Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Скрининговые исследования in vivo новых фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии злокачественных новообразований

□□3488150

На правах рукописи

ИВАНОВА-РАДКЕВИЧ Вероника Игоревна

СКРИНИНГОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO НОВЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009'

Москва-2009

003488150

Работа выполнена на базе Федерального государственного унитарного предприятия Государственный научный центр «Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей» и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологически наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор

Плетенева Татьяна Вадимовна Умнова Любовь Васильевна

Якубовская Раиса Ивановна Нестерова Ольга Владимировна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита диссертации состоится 25 декабря 2009 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д.212.203.13 при ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссипацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан «_» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор ^^ Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - относительно новое направление противоопухолевой терапии. Метод ФДТ основан на избирательном накоплении в опухолевой ткани фотосенсибилизатора, способного при локальном воздействии света определенной длины волны, соответствующей максимуму поглощения, генерировать цитотоксические агенты, вызывающие повреждение структурных элементов опухолевой ткани [Лукьянец Е.А., 1998; Гельфонд M.JL, 2007; Juzeniene А. and Moan J., 2007].

К настоящему времени по ФДТ накоплен обширный экспериментальный и клинический материал. Метод ФДТ успешно применяется в клинической онкологии как с радикальной целью при ранних стадиях рака, поверхностных новообразованиях, предраковых патологических состояниях, так и с паллиативной целью [Соколов В.В. и соавт., 1995; 2006; Castaño А.Р. et al., 2004; Moghissi К., et al. 2005; Alison R. et al., 2005; Juzeniene A. and Moan J., 2007]. В большинстве зарубежных стран и в России к клиническому применению разрешены фотосенсибилизаторы первого поколения на основе гематопорфирина - Фотофрин и его аналоги [Castaño А.Р. et al., 2004; Xu et al., 2007; Решетников A.B., 2007]. Однако указанные порфириновые препараты как фотосенсибилизаторы для ФДТ имеют ряд недостатков. Вследствие слабого оптического поглощения в длинноволновой области спектра (620-640 нм) они вызывают в опухолях ограниченные по глубине фотоиндуцированные некрозы. Кроме того, они обладают неоднородным химическим составом, характеризуются недостаточной селективностью накопления в опухоли, являются причиной выраженной кожной токсичности [Миронов А.Ф., 1996; Castaño А.Р. et а)., 2004].

Многолетние и многочисленные исследования в области ФДТ новообразований позволили сформулировать следующие требования, предъявляемые с оптимальному фотосенсибилизатору [Красновский А.А., 1992; Миронов А.Ф., 1996; Castaño А.Р. et al., 2004; Juzeniene A. and Moan J., 2007]: наличие интенсивной полосы поглощения в

Работа выполнена в рамках научно-технической Программы Правительства Москвы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2004-2007,2007-2009 гг.

длинноволновой области спектра, где обеспечивается наиболее глубокое проникновение возбуждающего излучения в ткань; высокий квантовый выход триплетного состояния для эффективного образования основного цитотоксического агента - синглетного кислорода; постоянный химический состав; технологичность производства; устойчивость при хранении и введении в организм; высокая селективность накопления в опухолях по сравнению с окружающими неизмененными тканями; слабое накопление в коже; сравнительно быстрое выведение из организма; низкая токсичность.

За последние годы в нашей стране и за рубежом разработан ряд соединений -фотосенсибизизаторов для ФДТ второго поколения (Темопорфин, Пурлитин, Фоскан, Фотодитазин, Радахлорин, Фотохлорин, Фотолон и др.), - которые обеспечивают большую глубину поражения опухолевой ткани за счет наличия максимумов поглощения в более длинноволновой области спектра (650-670 нм) по сравнению с препаратами первого пооления [Миронов А.Ф., 1996; Лукьянец Е.А., 1999; Jones HJ., 2003; Решетников A.B., 2007].

Во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» разработан, успешно прошел клинические испытания и разрешен с 2001 г. для медицинского применения фотосенсибилизатор второго поколения - Фотосенс, препарат на основе сульфированных производных фталоцианина алюминия с максимумом поглощения 670 нм.

На основании клинических данных успешного применения ФДТ как с отечественными, так и зарубежными фотосенсибилизаторами при различных онкологических заболеваниях метод ФДТ с 2008 г. включен в «Перечень видов высокотехнологичной медицинской помощи, оказываемой за счет средств федерального бюджета в федеральных медицинских учреждениях» (Приказ Минздравсоцразвития РФ № 812 от 28 декабря 2007 г.).

Вместе с тем, несмотря на хорошую эффективность при ФДТ, применение перечисленных фотосенсибилизаторов имеет определенные ограничения, связанные в первую очередь с тем, что высокий терапевтический эффект регистрируется у больных с опухолями небольших размеров и незначительной инвазией. Кроме того, несмотря на имеющуюся тропность к опухолевой ткани, для них характерны низкие коэффициенты накопления в опухоли, а также длительная циркуляция в организме, что обусловливает значительную кожную фототоксичность [Миронов А.Ф., 1996; Rovers J.P. et al, 2000; Castaño A.P. et al., 2004; Juzeniene A. and Moan J., 2007].

В настоящее время ведется активный поиск новых фотосенсибилизаторов с поглощением в области так называемого «терапевтического окна» - длинноволновой области видимого спектра (700-800 нм), где поглощение биологической ткани минимально и, следовательно, облучение в этой области обеспечивает более глубокое проникновение излучения в ткань. Проведенные экспериментальные и клинические исследования соединений, поглощающих в указанной области, в том числе производных тексаферина, бензопорфирина, нафталоцианина, бактериохлорина и др. показали значительное увеличение глубины воздействия на опухоль [Rovers J.P. et al., 2000; Castaño A.P. et al., 2004; Xu et al., 2007].

Во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» синтезирован ряд фотосенсибилизаторов, характеризующихся оптимальными фотофизическими параметрами и поглощающих в указанной длинноволновой области. Оценка цитотоксических и фотодинамических свойств этих соединений in vivo для отбора наиболее перспективных претендентов для последующих доклинических и клинических исследований является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работы - изучение цитотоксических и фотодинамических свойств новых соединений, синтезированных во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» - потенциальных фотосенсибилизаторов для ФДТ злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

1. Оценить «темновую» цитогоксичность (способность подавлять рост опухоли в отсутствии облучения) восьми новых соединений на экспериментальных опухолевых моделях in vivo.

2. Оценить фотодинамическую активность восьми новых соединений на экспериментальных опухолевых моделях in vivo.

3. Отработать оптимальные режимы проведения ФДТ с отобранными эффективными фотосенсибилизаторами.

4. Оценить динамику роста опухоли при проведении ФДТ в эффективных режимах методом биокинетического анализа.

