Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение эффектов феназепама на поли(бутил)цианоакрилатных наночастицах

На правах рукописи

Разживина Виктория Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТОВ ФЕНАЗЕПАМА НА ПОЛИ(БУТИЛ)ЦИАНОАКРИЛАТНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ

14.00.25. - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003460439

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова Российской академии медицинских наук и ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Росздрава

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Татьяна Александровна Воронина Ренад Николаевич Аляутдин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук

Владимир Павлович Жердев Галина Александровна Романова

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится «-V » февраля 2009 года на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан января 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В последние годы в связи с увеличением воздействия на человека етрессорных ситуаций резко возросло потребление анксиолитических средств, среди которых наибольшее распространение получили препараты бензодиазепиновой структуры, в том числе отечественный препарат феназепам, который применяется в лечебной практике уже более 25 лет (Воронина Т.А., 1978, 1982; Середенин С.Б. и соавт., 1982, 2005). Однако, наличие побочных эффектов, которые выражаются в ухудшении моторных (седативное и миорелаксантное действие), и мнестических функций, риске возникновения лекарственной зависимости и синдрома отмены, значительно ограничивает использование феназепама в клинической и, особенно, амбулаторной практике. Уменьшить или устранить побочные эффекты феназепама, при сохранности основного анксиолитического эффекта, представляется возможным при изменении его доставки в организм с использованием наноносителей.

В последние годы для целенаправленной транспортной доставки лекарственных веществ в мозг используется способ сорбирования и включения веществ в наночастицы, представляющие собой коллоидные системы, состоящие из полимерного матрикса (Чехонин В.П. и соавт., 2009; Alyautdin et al., 2001; Kreuter, 2001; Lockman et al., 2002; Olivier, 2005). К числу таких наночастиц относятся полибутилцианоакрилагные наночастицы (ПБЦА-наночастицы), покрытые сурфакгантами (полисорбатом-80), которые были созданы и изучены на кафедре фармацевтической технологии в университете И.В. Гёте (Франкфурт-на-Майне) и на кафедре фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Alyautdin et al.,1997, 2001; Kreuter, 1994, 2001). С целью предотвращения захвата ПБЦА наночастиц, содержащих препарат, клетками ретикуло-эндотелиальной системы, наночастицы покрываются сур ф актантом, что увеличивает (до 20 раз) концентрацию веществ в сосудах головного мозга (Kreuter, 2001; Ramge et al., 2000).

ПБЦА наночастицы используются у животных и человека в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг таких лекарственных препаратов, как лоперамид (Alyautdin et al., 1997) тубокурарин (Alyautdin et al.,1998), ванкамицин, ампициллин (Kreuter, 1994), мет-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2000), лей-энкефалин

(Ramge, Kreuter, 2001) и доксорубицин (Gelperina et al.,2003), который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США (Shen et al., 2006; Mansoor, 2007).

Показано, что при введении веществ в ПБЦА наночастицы повышается их биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия, а также снижаются побочные эффекты и токсичность.

Целью исследования явилось сравнительное изучение основных и побочных эффектов феназепама, сорбированного и включенного в полибутилцианоакрилатные (ПБЦА) наночастицы, покрытые сурфакгантом (полисорбатом-80), и феназепама в субстанции.

Задачи исследования.

1. Синтезировать ПБЦА наночастицы и ПБЦА наночастицы с феназепамом, определить размер ПБЦА-наночастиц методом фотонной корреляционной спектроскопии с использованием наносайзера Coulter N4MD (Великобритания) и провести количественное определение сорбированного и включенного феназепама в матрикс ПБЦА-наночастиц.

2. Провести сравнительное изучение анксиолитического, седативного и миорелаксантного эффектов феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц, феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции и выбрать нанокапсулированный феназепам для дальнейшего изучения.

3. Изучить возможность проникновения ПБЦА-наночастиц с включенным в матрикс родамином В через эндотелий кишечника при энтеральном введении методом иммунофлюоресцентной микроскопии.

4. Изучить основные (анксиолитический, противосудорожный, антиагрессивный) и побочные (седативный, миорелаксантный) эффекты феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфакгантом, в сравнении с феназепамом в субстанции.

5. Изучил, влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, в сравнении с феназепамом в субстанции на спектр мощности ЭЭГ в различных отделах мозга крыс.

6. Исследовать влияние анализаторов ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса (флумазенила и бикукуллина) на анксиолитический эффект феназепама,

включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфакгантом в сравнении с феназепамом в субстанции.

7. Исследовать возможность развития толерантности при длительном (21 день) применении феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфакгантом, в сравнении с феназепамом в субстанции и изучить синдром отмены после пре1фащения длительного введения веществ.

Научная новизна. Впервые феназепам сорбирован на поверхности и включен в матрицу полибутилцианоакрилатных наночастиц (ПБЦА-наночастиц), покрытых полисорбатом-80 и показано, что феназепам, включенный в матрикс наночастиц, покрытых полисорбатом-80, (Фен-Нано-Вкл) обладает более высокой анксиолитнческой активностью и имеет более высокий процент включения в наночастицы (65%), чем феназепам, сорбированный на наночастицах (Нано-Фен-Сорб) (43,7%). Показано, что размеры ПБЦА наночастиц составляют 230-250 нм, а с включенным в матрицу феназепамом - 350-370 нм. При энгеральном введении ПБЦА наночастицы не проникают через эндотелий кишечника. При парентеральном введении Фен-Нано-Вкл в дозах 0,1-2,5 мг/кг (внб) оказывает выраженное анксиолитическое, антиагрессивное, противосудорожное действие и не уступает по активности и глубине эффекта феназепаму в субстанции. Показано, что анксиолитическое действие Фен-Нано-Вкл ослабляется флумазенилом и бикукуллином, что свидетельствует о вовлечении бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов в реализацию этого эффекта. В противоположность феназепаму в субстанции, Фен-Нано-Вкл в терапевтических дозах (0,1-2 мг/кг) не оказывает миорелаксантного действия и не обладает седативным эффектом, но в высокой дозе (5 мг/кг) эти проявления действия наблюдаются у 70% животных, хотя в значительно меньшей степени, чем у феназепама в субстанции. Установлено, что Фен-Нано-Вкл усиливает спектр мощности ЭЭГ в диапазонах тета-2, бета-1 и бета-2 частот. Эффект Фен-Нано-Вкл на ЭЭГ в наибольшей степени выражен в гиппокампе и наступает быстрее, чем эффект феназепама в субстанции. При длительном введении Фен-Нано-Вкл (1 мг/кг), также как и при введении феназепама в субстанции, не развивается толерантности по анксиолитическому и антиагрессивному эффектам. Фен-Нано-Вкл после прекращения его длительного введения не вызывает проявлений синдрома отмены, характерных для феназепама в субстанции.

Научно-практическая значимость. Полученные данные о том, что феназепам, включенный в матрикс ПБЦА-наночастиц, покрытых сурфакгантом, при парентеральном введении сохраняет высокую анксиолитическую, антиагрессивную и противосудорожную активность, но при этом резко снижаются его побочные эффекта, связанные с моторными функциями (седативный и миорелаксангныЙ), а также данные об отсутствии проявлений синдрома отмены после прекращения длительного введения вещества являются основанием для продолжения исследований по разработке новых лекарственных форм психотропных препаратов, в том числе феназепама, с использованием нанотехнологических подходов и, в частности, ПБЦА наночастиц.

Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные лекарственные формы нанокапсулированного феназепама и проведено их фармакологическое изучение, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация работы: Результаты работы были доложены на межлабораторных конференциях ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech» (Москва, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 4 тезиса.

Объем и структура диссертации: Диссертация содержит введение, обзор литературы, раздел с описанием материалов и методов исследования, 5-ти глав результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена \\ъЛОд страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 62 рисунка. Библиографический указатель включает 124 отечественных и 207 иностранных источников.

Материалы и методы исследования

Препараты и вещества, используемые в исследовании. Феназепам субстанция (Физико-химический институт им. А.В. Богатского, АН Украины). Мономер бутилцианоакрилата (Institute for Pharmaceutical Technology Johann

Wolfgang Goethe-University). Родамин В (фирма "Sigma"), коразол (фирма "Sigma"), бемегрид (фирма "Sigma"), флумазенил (фирма "Sigma"), бикукуллин (фирма "Sigma").

Феназепам на ПБЦА наночастицах исследовался в сравнении с феназепамом в субстанции. Вещества вводили внутрибрюшинно в дозах 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5 и 5,0 мг/кг.

Методы полунения нанокапсулированного феназепама. В исследовании был использован мономер бутилцианоакрилат, полученный из Institute for Pharmaceutical Technology Johann Wolfgang Goethe-University, фирма"81сЬе1^егке" (Германия). Наночастицы готовили на кафедре фармакологии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова. Синтез ПБЦА наночастиц проводили методом кислотной полимеризации по стандартной методике (Аляутдин, 2000; Kreuter, 1998; Gelperina, 2003). Сорбцию феназепама на поверхность ПБЦА-наночастип осуществляли методом использованным ранее для приготовления других препаратов на ПБЦА наночастицах (Аляутдин, 2000; Басель, 2005; Kreuter, 1998). Процент сорбции феназепама определяли спектрофотометрически. Включение феназепама в матрикс ПБЦА наночастиц проводили по стандартной методике, описанной ранее (Аляутдин, 2000). Содержание феназепама в матриксе ПБЦА наночастиц определяли спектрофотометрически в диметилсульфоксиде. Перед введением экспериментальных лекарственных форм животным, наночастицы, содержащие феназепам, покрывали полисорбатом-80.

Размер частиц определяли методом фотонно-корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K) при следующих рабочих параметрах прибора: угол светорассеяния 90 градусов, температура 25 градусов, вязкость среды 0,01 пуаз, показатель преломления среды 1,333.

Приготовление ПБЦА наночастиц с родамином В, включенным в матрпкс и изучение распределения наночастиц в органах и тканях. ПБЦА наночастицы получали методом кислотной полимеризации. Содержание родамина В в лиофилизированном образце определяли спектрофотометрически при длине волны 554 нм. Наночастицы, меченные родамином В, вводили мышам перорально. Далее животных забивали, производили забор органов (мозг, печень, желудок, кишечник) и приготовление срезов. Проникновение наночастиц в органы и ткани определяли с

помощью иммунофлюоресцеетной микроскопии (микроскоп ВХ- 50 фирмы OLYMPUS с фильтром для родамина) (совместно с НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова).

Фармакологические методы исследования

Животные. Опыты проведены на самцах белых нелинейных крыс массой 250280 г и самцах белых беспородных мышей массой 23-28 г. (питомник "Столбовая" РАМН). Животных содержали в виварии в стандартных клетках при температуре 18-20°С при свободном доступе к пище и воде.

Анксиолитическое действие веществ оценивали с использованием методов конфликтной ситуации и приподнятого крестообразного лабиринта (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005). Методика конфликтной ситуации (Vogel, et ai. 1971) основана на столкновении (конфликте) у крыс питьевой мотивации и электроболевого раздражения. Исследование проводили на многоканальной установке конфликтной ситуации (Молодавкин Г.М., Воронина Т.А., 1995). Критерием наличия эффекта считали увеличение за 10 минут числа наказуемых взятий воды. Методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) основана на естественной боязни открытого пространства, новизне обстановки и страха падения с высоты (Pellow et al., 1985). Мышь помещали на центральную площадку лабиринта и в течение 3-х мин регистрировали: число выходов и длительность пребывания в открытых рукавах, число свешиваний с открытых рукавов и выходов в закрытые рукава. Антиагрессивное действие феназепама исследовали в тесте «драки» животных (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005). Мышей парами высаживали на электродный пол и раздражали постепенно увеличивающимся по силе прерывистым электротоком до возникновения драки. Регистрировали напряжение тока, при котором у животных возникала драка. Седативное действие оценивали с помощью метода «открытого поля» в опытах на крысах и мышах. Регистрировали в течение 3 мин. число пересеченных квадратов, вертикальных стоек и обследованных отверстий. Миорелаксантное действие веществ изучали с помощью метода вращающегося стержня (rota rod) со скоростью вращения 3 об/мин в эксперименте на крысах и мышах. Противосудорожиое действие оценивали в двух тестах. В тесте антагонизма с коразолом изучали способность феназепама предупреждать тонико-клонический компонент судорожного припадка у крыс, вызванного коразолом (70 мг/кг, п/к).

Влияние веществ на первично-генерализованную эпилептоформную активность по показателям ЭЭГ оценивали в течение 30-ти минут после введения бемегрида (10 мг/кг внб). Регистрировали длительность судорожных разрядов и число разрядов за минуту (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н., 2005).

Для регистрации биоэлектрической активности мозга крыс в сенсомоторную область коры, дорзальный гиппокамп и латеральный гипоталамус мозга крыс под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/м) вживляли нихромовые долгосрочные электроды по соответствующим координатам (Bureá и соавт. 1960). Регистрацию ЭЭГ проводили в экранированной камере в условиях свободного поведения животных с использованием 21-ти канального нейрокартографа «Нейро-КМ», работающего на базе компьютера Pentium 4 с установленными фильтрами на 32 Гц и постоянной времени 0,03. (фирма «Нейростатокин»), Компьютерный анализ ЭЭГ осуществлялся с помощью программы «BRAINSYS».

Развитие толерантности и синдрома отмены изучали на мышах с длительным (1 раз в сутки в течение 21 дня) введением и последующей отменой (на 24 часа) веществ, при использовании методологии, разработанной ранее (Гарибова Т.Л., 1993). Были изучены анксиолитический, антиагрессивный и седативный эффекты веществ.

Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена с помощью компьютерной программы BioStat for Windows. Достоверность различий оценивали с помощью вышеуказанной программы с использованием критериев Стьюдента и Фишера (при р < 0,05).

Результаты исследований Изучение фармацевтических характеристик нанокапсулированного феназепама Приготовление феназепама, сорбированного и включенного в матрикс ПБЦА наночастиц. Для синтеза ПБЦА наночастиц использовали метод кислотной полимеризации в среде содержащей декстран 70000 (Seca med 60000, Henkel) в качестве стабилизатора (декстран 70000 в 0,1М растворе соляной кислоты), к которому добавляли бутилцианакрилат. Синтезированные ПБЦА наночастицы имели размер в диапазоне 230-250 им. Далее проводили сорбцию феназепама на поверхность ПБЦА наночастиц. Процент сорбции феназепама на поверхности ПБЦА

наночастиц определяли спектрофотометрически, при длине волны 319 нм. Процент сорбции составил 43,7%.

