Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Экспериментально-клиническое изучение фармакокинетических и фармакодинамических аспектов нейропротекторной терапии в офтальмологии

На правах рукописи

СТАВИЦКАЯ Татьяна Васильевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ И ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ ТЕРАПИИ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ

14.00.08-глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2005

Работа выполнена на кафедре глазных болезней лечебного факультета Государственного общеобразовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства Здравоохранения Российской Федерации».

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ

доктор медицинских наук профессор ЕГОРОВ Евгений Алексеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор медицинских наук профессор АСТАХОВ Сергей Юрьевич доктор медицинских наук профессор БОЙКО Эрнест Витальевич доктор медицинских наук профессор ПОЛУНИН Геннадий Серафимович

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Г. Гельмгольца.

Защита состоится 2005 года в 12.00 на заседании

диссертационного совета Д 215.002.09 в Военно-медицинской академии имени СМ. Кирова (194004, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, дом 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени СМ. Кирова.

Автореферат разослан

" года.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА доктор медицинских наук профессор КИСЕЛЕВ Алексей Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В основе патогенеза различных заболеваний органа зрения лежит нарушение процессов доставки кислорода к тканям -гипоксия. В последние годы доля заболеваний органа зрения, обусловленных нарушением гемодинамики возросла [Тарасова Л.Н. и соавт., 2003]. Это связано с увеличением заболеваемости атеросклерозом, гипертонической болезнью, сахарным диабетом и т.д. Кроме того, все чаще ишемическое поражение сетчатки и зрительного нерва развивается не только у людей старшей возрастной группы, но и у лиц среднего возраста. Стойкое и выраженное снижение зрительных функций, возникающее вследствие недостатка поступления кислорода к тканям сетчатки и зрительного нерва, приводит к инвалидности большой группы населения. Все это требует значительных социально-экономических затрат со стороны государства. Рациональная терапия этих состояний способствует уменьшению количества больных, ослепших в результате ишемических и дегенеративных заболеваний глазного яблока.

Одним из направлений в лечении ишемических процессов сетчатки и зрительного нерва является нейропротекторная терапия. Нейропротекция подразумевает защиту сетчатки и волокон зрительного дерва от повреждающего действия различных факторов. В настоящее время все больше и больше внимания уделяется изучению и поиску новых способов нейропротекторной терапии.

История изучения патогенетических аспектов гипоксии и способов их коррекции насчитывает более 100 лет. Однако она по-прежнему далека от решения. Это связано не только со сложностью патогенетических механизмов повреждения тканей в условиях недостаточного поступления кислорода, вовлечением в патологический процесс широкого спектра метаболических систем, контролирующих его на разных уровнях, и необходимостью коррекции разнообразных метаболических сдвигов. Прежде всего, это обусловлено отсутствием сведений о накоплении

лекарственных препаратов в тканях глазного яблока и способах наиболее рационального их введения.

Гипоксия - это сложный динамический процесс, в одних случаях он может быть компенсированным, в других - некомпенсированным [Поборский А.В., 1991; Лукьянова Л.Д., 1997; Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000]. При нарушении поступления кислорода к тканям продолжительность сохранения функциональной способности ткани зависит от ее внутренних резервов [Власова И.Г., Лукьянова Л.Д., 1990; Дудко В.А., Соколов А.А., 2000]. В сетчатке существует несколько механизмов защиты от повреждения при экстремальных ситуациях. Это в первую очередь интенсивный анаэробный гликолиз [Лютов В.П., 1988; Pirie A., R. Van Heyningen, 1968]. При развитии гипоксии в сетчатке происходит перестройка метаболизма путем активации тормозных процессов [Гизатуллин А.Г. и соавт., 1986; Юсупов Р.Г., Сафина З.М., 1987]. При недостатке поступления кислорода и усилении процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) важную адаптационную роль играет пигментный эпителий [Донцов А.Е., Островский М.А., 1984]. Показано, что содержащийся в его клетках меланин обладает антиоксидантной активностью, ускоряя дисмутацию анион-радикалов кислорода [Островский М.А., Донцов А.Е., 1983]. Кроме того, нельзя забывать о роли стекловидного тела, как «резервуара» глюкозы и кислорода [Pirie A., R. Van Heyningen, 1968].

Все это способствует достаточно длительному сохранению функциональных резервов сетчатки [Зак П.П. и соавт., 2001; Webster H., Ames А., 1965; Steinman L., Ames A., 1974]. Однако следует отметить, что сведения о высокой устойчивости тканей сетчатки к недостаточному поступлению кислорода получены в экспериментах на животных, сетчатка которых содержит только колбочки. Кроме того, эти исследования были проведены на изолированных препаратах сетчатки при поддержании постоянной кислотности и концентрации глюкозы в растворе, используемом для перфузии.

При гипоксии одним из основных механизмов повреждения клеток является активизация процессов ПОЛ и увеличение концентрации свободных радикалов, поэтому для защиты сетчатки от повреждения при нарушении поступления кислорода нашли применение препараты, оказывающие антиоксидантое действие [Лукьянова Л.Д., 1989].

Другим важным механизмом повреждения нейронов в условиях гипоксии является нарушение ионного баланса и, прежде всего, увеличение концентрации ионов Са++ и Na+ в цитоплазме [Владимиров Ю.А., Арчаков

A.И., 1972; Дудко В.А., Соколов А.А., 2000; Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Шевченко Ю.Л. и соавт., 2000]. Одним из способов коррекции нарушения ионного равновесия является применение препаратов, воздействующих на работу ионных каналов [Orgul S., Flammer J., 2000].

Кроме того, при гипоксии наблюдается нарушение синаптической передачи и процессов синтеза в нейронах. Все это приводит к функциональным нарушениям. В организме существует система собственной регуляции функциональных нарушений, которую осуществляют специфические белки. Применение нейропептидов может способствовать нормализации функциональной способности нейронов сетчатки [Хавинсон

B.Х., Трофимова СВ., 2002].

На сегодняшний день имеются сведения о влиянии ряда лекарственных препаратов, относящихся к различным фармакологическим группам, на процессы ПОЛ, реологические свойства крови и микроциркуляцию в зоне ишемии. Однако большинство подобных исследований проводилось в отношении миокарда и тканей головного мозга. Данные о влиянии препаратов на течение гипоксии в сетчатке немногочисленны. Кроме того, большая доля исследований проводилась in vivo, что не дает полного представления о структурных и функциональных изменениях, происходящих в сетчатке на фоне применения лекарственной коррекции ишемических состояний.

Рациональная терапия любого заболевания основана не только на сведениях, отражающих фармакодинамические свойства лекарственного средства, но и на особенностях его фармакокинетики. Исследования глазной фармакокинетики малочисленны. В отношении препаратов, применяемых для коррекции метаболических процессов в тканях сетчатки, они практически отсутствуют. Однако, не зная особенностей распределения лекарственного препарата в тканях сетчатки, невозможно выбрать наиболее эффективный способ введения и режим применения лекарственного средства.

Таким образом, учитывая необходимость широкого использования нейропротекторной терапии в офтальмологии, можно выделить два направления решения данной проблемы. Необходимо расширить представления о фармакодинамике и изучить фармакокинетические свойства препаратов, уже применяющихся в офтальмологии, и на основании полученных данных разработать рациональные способы их применения. Перспективной является разработка новых препаратов, оказывающих нейропротекторное действие. Однако данное направление требует больших временных и экономических затрат.

В связи с этим, настоящее исследование имело целью провести экспериментально-клиническую оценку фармакокинетики и фармакодинамики препаратов, применяемых для лечения ишемических заболеваний сетчатки и зрительного нерва, и разработать рациональные схемы их комбинированного применения.

' В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распределения нейропротекторных препаратов в различных тканях глазного яблока с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Разработать методику математического анализа основных фармакокинетических параметров, характеризующих глазную фармакокинетику лекарственных средств.

3. Оценить особенности глазной фармакокинетики следующих препаратов - 1% раствора эмоксипина, 0,02% раствора гистохрома, 0,25% раствора цитохрома С, 400 000 ЕД/мл раствора супероксиддисмутазы, 0,5% раствора бетаксолола и 0,5% раствора ретиналамина.

4. Сравнить распределение исследуемых препаратов в различных тканях глазного яблока и изучить влияние способа введения лекарственного средства на параметры его глазной фармакокинетики.

5. Исследовать влияние нейропротекторных препаратов на степень изменения электрофизиологических параметров на фоне циркуляторной гипоксии сетчатки и зрительного нерва и выявить взаимосвязь динамики оцениваемых показателей со скоростью накопления и выведения веществ из сетчатки.

6. Разработать методику определения основных временных фармакокинетических параметров препаратов, оказывающих нейропротекторное действие, in vivo по биологической реакции тканей.

7. Оценить морфологические изменения ткани сетчатки в поздние сроки после нарушения артериального кровообращения на фоне применения исследуемых препаратов.

8. Изучить влияние нейропептида - ретиналамина на состояние зрительных функций у больных первичной открытоугольной глаукомой.

9. По степени изменения психофизических и электрофизиологических параметров у больных глаукомой с нормализованным ВГД сравнить выраженность нейропротекторных свойств антиоксидантов - супероксиддисмутазы, эмоксипина и гистохрома

10. Провести сравнительную оценку влияния неселективных и селективных бета-адреноблокаторов на гемодинамику и зрительные функции органа зрения больных первичной открытоугольной глаукомой.

11. На основании полученных данных разработать практические рекомендации по рациональному применению исследуемых препаратов для лечения ишемических заболеваний сетчатки и зрительного нерва.

Научная новизна

Проведено широкое изучение особенностей распределения в различных тканях глазного яблока лекарственных препаратов, оказывающих нейропротекторное действие.

Разработана методика математического анализа фармакокинетических параметров, характеризующих глазную фармакокинетику лекарственных препаратов.

По данным электрофизиологического исследования выявлена взаимосвязь фармакодинамических и фармакокинетических параметров лекарственных средств.

Впервые в мировой практике разработана методика оценки временных фармакокинетических параметров in vivo с помощью анализа динамической электроретинограммы.

Сравнение морфологических изменений, наблюдающихся в сетчатке в поздние сроки после нарушения артериального кровообращения на фоне применения наиболее известных нейропротекторных препаратов, позволило выявить особенности их фармакодинамики.

Проведено сравнение влияния применяемых для нейропротекторной терапии препаратов на сохранение зрительных функций при ишемических процессах в сетчатке и зрительном нерве на примере больных первичной открытоугольной глаукомой.

Практическая значимость работы

Внедрена методика хроматографического анализа распределения нейропротекторных препаратов в тканях глазного яблока.

Предложены и внедрены принципы математического моделирования фармакокинетических параметров, характеризующих глазную

фармакокинетику лекарственных средств.

Разработан и внедрен способ определения основных временных фармакокинетических параметров in vivo по данным электрофизиологического исследования, который позволяет получить

оптимальный объем информации об особенностях фармакокинетики препарата у животного или человека, не прибегая к травмирующим и дорогостоящим методам.

На основании полученных данных о распределении нейропротекторных препаратов в сетчатке предложены рациональные способы введения и режимы дозирования широко применяемых лекарственных средств.