5. Проверить возможность замены эмульгатора Кремофора EL на менее токсичный Проксанол 268 при солюбилизации гидрофобных фотосенсибилизаторов.

Научная новизна

В диссертационном исследовании впервые проведена оценка in vivo цитотоксичности и фотодинамической активности восьми новых, синтезированных во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» соединений с поглощением света в длинноволновой области видимого спектра (700-740 нм). Установлена высокая фотодинамическая активность четырех соединений, принадлежащих к трем химическим классам.

На основании результатов диссертационных исследований получен патент «М,М'-дифторборильные комплексы М-(3-арил-2Н-изоиндол-1-ил)-М-(3-арил-1Н-изоиндол-1-имиден)аминов и способ их получения» (Патент РФ 2364600 (2009)). Результаты диссертационной работы также включены в патенты по двум новым группам фотосенсибшшзирующих соединений: тетраазахлорины (Патент РФ 2278119 (2006)) и алкилтиозамещенные фталоцианины (Патент РФ 2340615 (2008)).

Практическое значение диссертационной работы

На основании экспериментальных исследований новых соединений с поглощением в длинноволновой области видимого спектра установлена высокая противоопухолевая эффективность производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух замещенных комплексов 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметенов при ФДТ экспериментальных опухолей у лабораторных животных и показана их перспективность для дальнейшего медико-биологического изучения.

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии РУДН (разделы «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» - фармацевтическая химия, «Токсичность лекарственных средств» - токсикологическая химия).

Положения, выносимые на защиту

1. Актуальность разработки новых фотосенсибилизаторов для ФДТ злокачественных новообразований с поглощением в длинноволновой области видимого спектра с целью эффективного лечения глубоко инвазивных опухолей.

2. Доказательство в экспериментах in vivo высокой фотодинамической активности ряда новых соединений, поглощающих в длинноволновой области видимого

б

спектра (700-740 нм): производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух дифторборильных замещенных комплексов 3,3-дифенилазадиизоиндолилметенов.

3. Оценка динамики роста экспериментальных опухолей при проведении ФДТ в эффективных режимах по биокинетическим параметрам опухолевого роста.

4. Возможность замены эмульгатора Кремофора EL на менее токсичный Проксанол 268 при солюбилизации гидрофобных фотосенсибилизаторов без потери их фотодинамической активности.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены в периодической печати (опубликовано 9 работ, из них 2 статьи в журналах списка ВАК, 6 тезисов докладов, 1 патент) и доложены на: I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006 г.), Итоговой конференции СНО медицинского факультета РУДЫ «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2006 г.), I Международной конференции по биоорганической химии (Канада, 2007 г.), Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007 г.), V международной конференции по порфиринам и фталоцианинам (Москва, 2008 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008 г.), 13-м конгрессе Европейского общества фотобиологии совместно со 2-ой конференцией Европейской платформы по фотодинамической медицине (Польша, 2009).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах и имеет разделы: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический список (151 источник, из них 54 на русском и 97 на иностранных языках). Работа содержит 18 таблиц, 71 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1 диссертационной работы посвящена обзору литературы по теме диссертации. Дана общая характеристика метода ФДТ, рассматриваются теоретические основы и механизмы фотоцитотоксичности фотосенсибилизаторов,

проанализирован ассортимент фогосенсибилизаторов, применяемых в клинической и экспериментальной онкологии, приведены данные по их фотодинамической активности, токсичности, области применения, фотофизическим особенностям. На основании проведенного анализа сделан вывод об актуальности поиска новых эффективных фотосенсибилизаторов, поглощающих в области спектра 700-800 нм.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись новые соединения, синтезированные во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» для ФДТ злокачественных новообразований, - производное тетраазахлорина, два дифторборильных замещенных комплекса 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметенов, сульфанилзамещенный фталоцианин; тетраазапорфин безметальный и тераазапорфины магния и цинка. Структурные

формулы соединений представлепы на рис. 1.

С.Н, У^Ч т _У-о,н, у—мн с^АА^ н с»н» а ОууО в ОууО в в ч г

. \ 1 Л 1 \ г-ск /=\ /»-Л NN СИ /\ -Г д е к ж А- N0 ИН нн___ сн р- АГ 3

Рис. 1. Структурные формулы исследованных соединений а - 2,3,3а,21 а-тетрагвдро-2-метил-За,8,13,18-тетрафенил-5,10,15,20-тетрааза- 1Н,22Н,24Н-пирроло[3,4-Ь]порфин (Ы-метилпирролидино[3,4-Ь]тетрафенил-тетраазахлорин (ФС-1); б-М,К'-дифторборил-№[3-(4-от/)еот.-бутилфенил)-2Н-изоивдол-1-ил)]-М'-[3-(4-отреот.-бугилфенил)-Ш-изоиндол-1-илвден]амин (ФС-2); в -N,N'-дифтopбopшI-l-[3-(4-метоксифенил)-2Н-изоиндол-1-ил)]-Ы'-[3-(4-метоксифенил)-1Н-изоиндол-1-илиден]амин (ФС-3); г- 1,8,15,22-тетракис(трет-бутилсульфанил)-29Н,ЗШ-фталоцианин (ФС-4); д-тетра(«рет.-бутиламино)тетрацианотетраазапорфин магния (ФС-5); е-тетра(4-дибутиламинофенил)тетрацианотетраазалорфин магния (ФС-б); ж-тстра(4-дибутиламинофенил)тетрацианотетраазапорфин (ФС-7); з -тетра(трет.-бутиламино)тетрациакотетраазапорфин цинка (ФС-8).

В связи с гидрофобностъю исследуемых. соединений для проведения экспериментальных исследований были использованы их солюбилизаты в 4% водных мицеллярных растворах неионогенных поверхностно-активных веществ - Кремофора EL и Проксанола 268. Все изученные фотосенсибилизаторы характеризовались наличием интенсивной полосы поглощения в длинноволновой области видимого спектра (700-740 нм).

Экспериментальные исследования проведены на мышах-самках линии СВА. В качестве экспериментальной опухолевой модели использовали перевиваемые солидные формы асцитной карциномы Эрлиха и саркомы S-37.

Для прививки солидной опухоли разведенную асцитную жидкость имплантировали подкожно на предварительно депилированную наружную поверхность бедра нижней правой конечности мыши-реципиента линии СВА. На 7-е сут роста солидной опухоли для проведения экспериментальных исследований отбирали мышей с поверхностными опухолями диаметром 0,5-0,8 см.

Исследуемые мицеллярные растворы вводили в хвостовую вену мышам-опухоленосителям однократно струйно. Наружное дистанционное облучение сенсибилизированной опухоли проводили через 0,5-24 ч после внутривенного введения образцов фотосенсибилизаторов.

