Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Экспериментальная модель фокальной ишемии головного мозга для изучения терапевтической эффективности клеточной терапии

004618976

ТАИРОВА РАИСА ТАИРОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

14.01.11 - «Нервные болезни»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

, 3 ЯНВ 2011

Москва-2010

004618976

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова

Защита состоится «.....»................ 20... года в 14.00. часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.09 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу; 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «.....»...................2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета:

/

доктор медицинских наук, профессор / / - Л.В. Губский

Скворцова Вероника Игоревна

Максимова Марина Юрьевна

Гехт Алла Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Ишемический инсульт - одна из важнейших причин заболеваемости, инвалидизации и смертности населения во всем мире.

Смертность от ишемического инсульта в России одна из самых высоких (Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская JI.B., 2007). В течение первого месяца показатель летальности при ишемическом инсульте составляет 28-35%. В течение последующих 5 лет 45-60% больных, выживших в остром периоде, умирают от повторных инсультов. До 60% больных после ишемического инсульта становятся тяжелыми инвалидами, 30% имеют стойкие резидуальные изменения и только 10% возвращаются к полноценной жизни. Вследствие этого резко ухудшается качество жизни не только больного, но и проживающих с ним родных и близких. Кроме того, государство несет экономические и финансовые потери из-за сокращения национального валового продукта, недополученного вследствие убыли заболевших инсультом в трудоспособном возрасте, а также затрат на медико-социальную поддержку инвалидов (Скворцова В.И., Стаховская Л.В., Пряникова H.A., 2006).

Актуальность поиска препаратов, обладающих нейропротективным действием в условиях ишемии головного мозга, а также регенераторно-репаративных технологий не вызывает сомнения.

Однако на сегодняшний день нейропротекторные препараты, испытанные в клинических исследованиях, оказались недостаточно эффективными (Wahlgren NG, Ahmed N., 2004). Поэтому разработка новых подходов к терапии и профилактике инсульта является важной задачей медицины.

Многочисленные экспериментальные работы посвященные изучению возможностей клеточной терапии в лечении цереброваскулярных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как метода, стимулирующего структурно-функциональное восстановление ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость (Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н. и др., 2007; A.I. Caplan, D.P. Lennon et. al, 2010).

Цель исследования:

Провести сравнительный анализ двух моделей острой фокальной ишемии головного мозга у крыс и оценить возможность их использования для изучения терапевтической эффективности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с использованием магнитно-резонансной томографии (МРТ) и гистохимических показателей.

Задачи исследования:

1. Сопоставить клинические, МРТ и гистохимические показатели двух экспериментальных моделей острой фокальной ишемии головного мозга у крыс: модель электрокоагуляции средней мозговой артерии (СМА) и модель эндоваскулярной окклюзии СМА с контролируемой длительностью реперфузии.

2. Оптимизировать протокол исследования терапевтической эффективности МСК на экспериментальных моделях фокальной ишемии головного мозга.

3. Оптимизировать МРТ исследование и способы анализа получаемых изображений для оценки тканевых изменений при острой фокальной ишемии головного мозга.

4. Оценить эффекты МСК при разных способах их введения на выраженность неврологических проявлений и на динамику объема очага церебрального ишемического поражения с помощью прижизненной МРТ-морфометрии.

Научная новизна

Усовершенствована эндоваскулярная модель фокальной ишемии головного мозга для ее использования при изучении патогенеза ишемического инсульта, проведения доклинических исследований новых методов реперфузионной, нейропротективной и реген ераторно-репаративной терапии.

Проведен мультипараметрический анализ двух экспериментальных моделей фокальной ишемии головного мозга, впервые продемонстрированы характер и частота интра-/постоперационных осложнений. Отмечены положительные характеристики эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга.

Изучен процесс формирования зоны инфаркта головного мозга у крыс по данным динамического МРТ исследования с использованием различных режимов сканирования.

Впервые показано положительное влияние терапии МСК, выделенных из плаценты человека, на восстановление нарушенных неврологических функций и поведения животных, достоверное уменьшение зоны ишемического поражения головного мозга, по данным нейровизуализации, при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс.

Впервые выявлена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием интацеребрального и системного введения МСК крысам с моделью фокальной ишемией головного мозга. Установлен факт дифференцировки МСК, выделенных из плаценты человека, в нейрональном направлении при экспериментальной ишемии головного мозга (визуализация скопления МСК экспрессирующих человеческий нейрональный белок NeuN).

Проведена оценка эффективности методики мечения МСК магнитными флуоресцирующими микрочастицами для визуализации миграции данных клеток после их трансплантации животным. Установлено, что метод нагрузки МСК магнитными микросферами диаметром 0,96 мкм с флуоресцентной меткой Dragon Green пригоден для прижизненного исследования миграции стволовых клеток при проведении МРТ.

Показано, что использование МРТ режима Т2* ВИ на основе градиентного эха позволяет проследить миграцию трансплантированных МСК меченных магнитными микросферами с флуоресцентной меткой, что подтверждено иммуногистохимическим анализом.

Научно-практическая значимость:

Разработаны практические рекомендации по усовершенствованию экспериментальной эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга.

Уточнены характер и динамика развития тканевых изменений в зоне ишемического поражения головного мозга при двух экспериментальных моделях острой фокальной ишемии головного мозга у крыс, что позволяет рекомендовать модель с эндоваскулярной окклюзией СМА для дальнейшего использования при изучении патогенеза и доклинической оценке терапевтической эффективности новых способов лечения ишемического инсульта.

Обоснована необходимость, при проведении МРТ исследования в острейшем периоде фокальной ишемии головного мозга у крыс, измерения вычисленного коэффициента диффузии (ВКД) и его сопоставления с другими показателями, влияющими на спин-спиновую (Т2) релаксацию.

Выработаны методические рекомендации по культивированию и нагрузке парамагнетиком МСК выделенных из плаценты человека в условиях in vitro.

Отработан протокол исследования эффективности и безопасности клеточных продуктов при экспериментальном ишемическом инсульте у крыс.

Внедрение в практику:

Оптимизация протокола МРТ исследования и способы анализа получаемых изображений, включая режим ДВИ с последующим измерением ВКД для оценки тканевых изменений в острейшем периоде фокальной ишемии головного мозга, используются в работе Центра магнитной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В.Ломоносова и внедрены в практику ГКБ №31 в работу неврологического и нейрореанимационного отделений.

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на 9— международном семинаре по магнитному резонансу (г. Ростов-на-Дону, 2008 г.); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (г. Москва, 2008 г.); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 г.г.» (г. Москва, 2008 г.); 6— Всемирном конгрессе по инсульту (г. Вена, 2009 г.); 2— ежегодной европейской конференции «Stem Cells & Regenerative Medicine» (г. Эдинбург, 2009 г.); Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (г. Пятигорск, 2010 г.); 14— Европейском Конгрессе Федерации Неврологических Обществ (Швейцария, Женева, 2010 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии МБФ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и сотрудников неврологического и нейрореанимационного отделений ГКБ №31.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, благодарности. Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и проиллюстрирована 40 рисунками. Список литературы включает 21 источник отечественной и 127 источников зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования явились половозрелые самцы белых крыс линии Wistar (п=120). Источник получения крыс - питомник лабораторных животных «Столбовая» РАМН (142350, Московская обл., Чеховский р-н, ст. Столбовая).