Используя полученные данные о фармакодинамике исследуемых нейропротекторных препаратов, оптимизированы схемы их комбинированного применения."

Внедрение полученных результатов позволит повысить эффективность нейропротекторной терапии ишемических состояний сетчатки и зрительного нерва.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение исследуемых препаратов способствует уменьшению деструктивных процессов в сетчатке.

2. При любом способе местного введения исследуемых препаратов концентрация вещества в сетчатке достигает терапевтически значимого уровня. Однако сохранение терапевтической концентрации непродолжительно. Поэтому для поддержания постоянной концентрации необходимо увеличение частоты введения лекарственных средств. Эффект пептидного каскада, характерный для ретиналамина, обеспечивает сохранение протекторного влияния препарата в течение суток при однократном его введении.

3. Наблюдается высокая корреляционная взаимосвязь изменения электроретинографических показателей и фармакокинетических параметров, характерных для нейропротекторных препаратов.

4. Наиболее выраженное протекторное влияние на состояние электрофизиологических показателей при продолжительном нарушении артериального кровоснабжения оказывают бетаксолол, ретиналамин и

эмоксипин. В свою очередь гистохром и СОД обладают умеренно выраженным нейропротекторным действием. Инсталляционное применение цитохрома С не приводит к сохранению функциональной способности сетчатки в условиях циркуляторной гипоксии

5. Динамическая электроретинография позволила выявить усиление протекторных свойств некоторых лекарственных средств при повторном их введении.

6. Парабульбарное введение эмоксипина не имеет преимуществ перед инсталляционным использованием. Нейропротекторный эффект гистохрома более выражен при парабульбарном введении.

7. В клинике комплексное применение исследуемых препаратов способствует сохранению зрительных функций больных ПОУГ. Продолжительность сохранения протекторного влияния антиоксидантов не превышает 1-2 месяцев.

Внедрение результатов в практику

Результаты проведенных исследований внедрены в клиническую практику кафедры глазных болезней лечебного факультета РГМУ, 13 и 15 глазных отделений, консультативно-диагностического центра при городской клинической больнице №15, Московского городского глаукомного центра, а также в учебную программу курса ФУВ «Клиническая офтальмология».

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г.), I - III Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2002-2004 гг.), Международном офтальмологическом конгрессе «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2002 г.), научно-практической конференции «Федоровские чтения» (Москва, 2003 г.), 6-й научно-практической конференции Федерального управления «Медико-биологических и экстремальных проблем» при МЗ РФ «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва 2003 г.), Центрально-азиатской конференции офтальмологов (Иссык-Куль, 2004),

Всероссийской научно-практической конференции «Глаукома: проблемы и решения» (Москва, 2004 г.), клинических конференциях кафедры глазных болезней лечебного факультета РГМУ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 32 статьи и 2 монографии, из них в центральной печати - 9, за рубежом - 1. Получено положительное решение по заявке на изобретение «Способ исследования фармакокинетических и фармакодинамических свойств лекарственных препаратов,

предназначенных для лечения глазного ишемического синдрома» (№2004124702/14(026883).

Объем и структура работы

Работа изложена на 371 странице машинописи и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 4 схемами, 126 диаграммами, 76 рисунками, 51 таблицей. Список использованной литературы включает 318 источников, из них 193 отечественных и 125 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В ходе данного исследования было проведено изучение фармакодинамических и фармакокинетических свойств следующих препаратов: 0,25% раствора цитохрома С, 1% раствора эмоксипина, 400 000 ЕД/мл раствора СОД, 0,5% раствора бетаксолола, 0,02% раствора гистохрома и 0,5% раствора ретиналамина. Фармакологические особенности исследуемых препаратов изучали при различных способах их местного введения - инсталляционном, субконъюнктивальном и парабульбарном введении.

Экспериментальные исследования проведены на 243 кроликах самцах (486 глаз) породы шиншилла весом 2,5-3,0 кг. В соответствии с поставленными задачами экспериментальные исследования включали

изучение распределения исследуемых лекарственных препаратов в тканях глазного яблока с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и их влияния на динамику электрофизиологических показателей и морфологию сетчатки у животных на фоне продолжительной циркуляторной гипоксии.

Хроматографическое исследование распределения исследуемых препаратов в тканях глазного яблока было проведено на 215 кроликах (430 глаз). Вначале на 44 кроликах (88 глаз) для каждого исследуемого препарата была разработана методика проведения хроматографического анализа и определены временные параметры забора биологического материала. Далее на 171 животном (342 глаза) провели исследование накопления исследуемых веществ в различных тканях глазного яблока. В ходе исследования, в зависимости от используемого препарата и способа его введения, животные были разделены на 13 групп (включая группу контроля).

Для проведения хроматографического анализа глазные яблоки удаляли и замораживали при температуре -70° С, для чего их опускали в емкость с жидким азотом на 2 - 3 минуты. После заморозки проводили последовательное выделение роговицы, водянистой влаги, сосудистой оболочки (радужки и цилиарного тела), хрусталика, стекловидного тела и сетчатки. До проведения анализа пробы хранили при температуре - 20°С в емкости с сухим льдом.

Далее с помощью ВЭЖХ в ее обращено-фазовом варианте проводили анализ полученных проб. Использовали хроматограф фирмы Gilson модели 305. Контроль над процессом хроматографии и анализ полученных хроматограмм осуществляли с использованием компьютерной программы. При анализе применяли предколонку размером 4 х 10 мм, заполненную сорбентом. Объем вводимой пробы составлял 20 мкл.

Анализ глазной жидкости и стекловидного тела проводили непосредственно. При анализе остальных тканей к предварительно взвешенному образцу ткани добавляли 0,2 мл бидистиллированной воды,

измельчали и проводили экстракцию в ультразвуковой ванне Bransoшc 5 в течение 2 часов. Полученный раствор фильтровали через фильтр (6 мк) и анализировали.

Качественный анализ проводили по времени удержания препарата. Количественный анализ проводили методом абсолютной калибровки с использованием фактора отклика.

Полученные в ходе исследования данные были использованы для математического анализа фармакокинетических свойств исследуемых лекарственных веществ.

Для расчета основных фармакокинетических параметров были использованы следующие формулы.

Площадь под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) определяли с помощью метода трапеций.

Далее приступали к анализу фазы элиминации (Р-фаза). Вначале вычисляли значение натурального логарифма концентраций, расположенных на терминальной части кривой зависимости концентрации от времени. Обозначив время через X, а натуральный логарифм концентрации через Y, вычисляли величину коэффициента сдвига (Ь) и коэффициента наклона (а). Их определяли с помощью метода наименьших квадратов:

Уравнение регрессии имеет следующий вид У = аХ +Ь. Используя данное уравнения, получаем, что - коэффициент

очевидного удаления, - константа скорости удаления.

Затем приступали к анализу фазы распределения (а-фаза). Используя ранее полученное уравнение регрессии, определяли значения натурального логарифма теоретически возможной концентрации в каждый момент

времени терминальной части кривой. Затем по таблице антилогарифмов находили величину теоретически возможной концентрации. Далее определяли модуль разницы экспериментально определенной концентрации

(Сэксп) и теоретически возможной концентрации. После чего вычисляли модуль натурального логарифма полученной разницы концентраций и обозначали его через Y, при этом время обозначали через X. Используя выше описанные формулы 1 и 2, вычисляли величину коэффициента сдвига (Ь) и коэффициента наклона (а). Затем, используя уравнение регрессии, принимали, что а — - а; b — in Ai, где А| - коэффициент очевидного всасывания, а - константа скорости распределения. Затем по таблице антилогарифмов находили величинуА) и Аг.

Коэффициент скорости абсорбции (kj определяли, используя формулу 3, а коэффициент скорости элиминации (kui) определяли по формуле 4.

Далее приступали к вычислению коэффициентов скорости обмена между двумя соседними камерами (к^ и кгО.Коэффициент к|2 описывает скорость поступления вещества из первичной зоны распространения в исследуемую ткань. Коэффициент кц описывает скорость обратного поступления вещества из исследуемой ткани в первичную зону распространения.

Взаимоотношения между этими коэффициентами можно определить следующими формулами: кп = ~j~ (5) k2l=(a + ß)-{h:n+kt,) (6)

Затем определяли кажущуюся начальную концентрацию (Cq) -концентрацию препарата, которая была бы достигнута в анализируемой ткани при мгновенном распределении препарата: Со =AUC kei (7).

Среднее время удержания препарата (MRT) в анализируемой ткани

вычисляли, используя следующую формулу:

Затем приступали к определению временных параметров периодов абсорбции (период полуабсорбции - ТуЛ и период полураспределения • -Т^) и

элиминации (период полувыведения -Tiа и терминальный период полувыведения -Т1/23).

Время достижения максимальной концентрации (Ттах) является функцией, отражающей соотношение между величинами, характеризующими скорость всасывания и элиминации. В зависимости от способа введения, анализируемой ткани и соотношения констант и коэффициентов скорости распределения и элиминации использовали различные формулы (13-15) для его расчета.

Оценка влияния исследуемых препаратов на динамику электрофизиологических показателей и морфологию сетчатки у животных на фоне продолжительной циркуляторной гипоксии проведена на 28 кроликах (56 глаз). В зависимости от используемого препарата и способа его введения в ходе исследования животные были разделены на 9 групп (включая группу контроля).

Циркуляторную гипоксию тканей сетчатки и зрительного нерва создавали путем перевязки обеих общих сонных артерий.

Электроретинограмму (ЭРГ) и зрительные вызванные корковые потенциалы (ЗВКП) регистрировали в стандартных условиях с использованием ганцфельд-стимуляции с помощью электроретинографа, выпускаемого фирмой МБН, до перевязки сосудов и далее каждые 30 минут в течение 5 часов. Затем глазные яблоки удаляли для проведения морфологического анализа сетчатки.

Для оценки фармакокинетических свойств исследуемых препаратов in vivo анализировали следующие параметры ЭРГ, по которым в

дальнейшем судили о временном распределении препарата в тканях сетчатки:

• Т0 - время регистрации амплитуды Ь-волны через 30 минут после нарушения кровообращения у животного;

• Т щах еИ - время достижения максимальной амплитуды (возникновения максимального увеличения амплитуды) Ь-волны.

Далее вычисляли временной интервал между Он

соответствует времени достижения максимальной концентрации

• Т у, та)( Cff - время снижения амплитуды Ь- волны на 50% от максимального показателя.

Величину амплитуды Ь-волны, соответствующую 50% максимального эффекта, вычисляли следующим образом: из величины амплитуды в точке вычитали величину амплитуды в точке далее полученную величину делили на 2. Затем из максимальной величины амплитуды Ь-волны вычитали ранее полученную цифру. Затем находили пересечение линии проведенной через точку расположенную на кривой, которая по оси ординат соответствует вычисленной амплитуде, с осью времени.

После чего вычисляли временной интервал между Он

соответствует периоду полувыведения

Морфологический анализ включал световую и электронную микроскопии. Для проведения световой микроскопии полутонкие срезы (1 мкм) окрашивали толуоидиновым синим по Нисслю в модификации Ромейса. Для электронно-микроскопического изучения сетчатки ульратонкие срезы (40-60 нм) контрастировали 5% уранилацетатом и цитратом свинца на сетках по Рейнольсу (1963). Просмотр и анализ сеток осуществляли с использованием электронного микроскопа марки JEM-100B.

