Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение нейропротективной активности рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в полимерные носители

На правах рукописи

005001270

Солев Игорь Николаевич

Изучение нейропротективной активности рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в полимерные носители.

14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Москва - 2011

005001270

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН и ГБОУ ВПО Первом Московском Государственном Медицинском Университете имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Гарибова Таисия Леоновна

Доктор медицинских наук, профессор Аляутдин Ренад Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ковалев Георгий Иванович

Доктор биологических наук Иноземцев Анатолий Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится « » ...................2011 года на заседании диссертационного

совета Д.001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ фармакологии имени В.В. ЗакусоваРАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан « » октября 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_темы. Заболевания, сопровождающиеся

нейродегенеративными процессами, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, различные деменции, травматические и токсические поражения головного мозга, инсульты являются одной из ведущих причин инвалидицации и смерти пациентов. Несмотря на наличие значительного количества лекарственных средств для лечения этих состояний, проводимая в настоящее время терапия недостаточно эффективна и требуются новые подходы к разработке препаратов с нейропротективной активностью. Один из современных подходов к поиску эффективных нейропротекторов основан на использовании патогенетических механизмов нейродегенерации и эндогенных защитных реакций организма.

В настоящее время накоплены обширные сведения о цитокинах - молекулах, которые являются посредниками межклеточных взаимодействий, регулируют кроветворение, иммунный ответ, клеточный цикл в различных тканях, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Широко известным и применяемым является гемопоэтический ростовой фактор - эритропоэтин (ЭПО). В медицинской практике для лечения анемий различного генеза используется рекомбинантный эритропоэтин человека (РЭЧ). Помимо регуляции эритропоэза, ЭПО проявляет широкий спектр защитных функций в организме, участвует в защите мозга от повреждения. ЭПО и рецептор к нему (ЭПОР) экспрессируются в центральной и периферической нервной системе, принимая активное участие в эмбриональном развитии млекопитающих и человека (Wu Н., 1999). Показано, что при периферическом введении ЭПО оказывает выраженные протекторные эффекты на поврежденную различными факторами церебральную ткань через активацию антиапоптотических генов, запуская антиоксидантные и противовоспалительные механизмы в нейронах, глиальных и цереброваскулярных эндотелиальных клетках, стимулирует ангио-и нейрогенез (Siren A.L. et al. 2001; Leist M. et al. 2004; Belayev L., et al. 2005). Вместе с тем, в связи с низким проникновением ЭПО через гематоэнцефалический барьер эти свойства препарата выявляются только в высоких дозах, в 20-100 раз превышающих терапевтические, что часто приводит к развитию побочных эффектов со стороны сердечнососудистой системы (повышение артериального давления), повышается риск тромбообразования. (Н. Ehrenreich, et al. 2009, R. Krapf, 2009., N.D. Vaziri 2001.)

В последнее время все большее внимание уделяется исследованиям, направленным на разработку транспортных систем для адресной «таргетной» доставки лекарственных препаратов в различные органы и ткани. Одним из таких

способов является включение веществ в полимерные системы доставки (Р.Н. Аляутдин 2001, Т.А. Воронина, и др., 2008., С. Э. Гельперина, В. И. Швец 2009.), в частности, использование поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА) покрытых сурфактантами (полисорбатом-80) и наночастиц на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА) (H.R. Kim, et al. 2007, Гельперина и др. 2011). На основе ПБЦА наночастиц в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг разрабатываются такие препараты, как ванкамицин, ампициллин (Kreuter, 1994), мет-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2000), лей-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2001) и доксорубицин (Gelperina et al.,2003), который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США и Европе. ПЛГА были использованы для доставки в мозг доксорубицина и лоперамида (Tosi G, et al.

2007).

Показано, что при введении веществ в полимерные наночастицы (ПБЦА, ПЛГА) повышается биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия лекарственных препаратов, а также снижаются их побочные эффекты и токсичность (Kreuter, Gelperina et al., 2003 Воронина и др.

2008). В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН в течение многих лет проводятся исследования по созданию препаратов, обладающих нейропротективной активностью, разработана методология поиска нейропротективной активности у новых веществ и известных препаратов (Середенин С.Б., Воронина, 2007; Гарибова и соавт., 2008; Островская Р.У., Гудашева Т.А., и соавт., 2009; Г.И. Ковалев и соавт., 2009; Р.С.Мирзоян и соавт., 2010; Воронина Т.А., 2010). В связи с этим представляется актуальным изучение нейропротективного действия РЭЧ и его наносомальных форм.

Целью исследования явилось экспериментальное изучение нейропсихофармакологической активности РЭЧ, включенного в наночастицы на основе ПБЦА и ПЛГА.

Задачи исследования.

1. Разработать методику включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот.

2. Разработать подходы к стандартизации наносомальных форм РЭЧ на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот.

3. Изучить возможность проникновения ПБЦА и ПЛГА наночастиц с включенным в их состав РЭЧ через гематоэнцефалический барьер, используя метод иммуноферментного анализа.

4. Исследовать противогипоксический эффект РЭЧ, включенного в

ПБЦА и ПЛГА наночастицы в сравнении с нативным РЭЧ.

4

5. Изучить нейропротективные свойства РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы на модели интрацеребрапьной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) в сравнении с нативным РЭЧ.

6. Изучить влияние РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, на уровень экспрессии мРНК нейротрофических факторов BDNF и NGF.

Научная новизна. Впервые разработаны методики включения РЭЧ в носители на основе ПБЦА и ПЛГА наночастиц; проведена стандартизация полученных наносомальных форм РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы. Показана возможность доставки РЭЧ в мозг. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) установлено, что концентрация РЭЧ в головном мозге мышей при использовании наносомальной формы на основе ПБЦА наночастиц значительно превышает концентрацию нативного РЭЧ.

