Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспериментальное исследование бактериохлорофиллид-серина и фенилтиопроизводных фталоцианинов как потенциальных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и флуоресцентного обнаружения новообразований

На правах рукописи

Меерович Игорь Геннадьевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛИД-СЕРИНА И ФЕНИЛТИОПРОИЗВОДНЫХ ФТАЛОЦИАНИНОВ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОБНАРУЖЕНИЯ НОВООБРАЗОВАНИЙ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук (14.00.14 - онкология)

Москва, 2005 г.

Работа выполнена в Государственном учреждении

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН.

Научные руководители:

Доктор фармацевтических наук, профессор Оборотова Н.А Доктор медицинских наук Смирнова З.С.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.А. Красновский Доктор медицинских наук, профессор Ю.П. Кувшинов

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «24» марта 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета (К.001.17.01) при ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «_» февраля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Фотохимиотерапия новообразований - направление

противоопухолевой терапии, в котором воздействие на ткань введенного химиотерапевтического агента инициируется облучением

сенсибилизированных патологических тканей световым излучением, поглощаемым этим агентом.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является наиболее активно развивающимся направлением фотохимиотерапии. При проведении ФДТ в организм пациента вводят препарат - фотосенсибилизатор (ФС), а затем облучают патологический участок оптическим излучением, поглощаемым фотосенсибилизатором. Свет выполняет функции адресации воздействия и является источником энергии для фотобиохимической реакции, приводящей к образованию в опухолевой ткани и/или сосудах опухоли цитотоксических агентов (активных форм кислорода).

Методы, основанные на использовании ФС, избирательно накапливающихся в патологических тканях и флуоресцирующих при фотовозбуждении, получили в последнее время широкое распространение и в онкологической диагностике.

Несомненные достоинства метода флуоресцентной диагностики (ФД): простота, неинвазивность, возможность совмещения процедуры с терапевтическим лазерным воздействием для проведения ФДТ - делают этот метод перспективным для обнаружения и определения границ новообразований преимущественно поверхностной и внутриполостных локализаций.

Однако созданные к настоящему времени ФС обладают недостаточно высокой селективностью накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью. Их возбуждение осуществляется светом в диапазоне 600-700 нм, сильно поглощаемым самой биологической тканью, что ограничивает глубину воздействия и снижает эффективность ФДТ и ФД. Многие ФС в

течение длительного времени (от недель до месяцев) сохраняют высокую концентрацию в коже, что приводит к длительной кожной фототоксичности и необходимости соблюдения пациентом "темнового" режима, снижая тем самим качество его жизни.

Необходимость совершенствования методов ФДТ и ФД опухолей делает актуальной задачу создания новых ФС с высокой фотодинамической активностью, хорошими флуоресцентными свойствами, высокой селективностью накопления в опухоли по отношению к нормальной ткани и коже и быстрым снижением концентрации в коже до значений, обеспечивающих отсутствие или минимизацию остаточных последствий их применения.

Актуальным является поиск ФС с поглощением в спектральном диапазоне 700-800 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей минимально. Использование таких ФС позволяет минимизировать потери на собственное поглощение ткани, увеличить глубину проникновения возбуждающего света и, за счет оптимального выбора их концентрации в тканях, обеспечить преимущественное воздействие на патологический очаг, расположенный на определенной глубине под облучаемой поверхностью.

Цель исследования

Исследование бактериохлорофиллид-серина и фенилтиопроизводных фталоцианинов в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и флуоресцентного обнаружения новообразований.

Задачи исследования

1. Исследование in vivo поглощения и флуоресценции бактерио-хлорофиллид-серина, изучение динамики и селективности его накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью.

2. Исследование фотодинамической активности бактериохлорофиллид-серина.

3. Получение липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов.

4. Исследование in vivo поглощения и флуоресценции фотосенсибилизаторов на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов, изучение динамики и селективности их накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью.

5. Исследование фотодинамической активности фотосенсибилизаторов на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов.

Научная новизна

Впервые спектрально-флуоресцентным методом изучена фармакокинетика бактериохлорофиллид-серина в ранний период после его введения и показано, что максимум концентрации этого ФС в тканях и органах достигается через 15-20 минут после введения. Селективность накопления препарата в опухоли по сравнению с нормальной тканью в этом временном промежутке составляет примерно 4:1, а через 4 часа после введения достигает значения 9:1. Обнаружены особенности спектров флуоресценции в опухоли и нормальных тканях, обусловленные различиями в них процессов биодеградации бактериохлорофиллид-серина и позволяющие совершенствовать флуоресцентный метод обнаружения опухолей и определения их границ. Показано, что терапевтическое действие при ФДТ с использованием бактерихлорофиллид-серина осуществляется, в основном, за счет нарушения кровотока в сосудистой системе опухоли, а также некроза и апоптоза клеток опухоли.

Впервые получены ФС на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианина с поглощением в, спектральном диапазоне 710-750 нм. Проведены экспериментальные исследования динамики и селективности накопления этих ФС в опухоли по сравнению с нормальной тканью и их фотодинамической эффективности. Показана перспективность исследования этого класса ФС для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии новообразований.

Практическая значимость работы

Получены и исследованы новые высокоэффективные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики на основе липосомальных дисперсий ряда фенилтиопроизводных фталоцианинов с поглощением в спектральном диапазоне максимальной прозрачности биологической ткани.

Уточнена фармакокинетика фотосенсибилизатора бактерио-хлорофиллид-серин, что позволило оптимизировать время проведения ФДТ и обеспечить ее высокую эффективность.

