Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эффективность лекарственных препаратов природного происхождения в экспериментальных моделях воспаления верхних дыхательных путей

На правах рукописи

ходько

Светлана Владимировна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ ВОСПАЛЕНИЯ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 НОЯ 2015

005564284

Санкт-Петербург - 2015

005564284

Работа выполнена в ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Шабанов Петр Дмитриевич

доктор медицинских наук Макарова Марина Николаевна

Официальные оппоненты:

Оковитый Сергей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» МЗ РФ, кафедра фармакологии и клинической фармакологии, заведующий

Денисенко Наталья Петровна, доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» МЗ РФ, кафедра патологической физиологии, профессор

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» МЗ РФ

Защита диссертации состоится «8» декабря 2015 г. в 15.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ» (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и на сайте Академии http://www.vmeda-mil.ni/

Автореферат разослан « 26 »

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Богомолов Борис Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

По статистическим данным, представленным в Государственном докладе «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2013 году», в Российской Федерации зарегистрировано более 33 млн. инфекционных заболеваний, при этом доля острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) и гриппа составляет более 90%.

ОРВИ представляет собой гетерогенную группу заболеваний, этиологическими агентами которых являются респираторные вирусы, преимущественно поражающие эпителий верхних дыхательных путей (Оковитый C.B., 2011). Наиболее распространенным заболеванием данной группы является острый риносинусит, его вклад в структуре ОРВИ составляет до 80% (Зайцев A.A., 2009).

Согласно Европейским рекомендациям по риносинуситу (Fokkens W. J., 2012 г.), острый риносинусит — острое воспаление слизистой оболочки полости носа и придаточных пазух (появившееся внезапно и продолжающееся не более 12 недель), характеризующееся заложенностью носа и/или наличием выделений из носа или по задней стенке глотки. Понятие «острый риносинусит» охватывает широкий спектр различных нозологических состояний, начиная от банальной ОРВИ до тяжелой бактериальной инфекции. Около 5% ОРВИ осложняются острым бактериальным риносинуситом (Wang D. Y, 2011), при котором в 30% случаев назначаются антибактериальные препараты (Gill J. M., 2006).

Острый тонзиллит наряду с острым риносинуситом также является широко распространенным заболеванием. Острый тонзиллит - острое воспаление преимущественно небных миндалин, сопровождающееся их отеком, гиперемией, наличием экссудата, а также повышением температуры тела и реакцией периферических лимфатических узлов (Полякова A.C., 2014). В данное время установлено, что причиной острого тонзиллита в большинстве случаев является вирусная, а не бактериальная инфекция (Hsieh Т.Н., 2011), при этом системная антибактериальная терапия в отношении вирусных тонзиллитов не эффективна (Полякова A.C., 2014).

На сегодняшний день наиболее широко применяемыми препаратами для лечения заболеваний верхних дыхательных путей являются антибактериальные препараты и нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Для эффективного лечения антибактериальными препаратами требуются дополнительные исследования, которые зачастую требуют времени, а использование НПВС влечет за собой развитие побочных эффектов. Поэтому сегодня остается актуальным поиск новых эффективных и безопасных лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей.

В литературе широко представлено описание экспериментальных моделей аллергического и бактериального ринита, но отсутствует описание экспериментальных моделей асептического риносинусита и острого

тонзиллита, что делает актуальным поиск новых экспериментальных методов для оценки эффективности лекарственных средств, используемых в терапии заболеваний верхних дыхательных путей (Руководство ..., 2012).