Приготовление феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц осуществляли следующим образом. К раствору феназепама в хлористом мегалене добавили бутилцианоакрилат. Этот раствор количественно переносили в водную фазу (безводная лимонная кислота, полоксамер 188, вода) и подвергали ультразвуковой гомогенизации. Суспензию перемешивали на магнитной мешалке, фильтровали и лиофилизовали. Содержание феназепама определяли спекгрофотометрически в диметилсульфоксиде при длине волны 319 нм. Процент включения феназепама в матрикс составил 65%, а размер наночастиц с феназепамом - 350-370 нм.

Для получения представлений о проникновении ПБЦА наночастиц через ГЭБ при пероральном введении, использовали ПБЦА наночастицы, меченные родамином В. Количественное определение содержания родамина В, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, в лиофилизованном образце проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 554 нм (в качестве растворителя использовали диметилсульфоксид). Показано, что содержание родамина в наночастицах составило 25%, размер частиц 310-330 нм. Забой животных проводили через 45 мин (для забора желудков) и через 80 мин (для забора фрагментов кишечника, печени и головного мозга). После введения наночастиц установлено, что флюоресценция в органах контрольных интактных животных не отличалась от флюоресценции в органах мышей, получивших наночастицы с родамином В, что позволяет сделать вывод о том, что наночастицы при их введении внутрь не всасываются в желудочно-кишечном тракте. В противоположность этому, ПБЦА наночастицы при внутрибрюшинном (внб) и внутривенном введении хорошо проникают через ГЭБ (Аляутдин Р.Н., 2000; Alyautdin et al.,2003; Kreuter et al., 1994, 1997). На основании полученных результатов дальнейшие экспериментальные исследования были выполнены при использовании внб введения ПБЦА наночастиц.

Сравнительное изучение фармакологических эффектов феназепама, сорбированного на ПБЦА наночастицах и феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых полисорбатом-80 в сравнении с феназепамом в субстанции.

Показано, что Нано-Фен-Сорб и Нано-Фен-Вкл в дозах 0,5 и 1 мг/кг (внб) не уступали феназепаму в субстанции по анксиолитическому действию в тесте конфликтной ситуации у крыс (Рис. 1), но не вызывали угнетения поведения в тесте открытого поля и миорелаксантного эффекта в тесте вращающегося стержня.

По выраженности анксиолитического действия в дозе 0,5 мг/кг Нано-Фен-Вкл достоверно превосходит Нано-Фен-Сорб. В дозе 1 мг/кг Нано-Фен-Вкл также превосходит Нано-Фен-Сорб, однако это различие не является достоверным (Рис. 1).

Полученные результаты фармакологических исследований и данные о более высоком содержании Нано-Фен-Вкл (65%), по сравнению с Нано-Фен-Сорб (43,7%) обосновывают дальнейшее проведение экспериментов с использованием феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом.

1СОО 900 800 700

|

5 600

х

I 500

8

I 400

I

300 200 100 О

ЫаС. Фен 0,5 мг/кг НаноФен (сорб) НаноФен (акточ) Фен 1 мг/кг НаноФен (сорб) 1 НаноФен (вк/коч) 1 0,5 мг/кг 0,5 мг/кг __мг/кг_мг/кг

□ NaCI □ Фен 0,5 мг/кг О НаноФен (сорб) 0,5 мг/кг □ НаноФен (включ) 0,5 мг/кг

□ Фен 1 мг/кг □ НаноФен (сорб) 1 мг/кг □ НаноФен (включ) 1 мг/кг

Рис. 1. Анксиолитическое действие Нано-Фен-Вкл н Нано-Фен-Сорб и феназепама в субстанции в тесте конфликтной ситуации в дозе 0,5 и 1 мг/кг в опытах на крысах. * - различие с контролем достоверно при р < 0,05

Изучение спектра фармакологических эффектов феназепама, включенного

в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытого полисорбатом-80, в сравнении с

феназепамом в субстанции.

Анксиолитическое действие было изучено в тесте приподнятого

крестообразного лабиринта (ПКЛ) в опытах на мышах. Установлено, что феназепам в

субстанции оказывал отчетливый дозозависимый анксиолитический эффект (Табл. 1).

В дозе 0,1 мг/кг он увеличивал время, проведенное в открытых рукавах в 6,3 раза, в дозе 0,5 мг/кг - в 7,9 раза и в дозе 1,0 мг/кг - в 11,2 раза (Рис. 2).

Таблица 1. Анкснолитическое действие феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (Фен-Нано-Вкл1). в сравнении с феназепамом в субстанции (Фен-Субс), в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах. __

Вводимые вещества Число выходов в открытые рукава Время в открытых рукавах (сек) Число свешиваний Число выходов в закрытые рукава

Контроль (ТЧаС1) 0,43 ± 0,09 5,14 ± 1,78 0,29 ± 0,12 2,29 ±0,1

Фен-Нано-Вкл (0,1 мг/кг, внб) 2,53 ± 0,16* 39,16 ±5,18* 2,11 ±0,24* 2,1 ±0,09*

Фен-Субс (0,1 мг/кг, внб) 3,27 ± 0,48* 32,3 ±3,16* 2,66 ±0,61* 0,64 ±0,18*

Фен-Нано-Вкл (0,5 мг/кг, внб) 2,73 ±0,18* 55,86 ±7,14* 2,12 ± 0,47* 1,3 ±0,22*

Фен-Субс (0,5 мг/кг, внб) 2,57 ±0,48* 41,1 ±5,17* 2,06 ± 0,52* 1,1 ±0,21*

Фен-Нано-Вкл (1 мг/кг, внб) 2,57 ± 0,89* 70,86 ± 4,84* 2,29 ± 0,52* 1,28 ±0,41*

Фен-Субс (1 мг/кг, вкб) 2,43 ± 0,75* 57,8 ± 6,77* 1,86 ±0,41* 1,28 ±0,41*

Рис. 2. Влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (НаноФен), в сравнении с феназепамом в субстанции (Фен-Субс), в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах. *- различие с контролем достоверно при р < 0,05

Фен-Нано-Вкл, также оказывал выраженный, зависимый от дозы

анксиолитический эффект (Табл. 1). В дозе 0,1 мг/кг (виб) он увеличивал время,

проведенное в открытых рукавах в 7,6 раза, в дозе 0,5 мг/кг - в 10,9 раза и в дозе 1,0 мг/кг - в 13,7 раза (Рис. 2).

Таким образом, по выраженности анксиолитического эффекта Нано-Фен-Вкл даже несколько превосходит феназепам в субстанции, однако, различия не носят достоверного характера.

Антиагрессивное действие было изучено в тесте немотивированной агрессивности - «драки» на электродном полу в опытах на мышах. При использовании феназепама в субстанции в дозе 2 мг/кг порог болевой реакции животных увеличился в 1,9 раз, а порог агрессивной реакции - в 1,6 раз (Табл. 2).