Предложен новый подход для флуоресцентного обнаружения и определения границ опухолей, основанный на различиях в форме спектров флуоресценции сенсибилизированных бактериохлорофиллид-серином опухолей и нормальных тканей. Апробация работы

Материалы приведенных в диссертационной работе исследований были представлены на следующих научных сообществах:

- Congress ILLA'2003, VIII International Conference on laser and laserinformation technologies: fundamental problems and applications (Plovdiv, September 27 - October 1,2003),

-Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 17-19 марта 2004 г.),

- III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 25-28 мая 2004 г.),

- 16th International Congress of Anti-Cancer Treatment (Paris, February 1-4,2005)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ. Объем и структура диссертации

Диссертация содержит 153 страницы машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы,

включающего 25 отечественных и 207 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 64 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и опухолевые модели

Работа выполнена на мышах-гибридах Ft и BDFt массой 22-24 грамм, полученных из разведения отделения лабораторных животных ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Исследования выполнялись на моделях внутримышечно перевиваемой опухоли Эрлиха (штамм ELD) и подкожно перевиваемого лимфоцитарного лейкоза Р-388. Штаммы перевиваемых опухолей были получены из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Опухоли перевивали мышам в область бедра асцитной жидкостью по 0,1 мл, содержащей 500 тыс. опухолевых клеток. Фотосенсибилизаторы вводили мышам однократно внутривенно на 5 день после перевивки. При

этом объем опухолевого узла, определяемый по формуле

где а, Ь, с - линейные размеры опухоли, составлял для опухоли Эрлиха и лимфолейкоза Р-388 соответственно 0,8-0,9 см3 и 0,35-0,40 см3. Это было обусловлено необходимостью изучения эффективности фотодинамического воздействия на опухоли больших размеров, для лечения которых и предназначались изучаемые фотосенсибилизаторы.

Фотосенсибилизаторы

- бактериохлорофиллид-серин (субстанция синтезирована в Институте Науки им. Вейцмана, Израиль);

— фенилтиопроизводные фталоцианинов: тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия; безметальный тетра-3-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианин гидроксиалюминия; тетра-3-фенилтиофталоцианин цинка (субстанции синтезированы во ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

Получение липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов

Для солюбилизации и внутривенного введения гидрофобных фенилтиопроизводных фталоцианинов были разработаны липосомальные композиции на основе лецитина (Lee), холестерина (Choi) и кардиолипина (CL). Липосомы получали по методу Бенгема смыванием водной фазой однородной пленки, полученной упариванием хлороформного раствора смеси липидов и ФС, с применением ультразвуковой соникации для уменьшения размеров везикул. Распределение липосом по размерам контролировали прибором Submicron Particle Sizer NICOMP-380 (Particle Sizing Systems, США).

Молярные отношения индивидуальных липидов и соотношения «суммарный липид: фталоцианин» подбирались экспериментально таким образом, чтобы повысить долю молекул фталоцианинов, включающихся в липидный бислой в мономерной (фотодинамически активной) форме, что оценивалось по интенсивности и форме спектра флуоресценции.

Выбранные в данной работе составы липосомальных композиций приведены в табл. 1.

Таблица 1. Молярные соотношения липидных композиций для создания липосом на основе фенилтиопроизводных фталоцианинов.

Фотосенсибилизатор Молярные соотношения липидов (Lee : Chol: CL) Соотношение "суммарный липид: фталоцианин"

Тетра-3 -фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия 10:4:0,2 236:1

Безметальный тетра-3-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианин 13:4:0,2 208:1

Тетра-3 -фенилтиофталоцианин цинка 12:4:0,2 313:1

Бактериохлорофиллид-серин растворяли в физиологическом растворе до концентрации 2 мг/мл непосредственно перед введением и вводили в хвостовую вену в дозе 20 мг/кг массы тела животного. Липосомальные дисперсии фенилтиопроизводных фталоцианинов готовили за сутки до

введения и вводили в хвостовую вену мышей из расчета 4 мг субстанции на килограмм массы тела.

Методы исследований

Исследования накопления фотосенсибилизаторов в биологических тканях проводились по интенсивности основных полос спектров их флуоресценции и поглощения, в приближении, что эти величины пропорциональны концентрации фотосенсибилизатора в ткани.

Для исследования флуоресценции применялся спектрально-флуоресцентный метод с использованием спектроанализатора «ЛЭСА-01-Биоспек» («Биоспек», Москва), при этом в качестве источников света применялись гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм и полупроводниковый лазер с длиной волны 775 нм.

Для исследования поглощения сенсибилизированных тканей in vivo применялся метод спектроскопии диффузного отражения, с использованием того же спектроанализатора. В этом случае в качестве источника света применялась галогеновая лампа непрерывного спектра. Этот же метод в диапазоне длин волн 520-590 нм использовался для исследования и мониторинга степени оксигенации крови в микроциркуляторном русле опухоли (отношения локальных содержания оксигенированной формы гемоглобина и суммарного гемоглобина).

Измерения производились на нескольких (3-5) участках поверхности опухоли, затем эти данные усреднялись. Для оценки селективности накопления дополнительно оценивался тем же методом уровень накопления препарата в зоне нормальной ткани, контралатеральной опухоли; эти данные также усреднялись. После этого вычислялся индекс селективности как соотношение интенсивности флуоресценции в опухоли и нормальной ткани.

Были проведены также исследования биораспределения бактериохлорофиллид-серина по тканям и органам животных и построена зависимость интенсивности флуоресценции препарата в них от времени. Для этого забивали по 3 животных через различные промежутки времени после

введения препарата и исследовали флуоресценцию их опухолевых и мышечных тканей, а также печени, почек, селезенки и кожи.

Для проведения ФДТ был разработан источник света на основе дуговой ксеноновой лампы с перестраиваемым фильтром, что обеспечило возможность облучать патологический участок узкополосным квазимонохроматическим излучением с регулируемой длиной волны спектрального максимума и спектральной полушириной 30-40 нм. Разработанный источник обеспечивал мощность терапевтического облучения до 800 мВт при диаметре светового пучка в зоне облучения 16 мм. Мощность излучения в облучаемой зоне контролировалась измерителем световой мощности "Optometer S370" (UDT Instruments, США).

Эффективность ФДТ оценивалась по критерию торможения роста опухолей, вычисляемому по формуле:

ТРО(%) = ^-^хЮО,

где: ТРО - торможение роста опухолей;

IVk - средний объем опухолей в контрольной группе (см3);

V0 - средний объем опухолей в опытной группе (см3).

Опытные группы формировали из 5-6, а контрольные - из 8-10 мышей.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Фишера-Стьюдента. Разницу считали достоверной при р < 0,05.