Впервые выявлены нейропсихофармакологические свойства наносомальных форм РЭЧ. Показано, что РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, покрытые полисорбатом-80, как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном введении обладает противогипоксическим эффектом и нейропротективными свойствами. На модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой выявлена способность наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц предотвращать гибель животных, уменьшать неврологические дефициты, улучшать ориентировочно-исследовательское поведение и память.

Выявлен один из механизмов нейропротективного действия новой наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. С помощью метода полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции показано, что наносомальная форма РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц в опытах in vivo значительно увеличивают экспрессию генов нейротрофинов BDNF и NGF в фронтальной коре и гиппокампе крыс.

Научно-практическая значимость. Разработанные методики включения РЭЧ в полимерные наночастицы и подходы к стандартизации могут быть в дальнейшем использованы для создания новой лекарственной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. Результаты эффективности эритропоэтина, включенного в ПБЦА-наночастицы, как нейропротектора, открывают перспективу для исследований по разработке и внедрению новой наносомальной формы эритропоэтина в качестве препарата для лечения заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией.

Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные формы нанокапсулированного эритропоэтина и проведено их фармакологическое изучение, разработана и апробирована методика определения концентрации эритропоэтина в тканях головного мозга, изучены потенциальные механизмы нейропротективного действия РЭЧ, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

На втором международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2009) Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург 2010)

VII Международной научно-практической конференции «Наука и современность» (Новосибирск 2010)

llth European College of neuropsychopharmacology Regional Meeting (St. Petersburg 2010)

III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых "Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии" (Волгоград 2011)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающий .... отечественных и .... зарубежных источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 3 схемами и 20 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные методики включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот позволяют получить новые формы РЭЧ, проникающие через ГЭБ.

2. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, обладает противогипоксическим действием на моделях гипоксии с гиперкапнией, гипобарической гипоксии и противоинсультным действием на модели

геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

3. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, при внутривенном введении способен стимулировать экспрессию нейротрофических факторов NGF и BDNF в коре и гиппокампе мозга крыс.

Материалы и методы исследования

Вещества, используемые в исследовании. В исследовании были использованы: субстанция человеческого рекомбинантного эритропоэтина (ООО «Протеиновый контур»); мономер бутилцианоакрилат (Sichel Werke, Германия); полисорбат 80 (ПС-80, твин-80) - Sigma; Pluronic F68 (полоксамер 188) - Sigma; сополимер молочной и гликолевой кислот - PLGA 50/50 - Absorbable Polymers International (в дальнейшем - ПЛГА; экстракционный лизирующий буфер готовили согласно методике Pollock et al. (Pollock G.S., et al. 2001.)

Животные. Опыты проведены на самцах белых нелинейных крыс массой 200-220г, самцах крыс линии Wistar массой 200-210 г и самцах белых беспородных мышей массой 20-25 г. (питомник "Столбовая" РАМН). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), приказу МЗ РФ №276 от 19.06.2003г. Эксперименты проводили с 10 до 16 часов.

Получение экспериментальной формы эритропоэтина сорбированного на ПБЦА наночастицах. В исследовании использовали мономер бутилцианоакрилата. Наночастицы получали в НИИ Молекулярной медицины Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Для синтеза ПБЦА наночастиц использовали метод кислотной полимеризации в среде содержащей полоксамер 188 и янтарную кислоту (Kreuter J., 1990). К раствору по каплям добавляли бутилцианакрилат. Для равномерной полимеризации полученную композицию перемешивали с помощью магнитной мешалки при скорости 500 об/мин в течение 4 ч при постоянном нагревании до 40°С. Образовавшуюся суспензию нейтрализовали с помощью 0,1 M раствора гидроксида натрия и фильтровали через стеклянный фильтр (размер пор 1 мкм). К полученной суспензии ПБЦА наночастиц прибавляли раствор субстанции РЭЧ и перемешивали магнитной мешалкой при скорости 500 об/мин в течение 5 часов. Далее инкубировали в течении 3 часов при температуре +4°С.

Получение экспериментальной формы эритропоэтина, включенного в ПЛГА наночастицы. В исследовании применяли сополимер молочной и гликолевой кислот (ПЛГА). Приготовление наночастиц для поверхностной сорбции вели методом нанопреципитации используя модифицированный метод

7

Santos-Magalhaes (Santos-Magalhaes N.S., 2000). Раствор сополимера молочной и гликолевой кислот ПЛГА в ацетоне добавляли 1% раствору pluronic F68. Полученный раствор при комнатной температуре по каплям добавляли в раствор полоксамера 188. Ацетон удаляли при постоянном нагревании до 50° С в течение 50 минут, суспензию фильтровали через стеклянный фильтр с размером пор 1 мкм. К полученной суспензии ПЛГА наночастиц прибавляли раствор субстанции РЭЧ и перемешивали магнитной мешалкой при скорости 500 об/мин в течение 4 часов. Далее инкубировали в течении 3 часов при температуре +4.

Определение степени включения РЭЧ в наночастицы. Степень сорбции РЭЧ определяли как отношение количества РЭЧ, связанного с наночастицами, к общему количеству РЭЧ. Для определения степени сорбции сепарировали свободный и связанный РЭЧ методом ультрацентрифугирования (центрифуга Beckman modell 5, США). Концентрацию РЭЧ в супернатанте определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА, набор - К040 ProCon ЕР02, ООО «Протеиновый контур», Россия).

Размер частиц определяли методом фотонно-корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K) при следующих рабочих параметрах прибора: угол светорассеяния 90 градусов, температура 25 градусов, вязкость среды 0,01 пуаз, показатель преломления среды 1,333.

Форму полученных наночастиц изучали с использованием метода трансмиссионной электронной микроскопии (трансмиссионный электронный микроскоп HU-12 (Hitachi, Japan). Суспензии ПБЦА и ПЛГА наночастиц наносили на медные предметные сетки, покрытые формваровой пленкой, препараты высушивали на воздухе и просматривали в микроскопе.