Таблица 2. Антиагрессивное действие феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы (Фен-Нзно-Вкл) и феназепама в субстанции (Фен-Субс) в тесте <<драки» у мышей._

Показатели поведения Контроль (ЫаС1) Фен-Нано-Вкл (2 мг/кг,внб) Фен-Субс (2 мг/кг,внб)

Порог болевой реакции 6,13 ±1,73 23,5 ±6,18* 11,88 ±4,22*

Порог агрессивной реакции 22,5 ± 4,96 38,8 ±4,51* 36,5 ± 1,29*

Порог судорожной реакции 25,5 ±1,93 40,13 ±1,29* 31,88 ±1,81*

* - различие с контролем достоверно при р < 0,05 Нано-Фен-Вкл в дозе 2 мг/кг увеличивал порог болевой реакции животных в 3,8

раз, а порог агрессивности - в 1,72 раза (Табл. 2) и таким образом, не уступал

феназепаму в субстанции по антиагрессивному действию.

При изучении противосудорожного действия установлено, что феназепам в субстанции и Нано-Фен-Вкл в 100% случаях блокировали судороги, вызванные коразолом, в то время как в контрольной группе при введении аналогичной дозы коразола у 90% крыс наблюдались тонико-клонические судороги.

После введения бемегрида в дозе 10 мг/кг в сенсомоторной коре, дорзальном гиппокампе и латеральном гипоталамусе регистрировались эпилептиформные разряды высокоамплтудных острых и медленных волн, амплитудой более 200 мкВ, длительностью от 0,3 до 2,5 сек. (Рис. 3). Число разрядов за минуту составило в среднем 12,3±4,6, а длительность разрядов за минуту - 6,1±0,4.

Нано-Фен-Вкл почти полностью устранял первично-генерализованные судороги (Рис. 4) и значительно увеличивал латентное время появления эпиразрядов. Число разрядов в минуту составило 1,1±0,07, т.е. в 11 раз меньше, чем в контроле, а длительность 0,45±0,07, т.е. в 13 раз меньше, чем в контроле.

Рисунок 3. Электрограммы крысы 3, зарегистрированные через 10 минут после введения бемегрида.

Г

ЩЩ «ДЧ41 /Л^ку г^ИЛ^а ^Лч^ЦА

. | ■ ! . ( ■ . I I | . ' I [ ■ ' | " ■ ■ I '

Рисунок 4. Элекгрограммы крысы, зарегистрированные при введении феназепама на наночастицах и бемегрида.

Феназепам в субстанции также ослаблял эффекты бемегрида: число разрядов за минуту снижалось до 3,2±0,5, а длительность до 0,5±0,08. Таким образом, можно отметить, что противосудорожная активность Нано-Фен-Вкл была несколько выше, чем у феназепама в субстанции.

Изучение седативного эффекта под влиянием феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг наблюдалось существенное уменьшение, по сравнению с контролем, числа пересеченных мышами квадратов (в 7 раз), количества вертикальных стоек (в 5 раз) и количества обследованных отверстий (в 15 раз) в открытом поле, что свидетельствует о его выраженном седативном действии. Нано-Фен-Вкл не вызывал снижения числа пересеченных квадратов и числа вертикальных стоек (Табл.3).

Таблица 3. Влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (Фен-Нано-Вкл), и феназепама в субстанции (Фен-Субс) в тесте открытого поля в опытах на мышах в дозе 1 мг/кг.

Показатели поведения Контроль (№С1) Фен-Нано-Вкл (1 мг/кг, внб) Фен-Субс (1 мг/кг, внб)

Горизонтальные перемещения 32,5 ±3,96 37,24 ±3,85 4,59 ±1,6*

Вертикальные стойки 6,29 ±1,78 4,24 ±0,63 1,24 ±1,25*

Обследованные отверстия 7,12 ±1,75 6,88 ±1,45 0,47 ±0,63*

Число болюсов 1,82 ±0,21 0,35 ±0,16* 1,24 ±0,45

* - различие с контролем достоверно при р < 0,05

Изучение миорелаксантного действия. В опытах на крысах феназепам в субстанции в дозе 1 мг/кг вызывал падение со стержня 50% крыс с латентным периодом 11,2 е., а в дозе 2 мг/кг - 80% животных с латентным периодом 4,1 с. Нано-Фен-Вкл в дозах 1 и 2 мг/кг практически не оказывал миорелаксантного действия: количество крыс, неспособных удержаться на вращающемся стержне при использовании вещества в дозах 1 и 2 мг/кг составило 10%.

В опытах на мышах при использовании феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг наблюдалось падение со стержня 50% мышей с латентным периодом 8,4 е., а в дозе 2,5 мг/кг - 90% животных с латентным периодом 2,8 с. В дозе 5 мг/кг феназепам в субстанции оказывал еще более глубокое миорелаксантное действие. У животных наблюдалось расслабление задних конечностей и 50% животных не были способны перемещаться даже на плоской поверхности (лабораторном столе). Нано-Фен-Вкл в дозе 1 мг/кг не вызывал нарушения координации движений и миорелаксантного действия. В дозе 2,5 мг/кг Нано-Фен-Вкл вызывал нарушение координации движений у 20% мышей при первой посадке и у 10% мышей при второй посадке. В высокой дозе 5 мг/кг Нано-Фен-Вкл вызывал нарушение координации движений у 70% мышей.

Влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции на спектр мощности ЭЭГструктур мозга крыс.

Визуальный анализ изменений биоэлектрической активности мозга крыс выявил, что Фен-НаноВкл, также как феназепам в субстанции, в дозе 1 мг/кг (внб) через 15 и 30 мин после введения вызывает усиление синхронизации и повышение амплитуды биоэлектрической активности в электрограммах дорзального гиппокампа, латерального гипоталамуса и сенсомоторной коры.

Спектральный анализ ЭЭГ показал, что через 15 минут после введения Фен-Нано-Вкл в дозе 1 мг/кг в электрограммах дорзального гиппокампа, латерального гипоталамуса и сенсомоторной коры отмечалось достоверное снижение мощности спектра в диапазоне дельта-частот. Наряду с этим, отмечалось увеличение спектра мощности в диапазоне тета2, бета1 и бета2 частот в электрограммах сенсомоторной коры (недостоверно) и, особенно, дорзального гиппокампа, где изменения носили высоко достоверный характер (Рис. 5.1). Этот эффект сохранялся и через 30 минут после введения Фен-Нано-Вкл (Рис. 5.2) и свидетельствует о преимущественном

влиянии Фен-Нано-Вкл на гиппокамп. В сравнении с Фен-Нано-Вкл, феназепам в субстанции (1 мг/кг) через 15 минут после введения уменьшал мощность спектров бета1 и бета2 диапазонов в сенсомоторной коре и гиппокампе (Рис. 5.1). Усиление активности в этих диапазонах частот наблюдалось только через 30 минут после введения феназепама в субстанции (Рис. 5.2). Наличие эффекта у Фен-Нано-Вкл уже через 15 минут после введения свидетельствует о более раннем проявлении его эффекта на показатели ЭЭГ в сравнении с феназепамом в субстанции. Рис. 5.1.

Изменения процентной мощности спектра ЭЭГ крыс через 15 минут после введения феназепама (А) и феназепама на наночастицах (Б), е дозе 1 мг/кг

123 4 6 ' 1 2 3 4 S 123 4 6

диапазоны частот: 1-дельта, 2-твта1 , 3- тета2. «t-бвта! , Б- Свта2

p.<0.05t>2.1»<0.01t»2.8 Student's t with stgn(N't-N2) N1= феназепам Т&ггип N2= фон- чистый

Рис. 5.2.