В некоторых экспериментах после фотодинамического воздействия были проведены патоморфологические исследования опухолей. Животные забивались на 9 день после облучения, опухоли фиксировались в 10%-ном нейтральном формалине с последующей заливкой в парафин. Парафиновые срезы окрашивались гематоксилином и эозином по стандартной методике, после чего проводилось макро- и микроскопическое исследование. Патоморфологические исследования проводились на кафедре патологической анатомии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 1. Исследование флуоресцентных и фотодинамических свойств бактериохлорофиллид-серина.

В спектрах сенсибилизированных BcЫ-Ser тканей наблюдается выраженная полоса поглощения в области 770 нм.

Спектры флуоресценции, регистрируемые спектроанализатором "ЛЭСА-01-Биоспек" в сенсибилизированных Bchl-Ser тканях при возбуждении излучением полупроводникового лазера с длиной волны 775 нм, имеют один пик с максимумом на длине волны 840 нм. В опухолевой и нормальной ткани спектры флуоресценции имеют только амплитудные отличия. При возбуждении №-№ лазером (длина волны излучения 633 нм) спектры сенсибилизированных Bchl-Ser опухолевых и нормальных тканей существенно отличаются по форме (рис.1). Спектр флуоресценции опухолевой ткани имеет два пика с максимумами около 700 и 790 нм, с четко выраженным провалом между ними в спектральном диапазоне 730-750 нм.

600 650 700 750 800 850 900 Длине волны, им

Рис. 1. Спектры флуоресценции тканей мыши F1 с опухолью Эрлиха, сенсибилизированных Bchl-Ser, при возбуждении излучением лазера с

длиной волны 633 нм: 1 — опухоль, 2 - нормальная ткань. Препарат введен за 17 минут до исследования в дозе 20 мг/кг.

При спектрально-флуоресцентных исследованиях Bchl-Ser было обнаружено, что концентрация препарата в опухоли достигает максимальных значений через 15-20 минут после его внутривенного введения, а затем

снижается более чем вдвое в течение 4 часов в результате его метаболизма и выведения из организма. Интенсивность флуоресценции в опухоли через 15 минут оказалась примерно в 4 раза выше по сравнению с ее значениями в коже. Наиболее высокая интенсивность флуоресценции на начальном этапе наблюдается в печени, почках и селезенке. Спад интенсивности флуоресценции в коже, мышечной ткани и внутренних органах в течение первых 4 часов происходит заметно быстрее по сравнению с опухолью (в коже и мышечной ткани в 4-6 раз, в селезенке в 3-4 раза, в почках в 4-5 раз, в печени - более чем в 20 раз).

Индекс селективности накопления BcЫ-Ser в опухоли по отношению к нормальной ткани, оцениваемый по интенсивности полосы флуоресценции с длиной волны 840 нм при возбуждении лазером с длиной волны 775 нм, достигает 4 уже через 15-20 минут после введения. Максимальное значение индекса селективности достигается примерно через 4 часа после введения и составляет 9-10. При оценке селективности накопления по интенсивности флуоресценции в спектральном диапазоне 770-790 нм, возбуждаемой лазером с длиной волны 633 нм, получаются близкие значения (около 4 на начальном этапе и 8-10 через 4 часа) (рис.2).

Рис. 2. Индекс селективности накопления BcЫ-Ser в опухоли Эрлиха по отношению к нормальной ткани мышей, оцениваемый по интенсивности флуоресценции при возбуждении лазерным излучением с различными длинами волн: -- • -- 775 нм, -А- 633 нм. Bchl-Ser введен в дозе 20 мг/кг.

Один из механизмов селективности BcЫ-Ser реализуется благодаря характерному для производных бактериохлорофилла повышенному сродству к липопротеинам низкой плотности (ЛПНП) плазмы, поскольку активно пролиферирующие опухолевые клетки продуцируют повышенное количество рецепторов к ЛПНП.

Дополнительное повышение селективности накопления Bchl-Ser в опухоли по сравнению с нормальной тканью связано с процессами его биодеградации в биологической ткани, при которых образуются продукты его окисления (хлорин) и деметаллизации (бактериофеофитин). Изучение спектров флуоресценции сенсибилизированных Bchl-Ser тканей животных показывает, что скорость накопления хлорина и бактериофеофитина в нормальных тканях заметно выше, чем в опухолях. Это можно объяснить меньшим содержанием кислорода в сосудах и тканях опухолей по сравнению с нормальными тканями. Отличия в процессах биодеградации приводят к дополнительному понижению концентрации Bchl-Ser в нормальной ткани по сравнению с опухолью. С другой стороны, они объясняют различия в форме спектров флуоресценции. Спектр флуоресценции сенсибилизированных тканей при возбуждении на длине волны 633 нм складывается из нескольких основных компонент: полосы собственно Bchl-Ser (с максимумом около 790 нм), хлоринов (интенсивная полоса с максимумом около 700 нм) и бактериофеофитина (с максимумом флуоресценции около 760 нм). В нормальной ткани флуоресценция бактериофеофитина дает больший вклад в суммарный спектр, что и приводит к сдвигу максимума длинноволновой полосы и сглаживанию "провала" между ней и полосой хлорина. Эти различия в спектрах флуоресценции опухолей и нормальных тканей, сенсибилизированных Bchl-Ser, могут быть использованы для создания нового подхода к флуоресцентной диагностике, дополняющего ранее разработанные методы. Действительно, анализ спектров флуоресценции, полученных в течение нескольких часов после введения, показывает, что,

несмотря на существенное снижение интенсивности, соотношение между ее значениями в диапазонах 780-800 нм и 730-750 нм в течение длительного времени остается примерно постоянным, но существенно разным для опухолевых и нормальных тканей. Введя для оценки этого соотношения параметр нормированной флуоресценции:

(где I - параметр нормированной флуоресценции, ^ - интенсивность флуоресценции в спектральном диапазоне 780-800 нм, !У - интенсивность флуоресценции в спектральном диапазоне 730-750 нм), которым можно охарактеризовать в каждой точке изучаемого участка эту особенность флуоресценции Bchl-Ser мы обнаружили, что значение этого параметра в нормальной ткани составляет не более 0,04, в то время как в патологической ткани оно превышает 0,08 (рис.3).