Методика определения содержания РЭЧ в головном мозге с помощью иммуноферментного анализа. Для определения возможности доставки эритропоэтина с помощью полимерных наночастиц через неповрежденый ГЭБ вещества вводили мышам внутривенно и измеряли концентрацию ЭПО в тканях головного мозга. Эксперименты выполнялись на нелинейных белых мышах-самцах весом 19-21 г. Препараты в дозе 0,5 мг/кг вводили мышам в хвостовую вену за 45 минут до начала опыта. У животных извлекали головной мозг, помещали в экстракционный лизирующий буфер, гомогенизировали и после инкубационного периода центрифугировали. Концентрацию ЭПО в полученном супернатанте определяли методом иммуноферментного анализа с помощью набора К040 ProCon ЕР02 (ООО «Протеиновый контур»), анализатор Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США).

Механизм нейропротективного действия РЭЧ и его наносомальной формы изучали в опытах на крысах самцах линии Wistar с использованием метода полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Определяли влияние РЭЧ на экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF in vivo. Для проведения обратной транскрипции в опытах использовали набор фирмы "Силекс" (Россия). Оценку уровня экспрессии BDNF и NGF мРНК проводили с использованием количественной ПЦР в реальном времени (real-time quantitative PCR, система МхЗОООР, Stratagene, США). Применяли высокоспецифичный сВДНК-связывающий краситель SYBR green I.

Противогипоксическое действие веществ оценивали на моделях гипобарической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме в опытах на мышах. Регистрировалось время жизни животных. Гипоксия с гиперкапнией («баночная гипоксия») моделировалась на животных одинакового веса (разброс в группах не более 2-х г). Мышей помещали по одному в герметически закрываемые банки объемом 200 см2. Гипобарическая гипоксия создавалась в проточно-вытяжной барокамере с поглотителем С02. Животных «поднимали на высоту» 11 км, со скоростью 20 м/сек до площадки «высотой» 11000 м. Экспозиция составляла 10 минут. Затем в течение 5 минут животных «спускали» до исходных условий. Для устранения гиперкапнии в камере находилась 30-35% щелочь. Для создания идентичных условий гипоксии в камеру одновременно помещались животные опытной и контрольной групп.

Противоинсультный эффект наносомальных форм эритропоэтина изучали в опытах крысах на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (ИПГ), геморрагического инсульта (ГИ) согласно методике Макаренко и соавторов (1999), Воронина и соавт. (2005).

Интрацеребральная посттравматическая гематома (геморрагический инсульт) у крыс

Для оценки нарушения поведения и состояния животных использовался комплекс методов, традиционно применяемых в психофармакологии. Неврологический статус животных определяли с использованием шкалы Stroke-index Мс Grow для монгольских песчанок (Мс Grow, 1977) в модификации И.В. Ганнушкиной (1996). Для оценки нарушения координации движений у животных использовался тест вращающегося стержня (3 об./мин.). Ориентировочно -исследовательское поведение у крыс оценивали в условиях методики открытого поля в течение 3-х минут, для исследования обучения и памяти крыс использовали условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ, Passive avoidance фирмы Lafayette Instrument Со, США). Взвешивание животных проводили до эксперимента и на 14-е сутки после операции.

Результаты исследования Изучение фармацевтических характеристик наноформ человеческого рекомбинантного эритропоэтина

Приготовление ПБЦА наночастиц с РЭЧ. Для синтеза ПБЦА наночастиц использовали метод кислотной полимеризации в среде содержащей полоксамер 188 и янтарную кислоту. Оптимальный рН для синтеза наночастиц находится в пределах 1,9-3,0. В данном диапазоне не происходит коагуляции бутилцианоакрилата при полимеризации и образующиеся наночастицы имели

10

правильную шаровидную форму и размер 230-250 нм. Процент включения РЭЧ в ПБЦА наночаетицы определяли методом иммуноферментного анализа, он составил составил 76,4%.

Приготовление ПЛГА наночастиц с РЭЧ. Приготовление наночастиц для поверхностной сорбции вели методом нанопреципитации используя модифицированный метод 8ап1о5-Ма£аШаез (8атоз-Ма§а!Ьаез N.8., 2000). Данная методика позволила получить наночаетицы однородные по размеру и имеющие правильную шаровидную форму. Синтезированные ПЛГА наночаетицы имели размер в диапазоне 260-350 нм. Процент включения РЭЧ в ПЛГА наночаетицы определяли методом иммуноферментного анализа, он составил составил составил 13,8%.

Изучение возможности проникновения РЭЧ включенного в полимерные носители через ГЭБ. Для изучения проникновения РЭЧ через ГЭБ использовали иммуноферментный анализ лизатов ткани головного мозга мышей. Измерение концентрации РЭЧ в образцах тканей мозга экспериментальных животных показало статистически достоверное увеличение уровня РЭЧ в ЦНС мышей, получавших РЭЧ, включенный в ПБЦА наночаетицы, покрытые ПС-80, в сравнении с контрольной группой мышей, получавших физиологический раствор (рис. 1). У животных, получавших только ПБЦА наночаетицы или водный раствор РЭЧ увеличения концентрации РЭЧ в мозге мышей не наблюдалось. В группах животных получавших раствор РЭЧ с ПС-80 или РЭЧ, включенный в ПЛГА-наночастицы, отмечалась лишь тенденция увеличения уровня РЭЧ в тканях мозга мышей (рис.1).

Таким образом, установлено, что только ПБЦА наночаетицы с ПС-80 способны обеспечить доставку РЭЧ через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении, статистически достоверно (в 3 раза, р<0,01) увеличивая его концентрацию в тканях мозга мышей.

