Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Комплексный анализ нейропротекторной активности ноотропов и их комбинаций с мелаксеном при экспериментальной ишемии головного мозга

ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

На правах рукописи

04201456375

ГАНЦГОРН Елена Владимировна

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ НООТРОПОВ И ИХ КОМБИНАЦИЙ С МЕЛАКСЕНОМ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель доктор медицинских наук Д.П. Хлопонин

Ростов-на-Дону 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.............................................6

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................14

1.1. Патофизиологические основы современной фармакотерапии при нарушениях мозгового кровообращения по ишемическому типу...........................14

1.1.1. Место ноотропов в нейропротекции при острой ишемии головного мозга............................................................................................21

1.1.2. Роль антиоксидантной терапии при ишемическом инсульте. Гормон эпифиза мелатонин как потенциальный нейропротектор...................................27

1.2. Мониторинг показателей ЭЭГ как достоверных маркеров функционального состояния головного мозга в норме и при патологии.................................37

1.2.1. Показатели ЭЭГ при острой ишемии головного мозга...............41

1.2.2. Количественная фармако-ЭЭГ. Роль динамики показателей ЭЭГ в оценке эффективности ноотропов при терапии острой ишемии головного

мозга.............................................................................................49

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................67

2.1. Методика экспериментального исследования....................................67

2.1.1. Объект исследования........................................................67

2.1.2. Лекарственные препараты..................................................69

2.1.3. Характеристика групп животных.........................................70

2.1.4. Модель экспериментальной ишемии головного мозга у крыс.......72

2.2. Методика исследования ЭЭГ........................................................74

2.2.1. Методика изготовления электродов........................................74

2.2.2. Методика имплантации электродов в головной мозг крыс............74

2.2.3. Методика регистрации ЭЭГ животных....................................78

2.3. Биохимические методы исследования................. ............................79

2.3.1. Определение радикальных продуктов перекисного окисления липи-

дов в крови крыс при экспериментальной ишемии головного мозга методом НгОг-индуцированной люминол-зависимой хемолюминесценции...................79

2.3.2. Определение содержания диеновых конъюгатов в крови крыс при экспериментальной ишемии головного мозга..............................................80

2.3.3. Определение содержания малонового диальдегида в крови крыс при экспериментальной ишемии головного мозга................................................82

2.3.4. Определение содержания оснований Шиффа в крови крыс при экспериментальной ишемии головного мозга..............................................82

2.3.5. Определение активности супероксиддисмутазы и супероксидустра-няющей активности плазмы крови крыс при экспериментальной ишемии головного мозга..............................................................................83

2.3.6. Определение активности каталазы в эритроцитах и скорости утилизации Н2О2 плазмой крови крыс при ишемии головного мозга.....................85

2.3.7. Определение оксидазной активности церулоплазмина в крови крыс при ишемии головного мозга..............................................................85

2.4. Морфологические методы исследования..........................................86

2.4.1. Светооптический микроскопический анализ...............................86

2.4.2. Электронно-микроскопический анализ....................................87

2.5. Методы математической и статистической обработки полученных

данных...........................................................................................88

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ИССЛЕДУЕМЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ КОМБИНАЦИЙ ПО ПОКАЗАТЕЛЯМ ВЫЖИВАЕМОСТИ И ДИНАМИКИ ЭЭГ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА.....................................................................89

3.1. Анализ выживаемости крыс контрольных и опытных групп при экспериментальной ишемии головного мозга...................................................89

3.2. Количественный анализ ЭЭГ при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс....................................................................................93

3.2.1. Анализ динамики суммарных ОЗМ по частотным диапазонам......93

3.2.2. Анализ динамики показателей биспектрального индекса (BIS) и спектрального индекса отношения представительства спектральных мощностей

дельта- к тета-диапазону (ЮТ).............................................................. 114

Резюме.......................................................................................... 120

3.3. Анализ частотно-пространственной организации ЭЭГ при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс....................................................122

Резюме.............................................................................................145

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА ЭФФЕКТОВ ПРЕВЕНТИВНОГО ВВЕДЕНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ КОМБИНАЦИЙ НА СОДЕРЖАНИЕ МАРКЕРОВ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В КРОВИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА............147