Содержание животных и постановка экспериментов проводились в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Все манипуляции с животными одобрены этическим комитетом ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

В работе использовались МСК, выделенные из плаценты человека и нагруженные магнитными микросферами ME02F с флуоресцентной меткой, диаметром 0,96 мкм (Bangs Laboratories). Выделение МСК из тканей плаценты человека производили ферментативным способом. Для получения клеток использовали фрагмент ткани плаценты после успешных родов вблизи пупочного канатика, объемом 1 см3. МСК имели фибробластоподобную структуру и следующий фенотип: HLA-ABC+, HLA-DR-, CD 10+, CDI3+, CD29+, CD3J+, CD44+, CD49b+, CD54+, CD55+, CD90+, CD J 05+, CD106+, CD166+. Клетки обладали мультигтотентностью, свойством адгезивности к пластику и способностью дифференцироваться в остеогенном и нейрональном направлениях.

Источник получения МСК - Лаборатория стволовых клеток РГМУ под руководством член-корр. РАМН, профессора К.Н. Ярыгина.

В работе были использованы два варианта моделирования фокальной ишемии головного мозга, операции проводили под внутрибрюшинной анестезией хлоралгидратом в дозе 300 мг/кг веса животных.

Модель фокальной ишемии головного мозга, вызванная путем электрокоагуляции (А. Татига и соавт., 1981), представляет собой перманентную окклюзию СМА путем пережигания сосуда методом электрокоагуляции, с предшествующей краниотомией.

Модель фокальной ишемии головного мозга по методу J. Koizumi и Y. Yoshida, (1986) в модификации Беляева J1. (1996) представляет собой эндоваскулярную окклюзию СМА с контролируемой длительностью окклюзии, составляющей один час. Для окклюзии СМА использовали нить 4-0 с силиконовым наконечником диаметром 0,25 мм, которую через катетер в наружной сонной артерии вводили во внутреннюю сонную

артерию (ВСА), продвигая ее "вслепую" на 17-20 мм до места отхождения СМА от ВСА. В таком положении микрофиламент оставляли на час для создания очага церебральной ишемии в бассейне СМА, по истечению этого времени микрофиламент извлекали из сосуда, накладывали лигатуру, рану послойно ушивали.

Введение МСК производили через 42±6,4 часа после моделирования фокальной ишемии головного мозга двумя способами: 1) внутривенное введение в бедренную вену (в дозе 2 млн. МСК в 1мл 0,9% NaCl); 2) внутримозговое введение по методике, описанной Mathias Hoehn и соавт. (2002), под кору мозга (на глубину 2 мм от твердой мозговой оболочки), и в полосатое тело (на глубину 5 мм от твердой мозговой оболочки) в дозе по 30 тыс. МСК в 1 мкл 0,9% NaCl.

Для оценки неврологического статуса животных использовалась шкала stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996), при этом учитывались показатели спонтанной активности и двигательной активности по состоянию животного при подвешивании за хвост, помещении на пол/стол и по способности взбираться по проволочной сетке. Оценивали проприоцептивную чувствительность по рефлексу с ушной раковины, роговичному рефлексу, стартл рефлексу. Каждый признак оценивался в определенное количество баллов, сумма которых и являлась показательной оценкой состояния животного: 15-18 баллов расценивали как легкое поражение, 11-14 - как средней тяжести и 1-10 баллов - как тяжелое поражение. Оценка неврологического дефицита по шкале McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной проводилась до операции, на 1, 3, 7, 14, 21 и 30-е сутки после окклюзии СМА. При проведении тестирования животные не испытывали неприятных ощущений или иного отрицательного воздействия.

Для оценки изменений поведенческих реакций использовали поведенческие тесты «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт». Тест «Открытое поле» в модификации А.А. Каменского (2002) направлен на изучение ориентировочно-исследовательского поведения животных. При тестировании животное помещали в центр арены и в течение 3 минут визуально фиксировали горизонтальную (по числу радиальных перемещений с пересечением внешней и внутренней окружности) и вертикальную двигательную активность (количество стоек), интенсивность груминга и количество дефекаций. Тест "крестообразный лабиринт" является одной из моделей изучения тревожности и страха у крыс. Животное помещали в центр лабиринта и регистрировали в течение 3 минут следующие показатели: время нахождения в темном отсеке, количество переходов через центр лабиринта, количество стоек, груминг, количество выглядываний из закрытых концов лабиринта, а также общее время на свету.

Оценку состояния всех животных, включенных в эксперимент, проводили как по сенсомоторным, так и по когнитивным тестам за несколько суток до индукции фокальной ишемии головного мозга для выявления возможного базового уровня неврологического дефицита, а также после операции на 10-е и 14-е сутки.

МРТ исследование проводилось на томографе BioSpec 70/30 с силой поля 7 Тесла (Центр Магнитной Томографии и Спектроскопии МГУ им. М.ВЛомоносова, директор -профессор Ю.А. Пирогов). Исследование проводили под общей анестезией (хлоралгидрат 300 мг/кг веса, внутрибрюшинно) на 1, 7, 14, 21-е сутки, через 1 и 1,5 месяца после операции. Во время МРТ исследования измеряли ЭКГ, частоту дыхания и ректальную температуру с помощью прибора для контроля жизнедеятельности Small Animal Monitoring and Gating System (SA Instruments Inc., USA). В ходе эксперимента были использованы различные импульсные последовательности: режим Т2 взвешенного изображения (Т2 В И) на основе импульсной последовательности мульти спин-эхо - для оценки зоны ишемии и исключения субарахноидального кровоизлияния (САК) и внутримозговой гематомы; режим ДВИ с использованием спин-эхо последовательности - для оценки зоны ишемии в острейшем периоде ишемического поражения; Т2* ВИ с помощью режима на основе градиентного эха (SNAP), данный режим чувствителен к парамагнитным эффектам магнитной восприимчивости и обеспечивает визуализацию МСК, меченных парамагнетиком, а также выявляет развитие геморрагической трансформации (ГТ); трехмерная времяпролетная MP ангиография (MPА), используемая для контроля окклюзии и оценки степени реканализации сосуда после удаления микрофиламента; режим Т1 ВИ + Т1 контраст-усиленное изображение, используемые для оценки нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Анализ MP-изображений проводился с помощью свободно распространяемой программы анализа медицинских изображений «Image J» (Институт психического здоровья, подразделение Национального института здоровья США). Объем зоны ишемического поражения вычисляли на режимах Т2 ВИ и ДВИ полуавтоматическим способом по формуле:

V = XA'd, где: V - объем; SA-сумма площадей всех МР-срезов; d-ширина срезов. Иммуногистохимический анализ экспрессии нейрональных маркеров МСК проводился в лаборатории медицинских клеточных технологий РГМУ под руководством член-корр. РАМН, профессора К.Н. Ярыгина. Животных декапитировали на фоне хлоралгидратного наркоза на 1-е сутки (п=6); 7-е сутки (п=6); 14-е сутки (п=7); 21-е сутки (п=7); через 1 месяц (п=6); 1,5 месяца (п=7); 2 месяца (п=4) после трансплантации МСК. Фронтальные серийные срезы головного мозга крыс толщиной 10 мкм готовили на

криотоме Microm НМ560 (Carl Zeiss, Германия). Визуализацию тканей и получение изображений проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия). Для оценки возможной дифференцировки трансплантированных клеток фиксированные фронтальные срезы мозга окрашивали антителами, специфичными к человеческим нейрональным (NeuN) и глиальным (GFAP) белкам по методике, рекомендованной производителем антител. Для объективной и информативной оценки пролиферативной активности трансплантированных МСК срезы головного мозга крыс окрашивали антителами к ядерному белку - регулятору клеточного цикла Ki-67, экспрессирующемуся в S, G2, M периодах клеточного цикла (Chemicon, США; разведение антител 1:100). В качестве вторичных антител использовали антивидовые антитела, меченые пероксидазой хрена.