* - статистически достоверное отличие от группы контроля (I критерий Стьюдента р<0,01). По вертикали: концентрация РЭЧ в лизатах ткани мозга мышей взятых на 45 минуте после введения

экспериментальных форм РЭЧ, нг/мл.

Изучение противоинсультного и нейропротективного эффектов РЭЧ, включенного в полимерные наночастицы.

Изучение противогипоксических свойств веществ

Исследование противогипоксической активности новых форм РЭЧ на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме показало, что нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, в дозах 0,05 мг/кг и 0,025 мг/кг не оказывали влияния на продолжительность жизни животных. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, в дозе 0,025 мг/кг не изменял, а в дозе 0,05 мг/кг статистически достоверно увеличивал (в 1,3 раза при р<0,05) продолжительность жизни мышей.

Изучение противогипоксической активности соединений на модели острой гипобарической гипоксии показало, что РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, в дозе 1 мг/кг и, особенно, в дозе 0,1 мг/кг обладал выраженным противогипоксическим действием, значительно увеличивая выживание животных в условиях барокамеры. У нативного РЭЧ в дозах 0,1 мг/кг и 1 мг/кг эффект выявлен не был.

Таким образом, нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, в диапазоне доз от 0,025 до 1 мг/кг не обладали противогипоксическим эффектом на моделях гипобарической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, а РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, в этих дозах статистически достоверно увеличивал продолжительность жизни мышей. Наиболее выраженный противогипоксический эффект был выявлен у РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, в диапазоне доз от 0,05 мг/кг до 0,1 мг/кг.

Изучение противоинсультных свойств веществ

Изучение противоинсультного эффекта новых форм РЭЧ проводили на модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной

12

ш

i

Физр-р ПБЦА-НЧ РЭЧ РЭЧ-ПС-80 РЭЧ ПБЦА РЭЧ ПЛГА

посттравматической гематомой. Установлено, что в группе ложнооперированных (ЛО) крыс количество животных с легкими неврологическими нарушениями (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор) составляло от 12,5 до 25% в течение всего времени наблюдения. Подобные изменения у контрольных крыс с ИПГ наблюдались у 40-50% животных. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, оказывал значительное протекторное действие, уменьшая количество крыс с неврологическими нарушениями в 2 раза (табл). РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, практически не оказывали влияния на легкие неврологические нарушения у крыс с ИПГ.

Таблица. Влияние исследуемых веществ на развитие легких неврологических нарушений у животных с ИПГ.

Группа крыс Количество животных с легкими нарушениями

время после операции, сутки

1-е 7-е 14-е

абс.пок. отн.пок. абс.пок. отн.пок. абс.пок. отн.пок.

ЛО 1 /20 5 3/ 20 15 2/20 10

ИПГ 10/20 50 5/13 39 1/6 17

ИПГ+РЭЧ 4/10 40 5/9 55 3/7 43

ИПГ+РЭЧ+ПБЦА 3/11 27 3/10 30 1 19 11

ИПГ+РЭЧ+ПЛГА 6/10 60 3/8 37,5 3/6 50

При регистрации тяжелых неврологических нарушений (птоз, манежные движения, парезы и параличи конечностей) установлено, что у ложножнооперированных животных этих проявлений не наблюдалось. В группе крыс с ИПГ парезы, манежные движения, параличи развивались у 20-40% крыс. Нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, не оказывали существенного влияния на проявления неврологического дефицита у крыс с ИПГ, наблюдалась лишь тенденция ослабления этих нарушений. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, в значительной степени (в 2 раза) ослаблял тяжелые проявления неврологический нарушений у крыс с ИПГ (рис 2).

Рисунок 2. Влияние исследуемых веществ на развитие тяжелых неврологических нарушений у крыс с ИПГ.

По вертикали: Количество животных с тяжелыми нарушениями, %; по горизонтали: время в сутках; 1 - ЛО, 2 - животные с ИПГ, 3 - ИПГ + РЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня), 4 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня), 5 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня). #-достоверность отличий от ЛО, при р<0,05 (точный критерий Фишера) * -достоверность отличий от группы крыс с ГИ, при р<0,05 (точный критерий Фишера).

Таким образом РЭЧ, сорбированный на ПБЦА наночастицах, оказывал защитный эффект при регистрации неврологических дефицитов у крыс после геморрагического инсульта, уменьшая количество животных как с легкими, так и с тяжелыми нарушениями. Нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, не оказывали существенного влияния на проявления неврологического дефицита у крыс после геморрагического инсульта, лишь незначительно ослабляя их.

При изучении влияния веществ на координацию движений животных в тесте вращающегося стержня установлено, что у крыс с ИПГ, в сравнении с ложнооперированными животными, наблюдалось статистически достоверное увеличение количества падений с вращающегося стержня. На фоне повторного введения РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, у крыс отмечалось статистически достоверное уменьшение количества падений, особенно, на 14-й день наблюдения (рис. 3). Нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, оказывали слабый позитивный эффект лишь незначительно уменьшая количество падений с вращающегося стержня крыс с ИПГ (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние экспериментальных форм РЭЧ на координацию движений крыс с ИПГ в тесте вращающегося стержня.