Облучение опухоли проводили на аппарате терапевтическом онкологическом для ФДТ АТО-1 с непрерывным спектром излучения. Для обеспечения максимальной эффективности облучения комбинацией светофильтров КС-18 и СЗС-24 формировали спектр излучения таким образом (Кшк ~709 нм, ширина на полувысоте ~51 нм), чтобы он попадал в основные полосы поглощения исследуемых соединений в области 700740 нм. Плотность мощности облучения варьировала от 200 до 250 мВт/см2, световая доза - от 120 до 150 Дж/смг. День проведения облучения считали нулевым днем фотодинамического воздействия.

Контролем для оценки эффективности какого-либо воздействия на опухоль являлись нелеченые мыши-опухоленосители. Кроме того, проверялись влияние на рост опухоли только светового излучения в используемых режимах и, так называемая, «темновая» токсичность фотосенсибилизаторов, то есть их способность подавлять рост опухоли в отсутствие облучения.

Среднее количество животных в опытной группе составляло 10, в контрольной -15 особей. Продолжительность наблюдения за животными составляла 20-25 сут после лечения.

Противоопухолевый эффект оценивали по динамике изменения объема опухоли, значениям торможения роста опухоли (ТРО, %), по количеству в группе животных с полной регрессией опухоли к концу срока наблюдения и по времени удвоения объема опухоли. Объем опухоли (см3) рассчитывали по формуле:

значение объемов опухоли (см3) в контрольной группе. Биологически значимым считали ТРО>50%.

Объемную долю опухоли от исходного объема (ау) вычисляли по формуле:

где V, - объем опухоли в контрольный срок наблюдения, К - объем опухоли до облучения.

Определяли константы скорости роста опухоли по прямым в полулогарифмических координатах 1п(ау%) -1 По найденным константам оценивали скорости роста опухоли в разных группах животных.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета ЗШлБЙса 6,0 (81я18оЙ, США). При анализе данных рассчитывали среднегрушовое значение параметра, значение стандартного отклонения ББ и стандартной ошибки среднего БЕ. Критерием сравнения отдельных выборок с целью оценки эффективности различных режимов воздействия на опухоль был выбран непараметрический критерий Манна-Уитни (р<0,05).

(1)

где Б1, Ог и Бз - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли (см). Расчет значений ТРО (%) проводили по формуле:

(3)

Результаты и их обсуждение

Глава 3. Экспериментальное изучение in vivo фотодинамической активности

новых соединений

Проведенные экспериментальные исследования in vivo показали, что ни одно из исследуемых соединений не обладало «темновой» цитотоксичностью, то есть не подавляло рост экспериментальной опухоли в отсутствие облучения. Облучение несенсибилизированных опухолей в используемых для проведения ФДТ режимах также не приводило к торможению их роста.

3.1. Фотодинамическая активность производного тетраазахлорииа (ФС-1)

В экспериментальных исследованиях in vivo изучена фотодинамическая активность производного тетраазахлорииа (далее - ФС-1) в дозах 6,0; 3,0; 1,0 и 0,5 мг/кг в отношении солидной формы асцитной карциномы Эрлиха у мышей. При введении животным ФС-1 в дозах 6,0; 3,0 и 1,0 мг/кг и проведении сеанса облучения через 24 ч после сенсибилизации отмечено биологически значимое подавление роста экспериментальной опухоли на протяжении всего срока наблюдения, значения ТРО были высокими во всех исследуемых группах и составляли, соответственно, 88-91%, 77-95% и 54-59%. На рис. 2 представлены кинетические кривые роста опухолей в опытных и контрольной группах.

Полная регрессия опухоли была достигнута у 55%, 44% и 16% животных в группе после введения фотосенсибилизатора в дозах 6,0; 3,0 и 1,0 мг/кг, соответственно.

Проведение облучения через 24 ч после введения ФС-1 в наименьшей из исследованных доз (0,5 мг/кг) не вызывало подавления роста опухоли. При уменьшении интервала времени между введением ФС-1 в дозе 0,5 мг/кг и проведением сеанса облучения с 24 ч до 0,5 ч отмечен биологически значимый противоопухолевый эффект, наблюдаемый на протяжении 25 сут после лечения (см. рис. 2). Значения ТРО составили 78-91%, полная регрессия опухоли была получена у 29% животных в группе.

—■ — контроль —О— облучение через 24 ч после введения ФС-1 в дозе 6,0 мг/кг

10 15

а

20 25 исут

— ■— контроль

—О— облучение через 24 ч после введения ФС-1 в дозе 3,0 мг/кг

10 15 б

20 25

—■— контроль —О— облучение через 24 ч после введения ФС-1 в дозе 1,0 мг/кг

20 25 1,сут

8 —■— контроль

—О— облучение через 0,5 ч после введения ФС-1 в дозе 0,5 мг/кг

10 ' в

10 15

г

20 25

I, сут

Рис. 2. Кинетика роста опухолей при проведении ФДТ с ФС-1 в 4% Кремофоре ЕЬ

Таким образом, уровень фотосенсибилизатора, достаточный для развития биологически значимого фотодипамического эффекта, сохранялся в течение как минимум 24 ч после внутривенного введения животным ФС-1 в дозах 6,0; 3,0 и 1,0 мг/кг и 0,5 ч после введения ФС-1 в дозе 0,5 мг/кг.

3.2. Влияние природы эмульгатора в мицеллнрных растворах производного тетраазахлорина на его фотодинамическую активность

В связи с тем, что в последнее время в литературе появились данные о развитии тяжелых анафилактоидных реакций при приеме некоторых лекарственных препаратов, в состав которых входит Кремофор ЕЬ, проверена возможность его замены при приготовлении мицеллярных растворов ФС-1 на Проксанол 268. Проксанол 268 - отечественный плюроник, производимый на Опытном заводе ФГУП ГНЦ «НИОПИК», разрешен в РФ к применению в клинической практике в качестве

эмульгатора искусственной плазмы крови (препарат «Перфторан») с 4% содержанием Проксанола 268.

Анализ спектров поглощения мицеллярных растворов ФС-1 в 4% Кремофоре ЕЬ и 4% Проксаноле 268 показал, что замена эмульгатора не приводит к смещению основной полосы поглощения солюбилизата с максимумом на 715 нм.

Экспериментальные исследования показали, что внутривенное введение 4% водной эмульсии Проксанола 268 в объеме 0,4 мл (двукратно превышающем объем вводимого солюбилизата фотосенсибилизатора) как в отсутствие облучения, так и при проведении сеанса облучения через 0,5 ч, не вызывало биологически значимого подавления роста опухоли.

Для того чтобы выяснить, не повлияла ли на биологическую активность солюбилизатов зФС-1 замена эмульгатора Кремофора ЕЬ на Проксанол 268, было проведено сравнительное экспериментальное исследование собственной (в дозе 6,0 мг/кг) и фотодинамической (в дозах 6,0 и 3,0 мг/кг за 24 ч до облучения) активности ФС-1 в 4% водных эмульсиях Проксанола 268 и Кремофора ЕЬ.

