли рефлекс пассивного избегания. Сходные результаты были получены на 14-е сутки: в группе ложнооперированных животных 100% крыс осуществляли рефлекс и только 35% - в группе животных с ГИ . Полученные результаты свидетельствуют о развитии у крыс с ГИ нарушений памяти.

Препарат ФРН оказывал наиболее слабое влияние из всех изученных препаратов, а на 7-е сутки он практически не обладал защитным эффектом. Препарат ПБЦА-НЧ превосходил его по активности на 7-й и 14-й день на 18% и 2% соответственно. Наиболее отчетливое протекторное действие на память оказывал препарат ФРН+ПБЦА+ПС80 на протяжении всего срока эксперимента. Он значительно превосходил по активности другие препараты, увеличивая реакцию избегания на 7-е сутки после инсульта до 70%, а на 1-е и 14-е сутки он полностью на 100% устранял посттравматическую амнезию (табл. 4).

Таким образом, препарат ФРН+ПБЦА+ПС80 на модели УРПИ обладал наибольшей активностью по устранению амнезии, вызванной у крыс геморрагическим инсультом в сравнении со другими исследованными препаратами фактора роста нервов.

Таблица 4.

Изучение влияния препаратов ФРН на обучение и воспроизведение рефлексов методом УРПИ крыс на модели геморрагического инсульта(ГИ). __

Группа животных Обучение Воспроизведение ре< текса

Латентное время рефлекса(мин.) Латентное время рефлекса(мин.) Количество крыс не зашедших в темную камеру, %

1-е сутки

ЛО 23,81 ±15,10 180,00 ± 0,00 100

ГИ 84,89 ± 17,33# 180,00 ±0,00 100

ФРН 76,20 ± 24,75 180,00 ±0,00 100

ФРН+ПБЦА-НЧ 71,35 ±20,04 180,00 ±0,00 100

ФРН+ПБЦА+ ПС80 21,00 ±14,80* 180,00 ± 0,00 100

7-е сутки

ЛО 180,00 ±0,00 100

ГИ 127,63 ± 14,19* 57#

ФРН 145,70 ±22,34 57

ФРН+ПБЦА-НЧ 176,50 ±23,50 75

ФРН+ПБЦА +ПС80 180,00 ±0,00* 100*

14-е сутки

ЛО 180,00 ±0,00 100

ГИ 94,00 ± 25,45 35*

ФРН 165,00 ±30,88 55

ФРН+ПБЦА-НЧ 120,55 ±30,50 57

ФРН+ПБЦА+ ПС80 180,00 ±0,00* 100*

# -достоверность отличий группы ложнооперированных животных(ЛО) от группы животных с геморрагическим инсультом (ГИ) (Р<0,05);

* - достоверность отличий групп, получавших препараты ФРН от группы с ГИ (Р<0,05).

Количественное определение ФРН в тканях мозга экспериментальных животных.

Исследование проведено на 96 белых беспородных мышах-самцах,которых разделили на 6 групп (по 16 животных в каждой).

Животным внутривенно вводили следующие лекарственные формы: Группа 1 - 0.9% раствор натрия хлорида (0,2 мл)

Группа 2-1% суспензия ПБЦА-НЧ (0,2 мл)

Группа 3 - раствор ФРН (5 мкг/животное в 0, 2 мл)

Группа 4 - раствор ФРН (5мкг/животное) в сочетании с 1% раствором

ПС-80

Группа 5 - ФРН (5 мкг/животное), сорбированный на ПБЦА-НЧ Группа 6 - ФРН (5 мкг/животное), сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80.

Полученные результаты приведены на рис. 5.