По вертикали: число падений крыс за 2 минуты; по горизонтали: время в сутках;! - ЛО, 2 -животные с ИПГ, 3 - ИПГ + РЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня), 4 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня), 5 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня). #-Достоверность отличий от ЛО, при р<0,05 (и критерий Манна-Уитни), *- достоверность отличий от группы крыс с ИПГ, при р<0,05 (х2)

При изучении влияния новых соединений на ориентировочно-исследовательское поведение животных в открытом поле, установлено, что у крыс с ИПГ в сравнении с ложнооперированными животными в первый день после операции наблюдалось статистически достоверное снижение всех показателей поведения в открытом поле: горизонтальной и вертикальной активности, числа обследований отверстий и снижение суммарных показателей двигательной активности (рис 4). На 14-е сутки наблюдения у ложнооперированных крыс наблюдалась естественная для этого теста адаптация к условиям эксперимента, так называемое, негативное обучение и регистрировалось снижение ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности в сравнении с показателями при первой посадке (1-е сутки). Иные закономерности наблюдались в группе крыс с ИПГ: снижение всех поведенческих показателей животных в открытом поле в первый день регистрации, значительная активация на 7-е сутки и нормализация поведения к 14-м суткам наблюдения. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, корректировал поведение крыс с ИПГ в открытом поле в 1-е и 7-е сутки после операции до уровня поведения ложнонооперированных животных. Нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, практически не оказывали влияния на поведение крыс с ИПГ в открытом поле на протяжении всего времени наблюдения (рис. 4).

Таким образом, в отличие от нативного РЭЧ и РЭЧ, включенного в ПЛГА наночастицы, РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, обладал способностью оптимизировать поведение крыс с ИПГ в условиях методики открытого поля.

Рисунок 4. Влияние новых соединений на двигательную активность крыс с ИПГ в открытом поле.

По вертикали: суммарная двигательная активность; по горизонтали: время в сутках; 1 - ЛО, 2 -животные с ИПГ, 3 - ИПГ + РЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня), 4 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня), 5 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня). # - Достоверность отличий от ЛО, при Р<0,05 (точный критерий Фишера), * - достоверность отличий от группы крыс с ГИ, при Р<0,05 (точный критерий Фишера).

Изучение влияния веществ на обучение УРПИ показало, что животные во всех пяти группах обучились условному рефлексу, т к. при его воспроизведении через 24 часов после обучения 100% животных помнили об ударе током в темной камере и не заходили туда в течение всего времени наблюдения (рис. 5). При воспроизведении УРПИ через 7 дней после обучения в группе ложнооперированных животных все 100% крыс помнили о ситуации и не заходили в темную камеру, а в группе крыс с ИПГ только 50% животных осуществляли рефлекс пассивного избегания. Сходные результаты были получены на 14-е сутки: в группе ложнооперированных животных 87% крыс осуществляли рефлекс и только 40% - в группе животных с ИПГ (рис. 5). Полученные результаты свидетельствуют о развитии у крыс с ИПГ нарушений памяти.

РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, предупреждал развитие амнезии УРПИ у крыс с ИПГ, увеличивая количество животных, осуществляющих рефлекс до 70% и 100% соответственно. Нативный РЭЧ не обладал защитным эффектом в этом тесте (рис. 5).

Таким образом, у большинства крыс с ИПГ, при воспроизведении УРПИ на 7-е и 14-е сутки после обучения развивалась амнезия УРПИ. РЭЧ, включенный в

ПБЦА наночастицы, в значительной степени ослабляли нарушения памяти, вызванные ИПГ, существенно увеличивая количество животных осуществляющих УРПИ. РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, увеличивал количество животных воспроизводящих УРПИ, но эти результаты были статистически недостоверны. Рисунок 5. Влияние веществ на обучение УРПИ крыс с ИПГ

По вертикали: количество животных не зашедших в темную камеру при воспроизведении рефлекса в %; по горизонтали: время в сутках. 1 - ЛО, 2 - животные с ИПГ, 3 - ИПГ + РЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня), 4 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня). & -Достоверность отличий от ЛО при р<0,05, (х2); *- достоверность отличий от группы крыс с ГИ, при р<0,05 (х2)

При изучении влияния веществ на динамику веса крыс с ИПГ взвешивание животных проводили до эксперимента и на 14-е сутки после операции. Установлено, что ложнооперированные животные к 14-му дню прибавили 36 г., а крысы с ИПГ потеряли 4,8 г (рис. 6). Нативный РЭЧ и РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы, не оказывали влияния на динамику веса крыс с ИПГ, а РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, в значительной степени уменьшал потерю веса крыс после инсульта.

Таким образом, только РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, предупреждал потерю веса, у крыс, вызванную ИПГ.

Рисунок 6. Влияние веществ на изменение веса крыс ИПГ (14-й день)

По вертикали: изменение веса животных. 1 — ЛО, 2 - животные с ИПГ, 3 - ИПГ + РЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня), 4 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня), 5 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня).

*- достоверность отличий от группы крыс с ГИ, при Р<0,05 (1 критерий Стьюдента)

Изучение динамики выживания крыс показало, что к 14-му дню наблюдения все ложнооперированные крысы выжили, а в группе крыс с ИПГ выжило только 30% животных. На фоне повторного 3-х дневного введения РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы к концу эксперимента выжило 75% крыс, что на 45% больше, чем в контрольной группе с ИПГ. Сходным, но менее выраженным действием, обладал нативный РЭЧ, на его фоне к 14-м суткам выжило 64% крыс. РЭЧ, сорбированный на ПЛГА наночастицах, практически не влиял на выживаемость крыс с ИПГ (рис. 7).

Таким образом, наиболее эффективным веществом, предупреждающим нарушения и гибель крыс с ИПГ был РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы. По степени выраженности эффекта соединения располагались в следующем порядке РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы > РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы > нативный РЭЧ.

Рисунок 7. Влияние веществ на выживаемость крыс с ИПГ

1

По вертикали: % выживших к 14 дню крыс; по горизонтали: время в сутках; 1 - ЛО, 2 -животные с ИПГ, 3 - ИПГ + РЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня), 4 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня), 5 - ИПГ + РЭЧ, включенный в ПЛГА наночастицы (0,05 мг/кг/3 дня). #-Достоверность отличий от ЛО, при Р<0,05 (точный критерий Фишера), *- достоверность отличий от группы крыс с ГИ, при Р<0,05 (точный критерий Фишера).

Изучение механизма нейропротективного действия РЭЧ и его наносомальной формы.