Для статистического анализа использовали следующие непараметрические критерии: Крускала-Уоллиса (непараметрический аналог дисперсионного анализа), Ньюмена-Кейлса (непараметрический аналог множественных сравнений), а также критерий Фридмана (непараметрический аналог дисперсионного анализа повторных изменений) для оценки динамики показателей в экспериментальных группах в разные временные точки. Для проведения анализа использовали программы STATISTICA 2007 и пакет программ Microsoft Office 2007.

Исследование проводили в два этапа:

На первом этапе были изучены две экспериментальные модели фокальной ишемии головного мозга с последующим их сопоставлением и выбором оптимальной модели, максимально приближенной к клиническим условиям. Модель электрокоагуляции СМА использовалась у животных с окклюзией СМ А (п=16), контролем явились ложнооперированные животные (ЛО) (п=4).

Для изучения ранней динамики формирования церебрального очага инфаркта на эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга была выделена группа из 30 животных.

Для сопоставления с группой животных с экспериментальной моделью электрокоагуляции СМА была составлена группа с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга без раннего контроля динамики формирования инфаркта мозга (п=31). Контрольную группу составили ЛО животные (п=4).

На втором этапе осуществляли изучение терапевтической эффективности МСК при разных способах их введения животным со сравниваемыми экспериментальными моделями фокальной ишемии головного мозга.

Результаты исследования и их обсуждение

Первый этап исследования

Сравнительный анализ летальности животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга выявил достоверно больший процент летальности (р=0,014) в период с 8-х по 14-е сутки после операции в группе животных с электрокоагуляцией СМА.

У всех животных отмечалось снижение массы тела в течение первых трех суток после операции на 9-10%, в дальнейшем отмечалась тенденция к набору массы тела. Однако животные с эндоваскулярной моделью имели достоверное превалирование массы тела, начиная с 14-х суток после операции (р<0,01). К полутора месяцам после операции прирост массы тела в этой группе составил 21%, что на 6% больше, чем в группе животных с электрокоагуляцией СМА (р<0,001). Более высокий темп прироста массы тела животных с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга (не требующей проведения краниотомии) может косвенно свидетельствовать о более хорошем функциональном восстановлении экспериментальных животных и низкой частоте возникновения постоперационных осложнений.

Моделирование фокальной ишемии головного мозга сопровождалось развитием неврологического дефицита, однако, его выраженность и степень функционального восстановления животных была разной (рисунок 1).

до 1 сут Зеут 7сут 2нед Знед 1 м«с 1,5 м*с ■р#мя поел* опшрации

Рисунок 1. Динамика неврологического восстановления животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга по шкале Мс Grow в модификации И.В. Ганнушкиной

Достоверность различий суммы баллов по шкале Ms Grow между группами животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга: р<0,05 (*); /т<0,001 (**)

Животные с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга

имели максимальное снижение суммы баллов на первые сутки после операции (р<0,001),

начиная с 14-х суток сумма баллов неврологического дефицита практически приближалась к значениям группы ЛО животных (17,6±0,5 уэ 18±0,3 баллов), животные с электрокоагуляцией СМА максимально низкий показатель суммы баллов имели на 7-е сутки после операции (р<0,05).

Общая тенденция изменения поведения животных после моделирования фокальной ишемии головного мозга выглядела следующим образом: на 10-е сутки после операции у всех животных происходило снижение исследовательской активности, что проявлялось в уменьшении числа пересеченных квадратов (пробега) и количества пересечений внутренних и наружных концентрических окружностей на экспериментальной площадке в тесте «открытое поле», снижении вертикальной активности (стоек), уменьшении количества выглядываний животных из закрытых рукавов лабиринта в тесте «крестообразный лабиринт». Степень снижения показателей и скорость их восстановления до исходного уровня в группах с разными моделями фокальной ишемии мозга была различной (рисунок 2 а, б).

■ Ложпоогериров*нмые жэлектрокоягуляцин СМА

до операции 10-е сутки 14-» сутки

время после операции

Рисунок 2а. Динамика вертикальной активности животных с разными моделями ишемии головного мозга исследуемая в поведенческом тесте «Открытое поле»

Достоверность различий суммы баллов показателей вертикальной активности у животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга: р<0,001(**)

■ Ложнооперированные «Эпектрокоагупяция СМА

до операции 10-е сутки 14-е сутки время после операции

Рисунок 26. Динамика исследовательской активности животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга, анализируемая в поведенческом тесте «Крестообразный лабиринт»

Достоверность различий суммы баллов показателей исследовательской активности у животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга: /)<0,001(**)

Менее выраженная вертикальная активность животных (/><0,001) на 10 и 14-е сутки после операции наблюдалась в группе животных с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга. Кроме того, животные с эндоваскулярной моделью имели более низкий показатель исследовательской активности, выражающийся в достоверном (р<0,05) снижении количества пересечений внешней окружности поля практически в 2 раза, по сравнению с животными с электрокоагуляцией СМА (2,5±0,5 Ув. 4,3±3). Однако к 14-м суткам показатель исследовательской активности животных с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии нарос (5,5±1,5) и даже превзошел значение у животных с электрокоагуляцией СМА. Результаты тестирования животных в «Крестообразном лабиринте» подтвердили аналогичные результаты в тесте «Открытое поле»

Анализ МР-изображений на первые сутки после операции показал, что проведение перманентной окклюзии СМА путем прижигания ее дистального участка позволило получить очаг ишемического повреждения преимущественно корковой локализации, захватывающий исключительно теменно-височную область. Моделирование фокальной ишемии головного мозга с помощью эндоваскулярной модели с контролируемой длительностью окклюзии в течение одного часа показало хорошую воспроизводимость по локализации и объему очага поражения. У 80% животных наблюдался корково-подкорковый очаг ишемического поражения, а у остальных 6 животных (20%) имелось изолированное поражение в области базальных узлов и гиппокампа (рисунок 3).