Рис. 3. Изменение во времени параметра нормированной флуоресценции сенсибилизированных Bchl-Ser опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2) мышей при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 633 нм.

Численные значения этого параметра не зависят от интенсивности возбуждающего излучения. Это позволяет более адекватно связать разницу в его значениях с отличиями биохимических свойств в опухолях и нормальных тканях и повысить достоверность обнаружения опухолей и определения их границ.

Полученные данные о динамике концентрации БеЫ-8ег в опухоли позволили выбрать для фотодинамического облучения временной интервал 15-35 минут после введения, когда концентрация ФС в опухоли была близка к максимальной. При проведении ФДТ опухоли облучались в течение 20 минут излучением лампового источника света с длиной волны 770 нм и плотностью мощности около 250 мВт/см2. ФДТ вызывала значительное торможение роста опухоли Эрлиха, достигающее 76%. Облучение опухоли дозой света 150-200 Дж/см2 приводило к полной необратимой деоксигенации крови в ее микроциркуляторном русле (рис.3), что позволяет предположить сосудистый характер фотодинамического поражения опухоли при использовании БеЫ-8ег. Это было подтверждено патоморфологическим исследованием, которое выявило сильные поражения сосудов в виде геморрагии и тромбозов на фоне выраженного некроза и апоптоза клеток опухоли (рис.4).

Рис. 3. Изменение уровня оксигенации крови в микроциркуляторном русле опухоли Эрлиха в процессе ФДТ с БеЫ-8ег. Плотность мощности 250 мВт/см2. Стрелка показывает момент прекращения облучения. БеЫ-8ег введен за 15 минут до облучения в дозе 20 мг/кг.

Рис. 4. Результаты патоморфологических исследований опухоли Эрлиха после ФДТ с БсЫ-8ег.

Глава 2. Исследование фенилтиопроизводных фталоцианинов в липосомальной форме в качестве потенциальных агентов для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики

Тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия ГЗ-(РЬ5УРсАЮН].

Спектр поглощения сенсибилизированной [3-(РЬ5)4-РсА10Н] опухоли имеет интенсивную полосу в области 710-740 нм, значительно (более чем в 5 раз) превышающую как собственное поглощение несенсибилизированной ткани, так и поглощение сенсибилизированной нормальной ткани (рис.5). Это обеспечивает высокую эффективность фотовозбуждения ФС при облучении опухоли излучением с длиной волны, соответствующей спектральному максимуму его поглощения, поскольку его молекулы поглощают около 80% света в указанном диапазоне.

625 650 675 700 725 750 775 800 825 Длина волны, им

Рис. 5. Спектры поглощения опухоли (1) и нормальной ткани (2) мыши, сенсибилизированной [3-(PhS)4-PcA10H], через 20 часов после введения в дозе 4 мг/кг в липосомальной форме. 3 - спектр поглощения до введения фотосенсибилизатора.

Обращает на себя внимание динамика формы спектра поглощения [3-(PhS)4-PcAIOH] в опухоли (рис.6). В течение первых нескольких часов после введения положение основного спектрального максимума и отношение интенсивностей основной и коротковолновой полос поглощения примерно такие же, как у липосомальной дисперсии [3-(PhS)4-PcA10H]. В дальнейшем

(примерно через 1 сутки после введения) интенсивность поглощения становится заметно больше, спектральный максимум основной полосы поглощения сдвигается в коротковолновую сторону до 714-716 нм, а соотношение интенсивностей коротковолновой и основной полос уменьшается примерно до 0,25. В течение последующих 2-3 суток положение спектрального максимума основной полосы остается приблизительно в том же положении, что и через 1 сутки, интенсивность основной полосы поглощения остается примерно постоянной или немного падает, но существенно возрастает поглощение в коротковолновой полосе.

0.20 т

g

g 0.10-I

о

|

с 0 05 ■

0 00-1—.—,—.—.—.——,—.—I—.—,—.—,

625 650 675 700 725 750 775 800 Длина волны, нм

Рис. 6. Спектр поглощения [3-(PhS)4-PcA10H] в опухолевой ткани мыши в разные моменты времени после введения в дозе 4 мг/кг в липосомальной форме: 1 - 3 часа, 2-24 часа, 3-72 часа.

Можно предположить, что наблюдаемые спектральные изменения связаны с изменением взаимодействия молекул тетра-3-фенилтио-фталоцианина гидроксиалюминия с окружением. На начальном этапе после введения большинство его молекул находится в липидном бислое липосом. Часть из них, предположительно, находится в агрегированном состоянии, что проявляется в виде коротковолнового крыла (650-670 нм) полосы поглощения. В дальнейшем липосомы взаимодействуют с эндотелием новообразованных сосудов и клетками опухоли, молекулы попадают внутрь клеток, предположительно, за счет слияния липосом с

клеточной мембраной либо их эндоцитоза. При этом молекулы ФС высвобождаются от липосомального липидного окружения и взаимодействуют с органеллами клеток. Изменение окружения молекул приводит к спектральному сдвигу поглощения. На начальном этапе этого процесса ФС накапливается в клетках преимущественно в мономерной форме, что приводит к росту основной полосы поглощения. Последующее накопление молекул ФС в клетках также приводит к их взаимодействию между собой и агрегации, вследствие чего растет поглощение в полосе 650-670 нм.

Концентрация фотосенсибилизатора в опухоли, оцениваемая по интенсивности флуоресценции препарата, возрастает за первые сутки в 2 раза, достигает максимальных значений (примерно в 2,5-3 раза превышающих начальный уровень) между 2 и 4 сутками после введения, а затем начинает медленно снижаться (рис.7). Таким образом, в течение двух суток наблюдается накопление препарата в опухоли.

1.2

0 -I-,-,-,-,

0.1 1 10 100 1000 Время, часы

Рис. 7. Зависимость интенсивности флуоресценции [3-(РИ8)4-РсЛ10Ы] от времени после введения в дозе 4 мг/кг мышам с опухолью Эрлиха: 1 - опухоль, 2 — нормальная ткань. Пунктиром обозначен уровень аутофлуоресценции несенсибилизированной ткани.