По мнению ряда авторов (Fumagalli F., 2007, Villa P., 2007), одним из механизмов нейропротективного действия эритропоэтина является активация генов нейротрофинов, а именно, BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и NGF (nerve growth factor). Для подтверждения гипотезы участия нейротрофинов в механизме нейропротективного действия эритропоэтина было изучено влияние препарата и его наноформ наэксперссию генов нейротрофинов в головном мозге крыс.

С помощью метода ОТ-ПЦР установлено, что РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы в дозе 0,05 мг/кг статистически достоверно увеличивал мРНК BDNF и мРНК NGF в гомогенатах тканей фронтальной коры в 3,5 и 1,9 раза соответственно (рис. 8). При оценке экспрессии генов исследуемых нейротрофинов в гиппокампе головного мозга крыс показано, что под действием РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы уровень мРНК BDNF увеличивался в 2,3 раза в сравнении с контролем, а уровень мРНК NGF - в 3,1 раза (р<0,05) (рис. 8). Таким образом, РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, подобно эндогенному мозговому ЭПО обладает способностью увеличивать экспрессию генов нейротрофических факторов NGF и BDNF в коре и гиппокампе крыс. Увеличение экспрессии BDNF и NGF под действием РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, по-видимому, является одним из основных молекулярных механизмов его протекторного действия на модели ИПГ. Вместе с тем, это не исключает вовлечения в механизм действия и других факторов, таких как активация антиапоптотических генов, антиоксидантные и противовоспалительные эффекты эритропоэтина, стимуляця ангио- и нейрогенеза, которые, как известно, не ассоциированы с повышением уровня эритропоэза (Belayev L. 2005, Gregory Т. 1999).

Рисунок 8. Влияние нативного РЭЧ и РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, на экспрессию нейротрофических факторов ВО№ (А) и ^Р (Б) в фронтальной коре (I) и гиппокампе крыс (II) через 1 час после внутрибрюшинного введения.

А Б А Б

По горизонтали: 1- физ. раствор, 2 - РЭЧ в дозе 0,05 мг/кг, 3 — РЭЧ, включенный ПБЦА наночастицах в дозе 0,05 мг/кг. * - статистически достоверное отличие от группы РЭЧ при р<0.05 (1 критерий Стьюдента). По вертикали: уровень мРНК нейротрофина, % от контроля.

Заключение

Проведенные в настоящей работе исследования позволили разработать методики включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот и осуществить подходы к стандартизации полученных наносомальных форм РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы. Применение метода ИФА позволило установить, что концентрация РЭЧ в головном мозге животных при использовании наносомальной формы на основе ПБЦА наночастиц значительно превышает концентрацию РЭЧ, включенного в ПЛГА наночастицы и нативного РЭЧ, что свидетельствует об эффективности использованных технологий для доставки РЭЧ в мозг животных. Подтверждением этих результатов являются, выявленные у новых наносомальных форм РЭЧ нейропсихофармакологические свойства. Показано, что РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, покрытые ПС-80 как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном введении обладает противогипоксическим эффектом и

20

нейропротективными свойствами. На модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой показана способность наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц оказывать выраженный нейропротективный эффект, предотвращая гибель животных, уменьшая неврологические дефициты, улучшая ориентировочно-исследовательское поведение и память у животных, перенесших инсульт. Выявленная в настоящем исследовании способность новой наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц увеличивать в мозге животных экспрессию генов нейротрофинов и N0?, в значительной степени определяет механизм его нейропротективного действия. Слабый или отсутствие эффекта наносомальной формы эритропоэтина сорбированного на ПЛГА наночастицах, по-видимому, связан с низким процентом сорбции и слабым высвобождением РЭЧ из комплекса с ПЛГА наночастицами.

Выводы

1. Разработаны методики включения рекомбинантного эритропоэтина человека в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот. Определены подходы к стандартизации наносомальных форм рекомбинантного эритропоэтина человека на основе ПЛГА и ПБЦА наночастиц.

2. Установлено, что 77,1% рекомбинантного эритропоэтина человека включается в ПБЦА-наночастицы из раствора и 13,8% на ПЛГА наночастицах. Полисобат-80 не влияет на степень сорбции рекомбинантного эритропоэтина человека.

3. Методом иммуноферментного анализа показано, что концентрация рекомбинантного эритропоэтина человека в мозге при введении эритропоэтина в наносомальной форме на основе ПБЦА наночастиц значительно превышает концентрацию рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в ПЛГА наночастицы, и нативного рекомбинантного эритропоэтина при их внутривенном введении мышам.

4. Рекомбинантный эритропоэтин человека, включенный в ПБЦА наночастицы, покрытые полисорбатом-80 в диапазоне доз от 0,05 мг/кг до 0,1 мг/кг при внутрибрюшинном введении обладает противогипоксическим эффектом на моделях гипобарической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, в отличие от нативного рекомбинантного эритропоэтина и рекомбинантного эритропоэтина, сорбированного на ПЛГА наночастицах.

5. Рекомбинантный эритропоэтин человека, включенный в ПБЦА наночастицы, (0,05 мг/кг/3 дня) уменьшает неврологические дефициты и количество погибших животных, восстанавливает нарушения ориентировочно-исследовательского поведения и памяти у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом).

6. Рекомбинантный эритропоэтин человека (0,05 мг/кг/3 дня) предупреждает гибель животных, а рекомбинантный эритропоэтин, сорбированный на ПЛГА наночастицах, в той же дозе ослабляет нарушения памяти у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом).

7. С помощью метода полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции показано, что наносомальная форма рекомбинантного эритропоэтина человека на основе ПБЦА наночастиц в опытах in vivo значительно увеличивают уровень мРНК нейротрофинов BDNF и NGF в фронтальной коре и гиппокампе крыс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Солев, И.Н. Изучение нейротропного действия наносомального эритропоэтина на модели тотальной ишемии головного мозга крыс [Текст] / И.Н.Солев // Второй международный форум по нанотехнологиям, Москва. - М., 2009. - С. 876.