ФС-1 в 4% водном Проксаноле 268, так же как и в 4% водном Кремофоре ЕЬ, при введении в дозе 6,0 мг/кг в отсутствие облучения не подавлял рост экспериментальной опухоли (ТРО<13%).

При введении ФС-1 в дозе 6,0 мг/кг за 24 ч до проведения облучения не было отмечено достоверных различий в фотодинамической активности солюбилизатов в 4% водных Проксаноле 268 и Кремофоре ЕЬ (значения ТРО составляли 92-100% и 8891%, соответственно). Также не отмечено достоверных различий в эффективности ФДТ с ФС-1 в дозе 3,0 мг/кг, солюбилизированном в 4% Проксаноле 268 и 4% Кремофоре ЕЬ (значения ТРО составляли 91-100% и 77-95%, соответственно). Кинетические кривые роста опухоли в указанных группах показаны на рис. 3.

Рис. 3. Кинетика роста опухоли при проведении ФДТ через 24 ч после введения ФС-1 в дозах 6,0 мг/кг (а) и 3,0 мг/кг (б) в 4% водных Кремофоре ЕЬ и Проксаноле 268

Таким образом, показано, что замена эмульгатора Кремофора ЕЬ на Проксанол 268 не влияла на фотодинамическую активность солюбилизатов ФС-1 при проведении ФДТ в указанных режимах.

3.3. Фотодинамическая активность дифторборильного замещенного комплекса 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметена(ФС-2)

Исследована фотодинамическая активность дифторборильного замещенного комплекса 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметена (далее - ФС-2) в дозах 5,0 и 1,0 мг/кг в эксперименте на мышах с подкожно имплантированной саркомой 8-37.

Как видно на рис. 4 при проведении сеанса облучения через 24 ч после введения ФС-2 в дозе 5,0 мг/кг было отмечено значительное подавление роста экспериментальной опухоли на протяжении всего периода наблюдения (ТРО 86-98%).

Рис. 4. Кинетика роста опухоли при проведении ФДТ с ФС-2

Полная регрессия опухоли была достигнута у 67% животных, среднее время удвоения объема опухоли в опытной группе увеличилось до (19±8) сут по сравнению с контрольной группой (3±2) сут (рис. 5).

Рис. 5. Время удвоения объема опухоли при проведении ФДТ с ФС-2

При уменьшении дозы фотосенсибилизатора, вводимого за 24 ч до проведения облучения, до 1,0 мг/кг биологически значимый эффект торможения роста опухоли сохранялся (средние значения ТРО в опытной группе составили 64-81%), полная регрессия опухоли была получена у 50% мышей, а удвоение объема опухоли происходило в среднем за 12±6 сут (см. рис. 4, 5), что также достоверно отличалось от контроля.

Различия в эффективности ФДТ с ФС-2 в двух изученных дозах (5,0 и 1,0 мг/кг) были статистически не значимы.

Таким образом, показана одинаково высокая противоопухолевая эффективность ФДТ с ФС-2 в дозах 5,0 и 1,0 мг/кг при проведении облучения через 24 ч после сенсибилизации животных.

3.4. Фотодинамическая активность дифторборильного замешенного комплекса 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметена (ФС-3)

Проведены экспериментальные исследования in vivo фотодинамической активности дифторборильного замещенного комплекса

3,3'-дифенилазадиизоиндолилметена (далее - ФС-3) в дозах 7,0; 1,4; 0,5 и 0,1 мг/кг на мышах с солидной саркомой S-37.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что проведение облучения через 24 ч после введения ФС-3 в дозах 7,0 и 1,4 мг/кг практически не изменяло динамику

роста опухоли (ТРО<17%). При сокращении интервала времени от введения фотосенсибилизатора в тех же дозах до проведения облучения с 24 ч до 0,5 ч отмечен биологически значимый антибластический эффект (рис. 6). Значения ТРО составили 51-83% при использовании фотосенсибилизатора в дозе 7,0 мг/кг и 77-86% - после введения в дозе 1,4 мг/кг.

-и— контроль

-О— облучение через 0,5 ч после введения ФОЗ в доге 7,0 мг/кг

20 су г

—■— контроль

—О— облучение через 0,5 ч после введения ФС-3 в дозе 1,4 мг/кг

20

ьсуг

Рис. 6. Кинетика роста опухоли при проведении ФДТ с ФС-3

При проведении облучения через 0,5 ч после введения ФС-3 в дозах 7,0 и 1,4 мг/кг полная регрессия опухоли к концу срока наблюдения была получена у 37% и 25% животных в группе, соответственно. Среднее время удвоения объема опухоли также значительно увеличилось (14±6 и 8±3 сут, соответственно) относительно контрольной группы (2±1 сут) (рис. 7).

сут

7,0 мг/кг 1,4 мг/кг контроль

Рис. 7. Время удвоения объема опухоли при проведении ФДТ с ФС-3

При проведении облучения через 0,5 ч после введения ФС-3 в меньших дозах (0,5 и 0,1 мг/кг) наблюдали отсутствие подавления роста экспериментальной опухоли.

Таким образом, уровень фотосенсибилизатора, достаточный для развития биологически значимого фотодинамического эффекта, сохранялся в течение как минимум 0,5 ч после внутривенного введения животным ФС-3 в дозах 7,0 и 1,0 мг/кг, а через 24 ч был уже недостаточным.

3.5.Фотодинамическая активность сульфанилзамещенного фталоцианина (ФС-4)

Проведена оценка in vivo фотодинамической активности сульфанилзамещенного фталоцианина (далее - ФС-4) в дозах 9,0; 4,0 и 1,0 мг/кг на модели мышиной саркомы S-37. Как видно на рис. 8, проведение облучения через 24 ч после введения ФС-4 в дозе 9,0 мг/кг вызывало биологически значимое подавление роста экспериментальной опухоли (значения ТРО были выше 87% на протяжении 20 сут наблюдения).

Рис. 8. Кинетика роста опухоли при проведении ФДТ с ФС-4

У 75% мышей в группе к 20-м сут наблюдения опухоль не пальпировалась. Время удвоения объема опухоли в опытаой группе превышало значение этого параметра в контроле более, чем в 10 раз (см. рис. 9).

Рис. 9. Время удвоения объема опухоли при проведении ФДТ с ФС-4

При проведении облучения через 24 ч после введения ФС-4 в меньшей дозе (4,0 мг/кг) биологически значимое торможение роста опухоли (ТРО 50-55 %) зарегистрировано на протяжении только 15 сут после окончания лечения. При дальнейшем снижении дозы ФС-4 до 1,0 мг/кг не отмечено существенного изменения динамики роста экспериментальной опухоли по сравнению с контролем на всем протяжении наблюдения (ТРО 14-33%).

3.6. Фотодинамическая активность производных тетраазапорфина (ФС-5; ФС-6; ФС-7 и ФС-8)

Исследована фотодинамическая активность четырех производных тетраазапорфина: тетраазапорфина магния (далее - ФС-5) в дозе 7,0 мг/кг; тетраазапорфина магния (далее - ФС-6) в дозе 5,5 мг/кг; тетраазапорфина безметального (далее - ФС-7) в дозе 0,5 мг/кг и тетраазапорфина цинка (далее - ФС-8) в дозе 3,0 мг/кг в отношении экспериментальной опухоли Эрлиха у мышей.

Проведенные исследования не выявили биологически значимого влияния ни одного из исследуемых соединений на рост опухоли, как в отсутствие светового воздействия, так и при проведении сеанса облучения через 0,5; 2 или 24 ч после введения фотосенсибилизатора. Кратковременное подавление роста опухоли до 10 сут наблюдения со значениями ТРО, близкими к биологически значимым (47-55%), было отмечено только для ФС-5 при введении в дозе 7,0 мг/кг за 0,5 ч до облучения.

Глава 4. Биокинетические параметры роста опухоли при проведении ФДТ с эффективными фотосенсибилизаторами

Для подтверждения активности отобранных фотосенсибилизаторов нами был использован биокинетический метод оценки роста опухоли при проведении ФДТ в эффективных режимах.

На рис. 10 показаны кинетические кривые роста опухоли при проведении облучения через 24 ч после введения ФС-1 в дозах 6,0; 3,0; 1,0 мг/кг и через 0,5 ч после введения ФС-1 в дозе 0,5 мг/кг в полулогарифмических координатах.

7.0 6.: б. о

5,5 5,0 4.5 4,0 3,5 3,0

■ контроль О облучение через 24 ч после введения ФС-1 в дозе 6,0 мг/кг

25 I, сут

7,0

б.5

в, О 5,5 5,0 4.5 4.0 3,5 3,0

■ контроль О облучение через 24 ч после введения ФС-1 в дозе 3,0 мг/кг

10 15 б

25

1, сут

1п!«„*>

7,0 6.5 6,0 5.5, 5,0'

■ контроль

О облучение через 24 ч после введения ФС-1 в дозе 1,0 мг/кг

10 15 в

25 I, сут

1п(0 V»)

7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5

■ контроль О облучение через 0,5 ч после введения ФС-1 в дозе 0,5 мг/кг

10 15

г

25

1> сут

Рис. 10. Кинетика роста опухоли при проведении ФДТ с ФС-1 в полулогарифмических координатах

По построенным прямым линейной регрессии в координатах 1п(ау%) -1 находили константы скорости роста опухоли к, по которым оценивали скорости роста опухоли в разных экспериментальных группах (табл. 1).

Таблица 1.

Биокинетические параметры роста опухоли при проведении ФДТ с ФС-1

Доза ФС-1, мг/кг интервал до ФДТ, ч период, сут к, сут"1 БЕ Я Р

6,0 24 0-10 -0,168 - -1 <0,0001

10-25 0,080 0,015 0,966 0,03

3,0 24 0-15 -0,090 0,016 -0,984 0,11*

15-25 0,155 0,012 0,997 0,050

1,0 24 0-15 -0,003 0,005 -0,399* 0,60*

15-25 0,116 0,005 0,999 0,02

0,5 0,5 0-15 -0,087 0,003 -0,999 0,001

15-25 0,152 0,017 0,994 0,07*

Контроль - 0-25 0,090 0,004 0,996 <0,0001

к - константа скорости роста опухоли (коэффициент линейной регрессии); БЕ - стандартная ошибка среднего; И - коэффициент линейной корреляции; р - вероятность, что И=0 (то есть нет линейной связи между 1п(ау%) и1); * - зависимость 1п(ау%) от 1 с большей достоверностью описывается не линейной, а множественной регрессией

Как видно на рис. 10, во всех проанализированных режимах ФДТ кинетика роста опухоли имела двухфазный характер. На начальных сроках наблюдения (10-15 сут) константы скорости роста опухоли в опытных группах принимали отрицательные значения, что указывает на уменьшение среднегруппового объема опухоли. У части животных (от 16% до 55% в зависимости от дозы фотосенсибилизатора) отмечена полная регрессия новообразований после ФДТ с ФС-1. У животных, у которых не удалось добиться полной регрессии опухоли, после 10-15 сут наблюдения был зарегистрирован вторичный рост остаточных опухолей со средней скоростью близкой к контрольной группе (копыптт) = 8,0-Ю"2 сут"1; котшт^) = 15,5-10"2 сут"1; киитроа = 9,0-10"г сут'1). Различия в константах скоростей вторичного роста остаточных опухолей во всех опытных группах по сравнению с контролем были статистически не достоверны.

Кинетика роста экспериментальной опухоли после ФДТ с ФС-2, ФС-3 и ФС-4 в максимальных из использованных доз (5,0; 7,0 и 9,0 мг/кг, соответственно) также носила двухфазный характер. В течение первых 10 сут наблюдали уменьшение среднегруппового объема опухоли (после ФДТ с ФС-2 и ФС-4) или значительное подавление роста опухоли без уменьшения ее объема (после ФДТ с ФС-3). После 10

сут наблюдения был зафиксирован вторичный рост остаточных опухолей у животных, у которых не удалось добиться полной регрессии опухоли со средней скоростью, близкой к контрольной группе: кога,гг(шт) = 20,0-Ю"2 сут-1; к„™т(пш) = 28,7-Ю"2 сут-1; к„,,гф1)яь (яиц) = 25,6-Ю"2 сут"1; кконтршКтах) = 33,МО-2 сут'1.

ФДТ с ФС-2 и ФС-3 в наименьших из эффективных доз (1,0 и 1,4 мг/кг, соответственно) приводила к значительному замедлению роста экспериментальной опухоли на протяжении всего периода наблюдения без уменьшения ее среднегруппового объема.

Таким образом, в проведенных экспериментальных исследованиях биокинетический анализ:

- подтвердил эффективность фотодинамической терапии с исследуемыми соединениями;

- показал вторичный рост остаточных опухолей и позволил сравнить интенсивность этого роста с контрольной группой;

- позволил графически выявить временной показатель - 10-15-е сутки после ФДТ, когда после заметного торможепия начинался вторичный рост опухоли, что может указывать на необходимость повторного проведения ФДТ в эти сроки с целью повышения эффективности лечения.

выводы

1. Изучены цитотокенческие и фотодинамические свойства нескольких новых химических соединений, показана перспективность их дальнейшего медико-биологического изучения для применения в ФДТ злокачественных новообразований.

2. Установлено в экспериментах in vivo отсутствие влияния восьми новых синтезированных соединений на рост экспериментальных опухолей в отсутствие облучения.

3. Показана в экспериментах in vivo высокая фотодинамическая активность четырех новых соединений - производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух дифторборильных комплексов 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметенов.

4. Отработаны эффективные режимы ФДТ (дозы фотосенсибилизаторов и интервалы времени от сенсибилизации до проведения облучения) для четырех отобранных перспективных фотосенсибилизаторов:

- 2,3,За,21а-тетрагадро-2-метил-За,8ДЗ,18-тетрафенил-5,10,15,20-тетрааза-1Н,22Н,24Н-пирроло[3,4-Ь]порфина - проведение облучения через 0,5 и 24 ч после введения в дозах 0,5-6,0 мг/кг;

- К,К'-дифторборил-К-[3-(4-/7г/7ет.-буталфег(ил)-2Н-изош(дол-1-ил)]-К'-[3-(4-ш/?ет.-бутилфенил)-1Н-изоиндол-1-илиден]амина - проведение облучения через 24 ч после введения в дозах 1,0-5,0 мг/кг;

- М,№дифторборил-1-[3-(4-метоксифещш)-2Н-изоиндол-1-ил)]-№-[3-(4-метоксифенил)-1Н-изоиндол-1-илиден]амина - проведение облучения через 0,5 ч после введения в дозах 1,4-7,0 мг/кг;

- 1,8,15,22-тетракис(трет-бутилсульфанил)-29Н,31Н-фталоцианина — проведение облучения через 24 ч после введения в дозе 9,0 мг/кг.

5. Продемонстрировано методом биокинетического анализа значительное подавление роста экспериментальных опухолей в группах животных на начальных сроках наблюдения (10-15 сут).

6. Показала возможность замены эмульгатора Кремофора EL на менее токсичный Проксанол 268 для солюбилизации гидрофобных фотосенсибилизаторов без снижения их фотодипамической активности.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование активности новой группы фотосенсибилизаторов производных тетраазахлорипов для фотодинамической терапии / Иванова-Радкевич В.И. // Вестник Российского Государственного медицинского университета: Материалы I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции. -Москва. - 2006. - № 2(49). - С. 373-374.

2. Изучение возможности применения производных тетраазахлоринов для фотодинамической терапии злокачественных новообразований / Иванова-Радкевич В.И. // Материалы Итоговой конференции СНО медицинского факультета «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». -Москва. - 2006. - С. 43-44.

3. Some structural regularites concerning solubilization of tetr-butylthiophthalocyanine derivatives in non-ionogenic surfactants / Barkanova S.V., Volkov K.A., Ivanova-Radkevich V.I., Negrimovsky V.M. and Lukyanets Б.А. // Programme Book of Iй-Georgian Bay International Conference on Bioinorganic Chemistry. - Parry Sound, (Canada). - 2007. - P. 100 (PI).

4. Изучение фотодинамической активности тетра-3-трет.-бутилтиофталоцианина безметального / Иванова-Радкевич В.И., Лукьянец Е.А., Умнова Л.В., Барканова С.В. // Материалы Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Концепции болезней цивилизации». - Москва. - 2007. - С. 393-394.

5. Tert-butylthio phthalocyanine derivatives as new photosensitizer for photodynamic therapy / Barkanova S.V., Volkov K.A., Ivanova-Radkevich V.I., Umnova L.V., Negrimovsky V.M. and Lukyanets E.A. // Book of abstracts Fifth International Conference on porphyrins and phthalocyanines ICPP-5. - Moscow (Russia). - 2008. - P. 299.

6. Фотодинамическая активность производного тетраазахлорина / Иванова-Радкевич В.И., Умнова JI.B., Барканова С.В., Макарова Е.А., Лукьянец Е.А. // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2008. - №3. - С. 39-41.

7. Биокинетические исследования фотодинамической активности новых фотосенсибилизаторов / Иванова-Радкевич В.И., Негримовский В.М., Барканова С.В., Макарова Е.А., Донягина В.Ф., Плетенева Т.В. // Химико-Фармацевтический Журнал. - 2009. - Т. 43, № 5. - С. 7-10.

8. МД^'-дифторборильные комплексы N-(3-арил-2Н-изоиндол-1 -ил)-К-(3 -арил-1Н-изоиндол-1-имиден)аминов и способ их получения. Патент РФ № 2 364 600 (2009) / Варганова С.В., Воронцов Г.Н., Донягина В.Ф., Иванова-Радкевич В.И., ЛукьянецЕ.А. и Умнова JI.B. //Бюлл. Изобр. -2009. -№ 23.

9. Difluoroboryl complexes of substituted 3,3'-diphenylazadiisoindolylraethenes as new photosensitize« for photodynamic therapy / Ivanova-Radkevich V.l., Lukyanets E.A., Umnova L.V., Barkanova S.V. and Donyagina V.F. H Book of abstracts 13-th Congress of European Society for Photobiology and 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine. - Wroclaw (Poland). - 2009. - P. 146 (P-734).

РЕЗЮМЕ

Иванова-Радкевич Вероника Игоревна

Скрининговые исследования in vivo новых фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии злокачественных новообразований.

Проведены экспериментальные исследования in vivo фотодинамической активности восьми новых, синтезированных во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» соединений с поглощением в длинноволновой области спектра (700-740 нм), где поглощение биологических тканей минимально и, следовательно, обеспечивается глубокое проникновение возбуждающего излучения в ткани и высокая эффективность фотодинамической терапии.

Установлена высокая фотодинамическая активность четырех из восьми изученных соединений в отношении экспериментальных опухолей Эрлиха и саркомы S-37 у мышей (производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух дифторборилышх замещенных комплекса

3,3'-дафенилазадиизоиндолилметенов) и определены оптимальные режимы проведения фотодинамической терапии с их использованием. Эффективность отобранных фотосенсибилизаторов подтверждена биокинетическими методами. Показано, что производное тетраазахлорина, сульфанилзамещенный фталоцианин и два дифторборильных замещенных комплекса 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметенов являются перспективными соединениями для дальнейшего доклинического и клинического изучения в фотодинамической терапии злокачественных новообразований.

RESUME

Ivanova-Radkevich Veronika I.

Screening tests in vivo of new photosensitize« for photodynamic therapy of malignant desease.

This study is devoted to the in vivo investigation of photodynamic activity of eight new photosensitizers with strong absorbance in the red spectral region (700-740 nm), that were synthesized in Organic Intermediates and Dyes Institute.

High photodynamic activity of four compounds (tetraazachlorine derivative, two difluoroboiyl substituted complexes of diphenylazadiisoindolylmethene and sulfanylsubstituted phthalocyanine) on mice bearing solid form of Ehrlich tumor and sarcoma S-37 has been established and optimal conditions of PDT with them have been determined. This compounds as new photosensitizers have been patented.

Subsequent pre-clinical and clinical trials of this photosensitizers have been recommended.

Подписано в печать: 09.11.2009

Заказ Ха 2967 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorefeiat.ru

Фотодинамическая терапия (ФДТ) — относительно новое направление противоопухолевой терапии. Метод ФДТ основан на избирательном накоплении в опухолевой ткани фотосенсибилизатора, способного при локальном воздействии света определенной длины волны, соответствующей максимуму поглощения, генерировать цитотоксические агенты, вызывающие повреждение структурных элементов опухолевой ткани [Лукьянец Е.А., 1998; Гельфонд M.JL, 2007; Juzeniene A. and Moan J., 2007].

К настоящему времени по ФДТ накоплен обширный экспериментальный и клинический материал. Метод ФДТ успешно применяется в клинической онкологии как с радикальной целью при ранних стадиях рака, поверхностных новообразованиях, предраковых патологических состояниях, так и с паллиативной целью [Соколов В.В. и соавт., 1995; 2006; Castaño А.Р. et al., 2004; Moghissi К., et al. 2005; Alison R. et al., 2005; Juzeniene A. and Moan J., 2007]. В большинстве зарубежных стран и в России к клиническому применению разрешены фотосенсибилизаторы первого поколения на основе гематопорфирина - Фотофрин и его аналоги [Castaño А.Р. et al., 2004; Xu et al., 2007; Решетников A.B., 2007]. Однако указанные порфириновые препараты как фотосенсибилизаторы для ФДТ имеют ряд недостатков. Вследствие слабого оптического поглощения в длинноволновой области спектра (620-640 нм) они вызывают в опухолях ограниченные по глубине фотоиндуцированные некрозы. Кроме того, они обладают неоднородным химическим составом, характеризуются недостаточной селективностью накопления в опухоли, являются причиной выраженной кожной токсичности [Миронов А.Ф., 1996; Castaño А.Р. et al., 2004].

Многолетние и многочисленные исследования в области ФДТ новообразований позволили сформулировать следующие требования, предъявляемые с оптимальному фотосенсибилизатору [Красновский А.А.,

1992; Миронов А.Ф., 1996; Castaño А.Р. et al., 2004; Juzeniene A. and Moan J., 2007]: наличие интенсивной полосы поглощения в длинноволновой области спектра, где обеспечивается наиболее глубокое проникновение возбуждающего излучения в ткань; высокий квантовый выход триплетного состояния для эффективного образования основного цитотоксического агента — синглетного кислорода; постоянный химический состав; технологичность производства; устойчивость при хранении и введении в организм; высокая селективность накопления в опухолях по сравнению с окружающими неизмененными тканями; слабое накопление в коже; сравнительно быстрое выведение из организма; низкая токсичность.

За последние годы в нашей стране и за рубежом разработан ряд соединений — фотосенсибизизаторов для ФДТ второго поколения (Темопорфин, Пурлитин, Фоскан, Фотодитазин, Радахлорин, Фотохлорин, Фотолон и др.), — которые обеспечивают большую глубину поражения опухолевой ткани за счет наличия максимумов поглощения в более длинноволновой области спектра (650-670 нм) по сравнению с препаратами первого пооления [Миронов А.Ф., 1996; Лукьянец Е.А., 1999; Jones H.J., 2003; Решетников A.B., 2007].

Во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» разработан, успешно прошел клинические испытания и разрешен с 2001 г. для медицинского применения фотосенсибилизатор второго поколения — Фотосенс, препарат на основе сульфированных производных фталоцианина алюминия с максимумом поглощения 670 нм.

На основании клинических данных успешного применения ФДТ как с отечественными, так и зарубежными фотосенсибилизаторами при различных онкологических заболеваниях метод ФДТ с 2008 г. включен в «Перечень видов высокотехнологичной медицинской помощи, оказываемой за счет средств федерального бюджета в федеральных медицинских учреждениях» (Приказ Минздравсоцразвития РФ № 812 от 28 декабря 2007 г.).

Вместе с тем, несмотря на хорошую эффективность при ФДТ, применение перечисленных фотосенсибилизаторов имеет определенные ограничения, связанные в первую очередь с тем, что высокий терапевтический эффект регистрируется у больных с опухолями небольших размеров и незначительной инвазией. Кроме того, несмотря на имеющуюся тропность к опухолевой ткани, для них характерны низкие коэффициенты накопления в опухоли, а также длительная циркуляция в организме, что обусловливает значительную кожную фототоксичность [Миронов А.Ф., 1996; Rovers J.P. et al., 2000; Castaño A.P. et al., 2004; Juzeniene A. and Moan J., 2007].

В настоящее время ведется активный поиск новых фотосенсибилизаторов с поглощением в области так называемого «терапевтического окна» — длинноволновой области видимого спектра (700800 нм), где поглощение биологической ткани минимально и, следовательно, облучение в этой области обеспечивает более глубокое проникновение излучения в ткань. Проведенные экспериментальные и клинические исследования соединений, поглощающих в указанной области, в том числе производных тексаферина, бензопорфирина, нафталоцианина, бактериохлорина и др. показали значительное увеличение глубины воздействия на опухоль [Rovers J.P. et al., 2000; Castaño A.P. et al., 2004; Xu et al., 2007].

Во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» синтезирован ряд фотосенсибилизаторов, характеризующихся оптимальными фотофизическими параметрами и поглощающих в указанной длинноволновой области. Оценка цитотоксических и фотодинамических свойств этих соединений in vivo для отбора наиболее перспективных претендентов для последующих доклинических и клинических исследований является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работы — изучение цитотоксических и фотодинамических свойств новых соединений, синтезированных во ФГУП ГНТТ «НИОПИК» — потенциальных фотосенсибилизаторов для ФДТ злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

- Оценить «темновую» цитотоксичность (способность подавлять рост опухоли в отсутствии облучения) восьми новых соединений на экспериментальных опухолевых моделях in vivo.

- Оценить фотодинамическую активность восьми новых соединений на экспериментальных опухолевых моделях in vivo.

- Отработать оптимальные режимы проведения ФДТ с отобранными эффективными фотосенсибилизаторами.

- Оценить динамику роста опухоли при проведении ФДТ в эффективных режимах методом биокинетического анализа.

- Проверить возможность замены эмульгатора Кремофора EL на менее токсичный Проксанол 268 при солюбилизации гидрофобных фотосенсибилизаторов.

Научная новизна

В диссертационном исследовании впервые проведена оценка in vivo цитотоксичности и фотодинамической активности восьми новых, синтезированных во ФГУП ГНЦ «НИОПИК» соединений с поглощением света в длинноволновой области видимого спектра (700-740 нм). Установлена высокая фотодинамическая активность четырех соединений, принадлежащих к трем химическим классам.

На основании результатов диссертационных исследований получен патент «Щ^Г-дифторборильные комплексы N-(3-арил-2Н-изоиндол-1 -mi)-N-(3-арил-1 Н-изоиндол-1 -имиден)аминов и способ их получения» (Патент РФ

2364600 (2009)). Результаты диссертационной работы также включены в патенты по двум новым группам ф ото сенсибилизирующих соединений: тетраазахлорины (Патент РФ 2278119 (2006)) и алкилтиозамещенные фталоцианины (Патент РФ 2340615 (2008)).

Практическое значение диссертационной работы

На основании экспериментальных исследований новых соединений с поглощением в длинноволновой области видимого спектра установлена высокая противоопухолевая эффективность производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух замещенных комплексов 3,3 '-дифенилазадиизоиндолилметенов при ФДТ экспериментальных опухолей у лабораторных животных и показана их перспективность для дальнейшего медико-биологического изучения.

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии РУДН (разделы «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» - фармацевтическая химия, «Токсичность лекарственных средств» — токсикологическая химия).

Положения, выносимые на защиту

1. Актуальность разработки новых фотосенсибилизаторов для ФДТ злокачественных новообразований с поглощением в длинноволновой области видимого спектра с целью эффективного лечения глубоко инвазивных опухолей.

2. Доказательство в экспериментах in vivo высокой фотодинамической активности ряда новых соединений, поглощающих в длинноволновой области видимого спектра (700-740 нм): производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух дифторборильных замещенных комплексов 3,3'-дифенилазадиизоиндолилметенов.

3. Оценка динамики роста экспериментальных опухолей при проведении ФДТ в эффективных режимах по биокинетическим параметрам опухолевого роста.

4. Возможность замены эмульгатора Кремофора EL на менее токсичный Проксанол 268 при солюбилизации гидрофобных фотосенсибилизаторов без потери их фотодинамической активности.

Апробация работы

ВЫВОДЫ

1. Изучены цнтотоксические и фотодинамические свойства нескольких новых классов химических соединений, показана перспективность их дальнейшего медико-биологического изучения для применения в ФДТ злокачественных новообразований.

2. Установлено в экспериментах in vivo отсутствие влияния восьми новых синтезированных соединений на рост экспериментальных опухолей в отсутствие облучения.

3. Показана в экспериментах in vivo высокая фотодинамическая активность четырех новых соединений — производного тетраазахлорина, сульфанилзамещенного фталоцианина и двух дифторборильных комплексов 3,3 -дифенилазадиизоиндолилметенов.

4. Отработаны эффективные режимы ФДТ (дозы фотосенсибилизаторов и интервалы времени от сенсибилизации до проведения облучения) для четырех отобранных перспективных фотосенсибилизаторов:

- 2,3,3 а,21 а-тетрагидро-2-метил-З а, 8,13,18-тетрафенил-5,10,15,20-тетрааза-1Н,22Н,24Н-пирроло[3,4-Ь]порфина - проведение облучения через 0,5 и 24 ч после введения в дозах 0,5-6,0 мг/кг;

- К,М,-дифторборил-К-[3-(4-/ире/и.-бутилфенил)-2Н-изоиндол-1-ил)]-1Ч,-[3-(4-трет. -бутил фенил)-1 Н-изоиндол-1 -илиден] амина — проведение облучения через 24 ч после введения в дозах 1,0-5,0 мг/кг;

- Т^Ы'-дифторборил-1 -[3-(4-метоксифенил)-2Н-изоиндол-1 -ил)]-КГ-[3-(4-метоксифенил)-1 Н-изоиндол-1-илиден] амина - проведение облучения через 0,5 ч после введения в дозах 1,4-7,0 мг/кг;

- 1,8,15,22-тетракис(трет-бутилсульфанил)-29Н,31Н- фталоцианина — проведение облучения через 24 ч после введения в дозе 9,0 мг/кг.

5. Показана возможность замены при солюбилизации гидрофобных фотосенсибилизаторов эмульгатора Кремофора EL на более оптимальный Проксанол 268.

6. Показана возможность применения биокинетического анализа для более детальной оценки противоопухолевой эффективности фотосенсибилизаторов. Подтверждена с помощью биокинетического анализа высокая фотодинамическая активность отобранных фотосенсибилизаторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ ассортимента фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии злокачественных новообразований, используемых в клинической практике, а также находящихся на стадии экспериментального изучения, показал актуальность разработки новых фотосенсибилизаторов с поглощением в длинноволновой области видимого спектра (700-800 нм) с целью эффективного лечения глубоко инвазивных опухолей.

В рамках диссертационной работы проведена оценка in vivo цитотоксических и фотодинамических свойств ряда синтезированных в ФГУП "ГНЦ "НИОПИК" соединений для ФДТ, поглощающих в указанной области спектра. Работа проводилась с целью отбора наиболее перспективных фотосенсибилизаторов для последующих доклинических и клинических исследований.

При проведении экспериментальных исследований на модели перевиваемых опухолей у мышей изучены цитотоксические свойства восьми новых соединений и показано отсутствие их влияния на рост экспериментальной опухоли в отсутствие облучения.

Исследования противоопухолевой эффективности ФДТ с указанными соединениями выявили четыре потенциальных фотосенсибилизатора, обладающие высокой фотодинамической активностью: производное тетраазахлорина, сульфанилзамещенный фталоцианин и два дифторборильных комплекса 3,3-дифенилазадиизоиндолилметенов. Для отобранных в результате скрининговых исследований фотосенсибилизаторов экспериментально установлены эффективные дозы и интервалы времени от введения до проведения ФДТ.

В рамках выполнения диссертационной работы при проведении исследований фотодинамической активности производного тетраазахлорина показана возможность замены эмульгатора Кремофора EL на менее токсичный Проксанол 268 при приготовлении мицеллярных растворов фотосенсибилизатора без потери его фотодинамической активности.

Достоверность полученных результатов подтверждена статистическим анализом с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Биокинетический анализ эффективности ФДТ с отобранными фото сенсибилизаторами подтвердил их высокую фотодинамическую активность и позволил более детально оценить динамику роста опухолей в опытных и контрольных группах животных.

Результаты проведенных экспериментальных исследований были использованы при получении патентов на три группы соединений -фотосенсибилизаторов для ФДТ: тетраазахлорины, алкилтиозамещенные фталоцианины и дифторборильные замещенные комплексы 3,3-дифенилазадиизоиндолилметенов.

Сделан вывод, что отобранные в результате проведенных скрининговых исследований фотосенсибилизаторы перспективны для дальнейшего медико-биологического изучения.