4.1. Анализ показателей Н202-индуцированной люминол-зависимой хемолюми-несценции плазмы крови крыс при экспериментальной ишемии головного

мозга...........................................................................................148

Резюме.........................................................................................154

4.2. Анализ содержания продуктов перекисного окисления липидов в плазме

крови крыс при экспериментальной ишемии головного мозга...................155

Резюме...........................................................................................163

4.3. Анализ активности ферментов антиоксидантной системы в плазме крови

крыс при экспериментальной ишемии головного мозга........................... 164

Резюме........................................................................................172

ГЛАВА 5. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЯВЛЕНИЙ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС......................................173

5.1. Микро- и ультрамикроскопическое исследование тканевых элементов коры головного мозга и гиппокампа ложнооперированных крыс группы контроля I уровня..........................................................................................173

5.2. Светооптический и электронно-микроскопический анализ тканевых элеме-

нтов коры головного мозга и гиппокампа крыс с экспериментальной острой церебральной ишемией....................................................................176

5.3. Влияние изучаемых лекарственных препаратов на структуру и ультраструктуру коры головного мозга и гиппокампа крыс при моделировании экспериментальной церебральной ишемии........................................... 182

5.3.1. Морфологические аспекты влияния мелаксена на изучаемые отделы головного мозга в норме и при моделировании церебральной ишемии..........182

5.3.2. Сравнительный морфологический анализ эффектов комбинанации Пирацетам + Мелаксен на тканевые элементы фронтальной коры и гиппокампа крыс в условиях нормы и ишемии головного мозга................................ 188

5.3.3. Сравнительное светооптическое и электронно-микроскопическое исследование тканевых элементов фронтальной коры и гиппокампа крыс, получавших комбинацию Винпоцетин + Мелаксен, в условиях нормы и ишемии головного мозга..................................................................................193

5.4. Морфометрический анализ влияния изучаемых лекарственных препаратов на тканевые элементы фронтальной коры и гиппокампа крыс в норме и при

моделировании экспериментальной ишемии головного мозга.................. 198

Резюме............................................................................................200

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................202

ВЫВОДЫ....................................................................................221

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.............................222

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................223

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АО - антиоксидантный (ые)

АОС - антиоксидантная (ые) система (ы)

АФК - активная (ые) форма (ы) кислорода

ВАК - возбуждающая (ие) аминокислота (ы)

ВП - вызванный (ые) потенциал (ы)

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГМ - головной мозг

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

Г-Э - гематоксилин-эозин

ДК - диеновый (ые) конъюгат (ы)

ИИ - ишемический инсульт

игм - ишемия головного мозга

КФЭЭГ - количественная фармако-электроэнцефалография

ло — ложнооперированнный (ые)

лп - лекарственный (ые) препарат (ы)

лс - лекарственное (ые) средство (а)

МДА - малоновый (ые) диальдегид (ы)

МПА - межполушарная асимметрия

МРТ - магнитно-резонансная томография

мт - мелатонин

н/г - соотношение нейроцитов к глиоцитам

нмк - нарушение (я) мозгового кровообращения

нтс - нитротетразолиевый синий

озм - относительное (ые) значение (я) мощности

онмк - острое (ые) нарушение (я) мозгового кровообращения

ОСА - общая (ие) сонная (ые) артерия (и)

пол - перекисное окисление липидов

сод - супероксиддисмутаза

СМА - средняя мозговая артерия

СР - свободный (ые) радикал (ы)

СРП - свободно-радикальный процесс (ы)

СРО - свободно-радикальное окисление

ссвп - соматосенсорный (ые) вызванный (ые) потенциал (ы)

СУА - супероксидустраняющая активность

ТБК - тиобарбитуровая кислота

хл - хемолюминесценция

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цвз - цереброваскулярное (ые) заболевание (я)

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

цнс - центральная нервная система

ЦП - церулоплазмин

шо - Шиффовое (ые) основание (я)