№меченкя пэоцектисй мощности спектра ЭЭГ крыс через 30 мшут после ееедения феназепама (А) и фена:епзмз -t£ наночзсшцах (Б), э дозе 1 v.r/w

ливпазоны чаотрт: 1- дельта, 2-?ата1 , Э. гага 2. 4-®ете1 , 5. бата2

рк0.051ь2.1:о«0.011*2.8 Student's t wttfi 8lgn(Nl-N2) W1= феназепам 30 мин М2=фон- чистый'.

Рис. 5. Сравнение эффектов феназепама в субстанции и феназепама на наночастицах на спектры мощности ЭЭГ крыс через 15 минут (6.1) и через 30 минут (6.2) после введения. ГПК - гиппокамп; ГПТ - гипоталамус; СМК - сенсомоторная кора.

Изучение влияния флумазенила и бикукуллина на анксиолитический

эффект феназепама, включенного в матрикс ПБЦА, и феназепама в субстанции.

Установлено, что прямой антагонист бензодиазепиновых рецепторов флумазенил (10 мг/кг, внб), введенный после феназепама (1 мг/кг), достоверно снижает анксиолитический эффект как феназепама в субстанции, так и Нано-Фен-

Вкл, о чем свидетельствовует значительное уменьшение (более чем в 6 раз) числа наказуемых взятий воды по сравнению с показателями одних веществ (Рис.6). Антагонист ГАМКА рецепторов Бикукуллин (1 мг/кг внб) также ослабляет анксиолитический эффект феназепама в субстанции и Нано-Фен-Вкл (Рис. 6), но его эффект был менее выражен, чем эффект флумазенила. Полученные данные позволяют предположить, что в реализацию анксиолитического действия Нано-Фен-Вкл, также как и в механизм действия феназепама в субстанции, вовлекаются бензодиазепиновые и ГАМК-А рецепторы. 1000 900 800

| 700

§

I Ю0

«

í 500

0

1

| 400

о

с;

§ 300 200 100

Рис. 6. Влияние флумазенила (Флум) в дозе 10 мг/кг на анксиолитическое действие феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц в дозе 1 мг/кг и феназепама в субстанции в дозе 1 мг/кг, в тесте конфликтной ситуации в опытах на крысах. * - различие с контролем достоверно при р < 0,05. # - различие с препаратом без антагониста достоверно при р < 0,05

Изучение толерантности и синдрома отмены после хронического введения феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции.

Исследование проводили на мышах, которых разбивали на 9 групп по 10 мышей. 1-3 группы - контроль (введение ЫаС! с 0,1 мл 0,1%Твин-80, внб): однократно (группа 1), хронически (1 раз в сутки 21 день, (группа 2) и введение 21 день и затем отмена на 24 часа (группа 3). Мышам 4-6 групп по той же схеме вводили

Фен 1 мг/кг Фен 1мг/кг+флум Фен 1 мг/кг+бик НаноФен 1мг/кг НаноФен НаноФен!

1мг/кг+Флум мг/кг+бик

феназепама в субстанции (1 мг/кг, внб), а мышам 7-9 групп - Нано-Фен-Вкл (1 мг/кг, внб). Вещества вводили за 30 минут до эксперимента.

Установлено, что феназепам в субстанции и Нано-Фен-Вкл при повторном, также как и при однократном введении, оказывают выраженный анксиолитический эффект в тесте ПКЛ (Рис. 7). После отмены введения феназепама в субстанции достоверно уменьшается число выходов в открытые рукава ПКЛ (в 2,4 раза), время пребывания в них (в 4,2 раза), число свешиваний с открытых рукавов (в 3,25 раза) и повышается число выходов в закрытые рукава (в 2,2 раза) по сравнению с показателями, наблюдаемыми после повторного (21 день) введения феназепама в субстанции (Рис. 7). После прекращения введения Нано-Фен-Вкл показатели поведения в ПКЛ практически не изменились по сравнению с показателями при длительном применении вещества (Рис. 7), что свидетельствует об отсутствии проявлений повышенной тревожности, характеризующей синдром отмены.

3,5

однократно 21 день отмена

|а№С1 вНаноФен 1 мг/кг пФэн 1 мг)кг

Рис. 7. Влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (НаноФен), и феназепама в субстанции (Фен) на число выходов в открытые рукава в тесте приподнятого крестообразного лабиринта при однократном, повторном (21 день) введении и отмене (на 24 часа) веществ в опытах на мышах. *- различие с контролем, # - различие с эффектом повторного (21 день) введения достоверно при р < 0,05

Под влиянием феназепама в субстанции (1 мг/кг) при однократном и повторном

введении отмечалось существенное уменьшение, по сравнению с контролем,

регистрируемых показателей в открытом поле, что свидетельствует о выраженном седативном эффекте препарата. После отмены препарата наблюдалось резкое снижение (в 21,2 раза) числа обследованных отверстий и увеличение (в 3 раза) числа фекальных болюсов (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции при однократном, повторном (21 день) введении и отмене на поведение мышей в тесте открытого поля. ___

Группы Режим введения Горизонт, перемещ Вертикальн перемещ. Обследования Число Болюсов

Контроль (КаС1) Однократно 32,43± 10,54 6,47 ± 1,8 9,59 ± 3,27 1,82 ±0,24

Повторно 35,15 ±8,38 6,94 ±1,39 10,6 ±2,4 2,2 ± 0,42

Отмена 24,24 ±5,51 6,51 ± 1,84 7,24 ± 2,39 1,76 ± 1,02

Нано-Феназепам, (1 мг/кг, внб) Однократно 37,29 ±8,43 4,24 ±1,63 7,24 ±1,63 0,35 ± 0,65*

Повторно 39,3 ± 6,54 5,16 ± 1,16 7,69 ± 2,23 0,21 ± 0,23*

Отмена 26,41 ±7,11 4,47 ±1,71 6,35 ± 0,63 0,9 ±0,55*

Феназепам субстанция (1 мг/кг внб) Однократно 4,59 ±1,6* 1,24 ±0,43* 4,17 ±0,73* 1,35 ±0,45*

Повторно 4,79 ± 1,9* 1,65 ±0,41* 5,1 ±0,65*# 1,1 ±0,65*

Отмена 10,24 ±2,87* 2,1 ±0,51* 0,24 ± 0,08*#А 3,5 ± 0,6*#л

*- различие с контролем, # - различие с однократным введением, Л - различие с длительным введением достоверно при р < 0,05.

Нано-Фен-Вкл при однократном и хроническом (21 день) введении достоверно не изменял показатели двигательного поведения в открытом поле по сравнению с контролем. Под влиянием Нано-Фен-Вкл отмечалось лишь достоверное снижение числа фекальных болюсов. После отмены хронического введения Нано-Фен-Вкл не наблюдалось изменения поведения по сравнению с эффектами длительного применения вещества, что свидетельствует об отсутствии проявлений синдрома отмены по этим показателям.

Феназепам в субстанции при однократном и повторном введении оказывал выраженное антиагрессивное действие. После отмены введения феназепама порог болевой чувствительности уменьшился в 1,54 раза, а порог агрессивной реакции - в 2,49 раза, что свидетельствуют о развитии синдрома отмены после прекращения длительного введения феназепама в субстанции (Рис. 8). Нано-Фен-Вкл также оказывал выраженный антиагрессивный эффект. При его длительном введении и при отмене пороги болевой и агрессивной реакции достоверно не изменялись по сравнению с эффектом вещества при однократном введении (Рис. 8), что свидетельствует об отсутствии у феназепама на наночастицах явлений толерантности и синдрома отмены.