Для оценки состояния ганглиозных нейронов производили подсчет количества указанных нейронов с использованием светооптической микроскопии. С этой целью подсчитывали общее число ганглиозных нейронов с хорошо контурируемыми ядрами по 10 полям зрения. Полученные для каждого среза цифровые данные складывали и находили

среднюю величину, характеризующую число сохранных ганглиозных нейронов в 1 поле зрения, для данной группы животных.

Затем на каждые 200 исследуемых клеток в переделах изучаемого среза каждой экспериментальной группы вели подсчет пораженных нейронов, выделяя среди них четыре группы: отсутствующий нейрон (ОН) -в зоне погибшего нейрона наблюдалось скопление глии; грубо измененный нейрон (ГН) - дегидратированный и атрофичный нейрон; слабо измененный нейрон (СН) - нейрон с сохраненным ядром, но с изменениями в цитоплазме (набухание, гиперхроматоз, хроматолиз); неизмененный нейрон (НН) -нормальный нейрон.

Далее вычисляли среднюю величину, характеризующую число ганглиозных нейронов с различной степенью поражения, для данной группы животных.

Полученные данные о количестве ганглиозных нейронов с различной степенью поражения использовали для определения тяжести (ТП), объема (ОП) и степени (СП) поражения. Эти величины вычисляли, используя следующие формулы [Чибурнидзе А.И., 1972; Свищев А.В., 1975]:

Клинические исследования были проведены у 180 больных (242 глаза) первичной открытоугольной глаукомой. У 140 больных (202 глаза) до включения в исследование ВГД было нормализовано на фоне применения гипотензивных препаратов - 0,5% раствора тимолола малеата 2 р/сут. Некоторые больные дополнительно использовали 1% раствор пилокарпина гидрохлорида 1-3 р/сут. У данных больных исследовали выраженность нейропротекторных свойств ретиналамина, СОД, эмоксипина и гистохрома. Изучение влияния бета-адреноблокаторов (тимолола и бетаксолола) на гемодинамику и зрительные функции было проведено у 40 больных (40 глаз), у которых глаукома была выявлена впервые и до включения в исследование гипотензивная терапия не проводилась.

В ходе исследования больные были разделены на 3 группы:

1-я группа включала 50 больных (80 глаз), у которых изучали влияние ретиналамина на динамику зрительных функций. Исследование было проведено с использованием плацебо контроля. Курс лечения включал 10 парабульбарных инъекций. Оценку состояния проводили до лечения, после 1-го курса терапии, через 1 месяц после 1-го курса терапии и после 2-го курса терапии.

2-я группа состояла из 90 больных (122 глаза), у которых проводили сравнение динамики функций органа зрения на фоне применения эмоксипина (инсталляционное введение 6 р/сут), СОД (введение методом форсированных инсталляций 3 р/сут) и гистохрома (парабульбарное введение 1 р/сут). Оценку состояния проводили до лечения и после него, а так же через 1 и 3 месяца после курса терапии.

В 3-ю группу были включены 40 больных (40 глаз), у которых сравнивали влияние бетаксолола и тимолола малеата на гемодинамику и зрительные функции больных ПОУГ. Период наблюдения составил 8 недель.

Для оценки влияния исследуемых препаратов на функциональное состояние органа зрения использовали: визометрию, визоконтрастометрию, автоматическую статическую периметрию (аппарат «Периком»), электрофизиологическое обследование (ГФ-ЭРГ, р-ЭРГ, м-ЭРГ, ЗВКП, КЧСМ) и реографию. Оценку переносимости терапии и контроль за течением заболевания осуществляли с помощью: биомикроскопии, офтальмоскопии и тонометрии по Гольдману. Ответной реакцией на лечения считали улучшение показателей функционального состояния глаза более чем на 10% от исходного уровня.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью параметрических (критерий Стыодента, Ньюмена-Кейлса, Даннета) и непараметрических (критерий Крускала-Уоллиса и Фридмана) методов.

Основные результаты и их обсуждение

С помощью хроматографического и математического анализа выявили, что при инсталляционном введении распределение бетаксолола была достаточно равномерным во всех тканях глазного яблока, за исключением стекловидного тела, в котором накопление препарата было незначительным. Среднее время удержания препарата в тканях глазного яблока не превышало 1,5-2,0 ч. Наиболее быстрое достижение максимальной концентрации бетаксолола было характерно для роговицы, в тоже время в сосудистой оболочке препарат накапливался медленно (табл. 1).

Таблица 1. Основные фармакокинетические параметры, характеризующие распределение бетаксолола в тканях глазного яблока.

Фармакокинетические параметры

Ткань AUC, мкг ч/мг MRT.ч Т,1/2>ч Tmах,ч

Роговица 66,9 1,63 1,36 0,31

ВГЖ 43,33 1,85 1,98 1,0

Хрусталик 55,63 1,48 0,7 0,62

Сосудистая 77,31 2,0 1,24 1,3

оболочка

Стекловидное 7,89 1,38 0,96 0,42

тело

Сетчатка 40,23 1,89 1,28 0,91

Изучая глазную фармакокинетику СОД при различных способах введения, наблюдали неравномерное распределение препарата в структурах глазного яблока. При инсталляционном введении наиболее высокая концентрация препарата была обнаружена в сетчатке, при субконъюнктивальном введении - в сосудистой оболочке, хотя накопление препарата в сетчатке было максимальным по сравнению с другими способами введения, при парабульбарном введении - в водянистой влаге и сосудистой оболочке. Следует отметить, что при парабульбарном введении накопление препарата в сетчатке было минимальным. Время удержания препарата в тканях глазного яблока зависело от быстроты достижения максимальной концентрации. Наиболее медленное накопление СОД при инсталляционном применении было характерно для роговицы, при

субконъюнктивальном введении - для сосудистой оболочки, при парабульбарном применении - для сосудистой оболочки и стекловидного тела (табл. 2).

Таблица 2. Основные фармакокинетические параметры,

характеризующие распределение СОД в тканях глазного яблока.

Ткань Способ введения Фармакокинетические параметры

лис, мкг ч/мг МКТ.ч Т1/2,Ч Тшах,'

Роговица инсталляции 156,74 3,48 2,4 2,28

с/к 325,95 1,13 0,79 0,93

п/б 359,8 1,44 0,99 1,0

ВГЖ инсталляции 195,19 1.1 0,76 0,79

с/к 294,72 1,46 1,02 0,74

п/б 724,35 1,09 0,75 0,93

Сосудистая оболочка инсталляции 411,85 1,66 1,16 1,42

с/к 780 2,56 2,46 2,23

п/б 680,89 3,21 2,31 1,3

Стекловидное тело инсталляции 128,9 0,89 0,62 2,09

с/к 153,7 1,86 1,28 1,3

п/б 82,65 3,26 2,24 2,87

Сетчатка инсталляции 501,27 1,Н 0,79 0,94

с/к 577,51 1,24 0,87 0,85

п/б 356,375 0,82 0,58 1,8

По сравнению с другими исследуемыми препаратами определенная с

помощью хроматографии концентрация эмоксипина была наименьшей. Следует отметить, что при любом способе введения в сетчатке наблюдалось наиболее высокое накопление эмоксипина. При этом количество препарата, достигающее сетчатки, при парабульбарном введении превышало аналогичный показатель, определенный в случае субконъюнктивального введения препарата на 40,2% и инсталляционного введения на 21%. Сравнивая среднее время удержания эмоксипина в различных тканях глазного яблока, выявили, что наиболее длительно препарат находится в сетчатке. При этом максимальные временные показатели наблюдали при инъекционном введении препарата (табл. 3).

Таблица 3. Основные фармакокинетические параметры,

характеризующие распределение эмоксипина в тканях глазного яблока.

Ткань Способ введения Фармакокинетические параметры

лис, мкгч/мг мят, ч 11/2, ч Ттах Ч

Роговица инсталляции 0,43 0,51 0,37 0,31

с/к 1,14 1,79 1,24 0,86

п/б 2,953 1,47 1,02 0,57

ВГЖ инсталляции 0,035 0,6 0,36 0,01

с/к 1,05 1,35 1,73 0,82

п/б 0,26 1,19 0,83 0,38

Хрусталик инсталляции 0,078 0,58 0,87 0,71

с/к 0,28 2,38 1,65 0,86

п/б 0,83 1,042 0,72 0,54

Сосудистая оболочка инсталляции 0,039 0,65 0,45 0,29

с/к 1,46 0,53 0,36 0,22

п/б 1,67 1,01 0,7 0,43

Стекловидное тело инсталляции 0,0015 0,67 0,48 0,07

с/к 0,058 0,8 0,55 0,28

п/б 0,13 1,27 0,89 0,23 .

Сетчатка инсталляции 3,45 0,93 0,64 0,48

с/к 2,63 2,78 1,93 1,17

п/б 4,4 1,67 1,0 0,7

При применении гистохрома наибольшее количество препарата было

выявлено в сосудистой оболочке. Следует отметить, что в сетчатке наблюдалось достаточно высокое накопление препарата, при этом различие в степени накопления в зависимости от вида периокулярной инъекции составило 12,1%. Наиболее длительно гистохром удерживается в сосудистой оболочке, хотя для сетчатки данный показатель также составляет достаточно большое значение (табл. 4).

При инсталляционном и субконъюнктивальном введении наиболее высокое накопление цитохрома С наблюдалось в водянистой влаге. При этом при парабульбарном введении максимальная концентрация цитохрома С была выявлена в сетчатке. Необходимо отметить, что уровень накопления препарата в сетчатки при парабульбарном применении превышал аналогичный показатель, измеренный при инстилляционном введении, в 10

раз. Отличительной особенностью фармакокинетики цитохрома С было наиболее длительное удержание препарата в некоторых тканях глазного яблока (роговица, ВГЖ, стекловидное тело) по сравнению с другими исследуемыми препаратами и максимально высокое накопление в хрусталике (табл. 5).

Таблица 4. Основные фармакокинетические параметры,

характеризующие распределение гистохрома в тканях глазного яблока.

Ткань Способ введения Фармакокинетические параметры

AUC, мкг ч/мг М^Т,ч Т1/2, Ч Т тах, Ч

Роговица с/к 37,86 2,43 1,69 0,64

п/б 70,3 1,23 0,86 0,57

ВГЖ с/к 192,73 0,47 0,53 0,35

п/б 89,64 0,78 0,54 0,89

Хрусталик с/к 10,02 0,98 0,68 1,26

п/б 11,4 2,15 1,47 1,3

Сосудистая оболочка с/к 256,26 2,5 1,73 1,6

п/б 193,06 1,44 1,0 0,89

Стекловидное тело с/к 47,4 1,63 1,14 0,55

п/б 54,37 1,64 1,14 0,63

Сетчатка с/к 107,9 2,08 1,44 1,4

п/б 96,21 1,96 1,36 1,008

Практически для всех препаратов соотношение коэффициентов и

констант было таково, что период распределения был меньше периода выведения. Интересным является то, что при введении бетаксолола при значительном снижении концентрации препарата в ВГЖ часть вещества, ранее проникшего в радужку, возвращается обратно во влагу передней камеры. Обратное распространение препарата в роговицу из ВГЖ и в стекловидное тело из сетчатки было характерным для СОД.