Концентрация фотосенсибилизатора в нормальной ткани заметно меньше, чем в опухоли и монотонно снижается в течение всего времени

наблюдения, начиная с 30 минут (первая точка наблюдения) до 7 суток после введения. Через 1 час после введения оно спадает примерно в 1,5 раза, а через 1 сутки - в 2-2,5 раза, и достаточно быстро спадает до уровня, когда интенсивность его флуоресценции становится соизмеримой с аутофлуоресценцией тканей.

Индекс селективности накопления [3-(РЬ5)4-РсА10Н] в опухоли по сравнению с нормальной тканью через 1 час после введения доходит до значения 3, через 5-6 часов превышает 6, а на 2-4 сутках (при максимуме накопления в опухоли) достигает 8.

Высокая селективность накопления этого фотосенсибилизатора в опухоли при введении его в липосомальной форме может быть связана с эффективным участием в транспорте фосфолипидных липосом липопротеинов крови, в частности, ЛПНП, поскольку активно пролиферирующие неопластические клетки продуцируют повышенное количество рецепторов к липопротеинам. Важными факторами, обеспечивающими опухолетропность в липосомальной

форме, являются, с учетом особенностей ангиогенеза опухолей, размер липосом (100-200 нм) и их липидный состав, сходный с составом плазматической мембраны клеток, что облегчает проникновение содержимого липосомы в клетку (за счет слияния липосом с клеточной мембраной либо их эндоцитоза). Эти предположения корреллируют с наблюдавшейся динамикой спектров поглощения в

опухоли (см. рис. 6). Можно также предположить, что рассмотренные механизмы накопления характерны и для других фенилтиопроизводных фталоцианинов в липосомальной форме.

ФДТ с [3-(РЬ5)4-РсА10Н] в липосомальной лекарственной форме проводилась через 20-24 часа после введения ФС. Доза препарата составляла 4 мг/кг. Облучение осуществлялось излучением с длиной волны 730 нм и плотностью мощности 250-300 мВт/см2 в течение 20 мин. Доза облучения достигала 360Дж/см2. В течение 1 суток после облучения на поверхности

облученной опухоли в центральной части зоны облучения формировался некротический струп. ФДТ вызывала заметное торможение роста опухолей, достигающее 80% для опухоли Эрлиха и 84% для лимфолейкоза Р-388, а в ряде случаев - полное разрушение опухоли. Безметальный тетра-фенилтио-тетра-5-т/гет-бутилфталоцианин [3-(PhS)1-5-(t-Bu)1-PcH2].

Спектр поглощения [3-(PhS)4-5-(f-Bu)4-PcH2] в биологической ткани представляет собой выраженную полосу со спектральной шириной около 40 нм из двух частично структурированных пиков с длинами волн 718 и 747 нм на фоне широких менее интенсивных крыльев с коротковолновой (600-700 нм) и длинноволновой (760-840 нм) сторон, которые связаны, по-видимому, с агрегатами молекул [3-(PhS)4-5-(í-Bu)4-PcHi] (рис. 8).

0.20 i

Э 0.15 -

Í

«г

£ 0.10 •

i

0

1 005 -0.00 •

625 650 675 700 725 750 775 800 825 Длина волны, нм

Рис. 8. Спектр поглощения в опухоли (1) и

нормальной ткани (2) ткани мыши через 7 часов после внутривенного введения в дозе 4 мг/кг.

Концентрация ФС в опухоли, оцениваемая по интенсивности его флуоресценции, за первые 5-7 часов после введения возрастает примерно в 1,5 раза, после чего медленно снижается. Таким образом, и для этого ФС в течение длительного времени после введения наблюдается накопление в опухоли, механизмы которого, предположительно, такие же, как и ранее рассмотренные для

Концентрация ФС в нормальной ткани монотонно снижается в течение времени наблюдения. Через 2 часа после введения его концентрация уменьшается примерно в 1,5 раза, через 1 сутки - в 2-2,5 раза, а за двое суток (48 часов) спадает до уровня, когда интенсивность его флуоресценции становится соизмеримой с аутофлуоресценцией тканей (рис. 9).

1 о

01 1 10 100 Время, часы

Рис. 9. Зависимость интенсивности флуоресценции [3-(РЬ8)4-5-(/-Би)4-РсИ2] от времени после введения фотосенсибилизатора в дозе 4 мг/кг: 1 - опухоль; 2 - кожа

Индекс селективности накопления в опухоли по отношению к норме за

первые 2 часа после введения достигал значения 1,8, а к 1 суткам - 2,6, после

чего медленно снижался. У некоторых особей индекс селективности

превышал значение 4.

При ФДТ с [3-(РЬ5)4-5-(<-Ви)4-РсН2] в дозе 4 мг/кг торможение роста

опухоли Эрлиха достигало 83%.

Тетра-3-фенилтио-фталоцианин цинка [3-(РЬ8УРс2п]

Спектр поглощения тканей, сенсибилизированных [3-(РЬ8)4-Рс7п], имеет интенсивную полосу в области 700-725 нм с максимумом около 710 нм (рис.10).

Концентрация ФС в опухоли, оцениваемая по интенсивности его флуоресценции, за первые несколько часов после введения возрастает в 1,5 раза, после чего начинает снижаться. Концентрация ФС в нормальной

ткани монотонно снижается в течение времени наблюдения: через 3 часа после введения интенсивность флуоресценции спадает примерно в 2 раза, через 1 сутки - в 10 раз, а за четверо суток спадает до уровня аутофлуоресценции тканей (рис. 11). Индекс селективности накопления в интервале времени, соответствующем максимальному накоплению в опухоли (6-20 часов), достигает значений 4,5-5.

Длина волны, нм

Рис. Спектр поглощения [3-(PhS)4-PcZn] ш vivo в опухоли Эра через

Время, часы

Рис. 11. Зависимость интенсивности флуоресценции тетра-3-фенилтио-фталоцианина цинка [3-(РИ8)4-Рс2п] от времени после введения ФС в дозе 4 мг/кг: 1 - опухоль, 2 - нормальная ткань.