I БМаС! йНаноФен 1 т/кг ПФен 1 мг/кг |

Рис. 8. Влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (НаноФен), и феназепама в субстанции (Фен) на порог агрессивной реакций при однократном, повторном (21 день) введении и отмене веществ опытах на мышах, *- различие с контролем достоверно яри р < 0,05;Л - различие с длительным введением достоверно при р < 0,05.

Заключение. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что Нано-Фен-Вкл в дозах 0,1-2,0 мг/кг при парентеральном (внб) введении, обладает выраженным дозозависимым анксиолитическим, антиагрессивным и противосудорожным эффектами и не уступает по активности феназепаму в субстанции. Анксиолитическое действие Фен-Нано-Вкл достоверно снижается флумазенилом и бикукуллином. Фен-Нано-Вкл, в противоположность феназепаму в субстанции, не обладает седативным и миорелаксантным действием в терапевтических дозах (0,1-2,0 мг/кг), а в дозе 5 мг/кг оказывает значительно меньшее миорелаксантное действие (нарушение координации движений у 70% животных), чем феназепам в субстанции (нарушение координации у 100% животных, расслабление задних конечностей и неспособность передвижения даже на плоской поверхности). В противоположность феназепаму в субстанции, который после прекращения длительного введения вызывает синдром отмены, Фен-Нано-Вкл после прекращения курсового (21 день) введения в терапевтической дозе (1 мг/кг) не вызывает усиления тревожности, агрессивности и нарушения ориентировочно-исследовательского поведения. Таким образом, нанокапсулированный феназепам пополняет список препаратов, при включении которых в ПБЦА наночастицы, снижается выраженность

их побочных эффектов и токсичность, при сохранности основного действия. Примером такого препарата является доксорубицин на ПБЦА наночастицах, который в настоящее время проходит III фазу клинических испытаний в США.

Одна из рабочих гипотез механизма действия Фен-Нано-Вкл по аналогии с объяснением действия других препаратов на ПБЦА наночастицах, может быть связана с представлениями о тропности ПБЦА наночастиц к аполипопротеину Е (АпоЕ) (Kreuter, 2000). В структурах мозга (в сосудах) выявлена различная плотность рецепторов к АпоЕ и показано, что они находятся в наибольшем количестве в сосудах гиппокампа и коры (Bales et al.,1999; Holtzman, et al., 2000; Irizany et al., 2000). Эти данные хорошо коррелируют с нашими результатами о том, что именно в гиппокампе - значимой для реализации анксиолитического эффекта структуре, а не в других структурах мозга под влиянием Фен-Нано-Вкл происходит усиление спектров мощности ЭЭГ. Можно предположить, что выявленный эффект Фен-Нано-Вкл в гиппокампе определяется его преимущественной доставкой именно в эту структуру, содержащую максимальное количество АпоЕ.

Анксиолитическое действие Фен-Нано-Вкл достоверно снижается флумазенилом и бикукуллином, что позволяет предположить вовлечение в реализацию анксиолитического эффекта бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов. Об участии ГАМК-А рецептора в действии Фен-Нано-Вкл свидетельствуют также данные об усилении под влиянием нанокапсулированного феназепама тета- ритма в гиппокампе, поскольку показано, что тета- ритм, генерируемый в септо-гиппокампальной области, связан преимущественно с ГАМК-ергическими воздействиями (Simon et al., 2006). Можно также предположить, что Фен-Нано-Вкл, возможно, оказывает более целенаправленное и избирательное действие на альфа2 субъединицу ГАМК-А рецептора, обеспечивающего избирательный анксиолитический эффект. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о преимущественном влиянии Фен-Нано-Вкл на диапазон бета частот ЭЭГ, в регуляции которой участвует именно а2, a не другие субъединицы ГАМК-А рецептора (Poijesz et al., 2002).

Однако, для получения доказательных представлений о механизме действия нанокапсулированного феназепама, требуется, прежде всего, целенаправленное изучение его взаимодействия с АпоЕ и проведение исследований по фармакокинетике и рецепторному связыванию.

Выводы.

1. Установлено, что размер ПБЦА наночастиц, составляет 230-250 нм, а ПБЦА-наночастиц, покрытых сурфактантом, с включенным в матрикс феназепамом,- 350370 нм (наносайзер Coulter N4MD, Великобритания). Фен-Нано-Вкл имеет более высокий процент содержания в наночастицах (65%), чем феназепам сорбированный на наночастицах (43,7%) и обладает более высокой анксиолитической активностью.

2. Фен-Нано-Вкл при энтеральном введении не проникает через эндотелий кишечника и не оказывает фармакологического действия, а при парентеральном (внутрибрюшинном) введении вызывает выраженные психотропные эффекты.

3. Фен-Нано-Вкл в дозах 0,1-2,0 мг/кг (внб) оказывает выраженное анксиолигическое, антиагрессивное, противосудорожное действие и не уступает по активности и глубине эффекта феназепаму в субстанции.

4. Анксиолитическое действие Фен-Нано-Вкл ослабляется флумазенилом и бикукуллином, что предполагает вовлечение бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов в реализацию этого эффекта.

5. Фен-Нано-Вкл в терапевтических дозах (0,1-2,0 мг/кг, внб) не оказывает седативного и миорелаксантного действия, в противоположность феназепаму в субстанции, однако, при использовании Фен-Нано-Вкл в высокой дозе (5 мг/кг) миорелаксация наблюдается, хотя в значительно меньшей степени, чем у феназепама в субстанции в этой же дозе.

6. Фен-Нано-Вкл и феназепам в субстанции в дозе 1 мг/кг (внб) усиливают синхронизацию и повышают амплитуды биоэлектрической активности в электрограммах дорзального гиппокампа, латерального гипоталамуса и сенсомоторной коры. Фен-Нано-Вкл достоверно снижает мощность спектра ЭЭГ в диапазоне дельта-частот и увеличивает в диапазоне тета2- и бета1-, бета2- частот. Эффект феназепама на наночастицах в наибольшей степени выражен в гиппокампе и наступает раньше, чем эффект феназепама в субстанции.

7. При повторном (21 день) введении Фен-Нано-Вкл (1 мг/кг, внб), также как при введении феназепама в субстанции, не развивается толерантности по анксиолитическому и антиагрессивному эффектам, а прекращение длительного введения Фен-Нано-Вкл не вызывает «синдрома отмены», характерного для феназепама в субстанции.

Список публикаций по теме диссертации.

1) Черневская (Разживина), В.А. Экспериментальное изучение анксиолитического действия феназепама, сорбированного на полимерных носителях наночастицах [Текст] / В.А.Черневская, Т.А. Воронина, Г.М. Молодавкин, Р.Н. Аляутдин, В.Ю. Балабаньян // Материалы III съезда фармакологов России. Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. - 2007 с.

2) Разживина, В.А. Экспериментальное изучение анксиолитического и противосудорожного эффектов феназепама, сорбированного на полимерных носителях наночастицах [Текст] / В.А. Разживина, Т.А. Воронина, Г.М. Молодавкин, Р.Н. Аляутдин, В.Ю. Балабаньян // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации». Москва, 14-17 ноября 2007 г., РУДН, 530 с.

3) Разживина, В.А. Изучение анксиолитического, седативного и миорелаксантного эффектов феназепама, сорбированного на полибутшшианоакрилатных наночастицах [Текст] / В.А. Разживина, Т.А. Воронина, Г.М. Молодавкин, Р.Н. Аляутдин, В.Ю. Балабаньян // Фармация. -2008.-№4.-С. 46-48.