При измерении концентрации ФРН в тканях мозга экспериментальных животных, взятых на 15 минуте после введения тестируемых веществ и комбинаций, статистически достоверной разницы между показателями различных групп не наблюдали. В результате измерения концентрации ФРН в образцах тканей мозга экспериментальных животных, взятых на 45 минуте после введения тестируемых веществ и комбинаций, отметили статистически достоверное увеличение уровня ФРН в ЦНС мышей, получавших ФРН, сорбированный на ПБЦА-наночастицах, покрытых ПС-80, в сравнении с группой контроля (группа животных, получавших 0,9% раствор натрия хлорида) . В группе 2 (ПБЦА-наночастицы) увеличения эндогенной концентрации ФРН по сравнению с группой 1 не наблюдали. В группе 3 животных, получавших водный раствор ФРН, отмечалось наименьшее из всех опытных групп увеличение ФРН в ЦНС. На 45 мин в группах 4 (ФРН-ПС80) и 5 (ФРН-НЧ) отметили устойчивую тенденцию к росту уровня ФРН в тканях мозга мышей, которое было статистически значимо. Вместе с тем, наибольшую концентрацию ФРН в тканях мозга из всех исследованных образцов ФРН создавала комбинация ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80. При этом содержание фактора роста нервов в 6-й группе по сравнению с контролем достоверно (Р<0,05) увеличилось в 6,8 раза. Сходные закономерности от введения препаратов ФРН, как и на 45 минуте отмечались в изменениях концентрации ФРН в образцах тканей мозга, взятых на 90 минуте. При измерении концентрации ФРН в гомогенатах мозга, полученных через 24 часа после введения тестируемых веществ и комбинаций, показатели опытных 2-5 групп животных достоверно не отличались от контрольной. Исключение составлял препарат, ФРН сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 из группы 6, который статистически значимо(Р<0,05) увеличивал содержание ФРН в 1,7 раза.

Таким образом, установлено, что комбинированный препарат состоящий из ФРН , сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 способствует самой эффективной доставке ФРН в мозг по сравнению с другими исследованными препаратами ФРН на всем протяжении эксперимента. Способность повышать содержание ФРН у препаратов (2-5 группы) сравнительно низка по отношению к препарату ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80(группа 6), а через 24 часа она исчезала у них полностью. В это же самое время(на 24-й час)

только препарат ФРН на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 из группы 6, был способен статистически значимо(Р<0,05) увеличивать содержание ФРН в 1,7 раза.

Влияние препаратов ФРН и его комбинации с ПБЦА-НЧ и ПС 80 на концентрацию ФРН в мозге

мышей

Интервалы времени

Рис.5 Влияние препаратов ФРН и его комбинации с ПБЦА-НЧ на концентрацию ФРН в мозге у мышей.

Выводы:

1 .Экспериментальные наносомальные формы фактора роста нервов для парентерального введения, стабильны после ресуспендирования и при хранении в лиофилизированном виде.

2. Фактор роста нервов практически полностью (95%) сорбируется из раствора на поверхности полибутилцианакрилатных наночастиц( ПБЦА-НЧ). Полисобат 80(ПС-80) не влияет на степень сорбции ФРН.

3. Полибутилцианоакрилатные наночастицы, покрытые полисорбатом-80, обеспечивают доставку сорбированного на них ФРН через гемато-энцефалический барьер.

4. Фактор роста нервов, сорбированный на наночастицах, покрытых полисорбатом 80, обладает выраженным нейропротективным эффектом на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой по всем использовавшимся тестам. Образец фактора роста нервов, сорбированного на наночастицах (ПБЦА-НЧ), уступает по активности препарату, покрытому полисорбатом, а ФРН практически не влияет на комплекс нарушений поведения, памяти и

неврологических дефицитов развивающихся у крыс после геморрагического инсульта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты позволяют рекомендовать продолжить теоретические и практические изыскания в области получения новых лекарственных форм фактора роста нервов на основе ПБЦА-НЧ, покрытых другими видами полисорбатов; введение в лекарственную форму других наполнителей и стабилизаторов и т.п. для повышения эффективности новых нанопрепаратов.

Рекомендуется продолжить доклинические и клинические испытания для последующего внедрения препарата в качестве средства для лечения последствий геморрагического инсульта. Рекомендуется применять материалы исследования в учебном процессе на кафедрах фармакологии и биотехнологии фармацевтических и медицинских ВУЗов.

Рекомендуется применять учебник «Общественного Здравоохранения», содержащий материалы работы Хосравани Масуда , для студентов Иранских медицинских Университетов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Джинджихашвили И.А, Курахмаева К.Б., Хосравани М, Попова О.П., Балабаньян В.Ю., Петров В.Е., Аляутдин Р.Н. Возможность доставки фактора роста нервов в мозг в эксперименте in vivo.// Фармация,- 2008.-№5.-с. 51-53.