ФДТ с использованием [3-(РЬ5)4-Рс7п] вызывала торможение роста опухоли Эрлиха, достигающее 60%.

Выводы.

1. Установлено, что бактериохлорофиллид-серин является эффективным фотосенсибилизатором ближнего инфракрасного диапазона для фотодинамической терапии новообразований. При облучении через 15-30 минут после внутривенного введения, когда концентрация бактериохлорофиллид-серина в опухоли максимальна, наблюдается высокая эффективность терапевтического воздействия (ТРО до 76%).

2. Выявлена полная и необратимая деоксигенация крови в микроциркуляторном русле опухоли, сенсибилизированной бактериохлорофиллид-серином, при терапевтическом облучении с длиной волны 770 нм дозой 150-200 Дж/см2. Это позволяет предположить сосудистый характер фотодинамического поражения опухоли при ФДТ, что и подтверждается результатами патоморфологических исследований.

3. Высокий уровень селективности накопления бактериохлорофиллид-серина и наличие спектральных особенностей флуоресценции в опухоли по сравнению с нормальной тканью, обусловленных разной биодеградацией в них фотосенсибилизатора, позволяют рекомендовать его для флуоресцентной диагностики новообразований.

4. Получены и исследованы новые фотосенсибилизаторы на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов, поглощающих в спектральном диапазоне 700-750 нм: тетра-3-фенилтио-фталоцианина гидроксиалюминия, безметального тетра-З-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианина и тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка.

5. Установлено, что полученные фотосенсибилизаторы обладают достаточно высокой скоростью выведения из нормальной ткани. Время снижения интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора до предела обнаружения для тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия не превышает 7 суток, для тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка - 4 суток, для безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианина - 2 суток.

6. Выявлено, что полученные липосомальные фотосенсибилизаторы в течение длительного времени накапливаются в опухоли.

Максимальной селективностью накопления в опухоли по отношению к нормальной ткани обладает тетра-3-фенилтиофталоцианин

гидроксиалюминия. Его индекс селективности достигает значений 6-8 в интервале 1-3 суток после введения, когда уровень накопления в опухоли максимален.

Индекс селективности безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианина достигает 2-3 в интервале времени 6-20 часов после введения, соответствующем максимальному накоплению.

Индекс селективности тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка достигает значений 3-5 в интервале времени 6-20 часов после введения, соответствующем максимальному накоплению.

7. Установлено, что ФДТ с использованием тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия и безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианина вызывает высокий терапевтический эффект (ТРО достигает значений 80-84%). При использовании для ФДТ тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка получен умеренный терапевтический эффект (ТРО = 60 %).

8. Показана перспективность применения для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии бактериохлорофиллид-серина. Из трех фенилтиопроизводных фталоцианинов для углубленного исследования и предклинического изучения на основании ряда характеристик: технологичности синтеза субстанции и получения липосомальной дисперсии, спектрального диапазона, высокой селективности накопления в опухоли, и высокой фотодинамической активности - отобран тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Меерович И.Г, Кубасова И.Ю., Меерович Г.А., Брандис А.С., Демура С.А., Шерц А. Флуоресцентные и фотодинамические свойства бактериохлорин-серина. (2003) Естественные и Технические Науки, т.З, №6, с.26-40.

2. Меерович И. Г., Оборотова Н.А. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ. (2003) Российский Биотерапевтический Журнал, т. 2, №4, с.3-8.

3. Меерович И.Г., Кубасова И.Ю., Меерович Г.А., Брандис А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю., Шерц А. О возможности использования бактерихлорофиллид-серина в качестве фотосенсибилизатора для флюоресцентного определения новообразований. (2003) Российский БиотерапевтическийЖурнал, т. 2, №4, с.9-13.

4. Меерович И.Г., Кубасова И.Ю., Меерович Г.А., Демура С.А., Брандис А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю., Шерц А. Изучение возможности применения бактериохлорофиллид-серина в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии. (2003) Российский Биотерапевтический Журнал, т.2, №4, с. 14-18.

5. Меерович И.Г., Оборотова Н.А. Применение липосом в фотохимиотерапии. 2. Липосомальные формы для создания фотоактивируемых липосомальных препаратов и фотобиологических исследований. (2004) Российский Биотерапевтический Журнал, т.З, №1, с.7-13.

6. Смирнова З.С., Меерович И.Г., Лукьянец Е.А., Меерович Г.А., Деркачева В.М., Оборотова НА, Стратонников А.А., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Герасимова Г.К., Лощенов В.Б., Ворожцов Г.Н., Барышников А.Ю. Фенилтиозамещенные фталоцианины -новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона. (2004) Российский Биотерапевтический Журнал, т.З, № 1, с.54-60.

7. Меерович И.Г., Меерович Г.А. "Устройство для люминесцентной диагностики и фотодинамической терапии". Патент РФ №2221605 от 20 января 2004 г. с приоритетом от 24 декабря 2001 г.

8. Меерович И.Г., Меерович Г.А. "Мощный регулируемый лазерный прибор". Патент РФ №2233519 от 27 июля 2004 г. с приоритетом от 18 ноября 2002 г.

9. Меерович И.Г., Меерович Г.А. "Способ флуоресцентного контроля топологии новообразований". Патент РФ № 2220753 от 10 января 2004 г. с приоритетом от 10 декабря 2002 г.

10. G.A. Meerovich, I.Yu. Kubasova, I.G Meerovich, A. Brandis, A. Scherz. Fluorescent and photodynamic properties of infrared photosensitizer bacteriochlorin-serine. Technical Digest of ILIA '2003. VIII International Conference, Laser and laser-information technologies: fundamentalproblems and applications, September 27-Octoberl, 2003, p.121.

11. Меерович И.Г., Кубасова И.Ю., Демура С.А., Брандис А., Шерц А. Изучение в эксперименте бактериохлорофиллид-серина в качестве препарата для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии новообразований. Материалы VII Российского онкологического конгресса. Москва, 25-27 ноября 2003 г., с.254

12. Меерович И.Г., Стратонников А.А., Рябова А.В., Меерович Г.А., Оборотова Н.А., Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Лукьянец Е.А., Брандис А., Бендель П., Лощенов В.Б., Шерц А., Барышников А.Ю. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях in vivo. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Отечественный противоопухолевые препараты", Москва, 17-19 марта 2004 г., Российский Биотерапевтический Журнал, т.З, №2, с.54-55.