Рисунок 3. (а, б) ишемическое поражение коры полушарий и базальных узлов на первые сутки после операции при эндоваскулярной модели фокальной ишемии,

коронарный срез: а - Т2 ВИ, б - ДВИ (Ь=1000); (в, г) ишемическое поражение подкорковой локализации при эндоваскулярной модели фокальной ишемии: в - Т2 ВИ, г - ДВИ (Ь= 1000)

Использование МРА непосредственно после введения силиконового

монофиламента и через 60 минут окклюзии СМА перед его удалением, позволило

визуализировать окклюзию СМА и исключить возможность смещения филамента в

сосуде. МРА исследование в динамике после удаления монофиламента позволило

определить характер восстановления кровотока в стволе СМА. По данному признаку

-11-

животные были разделены на 3 группы в зависимости от степени реканализации СМА: 63,3% животных имели полный вариант восстановления кровотока, у 20% кровоток восстановился частично, а у оставшихся 16,7% животных кровоток в окклюзированном сосуде не был восстановлен (таблица 1, рисунок 4). Отсутствие реканализации СМА сопровождалось гибелью 80% животных в течение последующих суток, тогда как при полном восстановлении кровотока 24-х часовая летальность составила всего 5,2%.

ЩЩ1Щ ......«щ

Рисунок 4. Характер восстановления кровотока в бассейне СМА на 5-ой минуте после удаления силиконового монофиламента, МР-ангиография:

а - полная реканализация; б - частичная реканализация; в - отсутствие реканализации СМА

Определенное значение в развитии феномена невосстановления кровотока по стволу СМА после удаления монофиламента, на наш взгляд, играет неправильно подобранный диаметр вводимого монофиламента и повторные попытки его ведения, либо замена его на филамент другого диаметра. Соответственно, профилактикой этого осложнения является более тщательный выбор необходимого диаметра монофиламента.

Таблица 1. Распределение групп животных в зависимости от варианта восстановления кровотока в СМА и локализации очага поражения

Локализация очага поражения Варианты восстановления кровотока после окклюзии СМА Количество животных

Полное Частичное Нет восстановления

Корково-подкорковый 13 (43%) 6 (20%) 5 (17%) 24 (80%)

Подкорковый 6 (20%) 0 0 6 (20%)

Все животные 19 (63%) 6 (20%) 5 (17%) 30(100%)

Достоверных различий между группами с корковой и корково-подкорковой локализацией очага поражения в зависимости от варианта восстановления кровотока в стволе СМА не выявлено.

Степень восстановления кровотока в окклюзированном сосуде коррелировала с

24-х часовой летальностью животных (11=0,47; р<0.03). 24-х часовая летальность в

группе животных без восстановления кровотока составила 80% от общего количества

крыс в данной группе, тогда как в группе с полным восстановлением кровотока 24-х часовая летальность составила всего 5,3%.

Анализ динамики объема ишемического поражения головного мозга в зависимости от степени восстановления кровотока в окклюзированном сосуде, показал достоверное (р<0,001) превалирование объема зоны поражения на 74-ой минуте (361 ±74 та 236,6±30 мм3) и через сутки после операции (880,5±40 га 559,2±70 мм3) в группах животных без восстановления кровотока в СМА по сравнению с животными с полным восстановлением кровотока (рисунок 5).

Время после окклюзии СМА

Рисунок 5. Динамика объема очага поражения по данным ДВИ с учетом степени восстановления кровотока в бассейне СМА

По оси абсцисс отложены сроки наблюдения после начала окклюзии СМА (начало окклюзии принято за ноль). По оси ординат - объем очага поражения в мм3.

Объем очага ишемического поражения головного мозга на режиме Т2 ВИ через , сутки после операции был достоверно большим у животных без восстановления кровотока в бассейне СМА по сравнению с группой животных с полной реканализацией данного сосуда (403,2±90 vs 252,1±30 мм3), в дальнейшем 4/5 животных погибли в течение следующих суток после операции, одно оставшееся животное не вышло из наркоза на 7-е сутки после операции при динамическом проведении МРТ (по данным МРТ у животного имелась обширная зона ишемического поражения, соответствующая всему бассейну СМА с развитием геморрагической трансформации).

Уменьшение величины вычисленного коэффициента диффузии (ВКД) явилось надежным индикатором повреждения мозга в острейшем периоде ишемического поражения. Минимальное значение показателя ВКД у животных эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга наблюдалось начиная с 36±12.5 минуты после операции, что связано с нарастанием цитотоксического отека в зоне острого

ишемического повреждения, к 7-м суткам после операции показатель ВКД приходил к своим исходным значениям (феномен псевдонормализации).

Сравнение динамики объемов очага ишемического поражения по данным МРТ в группах животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга показало достоверные различия на первые сутки после операции (таблица 2). Так, животные с эндоваскулярной моделью (без учета степени восстановления кровотока после удаления монофиламента) имели достоверно большее значение объема поражения (р=0,04), по сравнению с животными подверженными электрокоагуляции СМА (239,4±172 vs 144,6±40 мм3). В дальнейшем, в обеих группах отмечалась тенденция к уменьшению объема зоны ишемического поражения, максимально выраженная к 14-м суткам, однако, степень восстановления была разной.

Несмотря на превалирование объемов поражения в первые сутки в группе животных с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга, к 14-м суткам объем зоны ишемического поражения значительно уменьшался и был на 30% меньше, чем в группе животных с электрокоагуляцией СМА. Данный факт может свидетельствовать как о более быстром восстановлении неврологических функций у животных с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга, так и о замедлении восстановительных процессов в группе животных, перенесших краниотомию с последующей электрокоагуляцией СМА, вследствие присоединения постоперационных осложнений

Таблица 2. Объем зоны поражения головного мозга на Т2 ВИ (ммЗ) в сравниваемых группах животных, в скобках указано количество животных в соответствующих группах

Тип модели Сроки наблюдения после окклюзии СМА

1-е сутки 7-е сутки 14-е сутки 21 -е сутки 30-е сутки

Электро коагуляция СМА 144,6±40(16 ) 132,5±60 (14) 104,6±36 (9) 49,4±17 (9) 41,6±22 (8)

Эндоваску лярная окклюзия СМА 239,4±172 (31)" 150,6±54 (23) 73,4±24 (23)* 32,4±4 (22) 22,4±4 (20)

Достоверность различий между группами с разными экспериментальными моделями ишемического инсульта: ^<0,05 (*); /?<0,001(**).

МРТ исследование в динамике позволило выявить интра- и послеоперационные осложнения при экспериментальных моделях острой фокальной ишемии головного мозга. Летальность ко второй неделе после краниотомии с последующей электрокоагуляцией СМА составила 56,4%, причем у животных, как правило,

присутствовало одновременно несколько вариантов послеоперационных осложнений: воспаление и отек мягких тканей, явления церебрита, абсцесс головного мозга (рисунок 6). Результаты прижизненной нейровизуализации были подтверждены гистологическим анализом биопсийного материала: начиная с 5-7-х суток после операции, отмечено формирование церебрита с некротическим очагом, выраженным отеком и зоной перифокального воспаления. Затем, начиная с 9-х суток после моделирования фокальной ишемии головного мозга, вокруг некротического очага начинала формироваться демаркационная линия, новые сосуды, фиброз, с началом образования капсулы. У 3 животных абсцесс прорывался в субарахноидальное пространство, визуализируя картину менингита.