4) Разживина, В.А. Изучение анксиолитического, седативного и антиагрессивного эффектов феназепама, включенного в полибутилцианоакрилатные наночастицы в экспериментах на мышах [Текст] / В.А. Разживина, Т.А. Воронина, Г.М. Молодавкин, Р.Н. Аляутдин, В.Ю. Балабаньян // Фармация. - 2008. - №8. С 37-40.

5) Воронина, Т.А. Создание новой лекарственной формы феназепама на основе нанотехнологий. [Текст] / Т.А. Воронина, В.А. Разживина, Р.Н. Аляутдин, Г.Г. Авакян, В.Ю. Балабаньян // Сборник тезисов докладов международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech». Москва, 3-5 декабря 2008 г. • с. 375.

6) Курахмаева, К.Б. Наносомальный транспорт нейротропных средств в ЦНС [Текст] / К.Б. Курахмаева, И.А. Джинджихашвили, В.А. Разживина, ЯМ. Хамди, В.Ю. Балабаньян, Р.Н. Аляутдин // Сборник тезисов докладов международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech». Москва, 3-5 декабря 2008 г. - с. 388.

Список сокращений.

АпоЕ - аполипопротеин Б

внб - внутрибрюшинное введение

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

Нано-Фен-Вкл или Нано-Фен- феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночаетиц, покрытых полисорбатом 80.

Наио-Фен-Сорб - феназепам, сорбированный на поверхности ПБЦА наночаетиц, покрытых полисорбатом 80.

ПБЦА наночастицы - полибутилцианоакрилатные наночастицы ЭЭГ - электроэнцефалограмма

Заказ № 118. Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 152-00-16 Тираж 140 шт.

Актуальность. В последние годы в связи с увеличением воздействия на человека стрессорных ситуаций резко возросло потребление анксиолитических средств, среди которых наибольшее распространение получили препараты бензодиазепиновой структуры, в том числе отечественный препарат феназепам, который применяется в лечебной практике уже более 25 лет (Воронина Т.А., 1978, 1982; Середенин С.Б. и соавт., 1982, 2005). Однако, наличие побочных эффектов, которые выражаются в ухудшении моторных (седатнвное и миорелаксантное действие), и мнестических функций, риске возникновения лекарственной зависимости и синдрома отмены, значительно ограничивает использование феназепама в клинической и, особенно, амбулаторной практике. Уменьшить или устранить побочные эффекты феназепама, при сохранности основного анкснолитического эффекта, представляется возможным при изменении его доставки в организм с использованием наноносителей.

В последние годы для целенаправленной транспортной доставки лекарственных веществ в мозг используется способ сорбирования и включения веществ в наночастицы, представляющие собой коллоидные системы, состоящие из полимерного матрикса (Чехонин В.П. и соавт., 2009; Alyautdin et al., 2001; Kreuter, 2001; Lockman et al., 2002; Olivier, 2005). К числу таких наночастиц относятся полибутилцианоакрилатные наночастицы (ПБЦА-наночастицы), покрытые сурфактантами (полисорбатом-80), которые были созданы и изучены на кафедре фармацевтической технологии в университете И.В. Гёте (Франкфурт-на-Майне) и на кафедре фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Alyautdin et al.,1997, 2001; Kreuter, 1994, 2001). С целью предотвращения захвата ПБЦА наночастиц, содержащих препарат, клетками ретикуло-эндотелиальной системы, наночастицы покрываются сурфактантом, что увеличивает (до 20 раз) концентрацию веществ в сосудах головного мозга (Kreuter, 2001; Ramge et al., 2000).

ПБЦА наночастицы используются у животных и человека в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг таких лекарственных препаратов, как лоперамид (Alyautdin et al., 1997) тубокурарин (Alyautdin et al.,1998), ванкамицин, ампициллин (Kreuter, 1994), мет-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2000), лей-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2001) и доксорубицин (Gelperina et al.,2003), который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США и Европе (Mansoor, 2007; материалы сайта www.biospace.com и http://www.bioalliancepharma.com; Bender., 2008).

Показано, что при введении веществ в ПБЦА наночастицы повышается их биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия, а также снижаются побочные эффекты и токсичность.

Целью исследования явилось сравнительное изучение основных и побочных эффектов феназепама, сорбированного и включенного в полнбутилцианоакрилатные (ПБЦА) наночастицы, покрытые сурфактантом (полисорбатом-80), и феназепама в субстанции.

Задачи исследования.

1. Синтезировать ПБЦА наночастицы и ПБЦА наночастицы с феназепамом, определить размер ПБЦА-наночастиц методом фотонной корреляционной спектроскопии с использованием наносайзера Coulter N4MD (Великобритания) и провести количественное определение сорбированного и включенного феназепама в матрикс ПБЦА-наночастиц.

2. Провести сравнительное изучение анксиолитического, седативного и миорелаксантного эффектов феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц, феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции и выбрать нанокапсулированный феназепам для дальнейшего изучения.

3. Изучить возможность проникновения ПБЦА-наночастиц с включенным в матрикс родамином В через эндотелий кишечника при энтеральном введении методом иммунофлюоресцентной микроскопии.

4. Изучить основные (анксиолитический, противосудорожный, антиагрессивный) и побочные (седативный, миорелаксантный) эффекты феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом, в сравнении с феназепамом в субстанции.

5. Изучить влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, в сравнении с феназепамом в субстанции на спектр мощности ЭЭГ в различных отделах мозга крыс.

6. Исследовать влияние анализаторов ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса (флумазенила и бикукуллина) на анксиолитический эффект феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом в сравнении с феназепамом в субстанции.

7. Исследовать возможность развития толерантности при длительном (21 день) применении феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом, в сравнении с феназепамом в субстанции и изучить синдром отмены после прекращения длительного введения веществ.

Научная новизна. Впервые феназепам сорбирован на поверхности и включен в матрицу полибутилцианоакрилатных наночастиц (ПБЦА-наночастиц), покрытых полисорбатом-80 и показано, что феназепам, включенный в матрикс наночастиц, покрытых полисорбатом-80, обладает более высокой анксиолитической активностью и имеет более высокий процент включения в наночастицы (65%), чем феназепам, сорбированный на наночастицах (43,7%). Показано, что размеры ПБЦА наночастиц составляют 230-250 нм, а с включенным в матрицу феназепамом - 350-370 нм. При энтеральном введении ПБЦА наночастицы не проникают через эндотелий кишечника. При парентеральном введении феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в дозах 0,1-2,5 мг/кг (внб) оказывает выраженное анксиолитическое, антиагрессивное, противосудорожное действие и не уступает по активности и глубине эффекта феназепаму в субстанции. Показано, что анксиолитическое действие нанокапсулированного феназепама ослабляется флумазенилом и бикукуллином, что свидетельствует о вовлечении бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов в реализацию этого эффекта. В противоположность феназепаму в субстанции, феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в терапевтических дозах (0,1-2 мг/кг) не оказывает миорелаксантного действия и не обладает седативным эффектом, но в высокой дозе (5 мг/кг) эти проявления действия наблюдаются у 70% животных, хотя в значительно меньшей степени, чем у феназепама в субстанции. Установлено, что феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, усиливает спектр мощности ЭЭГ в диапазонах тета-2, бета-1 и бета-2 частот. Эффект нанокапсулированного феназепама на ЭЭГ в наибольшей степени выражен в гиппокампе и наступает быстрее, чем эффект феназепама в субстанции. При длительном введении феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (1 мг/кг), также как и при введении феназепама в субстанции, не развивается толерантности по анксиолитическому и антиагрессивному эффектам. Нанокапсулированный феназепам, после прекращения его длительного введения, не вызывает проявлений синдрома отмены, характерных для феназепама в субстанции.