13. Смирнова З.С., Меерович И.Г., Лукьянец Е.А., Меерович Г.А., Деркачева В.М., Оборотова Н.А., Стратонников А.А., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Герасимова Г.К., Лощенов В.Б., Ворожцов Г.Н., Барышников А.Ю. Новые инфракрасные

фотосенсибилизаторы на основе фенилтиозамещенных фталоцианинов. МатериалыШсъезда онкологов ирадиологов СНГ. Минск, 25-28 мая 2004 г., Часть l.с.173-177.

14. Меерович И.Г., Стратонников А.А., Оборотова НА, Смирнова З.С., Барышников А.Ю. Изучение оптического поглощения сенсибилизаторов, применяемых в новых методах онкологической терапии и диагностики. Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИонкологии ТНЦСОРАМН. Томск, 24-25 июня 2004 г., Часть II, с. 132-133.

15. Меерович И.Г., Стратонников А.А., Рябова А.В., Меерович ГА, Оборотова НА, Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Брандис А., Лукьянец Е.А., Бендель П., Лощенов В.Б., Шерц А., Барышников А.Ю. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях. (2004) Российский Биотерапевтический Журнал, т.З, №3, с.37-42.

16. Meerovich I.G., Kubasova I.Y., Meerovich G.A., Stratonnikov A.A., Demura S.A., Brandis A.S., Rosenbach-Belkin V., Scherz A. Fluorescent and photodynamic properties of infrared photosensitizer bacteriochlorophyllide-serine. (2004) Proceedings ofSPIE, v.5449, p.247-256.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им И.Н.Блохима РАМН Подписано в печать 2 5 .0 1 . 05 Заказ Л» 69 Тираж 100 экз

/ г- > j

f г ; :;

' 1773

2 2'.!;?2Cj5' "

Актуальность темы

Одной из актуальных задач современной онкологии является разработка новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих максимальное разрушение опухоли при минимальном повреждении нормальных клеток и тканей организма. Сложность этой задачи обусловлена тем, что цитотоксическая активность препарата проявляется прежде всего по отношению к наиболее чувствительным клеткам организма (ретикулоэндотелиальной и иммунной систем, кроветворных органов и т.д.). Одним из перспективных путей совершенствования химиотерапии является повышение избирательности действия препарата на опухоль за счет адресации его воздействия дополнительными факторами.

Фотохимиотерапия новообразований - направление противоопухолевой терапии, в котором воздействие на ткань введенного химиотерапевтического агента инициируется облучением сенсибилизированных патологических тканей световым излучением, поглощаемым этим агентом.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является наиболее активно развивающимся направлением фотохимиотерапии. При проведении ФДТ в организм пациента вводят препарат-фотосенсибилизатор, а затем облучают патологический участок оптическим излучением, поглощаемым фотосенсибилизатором (ФС). Свет выполняет функции адресации воздействия и является источником энергии для фотобиохимической реакции, приводящей к образованию в опухолевой ткани и/или сосудах опухоли цитотоксических агентов (активных форм кислорода).

ФДТ обладает рядом преимуществ по сравнению с химио-и радиотерапией, в частности:

- избирательность фотодинамического воздействия определяется как селективностью накопления фотосенсибилизатора, так и локальностью светового облучения;

-фотодинамическое воздействие ослабляет иммунную систему пациента в меньшей степени, чем химио- и радиотерапия.

В последнее время в онкологической диагностике • широкое распространение получили методы, основанные на использовании флуоресцирующих ФС, которые избирательно накапливаются в патологических тканях. Это позволяет, обнаружив участок с повышенной интенсивностью флуоресценции, предположить наличие в нем патологического процесса. Несомненные достоинства метода флуоресцентной диагностики (ФД): неинвазивность, быстродействие, возможность совмещения процедуры с терапевтическим лазерным воздействием для проведения ФДТ -делают этот метод перспективным для обнаружения очагов ряда заболеваний преимущественно поверхностной и внутриполостных локализаций.

Однако созданные к настоящему времени ФС на основе производных гематопрофирина ("Photofrin-2", "Фотогем"), сульфофталоцианинов ("Фотосенс"), хлоринов ("Foscan") обладают недостаточно высокой селективностью накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью (индекс селективности лежит обычно в диапазоне 1,5-3). Возбуждение этих ФС осуществляется светом в диапазоне 600-700 нм, сильно поглощаемым самой биологической тканью, что ограничивает глубину воздействия и снижает эффективность ФДТ и ФД. Многие ФС в течение длительного времени (от недель до месяцев) сохраняют высокую концентрацию в коже, что приводит к длительной кожной фототоксичности и необходимости соблюдения пациентом "темнового" режима, снижая тем самим качество его жизни.

Необходимость совершенствования методов фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики опухолей делает актуальной задачу создания

ФС с высокой фотодинамической активностью и селективностью накопления в опухолях по отношению к нормальным тканям.

Не менее важными и актуальными являются задачи оптимизации фармакокинетики ФС. Их биораспределение и динамика изменения концентрации в тканях и органах должны обеспечить:

- достижение высокой селективности накопления ФС в опухоли по отношению к нормальной ткани и коже;

- сохранение высокой концентрации ФС в опухоли в течение времени, небходимого для проведения терапевтических и/или диагностических процедур;

- достаточно большую скорость снижения концентрации ФС после завершения процедур за счет выведения из организма и/или метаболизма до значений, обеспечивающих отсутствие или минимизацию остаточных последствий их применения.

Одним из важных и актуальных направлений повышения эффективности фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики является поиск ФС с поглощением в спектральном диапазоне 700-800 нм, в котором собственное поглощение биологических тканей минимально. Использование таких ФС позволяет минимизировать потери на собственное поглощение ткани, увеличить глубину проникновения возбуждающего света и, за счет оптимального выбора их концентрации в тканях, обеспечить преимущественное воздействие на патологический очаг, расположенный на определенной глубине под облучаемой поверхностью.