2.Хосравани М. Оценка нейропротективного действия фактора роста нервов при экспериментальном геморрагическом инсульте// Материалы Всероссийская научно-практическая конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии»-Санкт-Петербург, 23-26 ноября 2010- с.2

3. Khosravani Masood. Nanoparticulates as Drug Carriers.// Journal of Nanotechnology(Tehran), No 130,- 2008,- p.277-283.

4. Khosravani Masood. Drug delivery to the brain by nanoparticles-Trojan Horse of modern neuropharmacology// Journal of Nanotechnology-Tehran-No7.- 2009,- p.28-31.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГИ- геморрагический инсульт

ИПГ- интрацеребральная посттравматическая гематома

ЛО- ложнооперированные животные

ГЭБ- гемотоэнцефалический барьер

ФРН-фактор роста нервов

ПС-80- полисорбат 80

НЧ-наночастицы

ПБЦА- полибутилцианакрилат

ПБЦА-НЧ - наночастицы полибутилцианакрилата

ФРН + ПБЦА-НЧ - фактор роста нервов, сорбированный

наночастицах полибутилцианакрилата

ФРН + ПБЦА-НЧ + ПС 80- фактор роста нервов, сорбированный наночастицах полибутилцианакрилата, покрытых полисорбатом-80. УРПИ-_условная реакция пассивного избегания

Заказ№ 139-А/11/2010 Подписано в печать 16.11.2010 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Актуальность темы

Коррекция и терапия различных патологий центральной нервной системы (ЦНС) актуальной задачей современной фармакологии. Однако, многие потенциально активные лекарственные средства(соединения петпидной природы, фактор роста нервов, четвертичные биогенные амины и др. ) не проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и, следовательно, не могут использоваться в клинике с целью лечения заболеваний ЦНС [64, 78, 89, 120,132,134, 148].

Для направленной доставки лекарственных веществ в мозг было предложено несколько способов, среди которых осмотическое открывание ГЭБ, подавление функций Р-гликопротеина, внутримозговое и интраназальное введения, использование генетически модифицированных вирусных векторов и магнитовоосприимчивых систем доставки и липосомальных форм лекарств [8, 9, 15, 19, 21, 22, 67, 74, 80, 87, 149, 150, 151, 154,158,181]. Весьма перспективным для решения поставленной задачи является применение нанотранспортных систем, а именно полимерных наночастиц [15, 17, 56, 57, 82, 106, 108, 138]. Субмикронные размеры наночастиц предоставляют возможность преодоления физиологических барьеров и достижения ими различных тканей с последующим результативным клеточным захватом [118, 127, 141]. Кроме того, включение лекарственного вещества в нанотранспортную систему позволяет модифицировать и контролировать характеристики их высвобождения. Известно, что покрытие наночастиц полисорбатом-80 способствует их проникновению через ГЭБ, что позволяет доставить частицы в мозг [32, 110, 114].

Способность полимерных частиц, покрытых полисорбатом-80, доставлять лекарственные вещества в мозг, показана на примере таких препаратов, как даларгин, аналогов энкефалинов (пептидов) [11, 27, 104], тубокурарин и прозерин (полярные соединения) [10, 13, 18], лоперамид и доксорубицин (субстраты для Р-гликопротеина) [12, 87].

В последнее время все большее внимание уделяется нейротрофическим факторам [61, 84]. Нейротрофины - факторы роста нервной ткани, семейства белков, относящиееся к классу цитокинов. Наиболее изученным нейротрофином является фактор роста нервов (ФРН) [120]. ФРН регулирует выживаемость симпатических и чувствительных нейронов периферической нервной системы, а также холинергических нейронов ЦНС [75, 129, 139]. Кроме того, ФРН влияет на выделение медиаторов (ацетилхолина, глутамата и др.) в нервно-мышечных синапсах и синаптосомах гиппокампа [167,170].

Потеря холинергических нейронов является одной из наиболее весомых причин развития нейродегенеративных заболеваний. Учитывая это, весьма перспективным является применение ФРН для терапии ряда патологий ЦНС [16, 66]. Существенным моментом, ограничивающим применение ФРН в клинике, является его низкая способность проникать через ГЭБ ввиду гидрофильности и высокой молекулярной массы [61].

Для преодоления этого препятствия использовали такие способы, как интраназальное введение и введение ФРН в желудочки мозга, использование генотерапии, липосомальных систем доставки, а также введение конъюгированных форм ФРН [67, 80, 85, 126, 169, 181]. Не все из предложенных подходов обеспечивают транспорт ФРН в ЦНС, кроме того, некоторые из них имеют ряд существенных недостатков, таких как инвазивность, риск развития кровотечений и образования гематом, риск развития опухоли (при трансплантации генетически модифицированных клеток), возможность развития хронического болевого синдрома, необходимость присутствия медицинского персонала и. т. д. [67, 85, 169, 181].

Исходя из данных современной литературы, можно заключить, что на сегодняшний день нет приемлемого способа направленного транспорта ФРН через ГЭБ, пригодного для использования в клинической практике [61, 85].

Цель и задачи планируемого исследования

Цель исследования

Целью данного исследования является оценка эффективности наносомальной формы фактора роста нервов при экспериментальной ишемии головного мозга, а также изучение возможности направленного транспорта ФРН в мозг при внутривенном введении с помощью ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80.

Задачи исследования

1. Получить экспериментальную наносомальную форму ФРН на основе ПБЦА-наночастиц, покрытых полисорбатом-80;

2. Изучить степень сорбции ФРН на поверхности ПБЦА-наночастиц с/без последующего покрытия их полисорбатом-80;

3. Провести определение наночастиц и концентрации ФРН в тканях мозга экспериментальных животных после системного введения наносомальной формы ФРН, на основе ПБЦА-наночастиц, без покрытия полисорбатом 80 и покрытых ПС-80.

4. Исследовать нейропротекторное действие наносомальной формы ФРН на основе ПБЦА-наночастиц, без покрытия полисорбатом 80 и покрытых ПС-80 на модели гемморагического инсульта.

Научная новизна

Впервые проведены измерения концентрации ФРН в тканях мозга экспериментальных животных после внутривенного применения ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80.

Впервые показана эффективность наносомальной формы ФРН на основе ПБЦА - наночастиц при экспериментальном геморрагическом инсульте.

Практическое значение работы

Показана возможность доставки ФРН в мозг с помощью ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 при внутривенном введении.

Проведенные исследования и полученные результаты в дальнейшем могут служить основой для разработки инновационных лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний ЦНС, обусловленных нарушением кровообращения.

Работа внедрена в учебный процесс на кафедре фармакологии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Полученные в работе данные использовались при написании учебника «Общественное Здравоохраненине», использующегося в Тегеранском Государственном медицинском Университете (Иран).

Основные положения, выносимые на защиту

1. ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, обеспечивают доставку ФРН в ЦНС при внутривенном введении;

2.Концентрация ФРН в тканях мозга экспериментальных животных при внутривенном введении ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, достоверно увеличивается по сравнению с данными группы интактных животных.

3.ФРН при нанотехнологический доставке в ЦНС обеспечивает протекторное действие при экспериментальном геморрагическом инсульте.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 162 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 225 источников, из которых 214 в иностранных изданиях. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 29 рисунками.

Апробация материалов диссертации

Основные материалы диссертации были доложены на: -научно-практической конференции кафедры фармакологии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ,2010

- на 1-st Iran-Russia Joint Seminar & Workshop on Nano technology, 2005

- на Iran-India Workshop on Nanotechnology, 2006

Выводы

1.Экспериментальные наносомальные формы фактора роста нервов для парентерального введения, стабильны после ресуспендирования и при хранении в лиофилизированном виде.

2. Фактор роста нервов практически полностью (95%) сорбируется из раствора на поверхности полибутилцианакрилатных наночастиц( ПБЦА-НЧ). Полисобат 80(ПС-80) не влияет на степень сорбции ФРН.

3. Полибутилцианоакрилатные наночастицы, покрытые полисорбатом- 80, обеспечивают доставку сорбированного на них ФРН через гемато-энцефалический барьер.