Следует обратить внимание, что для большинства исследуемых препаратов элиминация из стекловидного тела осуществляется через поверхность сетчатки. Исключение составляет СОД, который может выводиться из стекловидного тела как через поверхность сетчатки, так и в направлении передней камеры.

Таблица 5. Основные фармакокинетические параметры,

характеризующие распределение цитохрома С в тканях глазного яблока.

Ткань Способ введения Фармакокинетические параметры

АиС, мкгч/мг МЯТ, . ч - Т1/2, ч Ттах, Ч

Роговица инсталляции 98,855 1,04 0,72 0,23

с/к. 169,79 6,25 4,33 2,29

п/б 172,15 2,02 1,39 2,63

ВПК инсталляции 100,28 3,4 2,4 1,57

с/к 239,57 5,54 3,85 3,9

п/б 108,25 5,0 3,46 2,0

Хрусталик инсталляции 7,73 2,9 2,04 2,15

с/к 18,87 2,38 1,65 1,54

п/б 92,2 2,48 1,73 1,45

Сосудистая оболочка инсталляции 82,27 1,98 1,38- 0,4

с/к 117,9 2,5 1,73 0,73

П/б' 136,85 3,4 2,39 1,67

Стекловидное тело инсталляции 20,94 2,47 1,73 0,58

с/к 33,96 4,43 3,01 2,01

п/б 26,15 2,28 1,61 1,15

Сетчатка инсталляции 21,67 2,28 1,57 1,56

с/к 140,36 2,24 1,54 2,31

п/б 221,75 1,16 0,8 2,17

При анализе изменения электрос изиологических параметров на фон

продолжительной циркуляторной гипоксии у животных (группа контроля), у которых нейропротекторные препараты не применяли, наблюдалось постепенное снижение амплитуды обеих волн ГФ-ЭРГ и Рюо ЗВКП, вплоть до полного исчезновения регистрируемой кривой. При этом на фоне применения нейропротекторной терапии (диаграммы 1, 2) были выявлены следующие особенности изменения анализируемых показателей: после первоначального снижения амплитуды наблюдалось появление пика ее увеличения.

Время возникновения пика увеличения амплитуды было индивидуальным для каждого исследуемого препарата, однако изменение амплитуды а- и Ь-волн ГФ-ЭРГ и Рюо ЗВКП имело идентичный характер.

Наиболее выраженные изменения были характерны для Ь-волны ГФ-ЭРГ, что позволило разработать метод определения фармакокинетики нейропротекторных препаратов с помощью динамической ЭРГ.

Диаграмма 1. Динамика Ь-волны ГФ-ЭРГ на фоне циркуляторной гипоксии при применении ретиналамина, гистохрома и цитохрома С.

361

>

в + _ /'V • X N

я / \ А,' \ х ■ _____ч — ■ г -

X

Я 10

1 5 ■

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

I — ♦ — ретиналам —•— гист пб —гиот с/к • к- • ■ цитох кап

Диаграмма 2. Динамика Ь-волны ГФ-ЭРГ на фоне циркуляторной гипоксии при применении СОД, эмоксипина и бетаксолола.

(бетаксолол и СОД вводили 2 раза с 2-х часовым интервалом; эмоксипин вводили 3 раза с 1,5 часовым интервалом)

о -,---,---,-,-,-------

О 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

—•—СОД кап —■—эмок пб —*—эмок кап - • х- - -бетакс

При сравнении данных о временных фармакокинетических параметрах исследуемых препаратов, которые были получены при хроматографическом анализе, и с помощью разработанной нами методики их определения по биологической реакции сетчатки, было обнаружено совпадение результатов. Наблюдаемые отличия, в среднем, составляли 5-7 минут. Таким образом, определение основных временных параметров распределения препаратов в сетчатке возможно без забора биологического материала, что значительно

удешевляет данные исследования, а также позволяет избежать гибели экспериментальных животных.

Следует отметить, что распределения лекарственного препарата в организме зависит от особенностей течения метаболических процессов. При хроматографическом анализе у одного и того же обследуемого изучают содержание препарата в ткани только однократно, так как это связано с забором биологического материала, который осуществляют после гибели животного. В результате полученные данные об изменении концентрации препарата в тканях глазного яблока, которые исследовали на протяжении определенного времени, в значительной степени носят усредненный характер. Определение временных фармакокинетических параметров с Помощью динамической ЭРГ позволяет получить неограниченное количество данных у одного и того же обследуемого. Кроме того, использование данной методики позволит проводить индивидуальный подбор режима применения лекарственного препарата у человека.

Несомненным преимуществом разработанной методики определения фармакокинетики является возможность оценки аддитивных свойств нейропротекторных препаратов.

При многократном применении бетаксолола и эмоксипина наблюдалось усиление выраженности и длительности нейропротекторного действия. В то время как, повторное использование СОД приводило только к пролонгации эффекта (см. диаграмму 2).

В некоторых ситуациях оценить особенности фармакокинетики веществ, являющихся естественными метаболитами организма, с помощью традиционных методик (хроматографического анализа) невозможно. В таких случаях применение динамической ЭРГ позволит получить данные о распределении подобных веществ в сетчатке, что и было продемонстрировано в данном исследовании в отношении ретиналамина.

Интересным является факт увеличение амплитуды электрофизиологических показателей на фоне применения ретиналамина в

сроки превышающие среднее время его удержания в сетчатке (см. диаграмму 1). Учитывая, что повторного введения препарата не было, можно сказать, что применение ретиналамина способствует активизации собственных защитных механизмов сетчатки. Данный вывод подтверждают результаты морфологического анализа сетчатки животных. При световой микроскопии у животных, которым вводили ретиналамин, было выявлено появление 2-х ядерных ганлиозных нейронов. При этом на фоне применения некоторых других препаратов в основном встречались только 2-3 ядерные биполярные нейроны, количество которых было незначительным. При электронной микроскопии в сетчатке животных, которым вводили ретиналамин, были выявлены признаки выхода рибосом и ядрышка в цитоплазму ганглиозных нейронов; явления инвагинации ядерной мембраны биполярных, горизонтальных и амакриновых нейронов в направление к ядрышку; появление ганглиозных нейронов с признаками повышенной функциональной активности. Эти явления свидетельствуют об активном синтезе РНК в ганлиозных нейронах сетчатки, а также о возможном развитии компенсаторных процессов в клеточных компонентах сетчатки [Бродский В.Я., 1961;ЯрыгинВ.Н„ 1973].

Анализируя данные, полученные при изучении влияния исследуемых препаратов на сохранение функциональной активности сетчатки и зрительного нерва при длительном нарушении артериального кровоснабжения, можно сказать, что наиболее выраженное сохранение амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ наблюдали у животных, которым вводили бетаксолол и эмоксипин (диаграмма 3). Следует отметить, что степень сохранения анализируемого показателя при инсталляционном применении эмоксипина превышала показатель, полученный при парабульбарном его введении на 13,62%.

Умеренно выраженный эффект оказывали гистохром, СОД и ретиналамин. Более выраженное сохранение амплитуды а-волны ГФ-ЭРГ

наблюдали при парабульбарном введении гистохрома - разница показателей наблюдаемая при различных способах введения составляет 7,14%.

Диаграмма 3. Среднее снижение амплитуды! ГФ-ЭРГ на фоне циркуляторной гипоксии при применении нейропротекторной терапии.

а-волна Ь-волна

И контроль ■ бетаксол □эмок/кап Вэмок/пб Мгист/ск □ гист/пб ' В СОД Вцитохром ■ ретинал

Нейропротекторный эффект оказываемый цитохромом С был слабо выражен.

Как и в случае а-волны максимально выраженное сохранение амплитуды Ь-волны ГФ-ЭРГ наблюдали при применении бетаксолола.

В отношении эмоксипина ярко выраженное действие сохранилось только при инсталляционном использовании препарата. В то время как, при парабульбарном введении эффект был умеренно выраженным. Наблюдалось увеличение разницы степени сохранения анализируемого показателя в зависимости от способа введения. Она составила 20,27%.

Интересным является то, что протекторное влияние СОД на степень сохранения Ь-волны наоборот было более выраженным, по сравнению с а-волной - разница в степени сохранения а- и Ь-волны ГФ-ЭРГ составила 17,86%.

Эффект оказываемый гистохромом при парабульбарном введении был умеренно выражен и практически не отличался от характера изменения а-волны. При этом степень сохранения амплитуды Ь-волны ГФ-ЭРГ при субконъюнктивальном введении гистохрома была слабо выражена и

оказалась в 2 раза меньше, чем определенный показатель для а-волны. Различие в степени сохранения Ь-волны ГФ-ЭРГ при различных способах введения гистохрома составило 19,4%.

Нейропротекторное действие, ретиналамина было умеренно выраженным. Степень сохранения амплитуды Ь-волны превосходила аналогичный показатель, определенный для а-волны лишь на 6,2%.

Необходимо обратить внимание, что в отношении Ь-волны цитохром С не только не предупреждал быстрого снижения ее амплитуды, но и степень уменьшения амплитуды была более выраженной по сравнению с группой контроля (таблица 6).

Таблица 6. Изменение электрофизиологических параметров на фоне пролонгированной циркуляторной гипоксии при применении исследуемых препаратов.

Препарат/ Степень сохранения амплитуды по сравнению с

способ введения группой контроля (%)

а-волна ГФ-ЭРГ Ь-волна ГФ-ЭРГ Р.ооЗВКП

бетаксолол 40,61 42,3 57,24 (150 мин)*

эмоксипин/кап 48,41 45,41 55,04 (150 мин)*

эмоксипин/пб 34,79 25,14 62,02 (150 мин)*

гистохром/пб 26,94 27,5 21,38 (300 мин)*

гистохром/ск 19,8 8,1 13,5 (240 мин)*

СОД/кап 23,95 41,81 55,04 (180 мин)* 16,73 (300 мин)*

цитохром С/кап 4,8 -8,02 37,8 (180 мин)*

ретиналамин/пб 14,2 20,4 28,23 (300 мин)*

Примечание: * в скобках указано время, в течение которого были выявлены

различия между опытной и контрольной группами.

С нашей точки зрения, важным является то, что парабульбарное введение эмоксипина не имело преимуществ по сравнению с его инсталляционным введением. Однако при этом, следует обратить внимание, на то, что при парабульбарном введении гистохрома нейропротекторный эффект препарата более выражен, чем при субконъюнктивальном применении.

При анализе влияния исследуемых препаратов на динамику параметров ЗВКП (диаграмма 4 и таблица 6) следует выделить длительность сохранения протекторного эффекта и его выраженность. На протяжении всего периода наблюдения положительное влияние на сохранение амплитуды Р100 ЗВКП было характерно для гистохрома (при парабульбарном введении) и ретиналамина. Эффект остальных препаратов сохранялся на протяжении 150 - 180 минут исследования. При этом среди исследуемых препаратов наиболее эффективными оказались бетаксолол, эмоксипин (при парабульбарном введении эффект выше, чем при инсталляционном, хотя разница составляет менее 10%) и СОД.

Диаграмма 4. Среднее снижение амплитуды Р100 ЗВКП на фоне циркуляторной гипоксии при применении нейропротекторной терапии

(ЗВКП 180 - изменение параметра в течение первых 180 минут исследования; ЗВКП 300 - изменение параметра в течение всего исследования [300 минут]).

ЗВКП 180 ЗВКП 300

1 | В контроль Шбетаксол □ эмок/кап Еэмок/пб ■ гист/ск Огист/пб ,ВСОД Ицитохром Шретинал__

При парабульбарном введении гистохрома степень сохранения амплитуды Р100 ЗВКП была более выраженной и продолжительной, чем при субконъюнктивальном введении, хотя выявленные различия показателей были незначительными и составили 7,88%.

Следует отметить, что в отличие от динамики изменений ГФ-ЭРГ на фоне применения цитохрома С, анализ ЗВКП выявил положительное влияние препарата на сохранение амплитуды Р100 ЗВКП.

Во всех исследуемых экспериментальных группах животных при светооптическом и ультрамикроскопическом исследованиях наблюдались различной степени выраженности деструктивные изменения. Наибольшее поражение было выявлено в сетчатых слоях, фоторецепторном слое и ганглиозных нейронах. Менее выраженное повреждение было характерно для биполярных нейронов.

Среди наблюдаемых изменений в группе контроля можно выделить следующие особенности: выраженные изменения сосудистой оболочки, связанные с расширением сосудов всех калибров и гемостазом; изменения мембраны Бруха и как следствие увеличение проницаемости гематоофтальмического барьера; уменьшение толщины пигментного эпителия; уменьшение толщины сетчатых слоев, вплоть до полного их разрушения, связанного с деструкцией синапсов; уменьшение толщины ядерных слоев, обусловленное как гибелью клеток, так и деструктивными изменениями нейронов, которые могут быть связаны с кариопикнозом, а также с изменениями сходными с апоптозом; снижение количества ганглиозных нейронов; дегенеративные изменения в глиоцитах Мюллера.

Следует отметить, что применение практически всех исследуемых препаратов приводило к сохранению структуры гематоофтальмического барьера, значительное повреждение которого было выявлено в контрольной группе животных. При этом не наблюдалось выраженной дилатации сосудов хориоидеи и явлений гемостаза в них. Однако для СОД и цитохрома С изменения хориоидеи были идентичными группе контроля.

Было выявлено, что в поздние сроки нарушения артериального кровоснабжения для сетчатки характерно преобладания явлений сходных с апоптозом. Признаков первичного некроза выявлено не было, однако наличие «теней» клеток свидетельствует о том, что в более ранние сроки эти

явления присутствовали, что соответствует данным, представленным ВисЫ Б.Я. (1992).

Особенностью протекторного эффекта ряда препаратов (бетаксолол, эмоксипин, гистохром, ретиналамин) является появление 2-3 ядрышковых нейронов, а также инвагинации ядерной мембраны в сторону ядрышка, наблюдаемой при электронно-микроскопическом исследовании. Следует отметить, что для ретиналамина было характерным максимальная выраженность этих изменений, особенно среди ганглиозных нейронов.

Известно, что исходное число нейронов взрослого организма в случае гибели части клеток не восстанавливается. Поэтому оставшиеся жизнеспособные нейроны вынуждены работать в условиях повышенной функциональной нагрузки, что требует включения дополнительных механизмов, увеличивающих функциональные возможности нейронов. Одним из цитологических механизмов адаптации нейронов к повышенной функциональной нагрузке является появление многоядерных клеток.

При этом следует отметить, что для вегетативной нервной системы характерно существование многоядерных нейронов в норме, количество которых с возрастном увеличивается. Однако для сетчатки наличие многоядерных нейронов в норме не характерно.

Согласно данным Ярыгина В.Н. (1973) многоядерные нейроны отличаются большей массой, более выраженной степенью полишюидизации. Однако нельзя считать, что появление многоядерных нейронов является стадией их деления. По-видимому, многоядерность является одним из проявлений гипертрофии нейронов, которая компенсирует повышенную функциональную нагрузку.

Продолжая сравнение опытных групп животных с контролем, следует отметить, что световая микроскопия позволяет четко прослеживать как внутреннюю пограничную глиальную мембрану (ВПГМ), так и наружную пограничную глиальную мембрану (НГТГМ), что очевидно взаимосвязано с сохранностью цитоплазматических отростков клеток Мюллера. Сохранение

структуры глиоцитов Мюллера было более выражено при применении ретиналамина и эмоксипина.

Наименьшая тяжесть и степень поражения была характерна для животных, которым парабульбарно вводили раствор ретиналамина. Это обусловлено тем, что в сетчатке данной группы животных наблюдалось минимальное количество отсутствующих (ОН) и грубо измененных (ГН) ганглиозных нейронов, при максимальном, по сравнению с другими группами, содержании неизмененных (НН) и слабо измененных нейронов (СН). Однако при этом среднее количество сохранных нейронов в поле зрения, определенное по среднему количеству нейронов в 10 полях зрения, было минимальным. Данное явление можно объяснить тем, что в ранние сроки ишемии (первые 60 минут), когда наблюдается наиболее выраженная гибель ганглиозных нейронов, эффект препарата менее выражен, так как он развивается достаточно медленно.

Умеренно выраженная тяжесть поражения (диаграмма 5) была характерна для животных, у которых применяли растворы эмоксипина и СОД.

Диаграмма 5. Тяжесть поражения сетчатки нейронов в поздние сроки нарушения артериального кровоснабжения на фоне применения нейропротекторной терапии.

В контр ■ бетакс □ эмок/кап Оэмок/пб .Шгист/ск Огист/пб Мретиналам В СОД Ицитохр

При этом следует отметить, что, как и в случае электрофизиологического исследования, парабульбарное введение

эмоксипина не имело преимуществ по сравнению с его инсталляционным введением. Сравнивая морфологию сетчатки при инсталляционном применении СОД и эмоксипина, выявили, что последний оказывает более выраженное протекторное действие, так как содержание СН и ГН было выше, в то время как содержание ОН было ниже. При этом общее количество сохранных нейронов в 1 поле зрения у животных, которым закапывали раствор эмоксипина, было самым высоким среди экспериментальных животных, за исключением группы животных, которым вводили бетаксолол. Однако при применении бетаксолола НН выявлено не было, поэтому определенная тяжесть поражения была высокой.

Сравнивая среднее количество сохранных ганлиозных нейронов в 1 поле зрения (диаграмма 6), которое определяли, используя среднее значение по 10 полям зрения, можно сказать, что максимальное количество наблюдалось у животных, которым закапывали растворы бетаксолола и эмоксипина.

Диаграмма 5. Среднее количество сохранных ганглиозных нейронов в поздние сроки нарушения артериального кровоснабжения на фоне применения нейропротекторной терапии.

_ ш/-

I —И

5 | 60 ---

I 20 У

* ОХ—----

Н контр Ибетакс □ эмок/кап Шэмок/пб ■ гист/ск I □ гист/пб Иретиналам В! СОД В цитохр

Умеренно выраженное количество ганглиозных нейронов было характерным для животных, у которых применяли растворы эмоксипина (вводили парабульбарно), гистохрома (вводили субконъюнктивально) и СОД. И, наконец, минимальное количество ганглиозных нейронов было выявлено

у животных, которым вводили растворы ретиналамина, гистохрома (вводили парабульбарно) и цитохрома С.

Оценивая динамику параметров автоматической статической периметрии и данные электрофизиологического исследования у больных ПОУГ с нормализованным ВГД на фоне применения исследуемых препаратов, выявили улучшение функционального состояния органа зрения более чем у 70% больных. Наблюдали статистически значимое увеличение остроты зрения, улучшение параметров автоматической статической периметрии и данных электрофизиологического исследования.

Для всех групп обследованных пациентов было характерным улучшение амплитуды преимущественно Ь-волны ГФ-ЭРГ (диаграмма 7) и макулярной ЭРГ, а также амплитуды ритмической ЭРГ.

Диаграмма 7. Динамика амплитуды ь-волны ГФ- ЭРГ у больных ПОУГ на фоне применения ретиналамина, СОД, эмоксипина и гистохрома.

Увеличение амплитуды Ь-волны общей и ритмической ЭРГ может свидетельствовать об улучшении состояния рецепторного и средних слоев (прежде всего биполярных нейронов и глиоцитов Мюллера) сетчатки.

В свою очередь увеличение амплитуды локальной ЭРГ, свидетельствует об улучшении микроцикуляции в хориоидальном бассейне на фоне проводимой терапии, а также метаболических процессов и возбуждения в фоторецепторном слое.

Среди электрофизиологических параметров увеличение амплитуды Р100 ЗВКП на фоне проводимой нейропротекторной терапии было наиболее выраженным (диаграмма 8). Наблюдаемое на фоне терапии увеличение амплитуды Р100 ЗВКП связано с улучшением проведения возбуждения по волокнам зрительного нерва и ганглиозного слоя, вследствие активизации процессов метаболизма в них.

Диаграмма 8. Динамика амплитуды Р100 ЗВКП у больных ПОУГ на фоне применения ретиналамина, СОД, эмоксипина и гистохрома.

Анализируя динамику параметров автоматической статической периметрии у пациентов, применявших ретиналамин, СОД, эмоксипин или гистохром, выявили уменьшение количества всех видов скотом (наиболее выраженным было уменьшение количества относительных скотом 2-ой степени) и увеличение пороговой чувствительности (диаграмма 9).

Наиболее выраженное изменение анализируемых показателей наблюдали при применении ретиналамина. Степень изменения анализируемых параметров при использовании СОД, эмоксипина и гистохрома была практически идентична и умеренно выражена. Следует отметить, что в группе больных, у которых применяли ретиналамин, в период наблюдения после 1-го курса терапии наблюдалось не только сохранение полученного эффекта, но и дальнейшее улучшение функционального состояния органа зрения. При этом после применения

антиоксидантов (СОД, эмоксипин и гистохром) через 3 месяца после проведенного курса терапии наблюдали снижение первоначального эффекта.

Диаграмма 9. Динамика пороговой чувствительности по данным автоматической статической периметрии у больных ПОУГ на фоне применения ретиналамина, СОД, эмоксипина и гистохрома.

При применении бетаксолола по сравнению с группой больных, которые использовали тимолола малеат, наблюдалось улучшение параметров, характеризующих состояние кровотока в заднем отрезке глазного яблока (диаграмма 10).

Диаграмма 10. Динамика реографического коэффициента у больных ПОУГ на фоне применения бетаксолола и тимолола малеата.

Существенных различий в состоянии параметров автоматической статической периметрии и электрофизиологического обследования выявлено

не было, что, по-видимому, связано с малым объемом выборки и небольшим сроком наблюдения.

Используя данные, полученные при изучении особенностей фармакокинетики исследуемых препаратов, их влияния на сохранение функциональной активности сетчатки и зрительного нерва при продолжительном нарушении артериального кровоснабжения, а также клинического изучения нейропротекторного эффекта у больных ПОУГ, можно выделить следующие практические рекомендации по использованию исследуемых препаратов в клинике глазных болезней.

При хроническом нарушении кровоснабжения сетчатки и зрительного нерва целесообразно чередовать применение антиоксидантов с нейропептидами. Лечение антиоксидантами следует проводить в течение 2-4 недель. Промежуток между курсами терапии не должен превышать 1-2 месяцев. Применение нейропептидов следует проводить курсами, включающими 10 процедур. Промежуток между курсами лечения должен составлять не менее 5-6 месяцев, так как при более частом применении увеличивается риск развития побочных эффектов (аллергические процессы, болезненность в месте инъекции). Блокаторы кальциевых каналов следует применять постоянно. При этом СОД и эмоксипин следует применять не менее 4-6 раз в сутки. Так как при парабульбарное введении эмоксипина не было выявлено значительных преимуществ по сравнению с инсталляционным введением, а так же нецелесообразностью многократного инъекционного введения, следует рекомендовать его инсталляционное применение. Вместо многократного инсталляционного применения можно использовать мягкие контактные линзы, насыщенные растворами СОД или эмоксипина. При этом следует отметить, что эффективность гистохрома зависит от способа введения и в этом случае следует отдавать предпочтение парабульбарному введению препарата. Однако для создания постоянной концентрации гистохрома в сетчатке необходимо его многократное введение,

поэтому наиболее целесообразно использовать инфузионные системы или коллагеновую губку, имплантированные в ретробульбарное пространство.

При остром нарушении кровообращения в ранние сроки наиболее эффективны блокаторы кальциевых каналов и антиоксиданты. При длительном сохранении нарушения кровоснабжения развивается декомпенсация гипоксии и их эффекта недостаточно для предотвращения нейронов от гибели, что требует применения активаторов собственных адаптационных механизмов организма - нейропептидов.

Следует отметить, что наибольшее нейропротекторное действие при различных видах ишемического поражения органа зрения характерно для эмоксипина, который оказывает разнонаправленное действие.

Как показали проведенные исследования, несмотря на достаточно высокое накопление цитохрома С в сетчатке его нейропротекторный эффект был выражен слабо. Это можно объяснить тем, что в условиях длительного нарушения доставки кислорода к тканям сетчатки для нее, в отличие от миокарда, характерно преобладания явлений сходных с апоптозом, а не некротических процессов. Известно, что при развитии апоптоза ферментативная система, в которой участвует цитохром С блокируется. Кроме того, поступление экзогенного цитохрома С в цитоплазму и митохондрии замедляется. Также при анализе кинетики цитохрома было выявлено, что при инсталляционном введении препарат проникает в сетчатку в небольшом количестве, недостаточном для оказания терапевтического действия. Таким образом, применение цитохрома С для лечения ишемических состояний сетчатки и зрительного нерва не целесообразно.

ВЫВОДЫ

1. Морфологическое исследование сетчатки глаза кролика показало, что наименьшая тяжесть и степень поражения на фоне циркуляторной гипоксии была характерна для животных, которым парабульбарно вводили ретиналамин. Умеренно выраженные изменения сетчатки наблюдали у животных, которым вводили растворы эмоксипина и СОД. Значительное поражение, выявленное у животных на фоне применения гистохрома и бетаксолола, было обусловлено преобладанием грубо измененных нейронов. Выраженность деструктивных явлений в сетчатке при применении цитохрома С была максимальной и сходной с группой контроля.

2. Хроматографический и математический анализ показал, что при инсталляционном применении бетаксолол равномерно распределяется практически во всех тканях глазного яблока и его концентрация в сетчатке достигает высоких значений. Максимально высокое накопление в сетчатке эмоксипина наблюдалось при инсталляционном и парабульбарном введении, СОД - при инсталляционном и субконъюнктивальном введении, цитохрома С - при парабульбарном введении. Высокая концентрация гистохрома в сетчатке была характерна для обоих видов периокулярных инъекций.

3. Учитывая, что среднее время удержания исследуемых веществ в сетчатке, определенное с помощью математического моделирования, не превышало 2 ч, для создания в сетчатке стабильной терапевтической концентрации режим применения препаратов должен составлять 4-6 введений в сутки. При инъекционном применении лекарственных препаратов целесообразно использовать инфузионные системы или коллагеновую губку, имплантируемые в ретробульбарное пространство.

4. При применении ретиналамина наблюдается эффект пептидного каскада, который обусловлен стимуляцией синтезирующих свойств нейронов сетчатки. Достаточно длительное сохранение препарата в сетчатке (3,5 ч) и особенности его фармакодинамики позволяют достичь постоянного

нейропротекторного эффекта при однократном суточном введении препарата.

5. Разработанная- методика динамической ЭРГ расширяет возможности оценки фармакокинетических свойств нейропротекторных препаратов in vivo, так как характер изменения электрофизических параметров указывает на высокую корреляционную взаимосвязь фармакодинамических и фармакокинетических свойств нейропротекторов.

6. Наиболее выраженное сохранение функциональной активности сетчатки по данным ГФ-ЭРГ и ЗВКП при длительном нарушении артериального кровоснабжения наблюдалось при применении бетаксолола, ретиналамина и эмоксипина, чуть менее выраженным был эффект, оказываемый гистохромом и СОД. На фоне применения цитохрома С практически не было выявлено положительного влияния на сохранения функциональной активности сетчатки.

7. При повторном введении бетаксолола и эмоксипина наблюдается усиление выраженности и длительности нейропротекторного действия, для СОД характерен аддитивный эффект только в отношении времени сохранения нейропротекторных свойств. При использовании ретиналамина был выявлен второй пик увеличения электрофизиологических параметров в сроки превышающие среднее время удержания препарата в сетчатке, что обусловлено активизацией собственных защитных механизмов сетчатки на фоне применения ретиналамина.

8. По данным электрофизиологического исследования на фоне циркуляторной гипоксии парабульбарное введение эмоксипина не имело преимуществ по сравнению с его инсталляционным введением. Нейропротекторный эффект гистохрома был более выражен при парабульбарном введении.

9. Наиболее выраженное сохранение зрительных функций у больных ПОУГ наблюдали при применении ретиналамина. Степень изменений анализируемых параметров при использовании СОД, эмоксипина и

гистохрома была практически идентичной и умеренно выраженной. При применении бетаксолола у больных глаукомой наблюдается улучшение параметров, характеризующих гемодинамику глазного яблока.

10. Согласно выявленным особенностям фармакодинамики исследуемых препаратов, наиболее целесообразно комбинированное применение одного из антиоксидантов с нейропептидами. Клиническое изучение длительности сохранения нейропротекторного эффекта показало, что для антиоксидантов этот период не превышает 1-2 месяцев.

11. Широкое клиническое изучение фармакодинамики и фармакокинетики новых и уже широко применяемых нейропротекторных препаратов позволяет оптимизировать проводимую терапию у больных с заболеваниями, обусловленными ишемией сетчатки и зрительного нерва, и будет способствовать более точному адресному применению лекарственных средств.

СПИСОК научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Сравнительное изучение эффективности и безопасности 0,5% раствора бетоксолола, 0,5% раствора тимолола и гелевой формы тимолола малеата. //Материалы VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - М. 1999, с. 406 (соавт. Егоров Е.А.).

2. Изучение раздельного и комбинированного применения тимоптика-депо. // «Вестник офтальмологии» - 1999, т. 115, №3, с. 28-30 (соавт. Егоров Е.А., Войтова СП.).

3. Study of Separate and Combination application Timoptic XL. // "Ophthalmic research"- 1999, Vol. 31, s.l, p.45 (соавт. Egorov E.A.,Voitova S.P.).

4. Современные аспекты гипотензивного лечения глаукомы. // «Русский медицинский журнал» - 1999, т. 8, №3-4 (104-105), с.13-15 (соавт. Егоров Е.А.).

5. Сравнительное изучение эффективности и безопасности бетаксолола, тимолола малеата и тимоптика-депо. //Материалы XI научно-практической конференции «Новые технологии микрохирургии глаза» - Оренбург, 2000, с.74-78 (соавт. Егоров Е.А., Хлобыстов А.А., Бродская М.В., Бешеле Н.А.).

в. Сравнительное изучение влияния бетаксолола, тимолола малеата и тимоптика-депо на офтальмотонус, гемодинамику глаза и проводимость миокарда. // Материалы VII съезда офтальмологов России - М., 16-20 мая

2000, ч.1, с. 122 (Егоров Е.А., Хлобыстов А.А.).

7. Анализ лекарственных средств, применяемых в офтальмологии (часть 1). // «Глаз» - 2001, №3(19), с.29-33.

8-Анализ лекарственных средств, применяемых в офтальмологии (часть 2). // «Глаз» - 2001, №4 (20), с.34-39.

9. Современные аспекты гипотензивного лечения глаукомы. // «Глаз» -

2001,№5(21),с.2-7.

10. Лекарственные средства, применяемые в офтальмологии.// «Офтальмо-инфо», - 2001, Вып. 7, с.3-23 (соавт. Егоров Е.А.).

11. Медикаментозная терапия в офтальмологии. // «Кремлевская медицина» - 2002, №3, с.46-49 (соавт. Мошетова Л.К., Егоров Е.А.).

12. Особенности фармакокинетики препаратов, применяемых для лечения заболеваний глаз. Пути проникновения лекарственных веществ в переднюю камеру. (Часть 1) // «Глаз» - 2003, № 2 (30),с. 18-22.

13. Особенности фармакокинетики препаратов, применяемых для лечения заболеваний глаз. Распространение и метаболизм лекарственных препаратов в тканях глаза. (Часть 2) // «Глаз» - 2003, № 3 (31),с.26-36.

14. Фармакокинетика нейропротекторов для местного применения у больных глаукомой. // «Глаз», - 2003, № 3 (31),с.36-39.

15. Фармакокинетические аспекты применения супероксидисмутазы у больных глаукомой. // Материалы межрегионарной научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии» - Ижевск, 2003, с. 193197.

16. Электрофизиологические методы исследования в оценке и прогнозе стабилизации зрительных функций при глаукоме.// Материалы межрегионарной научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии» - Ижевск, 2003, с. 174-178 (соавт. Налобнова Ю.В.).

17. Электрофизиологическая оценка эффективности пептидного биорегуляторв - ретиналамина у больных первичной открытоугольной глаукомой. // Материалы X Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - М. 2003, с. 345.

18. Изучение фармакокинетики прямых нейропротекторов, применяемых у больных глаукомой. // «Клиническая офтальмология» - 2003, т.4,№2, с.61-63.

19. Особенности фармакокинетики глазной лекарственной формы бетаксолола. // Сборник научных трудов НПК «Современные технологии лечения глаукомы», Федоровские чтения - М., 2003, с. 376-379.

20. Влияние препарата Ретиналамин на электрофизиологические показатели у больных глаукомой. // «Новые лекарственные средства» - 2003, вып.З, с.4-7 (соавт. Егоров Е.А., Налобнова Ю.В., Алябьева Ж.Ю.).

21. Изучение возможности использования электроретинографии для оценки фармакокинетики лекарственных препаратов, оказывающих ретинопротекторное действие. // «Клиническая офтальмология» - 2003, т. 4, №3, с. 110-113.

22. Применение цитомединов в офтальмологии. // «Клиническая офтальмология» - 2003, т.4, № 4, с. 176-178 (соавт. Налобнова Ю.В., Егоров Е.А., Асророва Г.К.).

23. Прямое и непрямое нейропротекторное действие некоторых гипотензивных препаратов. // «Клиническая офтальмология» - 2003, т.4, № 4, с. 184-186.

24. Применение нейропептидов в офтальмологии. // «Глаз» - 2003, № 5 (33), с. 26-29 (соавт. Налобнова Ю.В.).

25. Патогенетические особенности адаптационных механизмов сетчатки в условиях гипоксии. // «Глаз» - 2004, № 1 (35), с. 32-36.

26. Общие принципы медикаментозного лечения заболеваний глаз. // «Клиническая офтальмология» - 2004, т. 5, № 1, с. 2-5 (соавт. Егоров Е.А., Астахов Ю.С).

27. Особенности глазной фармакокинетики и фармакодинамики препарата гистохром. // Сборник научных трудов «III всероссийская школа офтальмологов». - М., 2004, с. 289-293 (соавт. Егоров Е.А., Кадырова М.Х.).

28. Особенности глазной фармакокинетики препаратов. // Сборник научных трудов «Ш всероссийская школа офтальмологов» - М., 2004, с. 228239.

29. Сравнение возможностей применения бета-адреноблокаторов для нейропротекторной терапии глаукомы. // «Клиническая офтальмология» -2004,т.5, № 2, с. 59-60 (соавт. Егоров Е.А., Сугоняева О.Ю.).

30. Нейропротекторное действие некоторых гипотензивных препаратов. // «Глаз» - 2004, № 3 (37), с. 31-37.

31. Изучение глазной фармакокинетики раствора гистохрома при парабульбарном введении. // Материалы XI Российского национального

W

конгресса «Человек и лекарство» - М. 2004, с.838.

32. Сравнение нейропротекторных свойств ретиланамина и эмоксипина. // «Клиническая офтальмология» - 2004, т.5, № 5, с. 108-112 (соавт. Егоров Е.А., Топчиева Г.В., Древаль А.А., Кадырова М.Х.).

33. Офтальмофармакология. // Руководство для врачей. - М.: Геотар-Мед, 2004, стр. 47-85,290-293 (соавт. Егоров Е.А., Астахов Ю.С).

34. Рациональная фармакотерапия в офтальмологии. // Руководство для врачей под. ред. Е.А. Егорова - М.: Литтера, 2004, стр. 156-173 (соавт. Е.А. Егоров).

35. Способ исследования фармакокинетических и фармакодинамических свойств лекарственных препаратов, предназначенных

для лечения глазного ишемического синдрома. // Положительное решение по заявке на изобретение № 2004124702/14(026883) от 16.08.2004.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ЗВКП - зрительные вызванные корковые потенциалы п/б - парабульбарное введение ПОЛ - перикисное окисление липидов ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома с/к - субконъюнктивальное введение ЭРГ - электроретинограмма

\t9-j

1

Напечатано с готового оригинал-макета.

Издательство ООО «МАКС Пресс» Лицензия ИД № 00510 от 01.12.1999 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л.1,75. Тираж 100. Заказ 075. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносова,

2-й учебный корпус, 627 к. ^ £

Г г* ^ I

У

"1568

Актуальность проблемы

В основе патогенеза различных заболеваний органа зрения лежит нарушение процессов доставки кислорода к тканям - гипоксия. В последние годы доля заболеваний органа зрения, обусловленных нарушением гемодинамики возросла [166]. Это связано с увеличением заболеваемости атеросклерозом, гипертонической болезнью, сахарным диабетом и т.д. Кроме того, все чаще ишемическое поражение сетчатки и зрительного нерва развивается не только у людей старшей возрастной группы, но и у лиц среднего возраста. Стойкое и выраженное снижение зрительных функций, возникающее вследствие недостатка поступления кислорода к тканям сетчатки и зрительного нерва, приводит к инвалидности большой группы населения. Все это требует значительных социально-экономических затрат со стороны государства. Рациональная терапия этих состояний способствует уменьшению количества больных, ослепших в результате ишемических и дегенеративных заболеваний глазного яблока.

Одним из направлений в лечении ишемических процессов сетчатки и зрительного нерва является нейропротекторная терапия. Нейропротекция подразумевает защиту сетчатки и волокон зрительного нерва от повреждающего действия различных факторов. В настоящее время все больше и больше внимания уделяется изучению и поиску новых способов нейропротекторной терапии.

История изучения патогенетических аспектов гипоксии и способов их коррекции насчитывает более 100 лет. Однако она по-прежнему далека от решения. Это связано не только со сложностью патогенетических механизмов повреждения тканей в условиях недостаточного поступления кислорода, вовлечением в патологический процесс широкого спектра метаболических систем, контролирующих его на разных уровнях, и необходимостью коррекции разнообразных метаболических сдвигов.

Прежде всего, это обусловлено отсутствием сведений о накоплении лекарственных препаратов в тканях глазного яблока и способах наиболее рационального их введения.

Гипоксия - это сложный динамический процесс, в одних случаях он может быть компенсированным, в других — некомпенсированным [104, 121, 141]. При нарушении поступления кислорода к тканям продолжительность сохранения функциональной способности ткани зависит от ее внутренних резервов [31, 45]. В сетчатке существует несколько механизмов защиты от повреждения при экстремальных ситуациях. Это в первую очередь интенсивный анаэробный гликолиз [111, 279]. При развитии гипоксии в сетчатке происходит перестройка метаболизма путем активации тормозных процессов [35, 191]. При недостатке поступления кислорода и усилении процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) важную адаптационную роль играет пигментный эпителий [42]. Показано, что содержащийся в его клетках меланин обладает антиоксидантной активностью, ускоряя дисмутацию анион-радикалов кислорода [134]. Кроме того, нельзя забывать о роли стекловидного тела, как «резервуара» глюкозы и кислорода [279].

Все это способствует достаточно длительному сохранению функциональных резервов сетчатки [57, 296, 310]. Однако следует отметить, что сведения о высокой устойчивости тканей сетчатки к недостаточному поступлению кислорода получены в экспериментах на животных, сетчатка которых содержит только колбочки. Кроме того, эти исследования были проведены на изолированных препаратах сетчатки при поддержании постоянной кислотности и концентрации глюкозы в растворе, используемом для перфузии.

При гипоксии одним из основных механизмов повреждения клеток является активизация процессов ПОЛ и увеличение концентрации свободных радикалов, поэтому для защиты сетчатки от повреждения при нарушении поступления кислорода нашли применение препараты, оказывающие антиоксидантое действие [100, 101].

Другим важным механизмом повреждения нейронов в условиях гипоксии является нарушение ионного баланса и, прежде всего, увеличение концентрации ионов Са^ и Na+ в цитоплазме [30, 45, 121, 186]. Одним из способов коррекции нарушения ионного равновесия является применение препаратов, воздействующих на работу ионных каналов [274].

Кроме того, при гипоксии наблюдается нарушение синаптической передачи и процессов синтеза в нейронах [13]. Все это приводит к функциональным нарушениям. В организме существует система собственной регуляции функциональных нарушений, которую осуществляют специфические белки. Применение нейропептидов может способствовать нормализации функциональной способности нейронов сетчатки [171].

На сегодняшний день имеются сведения о влиянии ряда лекарственных препаратов, относящихся к различным фармакологическим группам, на процессы ПОЛ, реологические свойства крови и микроциркуляцию в зоне ишемии. Однако большинство подобных исследований проводилось в отношении миокарда и тканей головного мозга. Данные о влиянии препаратов на течение гипоксии в сетчатке немногочисленны. Кроме того, большая доля исследований проводилась in vivo, что не дает полного представления о структурных и функциональных изменениях, происходящих в сетчатке на фоне применения лекарственной коррекции ишемических состояний.

Рациональная терапия любого заболевания основана не только на сведениях, отражающих фармакодинамические свойства лекарственного средства, но и на особенностях его фармакокинетики. Исследования глазной фармакокинетики малочисленны. В отношении препаратов, применяемых для коррекции метаболических процессов в тканях сетчатки, они практически отсутствуют. Однако, не зная особенностей распределения лекарственного препарата в тканях сетчатки, невозможно выбрать наиболее эффективный способ введения и режим применения лекарственного средства.

Таким образом, учитывая необходимость широкого использования нейропротекторной терапии в офтальмологии, можно выделить два направления решения данной проблемы. Необходимо расширить представления о фармакодинамике и изучить фармакокинетические свойства препаратов, уже применяющихся в офтальмологии, и на основании полученных данных разработать рациональные способы их применения. Перспективной является разработка новых препаратов, оказывающих нейропротекторное действие. Однако данное направление требует больших временных и экономических затрат.

Цель работы

Провести экспериментально-клиническую оценку фармакокинетики и фармакодинамики препаратов, применяющихся для лечения ишемических заболеваний сетчатки и зрительного нерва, и разработать рациональные схемы их комбинированного применения.

Задачи исследования

1. Изучить распределения нейропротекторных препаратов в различных тканях глазного яблока с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Разработать методику математического анализа основных фармакокинетических параметров, характеризующих глазную фармакокинетику лекарственных средств.

3. Оценить особенности глазной фармакокинетики следующих препаратов -1% раствора эмоксипина, 0,02% раствора гистохрома, 0,25% раствора цитохрома С, 400 000 ЕД/мл раствора супероксиддисмутазы, 0,5% раствора бетаксолола и 0,5% раствора ретиналамина.

4. Сравнить распределение исследуемых препаратов в различных тканях глазного яблока и изучить влияние способа введения лекарственного средства на параметры его глазной фармакокинетики.

5. Исследовать влияние нейропротекторных препаратов на степень изменения электрофизиологических параметров на фоне циркуляторной гипоксии сетчатки и зрительного нерва и выявить взаимосвязь динамики оцениваемых показателей со скоростью накопления и выведения веществ из сетчатки.

6. Разработать методику определения основных временных фармакокинетических параметров препаратов, оказывающих нейропротекторное действие, in vivo по биологической реакции тканей.

7. Оценить морфологические изменения ткани сетчатки в поздние сроки после нарушения артериального кровообращения на фоне применения исследуемых препаратов.

8. Изучить влияние нейропептида - ретиналамина на состояние зрительных функций у больных первичной открытоугольной глаукомой.

9. По степени изменения психофизических и электрофизиологических параметров у больных глаукомой с нормализованным ВГД сравнить выраженность нейропротекторных свойств антиоксидантов — супероксиддисмутазы, эмоксипина и гистохрома

10. Провести сравнительную оценку влияния неселективных и селективных бета-адреноблокаторов на гемодинамику и зрительные функции органа зрения больных первичной открытоугольной глаукомой.

П. На основании полученных данных разработать практические рекомендации по рациональному применению исследуемых препаратов для лечения ишемических заболеваний сетчатки и зрительного нерва.

Объем проведенных исследований

Экспериментальные исследования проведены на 243 кроликах (486 глаз) породы шиншилла весом 2,5-3,0 кг. Клинические наблюдения проведены у 180 больных (242 глаза) первичной открытоугольной глаукомой с нормализованным ВГД.