2. Солев, И.Н. Нейропротекторное действие эритропоэтина, вводимого с использованием наиотранспортных систем [Текст] / И.Н.Солев, Р.Н.Аляутдин, В.Ю.Балобаньян, Т.Л.Гарибова // Первая международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 23-26 ноября 2010. - СПб., 2010. - С. 214-215.

3. Солев, И.Н. Эффекты наносомального эритропоэтина при интрацеребралыюй посттравматической гематоме (геморрагическом инсульте) у крыс [Текст] / И.Н.Солев, О.С.Елизарова, В.Ю.Балабаньян, С.А.Литвинова, Т.Л.Гарибова, Т.А.Воронина // VII Международная научно-практическая конференция «Наука и современность», Новосибирск, 27 декабря 2010. - Новосибирск, 2010. - С. 15-17.

4. Solev, I.N. Effect of nanosomic erythropoietin in rats with intracerebral post-traumatic haematoma (hemorrhagic stroke) [Текст] / I.N.Solev, V.U.Balabanyan, O.S.Elizarova, S.A. Litvinova, T.L. Garibova, T.A. Voronina // Russia Abstract book «llth ECNP Regional Meeting, 14-16 April 2011, St. Petersburg». - St. Petersburg, 2011. - P. 37.

5. Солев, И.Н. Разработка технологии получения наноформ рекомбинантного эритропоэтина человека. [Текст] / И.Н.Солев, О.С.Елизарова, В.Ю.Балабаньян, В.В.Тарасов, Р.Н.Аляутдин // Фармация. - 2011. - № 6. - С. 36-38.

6. Елизарова, О.С. Эффект рекомбинантного эритропоэтина человека, иммобилизованного на полимерных носителях на модели интрацеребралыюй посттравматической гематомы, геморрагического инсульта [Текст] / О.С.Елизарова, И.Н.Солев, С.А.Литвинова, В.В.Тарасов // Вестник ВолГМУ: приложение «Материалы III Всероссийского научно-практического семинара для молодых ученых "Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии"». - Волгоград: изд-во ВолГМУ, 2011.-С.31-32.

7. Балабаньян, В.Ю. Нейропротекторный эффект человеческого рекомбинантного эритропоэтина, сорбированного на полимерных наночастицах, на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (модель геморрагического инсульта) [Текст] / В.Ю.Балабаньян, И.Н.Солев, О.С.Елизарова Т.Л. Гарибова, С.А. Литвинова, Т.А. Воронина // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, № 10. - С. 12-15.

8. Солев, И.Н. Применение полимерных систем доставки для направленного транспорта рекомбинантного эритропоэтина человека через гемато-энцефалический барьер [Текст] / И.Н.Солев И.Н., О.С.Елизарова, В.В.Тарасов, В.Ю.Балабаньян, Р.Н.Аляутдин Н Естественные и технические науки. - 2011. - № 5. - С. 8-13.

9. Солев, И.Н. Изучение участия BDNF и NGF в механизме нейропротективного эффекта наноформ рекомбинантного эритропоэтина человека [Текст] / И.Н.Солев, О.С.Елизарова, В.Ю.Балабаньян, И.А.Волчек, С.А.Литвинова, Т.Л.Гарибова, Т.А.Воронина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2011., принята в печать.

Список сокращений:

ГИ - геморрагический инсульт

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ИПГ - интрацеребральная посттравматическая гематома

ИФА - иммуноферментный анализ

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция продуктов обратной транскрипции

ПБЦА - поли(бутил)цианоакрилатные наночастицы

ПКЛ - приподнятый крестооборазный лабиринт

ПЛГА - полилактидные наночастицы

ПС-8 0 - полисорбат 80

РЭЧ - рекомбинантный эритропоэтин человека

УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания

ЭПО - эритропоэтин

BDNF - brain-derived neurotrophic factor

NGF - nerve growth factor

Заказ №58-Р/10/2011 Подписано в печать 14.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 ;.,СЧ>; www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Актуальностьтемы. Заболевания, сопровождающиеся нейродегенеративными процессами, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, различные деменции, травматические и токсические поражения головного мозга, инсульты являются одной из ведущих причин инвалидицации и смерти пациентов. Несмотря на наличие значительного количества лекарственных средств для лечения этих состояний, проводимая в настоящее время* терапия недостаточно эффективна и требуются новые подходы к разработке препаратов с нейропротективной активностью. Один из современных подходов к поиску эффективных нейропротекторов основан на использовании патогенетических механизмов нейродегенерации и эндогенных защитных реакций организма.

В настоящее время накоплены обширные сведения о цитокинах -молекулах, которые: являются» посредниками межклеточных: взаимодействий; регулируют кроветворение; иммунный ответ, клеточный цикл в различных тканях, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Широко/известным и применяемым является гемопоэтический ростовой фактор

- эритропоэтин (ЭПО). В медицинской: практике для лечения анемий: различного генеза используется рекомбинантный эрйтропоэтин человека (РЭЧ). Помимо регуляции эритропоэза, ЭПО проявляет широкий спектр защитных функций в организме, участвует в защите мозга от повреждения. ЭПО и рецептор к нему (РЭПО) экспрессируются в центральной и периферической нервной системе, принимая активное участие в эмбриональном развитии млекопитающих и человека ^и Н., 1999]. Показано, что при периферическом введении РЭЧ оказывает выраженные протекторные эффекты на поврежденную различными факторами церебральную ткань через активацию антиапоптотических генов, запуская антиоксидантные и противовоспалительные механизмы в нейронах, глиальных и цереброваскулярных эндотелиальных клетках, стимулирует ангио- и нейрогенез [Siren A.L., 2001, Leist M., 2004, Belayev L., 2005]. Вместе с тем, в связи с низким проникновением РЭЧ через гематоэнцефалический барьер эти свойства препарата выявляются только в высоких дозах, в 20-100 раз превышающих терапевтические, что часто приводит к развитию побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы (повышение артериального давления), повышается риск тромбообразования [Ehrenreich H., 2009, Krapf R., 2009, Vaziri N.D., 2001].