4. Фактор роста нервов, сорбированный на наночастицах, покрытых полисорбатом 80, обладает выраженным нейропротективным эффектом на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой по всем использовавшимся тестам. Образец фактора роста нервов, сорбированного на наночастицах (ПБЦА-НЧ), уступает по активности препарату, покрытому полисорбатом, а ФРН практически не влияет на комплекс нарушений поведения, памяти и неврологических дефицитов развивающихся у крыс после геморрагического инсульта.

Заключение

Одним из наиболее перспективных решений такой глобальной проблемы, как направленный транспорт лекарственных веществ является использование нанотранспортных систем, а именно полимерных наночастиц. Изобилие высоко оптимизированных методов для производства и оценки качества, разнообразие форм и модификаций, доступность полимеров привели к чрезвычайному росту интереса ученых к наночастицам.

Полимерные коллоидные частицы обеспечивают направленный транспорт лекарств, а также способствуют их прохождению через физиологические барьеры, в том числе и ГЭБ. Способность ПБЦА-наночастиц, покрытых ПС-80, доставлять лекарства в мозг ранее была показана на примере как полярных, так и липофильных соединений -субстратов Р-гликопротеина. Исходя из этого, нами было предложено использовать ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80, для доставки ФРН в ЦНС.

Известно, что ФРН потенциально предотвращает гибель центральных холинергических нейронов, которая лежит в основе патогенезе ряда заболеваний ЦНС. Клиническое применение столь перспективного соединения ограничено его весьма умеренным проникновением через ГЭБ.

129

Таким образом, среди изученных образцов наиболее сильным нейропротективным эффектом на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой обладает ФРН+ПБЦА+ПС80 . ФРН+ПБЦА уступает первому по активности, а ФРН практически не влияет на комплекс нарушений поведения, памяти и неврологических дефицитов развивающихся у крыс после геморрагического инсульта.

Следует отметить, что для расширения представлений об особенностях нейропротективной активности каждого из изученных образцов целесообразно провести дополнительные исследования, используя другие дозы и другие схемы введения веществ животным. Вместе с тем, полученные результаты позволяют сделать заключение о в разной степени выраженном как количественно, так и качественно, нейропротективном эффекте исследуемых веществ.

В проведенных нами исследованиях была показана возможность доставки ФРН в мозг с помощью ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80. Как при внутривенном, так и интраназальном введении предполагаемой лекарственной формы отмечено значительное и достоверное увеличение показателей ЛП, что соответствует проявлению антиамнестического действия ФРН, связанного с его центральными эффектами.

При морфологическом изучении тканей мозга экспериментальных животных после введения наночастиц, ПБЦА-наночастицы, покрытые ПС-80, обнаруживались в телах эндотелиоцитов, что свидетельствует о возможности их проникновения через ГЭБ путем трансцитоза.

Способность ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, обеспечивать транспорт ФРН через ГЭБ подтвердили при измерении концентрации ФРН в тканях мозга экспериментальных животных после системного применения наносомальной формы ФРН. В ходе проведенного исследования максимальный уровень ФРН отмечен при применении ФРН-НЧ-ПС как при внутривенном, так и интраназальном введении. Эти результаты сопоставимы с данными, полученными в экспериментальной модели острой амнезии.

Из полученных в ходе выполнения данной работы результатов можно сделать следующее заключение. ПБЦА-наночастицы, покрытые ПС-80, обеспечивают доставку ФРН в ЦНС и тем самым представляются перспективным средством направленного транспорта нейротрофических факторов.

Для транспорта лекарственных веществ через ГЭБ могут быть использованы различные виды транспортных систем, позволяющие либо действовать через эндогенные механизмы (транспорт глюкозы, аминокислот, трансцитоз, рецептор - зависимый эндоцитоз), либо модифицировать проницаемость ГЭБ. Разнообразие возможностей транспорта веществ в мозг не означает решения проблемы, так как многие методы недостаточно изучены, многие из существующих методов нефизиологичны, что лимитирует их использование. Создание новых и модификация имеющихся носителей, усовершенствование существующих методов доставки лекарств в мозг создаёт предпосылки для доставки в ЦНС ряда потенциально эффективных лекарственных веществ и биологически активных соединений.