Научная новизна

Проведено широкое изучение особенностей распределения в различных тканях глазного яблока лекарственных препаратов, оказывающих нейропротекторное действие.

Разработана методика математического анализа фармакокинетических параметров, характеризующих глазную фармакокинетику лекарственных препаратов.

По данным электрофизиологического исследования выявлена взаимосвязь фармакодинамических и фармакокинетических параметров лекарственных средств.

Впервые в мировой практике разработана методика оценки временных фармакокинетических параметров in vivo с помощью анализа динамической электроретинограммы.

Сравнение морфологических изменений, наблюдающихся в сетчатке в поздние сроки после нарушения артериального кровообращения на фоне применения наиболее известных нейропротекторных препаратов, позволило выявить особенности их фармакодинамики.

Проведено сравнение влияния применяемых для нейропротекторной терапии препаратов на сохранение зрительных функций при ишемических процессах в сетчатке и зрительном нерве на примере больных первичной открытоугольной глаукомой.

Практическая значимость работы

Внедрена методика хроматографического анализа распределения нейропротекторных препаратов в тканях глазного яблока.

Предложены и внедрены принципы математического моделирования фармакокинетических параметров, характеризующих глазную фармакокинетику лекарственных средств.

Разработан и внедрен способ определения основных временных фармакокинетических параметров in vivo по данным электрофизиологического исследования, который позволяет получить оптимальный объем информации об особенностях фармакокинетики препарата у животного или человека, не прибегая к травмирующим и дорогостоящим методам.

На основании полученных данных о распределении нейропротекгорных препаратов в сетчатке предложены рациональные способы введения и режимы ' дозирования широко применяемых лекарственных средств.

Используя полученные данные о фармакодинамике исследуемых нейропротекгорных препаратов, оптимизированы схемы их комбинированного применения.

Внедрение полученных результатов позволит повысить эффективность нейропротекторной терапии ишемических состояний сетчатки и зрительного нерва.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение исследуемых препаратов способствует уменьшению деструктивных процессов в сетчатке.

2. При любом способе местного введения исследуемых препаратов концентрация вещества в сетчатке достигает терапевтически значимого уровня. Однако сохранение терапевтической концентрации непродолжительно. Поэтому для поддержания постоянной концентрации необходимо увеличение частоты введения лекарственных средств. Эффект пептидного каскада, характерный для ретиналамина, обеспечивает сохранение протекторного влияния препарата в течение суток при однократном его введении.

3. Наблюдается высокая корреляционная взаимосвязь изменения электроретинографических показателей и фармакокинетических параметров, характерных для нейропротекгорных препаратов.

4. Наиболее выраженное протекторное влияние на состояние электрофизиологических показателей при продолжительном нарушении артериального кровоснабжения оказывают бетаксолол, ретиналамин и эмоксипин. В свою очередь гистохром и СОД обладают умеренно выраженным нейропротекторным действием. Инсталляционное применение цитохрома С не приводит к сохранению функциональной способности сетчатки в условиях циркуляторной гипоксии

5. Динамическая электроретинография позволила выявить усиление протекторных свойств некоторых препаратов при повторном их введении.

6. Парабульбарное введение эмоксипина не имеет преимуществ перед инсталляционным использованием. Нейропротекторный эффект гистохрома более выражен при парабульбарном введении.

7. В клинике комплексное применение исследуемых препаратов способствует сохранению зрительных функций больных ПОУГ. Продолжительность сохранения протекторного влияния антиоксидантов не превышает 1-2 месяцев.

Внедрение результатов в практику

Результаты проведенных исследований внедрены в клиническую практику кафедры глазных болезней лечебного факультета РГМУ, 13 и 15 глазных отделений, консультативно-диагностического центра при городской клинической больнице №15, Московского городского глаукомного центра, а также в учебную программу курса ФУВ «Клиническая офтальмология». Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004 г.), I - III Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2002-2004 гг.), Международном офтальмологическом конгрессе «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2002 г.), научно-практической конференции «Федоровские чтения» (Москва, 2003 г.), 6-й научно-практической конференции Федерального управления «Медико-биологических и экстремальных проблем» при МЗ РФ «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва 2003 г.), Центрально-азиатской конференции офтальмологов (Иссык-Куль, 2004),

Всероссийской научно-практической конференции «Глаукома: проблемы и решения» (Москва, 2004 г.), клинических конференциях кафедры глазных болезней лечебного факультета РГМУ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 32 статьи и 2 монографии, из них в центральной печати - 9, за рубежом - 1. Получено положительное решение по заявке на изобретение «Способ исследования фармакокинетических и фармакодинамических свойств лекарственных препаратов, предназначенных для лечения глазного ишемического синдрома» (№2004124702/14(026883).

Выражаю свою искреннюю благодарность научному консультанту -заведующему кафедрой глазных болезней лечебного факультета РГМУ профессору Евгению Алексеевичу Егорову, научному руководителю ПНИЛ «Микрохирургии глаза» РГМУ академику РАМН профессору Аркадию Павловичу Нестерову, заведующему кафедрой химии нефти и органического катализа химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова профессору Эдуарду Аветисовичу Караханову и доценту этой же кафедры кандидату химических наук Антону Львовичу Максимову, доценту кафедры гистологии лечебного факультета РГМУ, кандидату биологических наук Анатолию Александровичу Древалю и старшему преподавателю той же кафедры, кандидату биологических наук Галине Васильевне Топчиевой, научному сотруднику отдела хирургических исследований ПНИЛ кандидату медицинских наук Малике Хикматовне Кадыровой, всем сотрудникам кафедры глазных болезней лечебного факультета РГМУ, заведующим глазными отделениями ГКБ №15 Любови Семеновне Бордашевской и Алле Ивановне Олейник, сотрудникам консультативно-диагностического центра при ГКБ №15, сотрудникам Московского городского глаукомного центра за помощь в проведении данного исследования.

16

287 ВЫВОДЫ

1. Морфологическое исследование сетчатки глаза кролика показало, что наименьшая тяжесть и степень поражения на фоне циркуляторной гипоксии была характерна для животных, которым парабульбарно вводили ретиналамин. Умеренно выраженные изменения сетчатки наблюдали у животных, которым вводили растворы эмоксипина и СОД. Значительное поражение, выявленное у животных на фоне применения гистохрома и бетаксолола, было обусловлено преобладанием грубо измененных нейронов. Выраженность деструктивных явлений в сетчатке при применении цитохрома С была максимальной и сходной с группой контроля.

2. Хроматографический и математический анализ показал, что при инстилляционном применении бетаксолол равномерно распределяется практически во всех тканях глазного яблока и его концентрация в сетчатке достигает высоких значений. Максимально высокое накопление в сетчатке эмоксипина наблюдалось при инстилляционном и парабульбарном введении, СОД — при инстилляционном и субконъюнктивальном введении, цитохрома С - при парабульбарном введении. Высокая концентрация гистохрома в сетчатке была характерна для обоих видов периокулярных инъекций.

3. Учитывая, что среднее время удержания исследуемых веществ в сетчатке, определенное с помощью математического моделирования, не превышало 2 ч, для создания в сетчатке стабильной терапевтической концентрации режим применения препаратов должен составлять 4-6 введений в сутки. При инъекционном применении лекарственных препаратов целесообразно использовать инфузионные системы или коллагеновую губку, имплантируемые в ретробульбарное пространство.

4. При применении ретиналамина наблюдается эффект пептидного каскада, который обусловлен стимуляцией синтезирующих свойств нейронов сетчатки. Достаточно длительное сохранение препарата в сетчатке (3,5 ч) и особенности его фармакодинамики позволяют достичь постоянного нейропротекторного эффекта при однократном суточном введении препарата.

5. Разработанная методика динамической ЭРГ расширяет возможности оценки фармакокинетических свойств нейропротекторных препаратов in vivo, так как характер изменения электрофизических параметров указывает на высокую корреляционную взаимосвязь фармакодинамических и фармакокинетических свойств нейропротекторов.

6. Наиболее выраженное сохранение функциональной активности сетчатки по данным ГФ-ЭРГ и ЗВКП при длительном нарушении артериального кровоснабжения наблюдалось при применении бетаксолола, ретиналамина и эмоксипина, чуть менее выраженным был эффект, оказываемый гистохромом и СОД. На фоне применения цитохрома С практически не было выявлено положительного влияния на сохранения функциональной активности сетчатки.

7. При повторном введении бетаксолола и эмоксипина наблюдается усиление выраженности и длительности нейропротекторного действия, для СОД характерен аддитивный эффект только в отношении времени сохранения нейропротекторных свойств. При использовании ретиналамина был выявлен второй пик увеличения электрофизиологических параметров в сроки превышающие среднее время удержания препарата в сетчатке, что обусловлено активизацией собственных защитных механизмов сетчатки на фоне применения ретиналамина.

8. По данным электрофизиологического исследования на фоне циркуляторной гипоксии парабульбарное введение эмоксипина не имело преимуществ по сравнению с его инсталляционным введением. Нейропротекторный эффект гистохрома был более выражен при парабульбарном введении.

9. Наиболее выраженное сохранение зрительных функций у больных ПОУГ наблюдали при применении ретиналамина. Степень изменений анализируемых параметров при использовании СОД, эмоксипина и гистохрома была практически идентичной и умеренно выраженной. При применении бетаксолола у больных глаукомой наблюдается улучшение параметров, характеризующих гемодинамику глазного яблока.

10. Согласно выявленным особенностям фармакодинамики исследуемых препаратов, наиболее целесообразно комбинированное применение одного из антиоксидантов с нейропептидами. Клиническое изучение длительности сохранения нейропротекторного эффекта показало, что для антиоксидантов этот период не превышает 1-2 месяцев.

11. Широкое клиническое изучение фармакодинамики и фармакокинетики новых и уже широко применяемых нейропротекторных препаратов позволяет оптимизировать проводимую терапию у больных с заболеваниями, обусловленными ишемией сетчатки и зрительного нерва, и будет способствовать более точному адресному применению лекарственных средств.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В случае хронической ишемии сетчатки и зрительного нерва целесообразно чередовать применение антиоксидантов (продолжительность курса 2-4 недели с интервалом не более 1-2 месяцев) и нейропептидов (продолжительность курса 10 дней с интервалом не менее 5-6 месяцев). При этом блокаторы кальциевых каналов следует применять длительно и регулярно.

2. При развитии острого ишемического процесса терапию необходимо начинать с одновременного применения всех трех групп нейропротекторов. При выборе антиоксидантов предпочтение следует отдавать эмоксипину, который оказывает разно направленное действие.

3. Растворы эмоксипина и СОД наиболее целесообразно применять инстилляционно 4-6 раз в день. Чтобы избежать частого инсталляционного применения можно использовать контактные линзы, насыщенные растворами данных препаратов.

4. Раствор гистохрома следует применять парабульбарно. Для создания постоянной концентрации гистохрома в сетчатке необходимо его многократное введение (4 раза в день). Поэтому наиболее целесообразно вводит растворы гистохрома с помощью инфузионной системы или коллагеновой губки, имплантированных в ретробульбарное пространство.

291