эигм - экспериментальная ишемия головного мозга

ээг - электроэнцефалография

вк - биспектральный индекс

нь - гемоглобин

ют - спектральный индекс соотношения дельта- к тета-диапазону

н202 - перекись водорода

ЫМБА - Ы-метил-О-аспартат

02~ - супероксид-анион

рН - водородный показатель

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

На сегодняшний день из-за значительной распространенности и тяжелых последствий для состояния здоровья населения сосудистые заболевания головного мозга (ГМ) являются одной из важнейших медико-социальных проблем в большинстве экономически развитых и развивающихся стран мира. В частности, инсульт, по данным ВОЗ, ежегодно поражает 16 млн. и является причиной смерти у 5,7 млн. человек, что составляет около 10% в общей структуре смертности во всем мире. Кроме того, в последние годы отмечается тенденция к «омоложению» цереброваскулярных заболеваний (ЦВЗ). Так, инсульт у молодых людей составляет, по разным данным, от 2,5 до 13% всех случаев нарушений мозгового кровообращения (НМК) (Е.В. Силина с соавт., 2011; Н.В. Ларина с соавт., 2012; J.L. Meyers et al., 2011).

ЦВЗ - одна из основных причин заболеваемости, смертности и инвалидизации и в Российской Федерации. У нас в стране уровень заболеваемости и смертности от инсульта - один из самых высоких в мире, а частота ЦВЗ достигает 450 случаев на 100 тыс. населения. Показатели смертности достигли 280 человек на 100 тыс., что среднем в 2,5 - 3 раза превышает аналогичные в развитых странах мира. Смертность от НМК в России занимает 2-е место, уступая лишь кардиоваскулярной патологии и составляя в острой стадии инсульта около 35% случаев (О.В. Котова, 2012). Важно отметить, что именно основные последствия ишемии головного мозга (ИГМ) - инсульт и сосудистая деменция являются ведущей причиной первичной инвалидизации населения. По данным Национальной ассоциации по борьбе с инсультом, 31% пациентов, перенесших инсульт, для ухода за собой нуждаются в посторонней помощи, а 20% - не могут самостоятельно ходить. Таким образом, инсульт ложится тяжелым социально-экономическим бременем на общество в целом (С.С. Довгун, 2011; Н.В. Ларина с соавт., 2012; М.М. Одинак с соавт., 2012).

С целью оптимизации тактики лечения в каждом конкретном случае значимым представляется установление непосредственной причины и механизма развития ЦВЗ (В.И. Скворцова с соавт., 2006). На практике разграничение роли острых и хронических нарушений в патогенезе прогрессирующего сосудистого поражения ГМ не всегда возможно, а с точки зрения терапии - целесообразно. Острые и хронические формы НМК могут переходить одна в другую, являясь стадиями ЦВЗ. В частности, ишемический инсульт (ИИ), преобладающий в структуре ЦВЗ над геморрагическим, как правило, развивается на фоне уже существующих морфофункциональных, биохимических и иммунологических изменений, обусловленных предшествующим дисциркуляторным процессом (атеросклеротической или гипертонической ангиоэнцефалопатией), признаки которого нарастают в постинсультном периоде. Развитие ИИ, в свою очередь, запускает каскад реакций, частично сохраняющихся на неопределенный срок и способствующих прогрессированию симптоматики хронического НМК (В.В. Захаров с соавт., 2012; Е.И. Чуканова с соавт., 2012).

В связи с перечисленными особенностями распространенности и последствий острых НМК (ОНМК) поиск новых путей первичной и вторичной профилактики инсультов, оптимизация системы квалифицированной медицинской помощи больным с цереброваскулярной недостаточностью справедливо считаются одними из приоритетных задач современной медицины в общем и клинической фармакологии, в частности (З.А. Суслина с соавт., 2008; JI.B. Стаховская с совт., 2009; О.В. Котова, 2012; J.L. Meyers et al., 2011).

Важным аспектом в усовершенствовании тактики нейропротекции является стремление к ее соответствию современным принципам фармакоэкономики и доказательной медицины (Т.В. Островая с соавт., 2007; С.С. Довгун, 2011). Однако «в зеркале» системного подхода и концепций доказательной медицины необходимость применения нейроротекторов, назначаемых значительному числу пациентов с инсультами, в настоящее время оспаривается, что находит отражение в публикациях А.И. Корзун (2002), О.М.