В последнее время все большее внимание уделяется исследованиям, направленным на разработку т ранспортных систем для адресной доставки лекарственных препаратов в различные органы и ткани. Одним из таких способов является включение веществ в полимерные с истемы доставки [Аляутдин Р.Н., 2001, Воронина Т.А., 2008., Гельперина С.Э., Швец В.И., 2009], в частности, использование поли (бутил)цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА) покрытых сурфактантами (полисорбатом-80) и наночастиц «на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА) [Kim H.R., 2007, Гельперина С.Э., 2011]. На основе ПБЦА наночастиц в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг разрабатываются такие препараты, как ванкамицин, ампициллин [Kreuter J., 1994], мет-энкефалин [Ramge, Kreuter,

2000], лей-энкефалин [Ramge, 2001] и доксорубицин [Gelperina., 2003], который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США и Европе. ПЛГА были использованы для доставки в мозг доксорубицина и лоперамида [Tosi G., 2007].

Показано, что при введении веществ в полимерные наночастицы (ПБЦА, ПЛГА) повышается биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия-лекарственных препаратов, а также снижаются их побочные эффекты и токсичность [Kreuter J., 2003, Воронина Т.А., 2008]. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН в течение многих лет проводятся исследования по созданию препаратов, обладающих нейропротективной активностью, разработана методология поиска нейропротективной активности у новых веществ и известных препаратов [Середенин С.Б., 2007, Гарибова Т .Л., 2008, Островская Р.У., Гудашева Т.А., 2009, Ковалев Г.И., 2009, Мирзоян P.C., 2010, Воронина Т.А., 2010]. В связи с этим представляется актуальным изучение нейропротективного действия РЭЧ и его наносомальных форм.

Целью исследования явилось экспериментальное изучение нейропсихофармакологической активности РЭЧ, включенного в наночастицы на основе ПБЦА и ПЛГА.

Задачи исследования.

1. Разработать методику включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и*сополимеров молочной и гликолевой кислот.

2. Разработать подходы к стандартизации наносомальных форм РЭЧ на основе поли (бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и? гликолевой кислот. '

3. Изучить возможность проникновения ПБЦА и ПЛГА наночастиц с включенным в их состав РЭЧ через гематоэнцефалический барьер, используя метод имму но ферментного анализа.

4. Исследовать противогипоксический эффект РЭЧ, включенного' в ПБЦА и ПЛГА наночастицы, в сравнении с нативным РЭЧ.

5. Изучить нейропротективные свойства РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) в сравнении с нативным РЭЧ.

6. Изучить влияние РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, на уровень экспрессии мРНК нейротрофических факторов BDNF и NGF.

Научная* новизна. Впервые разработаны методики включения РЭЧ в носители на основе ПБЦА и ПЛГА наночастиц; проведена стандартизация полученных наносомальных форм РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы. Показана возможность доставки РЭЧ в мозг. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) установлено, что концентрация РЭЧ в головном мозге мышей при использовании наносомальной формы на основе ПБЦА наночастиц значительно превышает концентрацию нативного РЭЧ.

Впервые выявлены нейропсихофармакологические свойства наносомальных форм РЭЧ. Показано, что РЭЧ, включенный/в ПБЦА наночастицы, покрытые полисорбатом-80, как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном введении обладает противогипоксическим эффектом и нейропротективными свойствами. На модели геморрагического инс ульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой1 выявлена способность наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц предотвращать гибель животных, у меныиать неврологические дефициты, улучшать ориентировочно-исследовательское поведение и память.

Выявлен один из механизмов нейропротективного действия новой наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. С помощью метода полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции показано,- что наносомальная форма РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц в опытах in vivo значительно увеличивают экспрессию' генов’ нейротрофинов BDNF и NGF в фронтальной коре и гиппокампе крыс. ,

Научно-практическая^ значимость. Разработанные методики включения' ч

РЭЧ в полимерные наночастицы и подходы к стандартизации могут, быть в дальнейшем использованы для создания' новой формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. Результаты эффективности эритропоэтина, включенного в ПБЦА наночастицы, как нейропротектора, открывают перспективу для исследований по разработке и внедрению новой наносомальной формы эритропоэтина в качестве препарата для лечения заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией. •

Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные формы нанокапсулированного эритропоэтина и проведено их фармакологическое изучение, разработана и апробирована методика определения концентрации эритропоэтина в тканях головного мозга, изучены потенциальные механизмы нейропротективного действия РЭЧ, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

На втором международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2009) Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург 2010)

VII Международной научно-практической конференции «Наука и современность» (Новосибирск 2010) ‘

11th European, college of neuropsychopharmacology Regional Meeting (St. Petersburg 2010) ' ,

III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых "Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии" (Волгоград 2011) •

Публикации ,

По материалам диссертации опубликовано 3- статьи и. 5 тезисов- в материалах российских и международных конференций.

Объемьи структура диссертации

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающий 26 отечественных и 303 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 3 схемами и 21 рисунками. ю

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные методики включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот позволяют получить новые формы РЭЧ, проникающие через ГЭБ.

2. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, обладает противогипоксическим действием на моделях гипоксии с гиперкапнией, гипобарической гипоксии и противоинсультным действием на модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

3. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, при внутривенном введении способен стимулировать экспрессию нейротрофических факторов КОБ и ВОКБ во фронтальной коре и гиппокампе мозга крыс.