Рисунок 6. Варианты послеоперационных осложнений у животных:

а-в - подвергшихся краниотомии с последующей электрокоагуляцией СМА, режим Т2 ВИ: а,б - в мягких тканях визуализируется зона гиперинтенсивного сигнала, соответствующая наличию воспаления и отека мягких тканей головы; в гиперинтенсивные изменения в оболочках мозга, соответствующие явлениям менингита; г - развитие внутримозговой гематомы с прорывом крови в желудочки мозга вследствие разрыва СМА силиконовым монофиламентом у крысы с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга.

Эндоваскулярная модель фокальной ишемии головного мозга характеризовалась преимущественно наличием интраоперационых осложнений (4,8% случаев), связанных с повреждением сосуда непосредственно в момент введения монофиламента и его продвижения до блокирования кровотока в стволе СМА. Наиболее высокая летальность в группе животных с эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга наблюдалась к 7-м суткам после операции (11% случаев), использование контрастного усиления с последующим проведением режима Т1 ВИ позволило оценить степень нарушения ГЭБ, кроме того наблюдалось повышение сигнала от коры и подкорковых структур с максимальным накоплением контрастного агента на 45-50-й минутах после его в/в введения, что можно объяснить наличием обширной зоны поражения корково-подкорковой локализации со смещением головного мозга и развитием геморрагической трансформация в 16,6 % случаев.

Второй этап исследования

При электрокоагуляции СМА суммарная летальность к 14-у дню после операции была достоверно ниже в группе животных, получавших внутривенно МСК - погибла 1 из 6 крыс, тогда как в группе животных без введения МСК погибли 9 из 16 крыс (/<<0,05). При эндоваскулярной окклюзии СМА различий по показателю суммарной летальности к 14-у дню после операции между группами животных, получавших и не получавших МСК внутривенно не наблюдалось.

В группах животных с внутримозговым способом введения МСК гибели животных в течение 14 дней после операции не наблюдалось.

Масса тела животных с моделью электрокоагуляции СМА была более низкой у животных не получавших МСК по сравнению с животными, которым внутривенно эти клетки вводились (319,3±18 v.v 335,4±23 г,р<0,05). При эндоваскулярной модели ишемии мозга также отмечалось более низкое значение показателя массы тела в группе животных, не получавших клеточную терапию, начиная с 7-х суток после операции (255,7±9 vs 274,6±17 r,/j<0,05).

Оценка восстановления неврологических функций животных, определяемая по шкале Мс Grow в модификации И.В. Ганнушкиной начиная с 7-х суток после операции, выявила более низкий показатель степени функционального восстановления у животных, не получавших МСК по сравнению с животными получившими клеточную терапию (р< 0,05).

Общая тенденция изменения поведенческих реакций у животных без клеточной терапии характеризовалась наличием более выраженного снижения вертикальной активности (р<0,001) и исследовательской активности (/><0,05) спустя две недели после операции.

Объем зоны ишемического поражения головного мозга у животных с моделью электрокоагуляции СМА и последующим внутривенным введением МСК к 7-м суткам уменьшился на 28,9%, а к 14-м суткам - на 34,9%. Объем зоны ишемического поражения у животных с внутримозговым способом введения МСК уменьшился в указанные временные периоды соответственно на 37,8% и 69,5% (таблица 3).

У животных с электрокоагуляцией СМА и последующим внутривенным введением МСК, выраженность воспалительного компонента и отека мягких тканей была менее выраженной, а явления церебрита имелись в 16,6% случаев против 31,3% в группе животных не получавших МСК.

Таблица 3. Динамика объема зоны поражения головного мозга крыс (ммЗ) с разными вариантами введения МСК_

Группы животных Сроки наблюдения после окклюзии СМА

1 -е сутки 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 30-е сутки

ЭК 144,6±34 132,5±60 104,6±36 49,4±17 41,6±22

ЭК+СК в/в 154,8±29 110,2±24 100,8±27 34,7±8 27,4±4**

ЭК+СК в/м 146,8±47 91,32±465 44,8+12" 37,3±6 30,2±4

ЭВ 239,4±172 150,6±54 73,4±24 32,4±4 22,4±4

ЭВ+СК в/в 225,4±72 "" 128,2±58 68,2±1812 22,7±б 11,4±3S"

ЭВ+СК в/м 205,4±36° 112±24 38±7" 23,3±5 16,7±4ín

ЭК/ЭВ+СК в/в (в/м) - животные с моделью электрокоагуляции / эндоваскулярная модель СМА, последующим внутривенным (внутримозговым) введением МСК. Достоверность различий между группами ЭК и ЭК+СК в/в: р<0.05 (*) Достоверность различий между группами ЭК и ЭК+СК в/м: /7<0,05(§); р<0,001 (§§); Достоверность различий между группами ЭВ и ЭВ+СК в/в /К0,05 (#); Достоверность различий между группами ЭВ и ЭВ+СК в/м /КО,05 ({) /К0,001 Достоверность различий между группами ЭК+СК в/в и ЭВ+СК в/в /><0,001(£1 П); Достоверность различий между группами ЭК+СК в/м и ЭВ+СК в/м /К0,05(п)

Одной из задач диссертационной работы было установление возможности использования МРТ методики исследования для in vivo контроля перемещения меченых МСК в мозге крыс. Для решения данной задачи использовался режим Т2* ВИ на основе градиентного эха. Стереотаксическое введение меченных МСК характеризовалось четким изменением MP-сигнала в месте введения у всех животных. В 85% случаев, начиная с 12-х суток после стереотаксического введения МСК у животных с экспериментальной моделью фокальной ишемии головного мозга на режиме Т2* ВИ визуализировались небольшие участки гипоинтенсивного сигнала в структурах мозга, в частности, вблизи субвентрикулярной зоны (рисунок 7).

Рисунок 7. МРТ изображения (Т2* ВИ) среза головного мозга крысы с электрокоагуляцией СМА после внутри мозгового введения МСК:

а) через 7 дней; б) через 14 дней; в) через 21 день; г) через 28 дней. Черными стрелками показаны участки снижения сигнала подозрительные на присутствие меченных клеток. Видно скопление меченных МСК в месте их стереотаксического введения в область базальных узлов.

-17-

Таким образом, использованная технология маркирования МСК позволяет определить пути их миграции в мозге в различные периоды после развития ишемического поражения головного мозга.

При анализе данных по характеру и динамике поражения головного мозга у животных с разными моделями фокальной ишемии установлено, что у животных с моделью электрокоагуляции СМА часто имеется выраженный воспалительный компонент в очаге поражения (церебрит) с последующим формированием абсцесса мозга в ряде случаев.

По данным С.Т ЕЫаМ е! а1. (2008) массивный воспалительный компонент способствует не только удалению погибших нейронов и созданию среды для последующих процессов регенерации, но и способствует более активному выделению хемотаксических факторов (преимущественно направляющих миграцию

стволовых клеток в очаг повреждения мозга. Кроме того повышение проницаемости ГЭБ в острый период ишемического инсульта продлевается за счет наличия дополнительного источника воспаления, вызванного проведением краниотомии, что также в свою очередь способствует проникновению в головной мозг МСК.

Проведенный иммуногистохимический анализ криосрезов мозга крыс с фокальной ишемией головного мозга позволил визуализировать скопления МСК преимущественно в очаге ишемии и периинфарктной зоне. Спустя месяц после трансплантации МСК визуализировались в субвентрикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков, а также в гиппокампах ишемизированного и контрлатерального полушарий мозга. Некоторые меченые клетки в зоне ишемии положительно окрашивались антителами к человеческому вРАР - белку-маркеру астроглии. №иМ-положительные меченые клетки выявлялись преимущественно вокруг очага инсульта. На основании всей совокупности полученных данных можно предположить, что часть трансплантированных клеток вступает на путь дифференцировки в нейроны и глию (рисунок 8).

Установлено также, что после внутривенного введения человеческих МСК крысам с экспериментальной моделью фокальной ишемии головного мозга происходит активная стимуляция пролиферации резидентных нейрональных стволовых клеток в СВЗ обоих полушарий.

Так, по сравнению с группой животных без введения МСК, количество делящихся клеток в СВЗ у животных с трансплантацией МСК становится существенно больше. К> 67-позитивные (пролиферирующие) клетки у животных на 45-е сутки после трансплантации МСК формировали отчетливые тангенциально направленные «треки»,

скопления пролиферирующих клеток наблюдались также непосредственно в очаге ишемии и в периинфарктной зоне, чего не наблюдалось у животных без трансплантации МСК (рисунок 9). Эти данные позволяют предположить, что трансплантация человеческих плацентарных МСК вызывает также стимуляцию собственных стволовых клеток мозга у крыс с фокальной ишемией головного мозга.

Рисунок 8. Иммуногистохимическое окрашивание клеток в зоне ишемии антителами, специфичными к человеческому глиальному фибриллярному кислому белку (СКАР) после внутримозгового введения МСК, разведение антител 1:100. Положительная иммуногистохимическая окраска ОБАР свидетельствует о том, что ряд МСК в зоне ишемии проявляют признаки дифференцировки в направлении глии.

A. 5-е сутки после трансплантации, локализация МСК вокруг сосудов; Б. 12-е сутки, «трек» в направлении очага ишемии;

B. 19-е сутки, скопление МСК в очаге ишемии; Г. 19-е сутки, МСК в гиппокампе.

: ."-¡п." Б

> В ч. '. г

д ~ ■ ' ■"' - ■ В

Рисунок 9. Стимуляция пролиферации резидентных клеток СВЗ (окрашивание антителами к Кь67). А - СВЗ, с МСК; Б - СВЗ, без МСК; В - путь миграции МСК; Г - без МСК;

Д - периинфарктная зона, с МСК; Е - периинфарктная зона, без МСК.

Резюмируя проведенное преклиническое испытание клеточной терапии на моделях экспериментальной фокальной ишемии головного мозга у крыс, можно предположить, что МСК оказывают специфический положительный эффект. Полученные данные делают обоснованными дальнейшие исследования эффективности клеточной терапии с перспективой последующего их клинического применения у больных с ишемическим инсультом.

выводы

1. Сопоставление двух экспериментальных моделей фокальной ишемии головного мозга выявило существенные недостатки модели, требующей краниотомии с последующей электрокоагуляцией СМА: небольшой объем зоны ишемического поражения мозга, преимущественно корковой локализации, наличие воспаления и отека мягких тканей головы, развитие церебрита, а в дальнейшем - формирование абсцесса головного мозга с выраженным перифокальным отеком. Показатель суммарной летальности животных с моделью электрокоагуляции СМА к 14-м суткам после операции существенно превышал данный показатель в группе животных с эндоваскулярной моделью ишемии мозга.

2. Применение эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга с контролируемой длительностью окклюзии 1 час позволило воспроизвести сопоставимую по локализации и объему зону ишемического поражения (область базальных узлов, гиппокамп, теменно-височная область) с низкой частотой послеоперационных осложнений.

3. Для контроля за динамикой тканевых изменений в зоне ишемического поражения головного мозга необходимо использование мультипараметрического протокола МРТ исследования, включающего: Т2 ВИ, ДВИ, Т2* ВИ, Т1 ВИ. Использование MP-ангиографии в острейшем периоде эндоваскулярной модели фокальной ишемии мозга позволяет контролировать степень окклюзии и определять последующий характер реканализации СМА.

4. Степень невосстановления кровотока по СМА у крыс после удаления силиконового монофиламента с использованием экспериментальной эндоваскулярной модели инсульта коррелирует с 24-часовой летальностью животных (R=0,47; р<0.03), по данным МР-ангиографии.

5. Результаты оценки неврологического дефицита и тестирования поведенческих реакций крыс в условиях экспериментальной фокальной ишемии мозга указывают, что как внутривенное, так и внутримозговое введение МСК сопровождается повышением способности к адаптации и меньшему неврологическому дефициту, уровень выживаемости животных с введением МСК был выше по сравнению с животными, не получавшими клеточную терапию. Применение МСК в условиях экспериментальной фокальной ишемии мозга связано с более быстрым уменьшением объема зоны ишемического поражения по сравнению с животными, не получавшими клеточную терапию.

6. Метод нагрузки МСК магнитными микросферами диаметром 0,96 мкм с флуоресцентной меткой Dragon Green пригоден для прижизненного исследования миграции клеток при проведении МРТ. Использование MP режима Т2* ВИ на основе градиентного эха позволяет проследить трекинг трансплантированных МСК, что подтверждается иммуногистохимическим анализом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При выполнении эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга

необходим тщательный подбор вводимого монофиламента для окклюзии СМА с учетом силиконового покрытия, диаметра наконечника, глубины введения.

2. MP-визуализация головного мозга экспериментального животного требует

использование оптимального протокола исследования, включающего режимы: Т2 ВИ (для оценки зоны церебральной ишемии, исключения развития САК и внутримозговой гематомы); ДВИ (для оценки зоны церебральной ишемии в острейшем периоде ишемического инсульта), Т2* ВИ (SNAP) режим (для контроля развития геморрагической трансформации); Т1 ВИ + Т1 контраст-усиленное изображение (анализ нарушения проницаемости ГЭБ).

3. При выполнении эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга

целесообразно использование MP-ангиографии для контроля окклюзии и оценки степени реканализации сосуда после удаления монофиламента.

4. Целесообразно использование различных функциональных тестов, направленных

на оценку когнитивных и сенсомоторных нарушений и изучение ориентировочно-исследовательского поведения у животных с экспериментальной фокальной ишемии головного мозга.

5. Для прижизненной нейровизуализации (МРТ, режим Т2* ВИ) и постмортальной

(флюорицентная микроскопия) оценки распределения и перемещения (хоуминга) трансплантированных МСК, рекомендовано осуществление нагрузки трансплантированных клеток магнитными микросферами ME02F с флуоресцентной меткой, диаметром 0,96 мкм.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева A.A., Таирова Р.Т. «Способность мезенхимальных клеток, выделенных их амниона человека, дифференцироваться в нервные клетки IN VITRO и IN VIVO» // Сб. статей в рамках Всероссийской и международная конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении"; 2007, стр. 63-64.

2. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева A.A., Таирова Р.Т. "Применение мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток при экспериментальном ишемическом инсульте у крыс" // Журнал Клеточные технологии в биологии и медицине. 2008, №1; стр. 14-20.

3. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева A.A., Таирова Р.Т. «Влияние мезенхимальных стволовых клеток на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс» // Сб. материалов научно-практической конференции «Медико-биологические проблемы для теоретической и клинической медицины»; Москва, ООО «Агат-Мед», 2008, стр. 9091.

4. Губский Л.В., Учеваткин A.A., Леденев В.В., Таирова Р.Т., Чеглаков И.Б., Цебоева A.A., Бурунова В.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н., Скворцова В.И. «Изучение влияния мезенхимальных стволовых клеток, меченных микрочастицами оксида железа в декстрановой оболочке на экспериментальных моделях ишемического инсульта у крыс» // Сб. материалов 9-го международного семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону, 2008, стр. 19.

5. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева A.A., Таирова Р.Т. «Влияние мезенхимальных стволовых клеток на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс» // Сб. материалов научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины". Москва, 2008, стр. 90-91.

6. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Р.Т. Таирова, Учеваткин A.A., Глушкова Т.Т. «Экспериментальная модель фокальной ишемии мозга у крыс на основе эндоваскулярной микрохирургии» // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2008,109, №2, стр. 62-69.

7. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева A.A., Таирова Р.Т. «Применение мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток при экспериментальном инфаркте мозга у крыс» // Сборник материалов межрегиональной конференции «Инсульт»; 2008, стр. 86.

8. Ярыгин КН., Чеглаков И.Б., Кониева А.А., Бурунова В.В., Таирова Р.Т., Губский Л.В., Каралкин П.А., Лупатов А.Ю., Шрагина О.А., Черкезов Я.А. «Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований в области клеточных технологий» // Сб. материалов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2008, стр. 159.

9. К.Н.Ярыгин, И.В.Холоденко, А.А.Кониева, В.В.Бурунова, Р.Т.Таирова, Л.В.Губский, Ю.А.Пирогов, В.Н.Ярыгин, В.И.Скворцова «Механизмы положительного влияния трансплантации МСК плаценты человека на восстановление крыс после экспериментального ишемического инсульта» // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009, 148, №12, стр. 621-628.

10. В.И.Скворцова, В.Н.Ярыгин, Ю.А.Пирогов, К.Н.Ярыгин, Л.В.Губский, Р.Т.Таирова, И.В.Холоденко, А.А.Кониева, В.В.Бурунова «Хоуминг-эффект мезенхимальных стволовых клеток на модели острой фокальной ишемии мозга у крыс» // Сб. материалов Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение». Пятигорск, 2010, стр. 47.

11. В.И.Скворцова, Ю.А.Пирогов, Л.В.Губский, Р.Т.Таирова «Динамика тканевых изменений при острой фокальной ишемии мозга у крыс по данным магнитно-резонансной томографии» // Сб. материалов Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение». - Пятигорск, Ставропольский край. 2010, стр.49.

12. Гуляев М.В., Таирова Р.Т., Губский Л.В., Пирогов Ю.А., Скворцова В.И. «Разработка и применение протокола сканирования магнитно-резонансной томографии на экспериментальной модели фокальной ишемии головного мозга крыс» // Сб. материалов II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010»; Москва, 2010, стр. 72.

13. Yarygin K.N., Kholodenko I.V., Konieva А.А., Burunova V.V., Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Yarygin V.N., Skvortsova V.I "Mechanisms of positive effects of human MSC transplantation at experimental cérébral infarct in rats" // Журнал «Вестник РГМУ». Материалы V Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых. Специальный выпуск №2, 2010, стр. 444.

14. Yarygin K.N., Kholodenko I.V., Konieva A.A., Burunova V.V., Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Yarygin V.N., Skvortsova V.I "MRI and behavior effects of early intravenous delivery of mesenchymal stem cells at experimental cerebral infarct in rats." // Cerebrovascular Disease 23 (suppl. 2), 2007; p. 1-147.

15. Yarygin K.N., Kholodenko I.V., Konieva A.A., Burunova V.V., Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Yarygin V.N., Skvortsova V.I "The influence of intravenous introduction mesenchymal stem cells marked by ultra small particles of iron oxide at infarct in rats // "International Journal of Stroke. 2008. Vol. 3, suppl. 1. 6th World Stroke Congress, Vienna, Austria.

16. Yarygin K.N., Kholodenko I.V., Konieva A.A., Burunova V.V., Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Yarygin V.N., Skvortsova V.I "Mechanisms of beneficial effects of human placenta MSC transplantation in rats with experimental ischemic stroke" // Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe conference. Edinburgh, 2009, p.276.

17. Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Skvortsova V.I "Diffusion of water molecules and MR characteristics of brain tissue during its acute focal ischemia in rats" 14-th Congress of the European Federation of Neurological Societies? 2010. // European Journal of Neurology, 17 (Suppl. 3), 72-350.

Подписано в печать 14.12.10г. Тираж бОэкз. Типография «Гелиопринт» 119571, г.Москва, ул.Ак.Анохина, д.38.к.1

Ишемический инсульт - одна из важнейших причин заболеваемости, инвалидизации и смертности населения во всем мире. Смертность от ишемического инсульта в России одна из. самых высоких [2,5]. В течение первого месяца показатель летальности при ишемическом инсульте составляет 28-35%. В течение последующих 5 лет 45-60% больных, выживших в остром периоде, умирают от повторных инсультов. До 60% больных после ишемического инсульта становятся тяжелыми инвалидами, 30% имеют стойкие резидуальные изменения и только 10% возвращаются к полноценной жизни. Вследствие этого резко ухудшается качество жизни не только больного, но и проживающих с, ним родных и близких. Кроме того, государство несет экономические и финансовые потери из-за сокращения национального валового продукта, недополученного вследствие убыли заболевших инсультом в трудоспособном возрасте, а также затрат на медико-социальную поддержку инвалидов [6].

Актуальность поиска препаратов, обладающих нейропротективным действием в, условиях ишемии головного мозга, а также регенераторно-репаративных технологий не вызывает сомнения.

Однако на сегодняшний день нейропротекторные препараты, испытанные в клинических исследованиях, оказались недостаточно эффективными [136]. Поэтому разработка новых подходов к терапии и профилактике инсульта является важной задачей медицины.

Многочисленные экспериментальные работы посвященные изучению возможностей клеточной терапии* в лечении цереброваскулярных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как метода, стимулирующего структурно-функциональное восстановление ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость [20,53].

Цель исследования:

Провести сравнительный анализ двух моделей острой фокальной ишемии головного мозга у крыс и оценить возможность их использования для изучения терапевтической эффективности мезенхимальных стволовых клеток с использованием магнитно-резонансной томографии и гистохимических показателей.

Задачи исследования:

1. Сопоставить клинические, МРТ и гистохимические показатели двух экспериментальных моделей острой фокальной ишемии головного мозга у крыс: модель электрокоагуляции средней мозговой артерии и модель эндоваскулярной окклюзии СМА с контролируемой длительностью реперфузии.

2. Оптимизировать протокол исследования терапевтической эффективности МСК на экспериментальных моделях фокальной ишемии головного мозга.

3. Оптимизировать МРТ исследование и способы анализа получаемых изображений для оценки тканевых изменений при острой фокальной ишемии головного мозга.