Цель исследования

Исследование бактериохлорофиллид-серина и фенилтиопроизводных фталоцианинов в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики новообразований.

Задачи исследования

1. Исследование in vivo поглощения и флуоресценции бактериохлорофиллид-серина, изучение динамики и селективности его накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью.

2. Исследование фотодинамической активности бактериохлорофиллид-серина.

3. Получение липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов.

4. Исследование in vivo поглощения и флуоресценции фотосенсибилизаторов на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов, изучение динамики и селективности их накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью.

5. Исследование фотодинамической активности фотосенсибилизаторов на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов.

Научная новизна

Впервые спектрально-флуоресцентным методом изучена фармакокинетика бактериохлорофиллид-серина в ранний период после его введения и показано, что максимум концентрации этого ФС в тканях и органах достигается через 15-20 минут после введения. Селективность накопления препарата в опухоли по сравнению с нормальной тканью в этом временном промежутке составляет примерно 4:1, а через 4 часа после введения достигает значения 9:1. Обнаружены особенности спектров флуоресценции в опухоли и нормальных тканях, обусловленные различиями в них метаболизма бактериохлорофиллид-серина и позволяющие совершенствовать флуоресцентный метод обнаружения опухолей и определения их границ. Показано, что терапевтическое действие ФДТ с использованием бактерихлорофиллид-серина осуществляется, в основном, за счет нарушения кровотока в сосудистой системе опухоли, а также некроза и апоптоза опухолевых клеток.

Впервые получены фотосенсибилизаторы на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианина с поглощением в спектральном диапазоне 710-750 нм. Проведены экспериментальные исследования их фармакокинетики и фотодинамической эффективности. Показана перспективность исследования этого класса ФС для флуоресцентной диагностики и фото динамической терапии новообразований.

Практическая значимость работы

Получены и исследованы новые высокоэффективные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики на основе липосомальных дисперсий ряда фенилтиопроизводных фталоцианинов с поглощением в спектральном диапазоне максимальной прозрачности биологической ткани.

Уточнена фармакокинетика фотосенсибилизатора бактериохлорофиллид-серин, что позволило оптимизировать время проведения ФДТ и обеспечить ее высокую эффективность.

Предложен новый подход для флуоресцентного обнаружения и определения границ опухолей, основанный на различиях в форме спектра флуоресценции бактериохлорофиллид-серина в опухоли и нормальных тканях.

Апробация работы

Материалы приведенных в диссертационной работе исследований были представлены на следующих научных сообществах:

- Congress ILLA'2003, VIII International Conference on Laser and laser-information technologies: fundamental problems and applications (Plovdiv, September 27 - October 1,2003);

- Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 17-19 марта 2004 г);

- III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 25-28 мая 2004 г);

- 16th International Congress of Anti-Cancer Treatment (Paris, February 1-4, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит 153 страницы машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 26 отечественных и 206 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 64 рисунками и 1 таблицей.

выводы

1. Установлено, что бактериохлорофиллид-серин является эффективным фотосенсибилизатором ближнего инфракрасного диапазона для фотодинамической терапии новообразований. При облучении через 15-30 минут после внутривенного введения, когда концентрация бактериохлорофиллид-серина в опухоли максимальна, наблюдается высокая эффективность терапевтического воздействия (ТРО до 76%).

2. Выявлена полная и необратимая деоксигенация крови в микроциркуляторном русле опухоли, сенсибилизированной бактериохлорофиллид-серином, при терапевтическом облучении с длиной волны 770 нм дозой 150-200 Дж/см2. Это позволяет предположить сосудистый характер фотодинамического поражения опухоли при ФДТ, что и подтверждается результатами патоморфологических исследований.

3. Высокий уровень селективности накопления бактериохлорофиллид-серина и наличие спектральных особенностей флуоресценции в опухоли по сравнению с нормальной тканью, обусловленных разной биодеградацией в них фотосенсибилизатора, позволяют рекомендовать его для флуоресцентной диагностики новообразований.

4. Получены и исследованы новые фотосенсибилизаторы на основе липосомальных дисперсий фенилтиопроизводных фталоцианинов, поглощающих в спектральном диапазоне 700-750 нм, где собственное поглощение биологической ткани минимально: тетра-3 -фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-от/7ети-бутилфталоцианина и тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка.

5. Установлено, что полученные фотосенсибилизаторы обладают достаточно высокой скоростью выведения из нормальной ткани. Время снижения интенсивности флуоресценции фотосенсибилизатора до уровня аутофлуоресценции биоткани для тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия не превышает 7 суток, для тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка - 4 суток, для безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-т/?е/и-бутилфталоцианина - 2 суток.

6. Выявлено, что максимальной селективностью накопления в опухоли по отношению к нормальной ткани обладает тетра-3 -фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия. Его индекс селективности достигает значений 6-8 в интервале 1-3 суток после введения, когда уровень накопления в опухоли максимален.

Индекс селективности тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка достигает значений 3-5 в интервале времени 6-20 часов после введения, соответствующем максимальному накоплению.

Индекс селективности безметального тетра-3-фенилтио-тетра-5-ти/?еи1-бутилфталоцианина достигает 2-4 в интервале времени 6-20 часов после введения, соответствующем максимальному накоплению.

7. Установлено, что ФДТ с использованием тетра-3 -фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия и безметального тетра-З-фенилтио-тетра-5-тирети-бутилфталоцианина вызывает высокий терапевтический эффект (ТРО = 80-84 %). Эти фотосенсибилизаторы наиболее перспективны для углубленных предклинических исследований.

При использовании для ФДТ тетра-3-фенилтиофталоцианина цинка получен умеренный терапевтический эффект (ТРО = 60 %).

8. Показана перспективность применения для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии бактериохлорофиллид-серина. Из трех фенилтиопроизводных фталоцианинов для углубленного исследования и предклинического изучения на основании ряда характеристик: технологичности синтеза субстанции и получения липосомальной дисперсии, спектрального диапазона, высокой селективности накопления в опухоли и высокой фото динамической активности - отобран тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия.