Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Экспериментальное 3D моделирование репаративного остеогенеза и васкулогенеза на границе костной ткани и тканеинженерной конструкции

На правах рукописи

□□3462813

МЕЛИХОВА ВАРВАРА СЕРГЕЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ЗЭ МОДЕЛИРОВАНИЕ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА И ВАСКУЛОГЕНЕЗА НА ГРАНИЦЕ КОСТНОЙ ТКАНИ И ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003462819

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии и патологии развития Государственного учреждения НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН.

Научные руководители:

Кандидат биологических наук, доцент И.Н. Сабурина

Доктор медицинских наук, профессор А.А. Орлов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор М. Л. Семенова

Доктор биологических наук, профессор П. В. Авдонин

Ведущее учреждение: ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий»

Защита диссертации состоится «_»_марта_2009 г. в_часов

на заседании Диссертационного совета Д001. 003. 01 при ГУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (125315 Балтийская улица, д.8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат медицинских наук

Л. Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Восстановление целостности кости является актуальной проблемой современной травматологии, ортопедии и стоматологии, а также фундаментальных медико-биологических дисциплин. В настоящее время активно ведется поиск новых клеточных технологий, которые позволяли бы ускорить образование костной ткани как на периферии костного дефекта, так и внутри имплантата.

Как известно, аутологичные и аллогенные костные трансплантаты (деминерализованные участки костной ткани без клеточных компонентов) характеризуются невысокой выживаемостью in situ, плохо взаимодействуют с костью реципиента из-за влияния на нее патофизиологических процессов и подвергаются быстрой резорбции [О.М. Bostman et al., 1991]. Также часто происходит полная перестройка пересаженной костной ткани, а процесс получения кости прежней прочности длительный и занимает несколько лет. В настоящее время показано, что полноценное восстановление костной ткани возможно только при перемещении костного трансплантата на сосудистой «ножке» или после предварительной его пересадки в отдаленные участки тела с целью формирования собственного сосудистого русла (включением в кровоток) [A. Arkudas et al., 2007]. Такие операции могут быть выполнены с помощью микрохирургической техники в высокоспециализированных стационарах, которые не могут обеспечить потребностей в возрастающем количестве остеопластических операций. По этим причинам в последнее время органные костные трансплантаты признаны неперспективным видом борьбы с дефицитом костной ткани.

В последние годы на первый план в фундаментальной и клинической стоматологии и ортопедии выходят ткане-инженерные трансплантаты на основе стволовых и прогениторных клеток. Изучение биологии костной ткани в культуре, открытие факторов роста, контролирующих патоморфологические изменения в поврежденной костной ткани, привело к бурному прогрессу знаний и развитию технологий по направленному остеогенезу, разработке новых методов лабораторного получения костной ткани in vitro на биологически активных, не имеющих антигенных свойств, заменителях костной ткани, способных к биодеградации и обладающих остеокондуктивными свойствами [J.K.L. Burg et al 2000, P.V.Giannoudis et al., 2005]. Клиницистами получены первые результаты, которые свидетельствуют о перспективности лечения дефектов костей различных локализаций и доступности подобных методик, их приемлемой стоимости [D. J.Schaefer et al., 2000]. Однако дальнейшее развитие новых клеточных технологий в области стоматологии, оперативной травмотологии и ортопедии сдерживается тем, что в подобных работах не прослежены отдаленные результаты лечения, недостаточно хорошо освящена динамика процесса, а исследования не структурированы по срокам наблюдения; также часто не описана функциональная активность восстановленной костной ткани, что затрудняет оценку адекватности выбора методов лечения и его эффективности. Как известно, лимиты естественной репарации костной ткани определяются патофизиологическими процессами, приводящими к снижению активности и численности остеобластов, что сопровождается снижением уровня щелочной

фосфотазы, остеокальцина, коллагена 1 типа и других маркерных белков остеогенеза, а также дефицитом ростовых факторов, сигнальных молекул и цитокинов, регулирующих процесс репарации. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [Деев Р. А., 2006]. Изучение данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, позволит разработать новые методы реконструкции костной ткани in vitro с участием прогениторных клеток, остеоиндуктивных и остеопластических высокопористых материалов и факторов, ускоряющих региональную и системную репарацию кости.

Целью данного исследования является изучение влияния биотрансплантата, состоящего из рЗ-фосфата кальция (ChronOs™) и стромальных клеток подкожной жировой ткани на de novo остеогенез после частичной остеоабразии наружной поверхности нижней челюсти у крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать условия получения культуры стромальных клеток подкожной жировой ткани (СКЖТ) и охарактеризовать ее.

2. Продемонстрировать биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани при подкожном введении (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).

3. Разработать условия получения 3D тканеинженерного биотрансплантата, пригодного для имплантации с целью эффективного и безопасного репаративного остеогенеза.

4. Разработать модель повреждения структуры костной ткани путем создания дефекта при остеоабразии на нижней челюсти крыс.

5. Изучить и сравнить влияние матрицы без клеток СКЖТ и биотрансплантата на процессы формирования кости de novo на разных сроках исследования (в том числе и длительных).

Научная новизна работы. Модифицирован и оптимизирован способ выделения и культивирования стромальных клеток подкожной жировой ткани, показана биобезопасность полученных клеток. Охарактеризован остеогенный потенциал культуры. Разработана оригинальная технология заселения клеток на выбранную матрицу, показана высокая эффективность прикрепления и пролиферации клеток на носителе. Разработана доклиническая модель исследования костного трансплантата, моделированного in vitro, на животных (in vivo). Изучен и сопоставлен регенерационный остеогенез без внесения и с внесением в область поверхностного дефекта нижней челюсти стромальных клеток подкожной жировой ткани (СКЖТ), показано их влияние на образование сосудистой сети в области импланта и вокруг нее. С помощью гистологического анализа выявлены закономерные этапы остеогенеза, происходящие на границе биотрансплантата и нативной костной ткани нижней челюсти после операции остеобаразии. На разработанной оригинальной модели репаративного остеогенеза у крыс с помощью серийного гистологического анализа изучены особенности действия клеточного трансплантата по сравнению с бесклеточным матриксом. Выявлена и изучена ангиогенная

активность клеточного трансплантата. Установлено, что на длительных сроках наблюдения de novo остеогенез идет только в условиях контакта с нативной костью в сравнении с подкожной имплантацией, тогда как васкулогенез происходит в обоих случаях. Проведенная работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые произведена оценка динамики репаративного остеогенеза и васкулогенеза in vivo.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработанная технология выделения и культивирования СКЖТ и их последующее заселение на подобранный пористый носитель позволила создать биобезопасный и биодеградируемый тканеинженерный имплантат. Предложена адекватная экспериментальная модель повреждения костной ткани на животных (операция частичной остеоабразии).

Работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции и динамики регенерации костной ткани трансплантации тканеинженерного трансплантата, полученного in vitro, путем заселения СКЖТ на пористый носитель ChronOs™. Материалы диссертации могут служить основой для дальнейшей научно-практической работы в данной области и разработки новых биомедицинских технологий. Результаты работы использованы компанией Synthes (Швейцария) для подтверждения биобезопасности и перспектив использования производимого материала в области регенерации костной ткани.

Разработанная технология выделения и культивирования клеток СКЖТ, а также их заселения на матрицу позволяет совершенствовать и внедрять в клиническую практику методы оптимизации течения репаративной регенерации костной ткани (при переломах, дефектах костей и др.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана оригинальная технология создания тканеинженерного биотрансплантата на основе остеопластического материала ChronOs™ и клеток СКЖТ, пересадка которого в область костного дефекта улучшает процесс формирования кости de novo и обеспечивает функциональное развитие костной ткани.

2. Присутствие в трансплантате культуры клеток СКЖТ приводит к коррекции патофизиологических процессов, а также к улучшению процессов формирования костной ткаии de novo в основном за счет улучшения кровоснабжения (формирования сосудистого русла) пересаженного биотрансплантата на ранних сроках.

3. Пересадка тканеинженерного биотрансплантата, моделированного in vitro на основе ChronOs™ и клеток СКЖТ, наиболее перспективна для последующего клинического использования, по сравнению с пересадкой носителя без клеточного материала.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на:

1. MGH-HKU-Nature China Forum: Molecular Medicine and Biopharma Opportunities. "Comparison of different stem cell sources and biomimetic scaffolds for bone tissue engineering (2007, Hong Kong);

2. Международной конференции «Osstem Meeting 2007 Early and Esthetic» (2007, Москва);

3. V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (2008, Москва);

4. Российской конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (2008, Москва) Публикации: по теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 110 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методик исследования, результатов исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа содержит 35 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 141 источник литературы, из них 5 отечественных и 136 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение и культивирование стромальных клеток подкожной жировой ткани (СКЖТ): для выделения стромальных клеток подкожной жировой ткани у животных в процессе операции брали фрагменты ткани подкожного жира из области нижней части живота и выделяли по стандартному протоколу, с изменениями [P. Zuk et al., 2001]. Для этого, под общей анестезией, рассекали кожу, отсепаровывали гиподерму от мышц брюшной стенки, отрезали фрагмент подкожного жира и помещали его в среду для культивирования клеток, кожу зашивали. Полученную ткань в стерильных условиях измельчали, до получения суспензии мелких фрагментов, проводили их инкубацию в растворе колланеназы 1-го типа (0,07%) и диспазы (0,025%) в течение 25-30 мин в пробирке на 50 мл. После окончания инкубации в раствор с ферментами и тканью добавляли полную среду культивирования (DMEM/F12 с глутамином, 1% пенициллин-стрептомицин, 10% FCS, Fetal Clone Serum) и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в полной среде и пропускали через нейлоновый фильтр, чтобы избавиться от крупных фрагментов ткани. Полученную суспензию клеток помещали на чашки Петри и культивировали в течение 10 сут. По той же методике проводили выделение клеточной суспензии из биоптата подкожной жировой ткани человека. Биоптаты были получены в ходе плановой хирургической операции с добровольного согласия пациентов и любезно предоставлены лаборатории клеточной биологии и патологии развития ГКБ №71.

В процессе культивирования клеток среду меняли каждые 3 сут, рассев осуществляли на 4-й и 8-й дни после выделения. Для замораживания выделенные клетки снимали с пластика на втором пассаже, обрабатывая поверхность чашки Петри раствором трипсина с ЭДТА (0,25%), суспензию клеток центрифугировали 5 мин при при 1000 об/мин, осадок ресуспендировали с сыворотке с 10% ДМСО, полученную суспензию помещали в криопробирки и

оставляли в низкотемпературном холодильнике при -80°С до 5 дней, затем клетки переносили в жидкий азот.

Проточная цитометрия: проточную цитометрию проводили на цитометре FACScalibur (BD Biosciences) с программным обеспечением CellQuest. Прибор стандартизовали при помощи микрогранул (7, 10, 15 и 20 микрон Dynosphere Uniform Microspheres; Bangs Laboratories Inc.; Fisher scientific). Для исследования клеток СКЖТ их инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 1% бычьего альбумина и первичные антитела, а затем, при необходимости, с вторичными антителами, мечеными различными флуоресцентными метками.

Молекулярное исследование клеток СКЖТ: выделение РНК проводили тризольным методом с использованием набора Trizol RNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя, с модификациями. Для выделения РНК брали замороженные на втором пассаже клетки (1,5><10б), размораживали и отмывали от криопротектора (ДМСО, ПанЭко). Концентрацию РНК измеряли спектрофотометрическим методом (при используемой длине волны 260 нм) с использованием прибора Thermo Spectronic (США) и программы Genesis. Конечная концентрация полученного раствора РНК составила 1,08 |ig/p.l. К полученному раствору РНК добавили 1мкл ингибитора рибонуклеаз из набора «Reverse Transcription System», Promega.

Выделение ДНК из клеток СКЖТ: замороженные ранее* клетки размораживали при 37°С, отмывали от криопротектора (ДМСО) и переносили в стерильную пробирку. В пробирку с образцом добавляли буфер для лизиса ядер клеток. Полученную смесь перемешивали и добавляли SDS до конечной концентрации 1%. В пробирку добавляли протеиназу К («Promega») до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировали в воздушном термостате при 37°С, 12 ч. По истечении инкубации добавляли ацетат Na до конечной концентрации 0,2 М. Перемешивали образовавшийся сгусток. Затем добавляли фенол (рН 8.0) в соотношении 1:1, перемешивали в течение 15 мин, оставляли для расслоения, затем перемешивали. Полученную смесь центрифугировали 20 - 30 мин при 3 000 - 4 000 об/мин (2 500 G).Отбирали водную фазу, добавляли смесь фенол: хлороформ (1:1) в соотношении 1:1, перемешивали плавно в течение 15 минут, и оставляли для расслоения, перемешивали еще раз. Центрифугировали 30 мин. при 4 000 об/мин. Отбирали водную фазу, добавляли хлороформ в соотношении 1:1, перемешивали в течение 15 мин, оставляли для расслоения, затем перемешивали. Центрифугировали полученную смесь 30 мин при 4 000. Затем отбирали водную фазу. Осаждение ДНК проводили изопропанолом 1:1. ДНК растворяли в воде MQ. Хранили при +4°С в течение 2-3 недель. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрическим методом (при используемой длине волны 260 нм) с использованием прибора Thermo Spectronic (США) и программы Genesis. Конечная концентрация тотальной ДНК составила 0,07 мкг/мл. Обратная транскрипция (синтез кДНК на выделенной РНК) и ПЦР: реакцию обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскриптазы RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase («Fermentas») согласно протоколу производителя. Для реакции брали 5 мкг выделенной РНК

(5 мкл), добавляли 0,2 мкг гексануклеотидных праймеров Random 6 «Синтол», добавляли обработанную DEPC воду до объема 14,5 мкл. Смесь инкубировали 5 мин при 70°С, затем помещали в лед. Добавляли 10х реакционный буфер до концентрации 1х (2 мкл), 10 мМ смесь dNTP до концентрации 1 мМ (2 мкл), 20 единиц ингибитора рибонуклеаз RiboLock™ «Fermentas». Смесь инкубировали 5 мин. при 25°С. Затем добавляли 200 единиц обратной транскриптазы (1 мкл с концентрацией 200 ед/мкл). Далее смесь икубировали 10 мин при 25°С, 60 мин. при 37°С, 10 мин. при 70°С и по окончании помещали в лед. Локус-специфическую ПЦР проводили с использованием пар праймеров для остеонектина (OSN F, OSN R), остеокальцина (OSC F, OSC R) и коллагена X (COL X F, COL X R) (Таблица 1).

Таблица 1.

Характеристики праймеров, использованных в работе.

Праймер Последовательность праймеров (5' - 3') Размер (N) Размер ожидаемого ПЦР продукта Ссылка

OSNF OSNR CGT TGG CTT GGA AGT TTC TCT T TAT AGG GCT TTC AGG CTC TTG С 22 22 188 пн Maeng et al., 2002

OSC F OSC R CAG ACC TAG CAG АСА CCA TGAG CGT CCA TAC TTT CGA GGC AG 22 20 440 пн Lisignoli et al., 2001

COL X F COL X R ACA AAG AGC GGA CAG AGA CC AGA AGG ACG AGT GGA CAT AC 20 20 442 пн Handa et al. 2001

Подбор условий для амплификации проводили на образцах ДНК, выделенных из клеток СКЖТ. ПЦР проводили на 170 нг ДНК с использованием смеси dNTP (25 мМ каждого) и термостабильной Taq ДНК-полимераза (нативная, с BSA) «Fermentas» на четырехканальном ДНК-амплификаторе ТП4-ПЦР-01-"Терцик" при температурных режимах, приведенных в таблице 2. Локус-специфическую ПЦР проводили при следующих количествах реагентов: 2мМ MgCl2, 1 mM смеси dNTP (по 0,25 мМ каждого), 1 х буфере для Taq ДНК-полимеразы, 0,5 - 1 мкМ каждого праймера (Таблица 2). Далее амплификацию проводили на синтезированной кДНК в таких же условиях.

Таблица 2.

Условия проведения ПЦР

Праймеры Количество праймеров Температурные режимы амплификации

OSNF OSNR 1 мкМ 1 мкМ 94°С - 3 мин; 1 цикл 94°С - 1 мин, 56°С - 1 мин, 72°С -1 мин; 30 циклов 72°С - 5 мин; 1 цикл

OSC F OSC R 1 мкМ 1 мкМ 94°С - 2 мин; 1 цикл 94°С - 30 сек, 56°С -1 мин, 68°С - 2 мин; 40 циклов 68°С - 7 мин; 1 цикл

COL X F COLXR 0,5 мкМ 0,5 мкМ 94°С - 3 мин; 1 цикл 94°С - 1 мин, 54°С -1 мин 30 сек, 72°С -1 мин 30 сек; 30 циклов 72°С - 5 мин; 1 цикл

Продукты амплификации фракционировали в 1,5% агарозном геле с последующей визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве маркера молекулярного веса использовали 50bp Ladder и Ladder Low range. Полученный результат анализировали при помощи трансиллюминаторе Biometra TI5 и программы обработки изображений BioDoc Analyze. Исследование моногенности клеток: Клетки СКЖТ рассевали с плотностью 1 клетка/см2. Через 2 недели клетки отмывали и окрашивали по Гимза. После этого культуры промывали водой и фотографировали колонии с диаметром более 1 мм, при помощи бинокуляра МБС-10, при суммарном увеличении Х4. Сканирующая электронная микроскопия: для подготовки препаратов к сканирующей электронной микроскопии, матрицы с клетками помещали стерильным пинцетом в чашку Петри с 1,5% глютаровым альдегидом на 20 минут. Зафиксированные блоки хранили при +4°С в течение месяца. Матрицы фиксировали следующим образом: отмывали от альдегида 3 раза по 5 мин в дистиллированной воде, после чего проводили осмирование образцов в течение 1- 1,5 ч в растворе оксида осмия 1% на дистилляте. Затем фиксированные образцы проводили по спиртам восходящей процентное™ (50%—»50%—>60%—»70%—>80%—>96%—>96%) выдерживая в каждом по 10 мин. Переносили образцы в пластиковые контейнеры для сушки в критической точке и помещали их в стеклянный стакан с ацетоном 4 раза по : 15 мин. Подготовленные таким образом матрицы сушили в критической точке и фиксировали на предметные столики и проводили напыление коллоидного золота. Подготовленные образцы исследовали при помощи сканирующего микроскопа JEOL-840, при увеличении от 30Х до 3000Х.

Объект исследования повеления биотрансплантата in vivo: выполнили на 57 самцах крыс линии Sprague Dawley в возрасте 3-4 мес со средним весом 400 гр. Животных содержали в НПП «Питомник лабораторных животных» РАН, г. Пущино, по одной особи в клетке. Все процедуры по рутинному уходу за животными выполняли в соответствии с правилами лаборатории. Стандартный, проверенный на контаминацию, экструдированный корм и очищенную воду животным давали ad libitum.

Исследование биобезопасности клеток СКЖТ: исследование биобезопасности методики пересадки аллогенных и аугологичных клеток после культивирования проводили на 21 животном, распределение по группам указано в таблицах 3 и 4.

Таблица 5.

Исследование биобезопасности пересадки ксеногенных стромальных клеток подкожной жировой ткани.

№ группы Кол-во животных № животных Тестируемый препарат Кол-во клеток Объем вводимого раствора (мл)

1 4 1;2; 3;4 культура клеток человека 10*106 2

2 4 5; 6; 7; 8 культура клеток человека 1*106 2

3 4 9; 10; 11; 12 физраствор 0 2

Таблица 4.

Исследование биобезопасности пересадки аллогенных и аутопогичных стромальных _клеток подкожной жировой ткани (4 группа).

№ животного № культуры Тестируемый препарат Сроки (сут)

1-3 1,2,3 соответственно Ауто 7

4,5 1 Алло 3, 7 соответственно

6,7 2 Алло 3, 7 соответственно

8,9 3 Алло 3, 7 соответственно

На первом этапе исследования через 10 сут после выделения клеток каждому животному вводили собственные культуры клеток в соответствии с номером. Введение осуществляли с помощью подкожной инъекции в область между лопатками. Всем животным вводили 10*10б клеток в 2 мл физраствора. Трем контрольным животным вводили 2 мл физраствора. Гистологическое исследование проводили на 7 сут после введения. При введении аллогенной культуры клеток использовали клетки от другого животного той же линии. Введение осуществляли шести животным с помощью подкожной инъекции в область между лопатками. Всем животным вводили 10*10® аллогенных клеток в 2 мл физраствора. Контрольным животным вводили 2 мл физраствора. Гистологическое исследование проводили на 3 и 7 сут после введения. Таким образом, всего в группе введения аллогенных клеток было 6 подопытных и 3 контрольных животных.

Для заселения матрикса клетками СКЖТ (для получения биотрансплантатов) in vitro брали коммерчески доступный матрикс (ChronOs™, Synthes, Швейцария) в форме блоков неправильной формы, среднего размера 0,5X0,5X0,8 мм. Блоки помещали по два в каждую лунку 4х-луночночного стерильного планшета и наносили на каждый по 50 тыс клеток в 100 мкл среды. Планшет помещали в инкубатор на 30-40 мин для обеспечения адгезии клеток к мактриксу. Через 40 мин в каждую лунку осторожно добавляли среду культивирования клеток до тех пор, пока она не покроет края матрикса с клетками. Среду в лунках меняли два раза в неделю, для аутологичной пересадки использовали матрицы через 10 сут после их заселения. Для микроскопических исследований использовали образцы через 10 сут после заселения клетками.

Операция остеоабразии: для пересадки полученных образцов нами была разработана операция по остеоабразии передней поверхности нижней челюсти крыс, моделирующее поверхностное нарушение структуры костной ткани. Для этого, под общим наркозом рассекали кожу в области левой щеки, отсепаровывали мышцу, обнажали поверхность угла нижней челюсти (рис. 1, цветная вставка 1). Далее скальпелем проводили абразию данной поверхности до глубины 0,1-0,2 мм. Поверхность санировали стерильным марлевым тампоном.

Имплантация биотрансплантатов: прижимая соответствующий аутологичный образец размером 0,5см*0,5см*0,8см пинцетом, фиксировали его

к челюсти посредством титановой проволоки (рис.1). Рану обрабатывали 0,4 мл антибиотика и послойно ушивали. Второй образец имплантировали под кожу в область между лопатками: разрезали кожу и подкожно- жировую клетчатку. Полутупым путем проходили в фасцию и «упаковывали» остеопластический материал в межфасциальное пространство. Рану послойно ушивали. Аналогично поступали в случае имплантации матрицы без клеток и контрольной остеоабразии без применения какого-либо материала. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования: Культуры клеток после выделения и после заселения на матрицы наблюдали при помощи микроскопа Olympus СКХ31, снабженного камерой DP12 и объективами Х4, XI0, Х20. В эксперименте по исследованию биобезопасности на 3 и 7 сут после введения всех типов клеток животных выводили из эксперимента, из межлопаточной области брали образец кожи с прилегающими тканями. Образцы тканей вырезали, зафиксировали в 4% растворе формалина на ФСБ, обезвоживали (стандартная проводка по спиртам восходящей концентрации), заливали в парафиновый блок, нарезали на микротоме (HM 340Е MICROM INTERNATIONAL GmbH, Германия) по 5-7 мкм и окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Визуальное исследование и фотографирование срезов ткани проводили с помощью микроскопа Leica DMLA (Германия) с объективами Х10, Х20, Х40 и камеры Photometries Cool SNAP. На 7, 21, 40 и 120 сут после имплантации биотрансплантата животных помещали в С02-камеру для эвтаназии и выводили из эксперимента. Затем выделяли часть нижней челюсти с фиксированной пластиной остеопластического материала ChronOs™ и фиксировали ее в 10% нейтральном формалине. Далее ткань кости подвергали декальцификации в Трилоне Б. Затем из каждого образца вырезали фрагмент ткани с участком имплантата толщиной примерно 5 мм, помещали его в одноразовую кассету и подвергали обработке в автомате для гистологической обработки тканей (STP 120, MICROM INTERNATIONAL GmbH, Германия). Далее производили заливку в парафин и формирование блоков. Затем приготавливали срезы, толщиной 5 мкм с использованием микротома. Далее окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону по стандартным методикам (Д.С. Саркисов 1996).

Иммуногистохимическое окрашивание проводили по следующей методике: неокрашенные парафиновые срезы, фиксированные на стеклах депарафинизировали в ксилоле. Затем проводили по спиртам 100% - 90% - 70% по 5 мин в каждом растворе. Промывали 3 раза по 5 мин в ФСБ. Затем инкубировали срезы в растворе первичных антител соответствующей концентрации при 4°С - 8ч (или при 20°С в течении 2-х часов). Далее отмывали срезы в ФСБ Зраза по 5 мин. Затем срезы инкубировали в растворе соответствующих вторичных антител, несущих флуоресцентную метку в разведении 1:100 -1:200 в течение 60 мин при комнатной температуре. Отмывали срезы от вторичных антител 3 раза по 5 мин в ФСБ. Далее докрашивали ядра клеток раствором бисбензимидазольного прижизненного красителя (Hoechst 33342) или DAPI в течение 5 мин, излишки красителя отмывали и заключали срезы в водорастворимую среду для флуоресцентных препаратов.

Рис. 1. Этапы операции остеоабразии и имплантации тканеинженерных конструкций.

Рис. 2. Стромальные клетки жировой ткани крыс: а - первичная культура; б -культура клеток СКЖТ, посаженная на пластик в низкой плотности (1кл. на 1см2), окрашивание по Гимза; в-сосудо-подобные структуры в культуре клеток СКЖТ.

Рис. 3. Клетки СКЖТ, адгезированные на матрице на 7 сут после заселения, сканирующий электронный микроскоп: а. Краевая поверхность носителя: б. Поверхность носителя и отростков двух клеток; в. Экспрессия остеокальцина в лунке биотрансплантата; г. Окрашивание ядер клеток в лунке.

Рис. 4. Проточная цитофлуориметрия культур СКЖТ. Гемопоэтические: С034, С045, и негемопоэтические маркеры: СЭ49Ь, СВ90 и ИЬА-АВС, выраженная экспрессия маркеров клеток мезенхнмального ряда: Сй117 и С£> 105.

Рис.6. На 7 суш после имплантации матрицы без внесения клеток: а. Формирование волн регенерации на (окрашивание по Ван-Гизону); 6. Лунка матрицы заполненная Т-клетками и эритроцитами (гематоксилин-эозин).

Рис. 7. Изображение матрицыс клетками СКЖТ на 7 суш: а. Ячейка остеопластического материала, заполненная Т-клетками, макрофагами, моноцитами; б. Начало формирования костной ткани внутри лунки биотрансплантата, (гематоксилин-эозин).

Рис. 8. Начало формирования волн регенерации со стороны костного дефекта: а. Скопление незрелых активно делящихся остеогенных клеток; б. Начальные стадии остеогенза внутри лунки (окрашивание по Ван-Гизону).

Рис. 9. Срезы биотрансплантата на 21 сут: а. Общий вид биотрансплантата на 21сут (гематоксилин - эозин); б. Начало формирования зрелого костного матрикса в центре ячейки (окрашивание по Ван-Гизону).

Рис. 10. Изображение матрицы без внесения клеток СКЖТ на 40 суш: а. Миграция и многочисленные деления остеогенных клеток со стороны кости, заселение лунок (гематоксилин-эозин); б. Автономное формирование зрелой компактной костной ткани в ячейке носителя (окрашивание по Ван-Гизону).

Рис.11. Изображение матрицы с клетками СКЖТ на 40 сут: а. «Волны» регенерации, формирование незрелой костной ткани на границе костной ткани нижней челюсти и биотрансплантата; б. Накопление и оссификация ВКМ в лунке, делящиеся остеогенные тетки по периферии (окрашивание по Ван-Гизону).

Рис. 12. Группа с использованием матрицы без внесения клеток СКЖТ на 120 сут: (а-б). Формирование зрелой костной ткани в большинстве ячеек остеопластического материала (окрашивание по Ван-Гизону).

Рис 13. Формирование костного мозга в новообразованной кости на 120 сут после трансплантации биотрансплантата (окрашивание по Ван-Гизону).

Рис. 14. Экспрессия остеокалъцина (зеленый) в срезах матрицы без внесения кле, сут, 6-120 сут

на разных сроках исследования: а - 40

а ** - - — л • ■ "V *> *с ... , ' . 3' „ \ — к * * £ 1 ' ■ »г г . "»**,. •»»« « * * - ч¿, " » « *) *> ' 6 в

Рис. 15. Экспрессия остеокалъцина (зеленый) в срезах биотрансплантата на разных сроках исследования: а- 21 сут, 6-40 сут, в -120 сут.

Рис. 16. Экспрессия фактора фон Виллебрандта (а, красный) на 21 сут после имплантации и общий вид (б): ядра клеток (синий), остеокапьцин (зеленый), фактора фон Виллебрандта (красный) на 21 сут.

Таблица 5.

Динамика изменения количества сосудов в двух экспериментальных группах на _разных сроках исследования. По оси ординат - количество сосудов.

120 100 80 60 40 20 4 ■ Матрица ■ Матрица+ССФ Л

21 сутки 40 сутки 120 сутки

Среднее между группами количество сосудов на 21 сутки=81,5±6,5 Среднее между группами количество сосудов на 40 сутки=89,5± Среднее между группами количество сосудов на 120 сутки=56,5+10,5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика культуры клеток СКЖТ и тканеинженерного трансплантата

Полученные культуры клеток СКЖТ гетерогенны, в них присутствуют клетки сосудистого эндотелия, фибробласты, фибробластоподобные клетки, макрофаги, перициты, гладкомышечные клетки. Полученная гетерогенная фракция клеток СКЖТ экпрессировала следующие антигены: CD34 (0,31%), CD 45 (0,8%), CD 105 (99,1%), CD49b (1,54%), CD90 (40,69%), HLA-ABC (89,18%), CD 117 (0,66%). Такой профиль экспрессии поверхностных маркеров соответствует данным литературы.

Данная фракция была способна формировать колонии при рассеве клеток в низкой плотности (100 кл. на 1см3), что характеризует их как клоногенную культуру (цветная вставка 1, рис. 26). Исследуемые культуры клеток человека и крыс на 7-10 сут культивирования спонтанно формировали сосудо-подобные структуры. Способность формировать такие структуры является отличительной способностью СКЖТ (в отличие от стромальных клеток, полученных из других источников, в т.ч. от предшественников костного мозга). Некоторые исследовательские группы называют такие клетки стромально-сосудистой фракцией.

Клетки СКЖТ крыс после заселения на носитель были адгезированны к его поверхности и были способны пролиферировать в его лунках. После разделения культуры клеток СКЖТ и матрицы носителя клетки (через 7 сут после заселения) спонтанно формировали очаги минерализации без использования остеогенных индукторов в среде. Этот факт свидетельствует в пользу того, что матрица обладает ярко выраженным остеоиндуктивными свойствами и стимулирует клетки СКЖТ к дифференцировке в остеогенном направлении в двухмерном пространстве. При иммуноцитохимическом окрашивании лунок биотрасплантата была выявлена экспрессия остеокальцина в клетках, заселяющих лунку матрицы (цветная вставка 1, рис.Зв) Так, полученная фракция практически не экспрессирует гемопоэтических маркеров, однако, экспрессия маркера клеток-предшественников достигает 99% (цветная вставка 2, рис 4.).

Исследование иммунологического ответа на трансплантированные клетки

Результаты исследования иммуногенного эффекта клеток всех трех типов (ксеногенная, аллогенная и аутологичная культуры) позволили сделать вывод, что введение аутологичной культуры клеток в количестве 1*106и 10*106, не вызвало изменения температуры тела относительно нормальной физиологической температуры тела животных, а также не приводило к разитию иммунного ответа. Результаты гистологического анализа позволили прийти к выводу, что введение культуры человеческих клеток в концентрации 1*106 и 10*10 вызвало местно раздражающее действие, которое было ярко выражено на 7 сутки после введения. Введение культуры клеток в концентрации 10*106 вызвало выраженную иммунную реакцию в гиподерме в виде большого локального лимфоцитарного инфильтрата, введение клеток в концентрации 1*106 вызвало умеренную иммунную реакцию в виде небольшого по площади диффузного лимфоцитарного инфильтрата в гиподерме.

Результаты молекулярного исследования экспрессии генов остеогенеза в клетках СКЖТ

После заселения на носитель через 10 сут после культивирования клетки снимали с матрицы и исследовали экспрессию остеонектина, остеокальцина и коллагена 10 методом ПЦР-анализа (рис.5). Контролем служила кДНК клеток, не заселенных на матрикс, а культивировавшихся в монослое в течение соответствующего срока. Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки после заселения на матрикс становятся коммитированными в остеогенном направлении и экспрессируют остеогенные маркеры (остеонектин. остеокальцин и коллагена 10), однако в силу того, что данные гены маркируют незрелые остеогенные клетки, говорить о полной терминальной дифференцировке клеток СКЖТ в остеобласты на данном этапе исследований нельзя. В контрольных клетках СКЖТ (не заселявших матрицу) нами была обнаружена экспрессия остеонектина, но менее выраженная, чем в клетках, которые заселяли матрикс (рис. 56). Это подтверждает данные литературы, свидетельствующие о том, что фракция СКЖТ содержит плюрипотентные клетки, способные дифференцироваться в остеогенном направлении. Однако этот процесс, в случае клеток, находящихся в двумерном пространстве идет не до конца и контрольные клетки не экспрессируют коллаген 10 и остеокальцин, маркирующий более поздние этапы остеогенеза.

К 1 2 К 1 2 К 1 2

200 —— ■......... ........... 100

400 ЯШ

300 200 100

а. б. в.

Рис 5. Анализ экспрессии генов остеогенеза в клетках СКЖТ через 10 сут после заселения на матрикс (1,2) и в контрольных клетках (К); а. экспрессия коллагена X; б. экспрессия остеонектина; в. экспрессия остеокальцина

Таким образом, можно предположить, что клетки, помещенные на трехмерный носитель, через 10 сут культивирования на нем становятся коммитированными в остеогенном направлении и проходят несколько стадий остеогенеза: гипертрофия хондробластов (коллаген X), пролиферация остеогенных предшественников и синтез белков ВКМ (остеонектин), дифференцировка предшественников в остеобласты и минерализация белкового матрикса (остеокальцин).

Постабразивный остеогенез в зоне дефекта: 7 сут после пересадки материала

В опытных и контрольных группах на 7 сут после травматического повреждения в области дефекта уже не было выявлено гематомы, однако присутствовали признаки воспалительной реакции, контакт остеопластического материала с поверхностью кости нижней челюсти животного отсутствовал. Со стороны надкостницы, признаки остеогенеза отмечены лишь в виде неструктурированных «волн». Ячейки остеопластического материала в основном заполнены эритроцитами, присутствие которых связано с забором

образцов для гистоанализа, единичными фибробластоподобными клетками, единичными многоядерными клетками, а также неклеточным веществом, по-видимому, тонкими нитями фибрина.

Группа с использованием матрицы: в опытных и контрольных группах на 7 сут после травматического повреждения в области дефекта уже не было выявлено гематомы, однако присутствовали признаки воспалительной реакции (цветная вставка 2, рис. 6). Измерительный отрезок на всех рисунках (кроме фотографий со сканирующего микроскопа) соответствует 100 мкм. Контакт остеопластического материала с поверхностью кости нижней челюсти животного отсутствовал. Со стороны надкостницы, признаки остеогенеза отмечены лишь в виде неструктурированных «волн». Клеточный состав инфильтрата представлен многочисленными мононуклеарами с преобладанием лимфоцитов и макрофагов, а также многочисленными фибробластами. Отмечено формирование многоядерных клеток, последние представлены в умеренном количестве. Признаки неоангиогенеза на данном сроке не отмечены.

Группа с использованием маттты с клетками СКЖТ: контакт остеопластического материала с поверхностью кости нижней челюсти животного отсутствует. Со стороны надкостницы признаки остеогенеза не отмечены.

Клеточный состав инфильтрата представлен многочисленными мононуклеарами с преобладанием лимфоцитов и макрофагов, а также многочисленными фибробластами (цветная вставка 3, рис.7а). Также отмечено формирование многоядерных клеток, последние представлены в умеренном количестве.

В единичных ячейках, находящихся в непосредственном контакте с мышечной массой отмечена инвазия сосудов из соседней ткани. Признаки ангиогенеза на данном сроке наблюдения не отмечены. В целом, ячейки остеопластического материала заполнены эритроцитами, неклеточным веществом (нити фибрина и коллагена), и единичными клетками веретенообразной формы.

Результаты исследования на 21 сутки после пересадки материала

Группа с использованием матрицы: на 21 сут эксперимента во всех группах наблюдения отмечали высокую активность репаративных процессов.

Между костной поверхностью нижней челюсти и остеопластическим материалом сформировалась тонкая прослойка волокнистой соединительной ткани, представляющая собой тяжи коллагеновых волокон. Все ячейки остеопластического материала заполнены в умеренном количестве мигрирующими фибробластами, нитями коллагеновых волокон, в отдельных ячейках присутствуют более плотные образования из коллагена в виде коллагеновых тяжей. Во многих ячейках, в большей степени в тех, которые находятся ближе по отношению к мышечной ткани, отмечено умеренное количество многоядерных клеток. В пределах каждой ячейки эти клетки локализованы на стенках ячеек (предположительно - остеокласты). В ячейках также отмечены в умеренном количестве мононуклеары, преимущественно лимфоциты. Большинство ячеек остеопластического материала (прилежащих как к костной поверхности, так и к пласту мышечной ткани, а также в центре пластинки) заполнены массой нейтрофилов и клеточным детритом

нейтрофилов. В некоторых ячейках, с меньшим содержанием нейтрофилов и клеточного детрита отмечены единичные кровеносные сосуды. Отдельные ячейки были пусты.

Группа с использованием матрицы с клетками СКЖТ

Между костной поверхностью нижней челюсти и остеопластическим материалом сформировалась прослойка волокнистой соединительной ткани, представляющая собой тяжи коллагеновых волокон. В соединительнотканной прослойке отмечено много сосудов различного диаметра, а также умеренное количество лимфоцитов.

В ячейках остеопластического материала, прилежащего к мышечной ткани отмечена высокая плотность заполнения коллагеновыми волокнами. В ячейках, расположенных в центральной части пластины, плотность заполнения коллагеновыми волокнами ниже. В целом, в ячейках отмечено большое количество сосудов различного диаметра, умеренное количество многоядерных клеток, умеренное количество мигрирующих фибробластов и мононуклеаров с преобладанием лимфоцитов. В отдельных ячейках, расположенных в непосредственной близости по отношению к мышечной ткани, отмечено большое количество лимфоцитов. Признаки остеогенеза отмечены в двух независимых областях. На поверхности кости отмечен костный гребешок, на более глубоких срезах костный гребешок в виде сформировавшейся костной ткани можно наблюдать в ячейке остеопластического материала. Сформировавшуюся костную ткань можно было также наблюдать в одной из ячеек, расположенную в отдалении от костной поверхности, ближе к мышечному пласту. В обоих случаях новообразованная костная ткань находилась в окружении незрелых клеток с морфологическими признаками остеобластов, а также узких, веретенообразных клеток. На одном участке костной поверхности отмечена небольшая группа клеток с морфологическими признаками остеобластов. Ячейки меньшей часть пластины, относительно всей площади, заполнены коллагеновыми волокнами и кровеносными сосудами, степень заполнения высокая

Результаты исследования на 40 сутки после пересадки материала

Группа с использованием матрицы: между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти сформировалась прослойка из волокнистой ткани, пронизанная кровеносными сосудами. В области плотного контакта пластины с костной поверхностью нижней челюсти отмечены многочисленные среднего размера костные бугорки и гребешки, а также оссификация (кальцинирование) материала между ячейками. В единичных ячейках отмечена хорошо сформированная новообразованная костная ткань.

Со стороны мышечного пласта отмечен слой бластных форм клеток, прилегающий непосредственно к имплантату. В отдельных ячейках со стороны мышечного пласта отмечено формирование костной ткани и большое количество бластных форм клеток. В отдельных ячейках, преимущественно центральной локализации в пластине, отмечено небольшое количество адипозной ткани.

Группа с использованием матрицы с клетками СКЖТ: между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти

сформировалась прослойка из волокнистой ткани, пронизанная кровеносными сосудами. На одном участке костной поверхности отмечен средний по размеру, но глубокий дефект кости. В ячейках носителя со стороны мышечной ткани отмечено огромное количество мононуклеаров с преобладанием плазматических клеток, присутствуют гигантские многоядерные эпителиоидные клетки (за счет слияния макрофагов).

На основании клеточного состава можно предположить, что ранее имел место выраженный острый воспалительный процесс и на данный момент зафиксирована 3 стадия воспаления. Это предположение также подтверждается тем, что во многих центральных ячейках, соответствующих примерно Уг пластины, отмечено присутствие масса детрита нейтрофилов, а также небольшие скопления нейтрофилов. Во многих ячейках со стороны мышечной ткани отмечено формирование новообразованной костной ткани. Новообразованная костная ткань на костной поверхности нижней челюсти отмечена лишь в одном участке челюсти. Процессы регенерации в костных дефектах с введением клеточных трансплантатов и в дефектах на противоположной конечности были более активными и характеризовались большей степенью компактизации и зрелостью костной ткани, приобретшей в отдельных участках модульное обособленное пластинчатое строение. Результаты исследования на 120 сутки после пересадки материала

Группа с использованием .матрицы На отдельных участках костной поверхности нижней челюсти отмечены единичные новообразованные костные бугорки относительно большого размера. Отмечено также появление признаков компактизации кости, на некоторых срезах была выявлена зрелая компактная костная ткань (цветная вставка 4, рис. 12). В ячейках матрицы со стороны костной поверхности нижней челюсти отмечен интенсивный процесс остеогенеза. Этому явилось подтверждение отмеченные на срезах два сравнительно больших по площади участка, на которых представлена группа ячеек носителя с формированной новообразованной костной тканью. Со стороны мышечного пласта в ячейках матрицы отмечено выраженное формирование плотной волокнистой соединительной ткани.

Практически все ячейки, в которых не отмечено новообразованной костной ткани, заполнены большим количеством пучков коллагеновых волокон. Во всех ячейках отмечено присутствие элементов сосудистого русла различного диаметра. В единичных ячейках отмечена в умеренном количестве адипозная ткань. Количество гигантских многоядерных клеток (предположительно - остеокластов) в ячейках незначительное. Отмечены участки, в которых имеет место процесс кальцификации материала между ячейками. В целом, репаративные процессы кости на этих сроках наблюдения можно охарактеризовать как перестройку ретикулофиброзной (незрелой кости) в компактную (зрелую). Скорость репаративных процессов во всех группах снизилась, на первый план выступали процессы минерализации и ремоделирования костной ткани в соответствии с функциональной нагрузкой костного органа.

Группа с использованием матрицы с клетками СКЖТ: на 120 сут эксперимента во всех группах наблюдения отмечали замедление репаративных

процессов. Костная часть регенерата состояла из ретикулофиброзной и компактной кости. Ретикулофиброзная кость была образована массивными костными трабекулами с узкими щелевидными межтрабекулярными пространствами, заполненными соединительной тканью или костным мозгом (цветная вставка 5, рис. 13). Стенки костных трабекул были выстланы вытянутыми клетками, предположительно остеобластами или остеогенными предшественниками. Эти клетки скапливались вокруг кровеносных сосудов, и прилежащая к этим участкам костная ткань имела пластинчатое строение и более интенсивно окрашивалась (рис. 13)

Между остеопластическим материалом и костной поверхностью нижней челюсти сформировалась прослойка из волокнистой соединительной ткани, пронизанная кровеносными сосудами. Отмечен выраженный остеогенез в центральных ячейках и ячейках, расположенных ближе к костной поверхности нижней челюсти. На серии срезов отмечены многочисленные группы ячеек материала, заполненных сформированной новообразованной костной тканью. В новообразованной костной ткани ячеек одной из групп отмечен хорошо сформированный красный и желтый костный мозг. На отдельной серии срезов практически все ячейки матрицы заполнены сформированной новообразованной костной тканью. Ячейки, в которых новообразованная костная ткань отсутствует, заполнены в большом количестве мощными пучками коллагеновых волокон. Во всех ячейках представлено хорошо сформированное сосудистое русло. В данном случае отмечен наиболее ярко выраженный остеогенез, подтверждением чему явилось большое количество ячеек матрикса, заполненных сформированной новообразованной костной тканью, а также в отдельных ячейках отмечены участки хорошо сформированного красного и желтого костного мозга.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что идет активное замещение материала сформированной и функционально активной новообразованной костной тканью. Результаты нммуногистохимического окрашивания

Иммуногистохимическое окрашивание срезов матрицы после имплантации

При иммунохимическом окрашивании срезов матрицы на 40 и 120 сут после трансплантации нами была зафиксирована экспрессия остеокальцина. В основном, остеокальцин-позитивные клетки локализовались по периферии матрицы, что вероятно свидетельствует о том, что это клетки собственной надкостницы реципиента, являющиеся в данном случае клеточным источником остеобластов. При иммунохимическом окрашивании срезов матрицы на 21 сутки экспрессии остеокальцина не было отмечено.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов биотранеппантата

При иммунохимическом окрашивании срезов биотрансплантата (матрицы с клетками СКЖТ) на 21, 40 и 120 сут после трансплантации нами была зафиксирована экспрессия остеокальцина на всех трех сроках. В большинстве случаев, остеокальцин-позитивные клетки локализовались внутри ячеек носителя, в следствие чего мы предполагаем, что остеокальцин экспрессировали клетки СКЖТ, ранее имплантированные на матрицу (цветная вставка 5, рис. 15)

На всех трех сроках исследования интенсивность свечения была более ярко выражена по сравнению с использованием лишь матрицы без клеток (рис. 14).

Также нами была зафиксирована экспрессия фактора Фон Виллебрантда -маркерного антигена, характеризующего клетки зрелой сосудистой стенки (эндотелий). Таким образом, в группе с использованием клеток СКЖТ было обнаружено формирование зрелых сосудов в трансплантате уже на 21 сут после операции (цветная вставка 6, рис. 16). Таким образом, при иммунохимическом окрашивании трансплантатов на разных сроках исследования была выявлена экспрессия остеокальцина во обеих группах, что подтвердило результаты ПЦР-анализа. Однако лишь в группе с использованием клеток СКЖТ экспрессия данного маркера была обнаружена на всех сроках исследования. Кроме того, экспрессия фактора Фон Виллебрантда подтверждает формирование зрелого сосудистого русла в трансплантате уже на 21 сут, что было не так ярко выражено при исследовании гистологических препаратов. Сравнение количества сосудов в экспериментальной и контрольной группах

На всех сроках исследования производили подсчет сосудов в обеих группах исследования. Результаты представлены в Таблице 5. Оказалось, что количество крупных, мелких и средних сосудов достоверно выше в группе с использованием клеток СКЖТ.

Было также обнаружено, что на поздних сроках происходит значительное уменьшение количества сосудов в обеих группах, однако в группе с клетками СКЖТ этот феномен менее выражен.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы стромальные клетки подкожной жировой ткани, показана биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани после подкожного введения (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).

2. Разработан метод создания тканеинженерного биотрансплантата на основе остеопластического материала ChronOs™ и клеток СКЖТ, показана дифференцировка клеток СКЖТ в остеогенном направлении, культивированых в составе биотрансплантата in vitro.

3. Разработана модель повреждения костной ткани на нижней челюсти крыс, пригодная для оценки репаративного влияния тканеинженерного биотрансплантата на de novo остеогенез.

4. С использованием разработанной модели, показана эффективность пересадки биотрансплантата по сравнению с пересадкой матрицы без внесения клеток в процессе репаративного остеогенеза.

5. Формирование функционально активной костной ткани de novo при использовании биотрансплантата происходит во многом за счет достоверного увеличения количества сосудов в биотрансплантате.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. B.C. Мелихова, к.б.н. И.Н. Сабурина, д.м.н. А.А. Орлов, д.м.н., B.C. Репин, к.б.н. Н.И.Новикова, д.б.н. Мурашов А.Н. Исследование безопасности использования аутологичных, аллогенных и кссногенных культур клеток-предшественников из подкожной жировой ткани. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2008, - Т.З - № 3 - С. 26-34.

2. Сабурина И.Н., Мелихова B.C.. Кошелева Н. В., Горкун А. А., Исаев А.А., Приходько А. В., Репин В. С. Характеристика клеток, выделенных из пупочного канатика. // Материалы конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения». -М,-2008.-С. 49.

3. Орлов А.А., Сабурина И.Н., Кондратьев С.Н., Мелихова B.C.. Репин B.C., Новикова Н.И., Мурашев А.Н., Маевский Е.И., Бизяев А.Ф., Ипполитов

B.П., Белецкий И.В, Праздников Э.Н., Шабанов B.JI. Моделирование 3-D остеогенеза костной ткани в эксперименте на базе аутологичных культур плюрипотентных мезенхимальных стромальных клеток крыс, выращиваемых на остеоиндуктивном матриксе из пористых остеопластических биоматериалов для устранения дефектов кости. // Тезисы конференции «Osstem Meeting 2007 Early and Esthetic». - M. - 2007. - C. 21

4. Мелихова В. С.. Пулин А. А., Кошелева Н. В. ГУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН. Экспериментальное 3D моделирование костной ткани, на базе аутологичных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток крыс и остеопластических материалов. // V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - М.-2008. -

C. 285.

5. Melikhova V.S.. Saburina I. N., Orlov A. A., Kondratiev S.N. Comparison of different stem cell sources and biomimetic scaffolds for bone tissue engineering. // MGH-HKU-Nature China Forum: Molecular Medicine and Biopharma Opportunities. - Hong-Kong - 2007. -C.53.

EXPERIMENTAL 3D DESIGN OF METHOD TO CORRECT PATHOLOGICAL PROCESSES BETWEEN BONE TISSUE AND TISSUE ENGINEERED TRANSPLANT Melikhova V. S.

Over the last decade, bone tissue has been engineered from osteoprogenitor cells and degradable polymers in to animal implanting models. The ability to fabricate bone tissue in precise geometric shapes and sizes for reconstructive surgical applications is attractive and may be applied for reconstructive surgical problems such as phalangeal or temporomandibular joint reconstruction. Our aim was to create 3 dimensional analogue of bone tissue and to study the influence of this implant (based on (33-calcium phosphate, ChronOs™ and adipose stromal cells) и on de novo osteogenesis after partial osteoabrasion in rat maxilla. During the preliminary experiments we have evaluated that the use of autologous rat adipose stromal cell is the most relevant. We have elaborated a method matrix seeding with cells, so they can adhere and proliferate, as well as differentiated on its surface. Though the formation of new vessels and capillaries rat adipose stromal cells promote faster mature bone formation

in the implant, newly formed bone tissue was functionally active, what was proved by bone marrow formation and the beginning of hematopoesis process.

Автор выражает искреннюю благодарность за поддержку и научное консультирование: кандидату биологических наук Н.И. Новиковой, кандидату биологических наук И.А. Мартиросян, доктору медицинских наук, профессору, член-корреспонденту РАМН, B.C. Репину.

Заказ № 136/02/09 Подписано в печать 24.02.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 \v\vw. с/г. ги; е-таП: т/о@с/г. ги

Травмы, хирургические вмешательства при доброкачественных и злокачественных опухолях на челюстях заставляют клиницистов и исследователей искать новые подходы к восстановлению пораженной, травмированной или утерянной костной ткани. В ортопедической и стоматологической практике широко применяются остеопластические и остеоиндуктивные материалы различного происхождения. Так, гидроксиапатит был впервые применен в 1978 году, а с конца 80-х годов больше половины статей в специализированном журнале «Materials in Medicine», а также значительное количество исследовательских работ в наиболее престижных ортопедических и стоматологических журналах были посвящены исследованию и применению этого и других остеопластических материалов [19, 57, 72, 127]. В дальнейшем спектр используемых материалов стал значительно расширяться. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой восстановительной способностью, в ряде случаев репаративный процесс в костной ткани (даже при использовании различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов) не заканчивается восстановлением ее структуры и функции [20, 21]. Подобные случаи, обусловленные разрушением или недостатком клеток-предшественников костной ткани, можно охарактеризовать как "остеогенную недостаточность" [3, 21, 22, 23]. В связи с этим, на протяжении последних десяти лет в различных странах исследователями и клиницистами ведется поиск новых материалов, а также методик (в том числе и с использованием клеток-предшественников костной ткани) для восстановления не только структуры костной ткани, но и ее функций [38].

Актуальность

Восстановление целостности кости является актуальной проблемой современной травматологии, ортопедии и стоматологии, а также фундаментальных медико-биологических дисциплин. В настоящее время активно ведется поиск новых клеточных технологий, которые позволяли бы ускорить образование костной ткани, как на периферии костного дефекта, так и внутри имплантата.

Как известно, аутологичные и аллогенные костные трансплантаты характеризуются невысокой выживаемостью in situ, плохо взаимодействуют с костью реципиента из-за влияния на нее патофизиологических процессов и подвергаются быстрой резорбции [21-23]. Также часто происходит полная перестройка пересаженной костной ткани, а процесс получения кости прежней прочности длительный и занимает несколько лет. Кроме того, полноценное восстановление костной ткани возможно только при перемещении костного трансплантата на сосудистой «ножке» или после предварительной его пересадки на отдаленные участки тела с включением в кровоток [132, 133]. Такие операции могут быть выполнены с помощью микрохирургической техники в высокоспециализированных стационарах, которые не могут обеспечить потребностей в возрастающем количестве остеопластических операций. По этим причинам в последнее время органные костные трансплантаты признаны неперспективным видом борьбы с дефицитом костной ткани.

В последние годы на первый план в фундаментальной и клинической стоматологии и ортопедии выходят клеточные трансплантаты на основе стволовых и прогениторных клеток. Изучение клеточной биологии костной ткани в культуре, открытие ростовых факторов, контролирующих патоморфологические изменения в поврежденной костной ткани, привело к бурному прогрессу знаний и технологий по направленному остеогенезу, разработке новых методов лабораторного выращивания костной ткани in vitro на биологически активных, не имеющих иммуногенных свойств, заменителях костной ткани, способных к биодеградации и обладающих остеокондуктивными свойствами [51]. Клиницистами получены первые б результаты, которые свидетельствуют о перспективности лечения дефектов костей различных локализаций и доступности подобных методик, и их приемлемой стоимости [109]. Однако дальнейшее развитие новых клеточных технологий в области стоматологии, оперативной травматологии и ортопедии сдерживается тем, что в подобных работах не прослежены отдаленные результаты лечения, недостаточно хорошо освящена динамика процесса, а исследования не структурированы по срокам наблюдения; также часто не описана функциональная активность восстановленной костной ткани, что затрудняет оценку адекватности выбора методов лечения и его эффективности. Как известно, лимиты естественной репарации костной ткани определяются патофизиологическими процессами, приводящими к снижению активности и численности остеобластов, что сопровождается снижением уровня щелочной фосфотазы, остеокальцина, коллагена 1 типа и других маркерных белков остеогенеза, а также дефицитом ростовых факторов, сигнальных молекул и цитокинов, регулирующих процесс репарации. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [2]. Изучение вопросов данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что позволит разработать новые методы реконструкции костной ткани in vitro с участием стволовых клеток, остеоиндуктивных и остеопластических высокопористых материалов и факторов, ускоряющих региональную и системную репарацию кости.

Регенерация кости - сложный многоступенчатый процесс, составляющими которого являются миграция, пролиферация, дифференцировка различных клеточных популяций мезенхимального происхождения. Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекают с участием незрелых клеток мезенхимы, которые сохраняются в так называемых стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга [31, 78, 137]. Теоретические основы использования остеогенных и хондрогенных клеточных элементов в целях костной пластики и лечения повреждений тканей хряща закладывались основоположниками классической гистологии. Известный гистолог A.A. Максимов, еще в двадцатые годы предложил теорию о «мезенхимальном резерве», согласно которому, все «механоциты» (фибробласты, остеобласты, хондроциты и др.) и клетки крови во взрослом организме происходят от слабо дифференцированных полипотентных предшественников [89]. Через некоторое время в процессе исследований, в экспериментах с культурами стромы костного мозга взрослых доноров были выявлены клетки, которые очевидно являлись предшественниками «механоцитов», однако при этом они не были идентичны стволовым клеткам крови по своим свойствам [5].

Исследований патологов, гистологов и морфологов, касающихся целостного гистологического и гистоморфометрического анализа репаративных процессов в костной ране при использовании клеточных биотехнологий в научной литературе недостаточно. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [2]. Кроме того, одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для культуры клеток, что непосредственно влияет на судьбу клеточной культуры, привнесенной в дефект кости, и исход процесса регенерации кости.

Исследование данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что может быть использовано в теоретической гистологии и клинической практике. С учетом приведенных положений разрабатываемая проблема является актуальной и представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что и определяет тему данного экспериментального исследования.

Цель исследования

Целью данного исследования является изучение влияния биотрансплантата, состоящего из рЗ-фосфата кальция (ChronOs™) и стромальных клеток подкожной жировой ткани на de novo остеогенез после частичной остеоабразии наружной поверхности нижней челюсти у крыс

Задачи

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать условия получения культуры стромальных клеток подкожной жировой ткани и охарактеризовать ее.

2. Продемонстрировать биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани при подкожном введении (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).

3. Создать и охарактеризовать 3D тканеинженерный биотрансплантат для моделирования репаративного остеогенеза in vivo.

4. Разработать способ получения тканеинженерной конструкции, пригодной для имплантации с целью эффективного и безопасного репаративного остеогенеза.

5. Разработать модель повреждения костной ткани в виде остеоабразии на нижней челюсти крыс.

6. Изучить влияние матрицы с клетками и без них на процессы формирования кости de novo на разных сроках исследования (в том числе и длительных).

Научная новизна

Модифицирован и оптимизирован способ выделения и культивирования стромальных клеток подкожной жировой ткани, показана биобезопасность полученных клеток. Охарактеризован остеогенный потенциал культуры.

Разработана оригинальная технология заселения клеток на выбранную матрицу, доказано выживанием клеток на матрице, показана высокая эффективность прикрепления и пролиферации клеток на матрице. Разработана доклиническая модель исследования костного трансплантата, моделированного in vitro, на животных (in vivo).

Изучен и сопоставлен регенерационный остеогенез без внесения и с внесением в область поверхностного дефекта нижней челюсти стромальных клеток подкожной жировой ткани (СКЖТ), показано их влияние на образование сосудистой сети в области имплантата и вокруг нее.

С помощью гистологического анализа выявлены закономерные этапы остеогенеза, происходящие на границе биотрансплантата и нативной костной ткани нижней челюсти после операции остеобаразии. На разработанной оригинальной модели репаративного остеогенеза у крыс с помощью серийного гистологического анализа изучены особенности действия клеточного трансплантата по сравнению с бесклеточным матриксом. Выявлена и изучена ангиогенная активность клеточного трансплантата. Установлено, что на длительных сроках наблюдения de novo остеогенез идет только в условиях контакта с нативной костью в сравнении с подкожной имплантацией, тогда как васкулогенез происходит в обоих случаях.

Проведенная работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые произведена оценка динамики репаративного остеогенеза и васкулогенеза in vivo.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанная технология выделения и культивирования СКЖТ и их последующее заселение на подобранный пористый носитель позволила создать биобезопасный и биодеградируемый тканеинженерный имплантат.

Предложена адекватная экспериментальная модель повреждения костной ткани на животных (операция частичной остеоабразии).

Работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции и динамики регенерации костной ткани трансплантации тканеинженерного трансплантата, полученного in vitro, путем заселения СКЖТ на пористый носитель ChronOs™. Материалы диссертации могут служить основой для дальнейшей научно-практической работы в данной области и разработки новых биомедицинских технологий. Результаты работы использованы компанией Synthes (Швейцария) для подтверждения биобезопасности и перспектив использования производимого материала в области регенерации костной ткани.

Разработанная технология выделения и культивирования клеток СКЖТ, а также их заселения на матрицу позволяет совершенствовать и внедрять в клиническую практику методы улучшения течения репаративной регенерации костной ткани (при переломах, дефектах костей и др.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная технология пересадки тканеинженерного биотрансплантата на основе остеопластического материала ChronOs™ и клеток СКЖТ в область дефекта плоской кости ускоряет процесс формирования кости de novo и обеспечивает формирование функционально активной костной ткани.

2. Присутствие в трансплантате культуры клеток СКЖТ приводит к сокращению сроков образования костной ткани de novo в основном за счет улучшения формирования сосудистого русла и кровоснабжения в пересаженном биотрансплантате на ранних сроках.

3. Пересадка тканеинженерного биотрансплантата, моделированного in vitro на основе ChronOs и клеток СКЖТ является наиболее перспективной стратегией для последующего клинического использования, по сравнению с пересадкой носителя без клеточного материала.

Реализация работы

Результаты работы служат теоретическим обоснованием для дальнейшего развития клеточных биотехнологий и их внедрения в травматологическую и стоматологическую практику. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. На основе результатов диссертации планируется проведение ограниченных клинических испытаний в стоматологической практике.

Апробация работы Основные положения работы доложены на:

1. MGH-HKU-Nature China Forum: Molecular Medicine and Biopharma Opportunities. "Comparison of different stem cell sources and biomimetic scaffolds for bone tissue engineering." (2007, Hong Kong);

2. Международной конференции «Osstem Meeting 2007 Early and Esthetic» (2007, Москва);

3. V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (2008, Москва);

4. Российской конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (2008, Москва)

Структура и объем работы Материалы диссертации представлены на 112 страницах. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методик исследования, результатов исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка и 9 таблиц. Список литературы включает 143 источника, из них 5 отечественных и 138 иностранных авторов.

Выводы

1. Получены и охарактеризованы стромальные клетки подкожной жировой ткани. Показана биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани после подкожного введения (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).

2. Разработан метод создания тканеинженерного биотрансплантата, на основе остеопластического материала Chronos™ и клеток СКЖТ, показана дифференцировка клеток СКЖТ в остеогенном направлении, при культивировании в составе данного биотрансплантата in vitro.

3. Разработана модель повреждения костной ткани в виде остеоабразии на нижней челюсти крыс; пригодная для оценки репаративного влияния тканеинженерного биотрансплантата на de novo остеогенез.

4. С использованием разработанной модели, показана эффективность пересадки биотрансплантата (клетки СКЖТ на матрице Chronos™) по сравнению с пересадкой матрицы без внесения клеток в процессе репаративного остеогенеза.

5. Показано, что de novo формирование функционально активной костной ткани при использовании биотрансплантата происходит во многом за счет достоверного увеличения количества сосудов в биотрансплантате.

Заключение

В связи с развитием исследований в областях стволовых клеток и тканевой инженерии нерешенными остаются проблемы пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников на матрице-носителе, а также функциональные характеристики полученной ткани в отсутствие необходимого кровоснабжения.

В соответствии с поставленной целью были проведены клеточные, молекулярные и экспериментально-гистологические исследования, которые позволили охарактеризовать постабразивную регенерацию костной ткани после трансплантации тканеинженерного имплантата, выявить его воздействие на костную ткань нижней челюсти, представить перспективы использования данного метода в клинической практике.

В результате первого этапа исследования разработан и модифицирован протокол получения культуры клеток СКЖТ крыс и человека. В экспериментах по биобезопасности при подкожной инъекции аллогенные и ксеногенные клетки либо поглощались макрофагами, либо были заключены в соединительнотканную капсулу. Поэтому все дальнейшие эксперименты проводили только с аутологичными культурами клеток.

При помощи световой и сканирующей электронной микроскопии выделенные клетки СКЖТ охарактеризованы морфологически: это фибробласты, эндотелиоциты, незрелые клетки-предшественники, гладкомышечные клетки, перициты. Доминирующим морфо-фенотипом в такой культуре являются мелкие полигональные фибробластоподобные клетки с мелким ядром, которые по мере пролиферации и дифференцировки культуры изменяют свою форму от полигональной к веретеновидной. Функциональная активность клеток продемонстрирована при помощи молекулярных методов. Процесс заселения клеток на носитель служит индуктором дифференцировки клеток СКЖТ в остеогенном направлении, что было доказано выявлением экспрессии специфически геном остеогенеза.

На основе полученных данных была разработана экспериментальная доклиническая модель костной ЗD композиции после остеоабразии на нижней челюсти и изучено влияние пересаженного имплантата на регенеративный остеогистогенез. Эксперименты выполнены на 57 взрослых крысах.

Полученные данные, свидетельствуют о выраженном положительном влиянии клеточного компонента трансплантата на репаративный остеогенез после абразии костной ткани, а предложенная модель (сочетание операции по остеоабразии и использование матрицы, как с клетками так и без них) позволяет рассматривать перспективы клинического применения современной клеточной биотехнологии.