Научно-практическая значимость. Полученные данные о том, что феназепам, включенный в матрикс ПБЦА-наночастиц, покрытых сурфактантом, при парентеральном введении сохраняет высокую анксиолитическую, антиагрессивную и противосудорожную активность, но при этом резко снижаются его побочные эффекты, связанные с моторными функциями (седативный и миорелаксантный), а также данные об отсутствии проявлений синдрома отмены после прекращения длительного введения вещества являются основанием для продолжения исследовании по разработке новых лекарственных форм психотропных препаратов, в том числе феназепама, с использованием нанотехнологических подходов и, в частности, ПБЦА наночастиц.

Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные лекарственные формы нанокапсулированного феназепама и проведено их фармакологическое изучение, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация работы: Результаты работы были доложены на межлабораторных конференциях ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech» (Москва, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 4 тезиса.

Выводы.

1. Установлено, что размер ПБЦА наночастиц, составляет 230-250 нм, а ПБЦА-наночастиц, покрытых сур ф актантом, с включенным в матрикс феназепамом,- 350-370 нм (наносайзер Coulter N4MD, Великобритания). Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, имеет более высокий процент содержания в наночастицах (65%), чем феназепам сорбированный на наночастицах (43,7%) и обладает более высокой анксиолитической активностью.

2. Нанокапсулированный феназепам при энтеральном введении не проникает через эндотелий кишечника и не оказывает фармакологического действия, а при парентеральном (внутрибрюшинном) введении вызывает выраженные психотропные эффекты.

3. Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в дозах 0,1-2,0 мг/кг (внб) оказывает выраженное анксиолитическое, антиагрессивное, противосудорожное действие и не уступает по активности и глубине эффекта феназепаму в субстанции.

4. Анксиолитическое действие феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, ослабляется флумазенилом и бикукуллином, что предполагает вовлечение бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов в реализацию этого эффекта.

5. Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в терапевтических дозах (0,1-2,0 мг/кг, внб) не оказывает седативного и миорелаксантного действия, в противоположность феназепаму в субстанции, однако, при использовании нанокапсулированного феназепама в высокой дозе (5 мг/кг) миорелаксация наблюдается, хотя в значительно меньшей степени, чем у феназепама в субстанции в этой же дозе.

6. Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепам в субстанции в дозе 1 мг/кг (внб) усиливают синхронизацию и повышают амплитуды биоэлектрической активности в электрограммах дорзального гиппокампа, латерального гипоталамуса и сенсомоторной коры. Нанокапсулированный феназепам достоверно снижает мощность спектра ЭЭГ в диапазоне дельта-частот и увеличивает в диапазоне тета2- и бета1-, бета2- частот. Эффект феназепама на наночастицах в наибольшей степени выражен в гиппокампе и наступает раньше, чем эффект феназепама в субстанции.

7. При повторном (21 день) введении феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, (1 мг/кг, внб), также как при введении феназепама в субстанции, не развивается толерантности по анксиолитическому и антиагрессивному эффектам, а прекращение длительного введения нанокапсулированного феназепама не вызывает «синдрома отмены», характерного для феназепама в субстанции.

Заключение.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что феназепам, включенный в матрикс наночастиц, в дозах 0,1-2,0 мг/кг при парентеральном (внб) введении, обладает выраженным дозозависимым анксиолитическим, антиагрессивным и противосудорожным эффектами и не уступает по активности феназепаму в субстанции. Анксиолитическое действие нанокапсулированного феназепама достоверно снижается флумазенилом и бикукуллином. Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в противоположность феназепаму в субстанции, не обладает седативным и миорелаксантным действием в терапевтических дозах (0,1-2,0 мг/кг), а в дозе 5 мг/кг оказывает значительно меньшее миорелаксантное действие (нарушение координации движений у 70% животных), чем феназепам в субстанции (нарушение координации у 100% животных, расслабление задних конечностей и неспособность передвижения даже на плоской поверхности). В противоположность феназепаму в субстанции, который после прекращения длительного введения вызывает синдром отмены, нанокапсулированный феназепам после прекращения курсового (21 день) введения в терапевтической дозе (1 мг/кг) не вызывает усиления тревожности, агрессивности и нарушения ориентировочно-исследовательского поведения.

Таким образом, нанокапсулированный феназепам пополняет список препаратов, при включении которых в ПБЦА наночастицы, снижается выраженность их побочных эффектов и токсичность, при сохранности основного действия. Примером такого препарата является доксорубицин на ПБЦА наночастицах, который в настоящее время проходит III фазу клинических испытаний в США (Mansoor, 2007; материалы сайта www.biospace.com и http://www.bioalliancepharma.com; Bender., 2008).

Одна из рабочих гипотез механизма действия феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, по аналогии с объяснением действия других препаратов на ПБЦА наночастицах, может быть связана с представлениями о тропности ПБЦА наночастиц к аполипопротеину Е (АпоЕ) (Kreuter, 2000). В структурах мозга (в сосудах) выявлена различная плотность рецепторов к АпоЕ и показано, что они находятся в наибольшем количестве в сосудах гиппокампа и коры (Bales et al.,1999; Holtzman, et al., 2000; Irizarry et al., 2000). Эти данные хорошо коррелируют с нашими результатами о том, что именно в гиппокампе - значимой для реализации анксиолитического эффекта структуре, а не в других структурах мозга под влиянием нанокапсулированного феназепама происходит усиление спектров мощности ЭЭГ. Можно предположить, что выявленный эффект Феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, в гиппокампе определяется его преимущественной доставкой именно в эту структуру, содержащую максимальное количество АпоЕ.

Анксиолитическое действие нанокапсулированного феназепама достоверно снижается флумазенплом и бикукуллином, что позволяет предположить вовлечение в реализацию анксполитического эффекта бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов. Об участии ГАМК-А рецептора в действии феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, свидетельствуют также данные об усилении под влиянием нанокапсулированного феназепама тета- ритма в гиппокампе, поскольку показано, что тета- ритм, генерируемый в септо-гиппокампальной области, связан преимущественно с ГАМК-ергическими воздействиями (Simon et al., 2006). Можно также предположить, что феназепам на наночастицах, возможно, оказывает более целенаправленное и избирательное действие на альфа2 субъединицу ГАМК-А рецептора, обеспечивающего избирательный анксиолитический эффект. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о преимущественном влиянии нанокапсулированного феназепама на диапазон бета частот ЭЭГ, в регуляции которой участвует именно а2, а не другие субъединицы ГАМК-А рецептора (Poijesz et al., 2002).

Однако, для более полного изучения механизма действия нанокапсулированного феназепама, требуется дальнейшее проведение исследований по определению его связывания с рецепторами аполипопротеина Е, различными подтипами бензодиазепиновых рецепторов и проведение углубленных исследований по фармакокинетике и фармакодинамике препарата при различных путях введения.