Драпкиной с соавт. (2007). Несмотря на это, по всей видимости, не следует становиться «заложниками» доказательной медицины и не учитывать огромный массив данных, подтверждающих клинико-экспериментальную эффективность нейропротекторных ЛП с нейрометаболическим, мембрано-, вазотропным и прочими механизмами действия при ИГМ (Е.И. Гусев с соавт., 20026; С.А. Румянцева с соавт., 2010; В.И. Скворцова, 2011; М.М. Одинак с соавт., 2012).

Основываясь на многокомпонентности «ишемического каскада» (НМК, глутаматная «эксайтотоксичность», индукция различных форм клеточной гибели, активация свободнорадикальных процессов (СРП) и др.), при лечении ИГМ следует обратить особое внимание на целесообразность совместного применения лекарственных препаратов (ЛП), способных потенцировать действие друг друга. Исходя из этого, дальнейшие перспективы и задачи в развитии нейропротекции связаны с поиском новых и расширением возможностей существующих терапевтических стратегий (А.И. Исайкин, 2010; O.E. Ваизова с соавт., 2011; М.А. Луцкий с соавт., 2011; В.И. Шмырев с соавт., 2011; В.В. Захаров с соавт., 2012; L.B. Goldstein, 2007). Одним из путей реализации этой задачи, наряду с созданием новых препаратов, является разработка новых схем применения уже испытанных и хорошо зарекомендовавших себя в клинике ЛП различного принципа действия. Среди большого арсенала нейропротекторов в настоящее время значимое место занимают ноотропы («истинные» и ноотропные ЛП смешанного, в т.ч. антиоксидантного (АО), действия).

Особый интерес в лечении ЦВЗ, на наш взгляд, представляет гормон эпифиза мелатонин (МТ), обладающий, по мнению многих авторов, выраженным АО потенциалом (Э.Б. Арушанян Э.Б., 2007а, 2010; S.R. Pandi-Perumal et al., 2006; R.J. Reiter et al., 2007; P. Subramanian et al., 2007; D.-X. Tan et al., 2007; V. Srinivasan et al., 2008; V.H. Ozacmak et al., 2009; R.R. Watson, 2012). В нашей стране изучение и применение МТ стало реальным после того, как несколько лет назад на отечественный фармацевтический рынок поступил

содержащий его ЛП - «Мелаксен», производимый компанией «ЦтрИагт» (США).

На основании изложенного цель нашего исследования состояла в комплексной фармакологической оценке нейропротекторной активности ноотропов различного механизма действия, применяемых самостоятельно и в комбинации с мелаксеном при экспериментальной ИГМ (ЭИГМ) у крыс.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить нейропротекторные эффекты ноотропов пирацетама, винпоцетина и мелаксена, а также их комбинаций по показателю 24-часовой выживаемости крыс после ЭИГМ.

2. Провести сравнительный анализ биоэлектрической активности ГМ крыс в контроле и на фоне применения изучаемых ЛП; выявить информативные параметры спектров мощности электроэнцефалограмм (ЭЭГ) крыс до и в различные периоды времени после моделирования неполной глобальной ИГМ.

3. Оценить влияние превентивного курсового введения изучаемых ЛП и их комбинаций на биохимические показатели активности СРП как маркеров развития окислительного стресса в крови крыс через 24 ч после ЭИГМ.

4. Провести сравнительный морфологический анализ структуры коры ГМ и гиппокампа крыс, подвергшихся ЭИГМ, в контроле, а также на фоне введения мелаксена и его комбинаций с пирацетамом и винпоцетином.

Научная новизна исследования

Впервые изучено нейропротекторное действие МТ-содержащего ЛП — мелаксена самостоятельно и в комбинациях с ноотропами различного механизма действия на модели неполной ЭИГМ.

Проведен сравнительный анализ выживаемости крыс, получавших пирацетам, винпоцетин, мелаксен и их сочетания, при цер