4. Оценить эффекты МСК при разных способах их введения на выраженность неврологических проявлений и на динамику объема очага церебрального ишемического поражения с помощью прижизненной МРТ-морфометрии.

Научная новизна

Усовершенствована эндоваскулярная модель фокальной ишемии головного мозга для ее использования при изучении патогенеза ишемического инсульта, проведения доклинических исследований новых методов репер-фузионной, нейропротективной и регенераторно-репаративной терапии.

Проведен мультипараметрический анализ двух экспериментальных моделей фокальной ишемии головного мозга, впервые продемонстрированы характер и частота интра-/постоперационных осложнений. Отмечены положительные характеристики эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга.

Изучен процесс формирования.зоны инфаркта головного мозга у крыс по данным динамического МРТ исследования с использованием различных режимов сканирования:

Впервые показано положительное влияние терапии MGK, выделенных из плаценты человека, на восстановление нарушенных неврологических функций и поведения животных, достоверное уменьшение зоны ишемического поражения головного мозга, по данным нейровизуализации, при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс.

Впервые выявлена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием интацеребрального и системного введения МСК крысам с моделью фокальной ишемией головного мозга. Установлен факт дифференцировки МСК, выделенных из плаценты человека, в нейрональном направлении при экспериментальной ишемии головного мозга (визуализация скопления МСК экс-прессирующих человеческий нейрональный белок NeuN).

Проведена оценка эффективности методики мечения МСК магнитными флуоресцирующими микрочастицами для визуализации миграции данных клеток после их трансплантации животным. Установлено, что метод нагрузки МСК магнитными микросферами диаметром 0,96 мкм с флуоресцентной меткой Dragon Green пригоден для прижизненного исследования миграции стволовых клеток при проведении МРТ.

Показано, что использование МРТ режима Т2* ВИ на основе градиентного эха позволяет проследить миграцию трансплантированных МСК меченных магнитными микросферами с флуоресцентной меткой, что подтверждено иммуногистохимическим анализом.

Научно-практическая* значимость: Разработаны практические рекомендации по усовершенствованию экспериментальной эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга.

Уточнены характер и динамика развития тканевых изменений в зоне ишемического поражения головного мозга при двух экспериментальных моделях острой фокальной ишемии мозга у крыс, что позволяет рекомендовать модель с эндоваскулярной окклюзией СМА для дальнейшего использования при изучении патогенеза и доклинической оценке терапевтической эффективности новых способов лечения ишемического инсульта.

Обоснована необходимость, при проведении МРТ исследования в острейшем периоде фокальной ишемии головного мозга у крыс, измерения, вычисленного коэффициента диффузии и его сопоставления с другими показателями, влияющими на спин-спиновую (Т2) релаксацию.

Выработаны методические рекомендации по культивированию и нагрузке парамагнетиком МСК выделенных из плаценты человека в условиях in vitro.

Отработан протокол исследования эффективности и безопасности клеточных продуктов при экспериментальном ишемическом инсульте у крыс. Структурами объем диссертации: диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, благодарности. Диссертационная, работа изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и проиллюстрирована 40 рисунками. Список литературы включает 21 источник отечественной и 127 источников зарубежной литературы.

ВЫВОДЫ

1. Сопоставление двух экспериментальных моделей фокальной ишемии головного мозга выявило существенные недостатки модели, требующей краниотомии с последующей электрокоагуляцией СМА: небольшой объем зоны ишемического поражения мозга, преимущественно корковой локализации, наличие воспаления и отека мягких тканей головы, развитие церебрита, а в дальнейшем - формирование абсцесса головного мозга с выраженным перифокальным отеком. Показатель суммарной летальности животных с моделью электрокоагуляции СМА к 14-м суткам после операции существенно превышал данный показатель в группе животных с эндоваску-лярной моделью ишемии мозга.

2. Применение эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга с контролируемой длительностью окклюзии 1 час позволило воспроизвести сопоставимую по локализации и объему зону ишемического поражения (область базальных узлов, гиппокамп, теменно-височная область) с низкой частотой послеоперационных осложнений.

3. Для контроля за динамикой тканевых изменений в зоне ишемического поражения головного мозга необходимо использование мультипара-метрического протокола МРТ исследования, включающего: Т2 ВИ, ДВИ, Т2* ВИ, Т1 ВИ. Использование MP-ангиографии в острейшем периоде эндоваскулярной модели фокальной ишемии мозга позволяет контролировать степень окклюзии и определять последующий характер реканализации СМА.

4. Степень невосстановления кровотока по СМА у крыс после удаления силиконового монофиламента с использованием экспериментальной эндоваскулярной модели инсульта коррелирует с 24-часовой летальностью животных (R=0,47; р<0.03), по данным МР-ангиографии.

5. Результаты оценки неврологического дефицита и тестирования поведенческих реакций крыс в условиях экспериментальной фокальной ишемии мозга указывают, что как внутривенное, так и внутримозговое введение МСК сопровождается повышением способности к адаптации и меньшему неврологическому дефициту, уровень выживаемости животных с введением МСК был выше по сравнению с животными, не получавшими клеточную терапию. Применение МСК в условиях экспериментальной фокальной ишемии мозга связано с более быстрым уменьшением объема зоны ишемического поражения по сравнению с животными, не получавшими клеточную терапию.

6. Метод нагрузки МСК магнитными микросферами диаметром 0,96 мкм с флуоресцентной меткой Dragon Green пригоден для прижизненного исследования миграции клеток при проведении МРТ. Использование MP режима Т2* ВИ на основе градиентного эха позволяет проследить трекинг трансплантированных МСК, что подтверждается иммуногистохимическим анализом.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор работы выражает глубокую признательность и благодарность: научному руководителю, член. корр. РАМН, профессору кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, - Веронике Игоревне Скворцовой.

Автор особо признателен куратору работы, профессору кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, д.м.н. -Леониду Васильевичу Губскому за постоянное внимание и неоценимую помощь на всех этапах работы над диссертацией.

Автор глубоко признателен Константину Никитичу Ярыгину, руководителю лаборатории клеточной биологии НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, за предоставление клеточного материала для проведения данной работы.

Особенно хочется поблагодарить профессора, д.м.н. медицинского факультета Университета' Хайдельберга, Jlomapa Шилленга (Lothar Schilling) и Наталью Евгеньевну Лапину за помощь в освоении методики моделирования экспериментальной фокальной ишемии мозга у крыс на основе эндоваскулярной микрохирургии.

Выражаю большую благодарность Юрию Андреевичу Пирогову, директору учебно-научного межфакультетского и междисциплинарного центра магнитной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова, и его сотрудникам за предоставленную возможность проведения прижизненной морфометрии экспериментальным животным.

Автор признателен Оксане Викторовне Поваровой, старшему научI ному сотруднику кафедры фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова, за моделирование экспериментальной фокальной ишемии мозга при помощи электрокоагуляции средней мозговой артерии.

Практические рекомендации

Для прижизненной нейровизуализации (МРТ, режим Т2* ВИ) и постмортальной (флюорицентная микроскопия) оценки распределения и перемещения (хоуминга) трансплантированных МСК, рекомендовано осуществление нагрузки трансплантированных клеток магнитными микросферами ME02F с флуоресцентной меткой, диаметром 0,96 мкм.