Степень разработанности темы исследования

Предлагаемые к изучению препараты фрешнос и KJIC-04 являются новыми лекарственными средствами. Растения, экстракты которых были использованы при создании препарата фрешнос, широко изучены и представлены в литературе. Однако сочетание экстрактов шалфея, травы тысячелистника обыкновенного, травы зверобоя продырявленного и побегов багульника болотного в виде назальных капель до настоящего времени не изучались. Эти растения широко известны своими противовоспалительными, антибактериальными, противовирусными и эндотелийпротекторными свойствами. Кроме того, в состав препарата входит мятное эфирное масло, которое широко применяется в препаратах, предназначенных для лечения воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей (Dicpinigaitis P.V., 2003, Pereira Е. J. et al., 2013) и тимол, который часто применяется в комплексных препаратах как антисептическое средство (Учайкин В.Ф. 2004, Руженцова Т.А., 2014). Таким образом, основными действующими веществами исследуемого препарата, являются летучие компоненты эфирных масел и флавоноиды, которые обеспечивают широкий спектр фармакологических эффектов данного препарата (Макарова М.Н., Макаров В.Г., 2010).

Новое лекарственное средство KJIC-04, представляет собой липидный комплекс, полученный по оригинальной технологии в соответствии с патентом РФ 2420213 (Шиков А. и др., 2012) из свежемороженой печени трески (Gadus morhua L.) в лекарственной форме спрея. Ранее были изучены инъекционная и наружная формы препарата на моделях воспаления: каррагениновый воздушный мешочек у крыс и контактный дерматит у мышей (Рыбакова A.B., 2012, Крышень K.JL, 2013). В этих работах было показано, что производные со-3-полиненасыщенных жирных кислот (резолвины, протектины), входящие в состав препарата, играют важнейшую роль в разрешении острого воспалительного процесса и действуют на несколько молекулярных мишеней, включая ЦОГ-2, 5-ЛОГ и Н1-гистаминовые рецепторы.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности новых препаратов природного происхождения фрешнос и КЛС-04 с использованием разработанных и валидированных моделей асептического острого риносинусита и острого шейного лимфаденита.

Задачи исследования:

1. Разработать и валидировать новую экспериментальную модель асептического острого шейного лимфаденита с учетом биохимических, гематологических, патофизиологических и патоморфологических показателей.

2. Разработать и валидировать новую экспериментальную модель асептического острого риносинусита на основании патофизиологических и патоморфологических параметров.

3. Оценить эффективность нового отечественного препарата в форме спрея KJIC-04, на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном.

4. Оценить эффективность нового отечественного препарата фрешнос в форме капель назальных на экспериментальной модели острого риносинусита в сравнении с виброцилом и аквамарисом.

Научная новизна

Впервые разработаны и валидированы экспериментальные методы оценки эффективности лекарственных средств на моделях асептического воспаления верхних дыхательных путей. Показано, что для индукции острого шейного лимфаденита в качестве провоспалительного агента наиболее целесообразно использование липополисахарида клеточной стенки бактерий E.coli (ЛПС) в дозе 0,1 мг/кг и каррагенина в дозе 0,8 мг/кг, а для развития острого риносинусита - формалина в дозе 12 мг/кг. Доказано, что при формировании острого шейного лимфаденита патогенетически значимым является определение концентрации провоспалительного цитокина в крови экспериментальных животных TNF-a - через 4 ч от момента индукции патологии и уровня С-реактивного белка (СРБ) через 72 ч от момента индукции патологии. В то же время в процессе формирования острого риносинусита патогенетически значимым является степень увеличения количества бокаловидных клеток и выраженность клеточной инфильтрации носовых ходов.

Впервые осуществлена проверка эффективности применения разных доз нового противовоспалительного препарата Ю1С-04 в форме спрея для купирования патологических процессов, сопровождающих развитие асептического лимфаденита, при этом доказаны преимущества применения КЛС-04 в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном. Также впервые в широком диапазоне доз проведена оценка противовоспалительной эффективности нового комплексного лекарственного препарата фрешнос на модели асептического острого риносинусита в сравнении с виброцилом и аквамарисом, что позволило установить диапазон эффективных доз препарата для последующей клинической апробации.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическое значение работы состоит в апробации и валидации новых экспериментальных моделей острого шейного лимфаденита и острого риносинусита у крыс. Результаты экспериментального исследования препарата КЛС-04 вошли в досье на препарат для получения разрешения на проведение клинических испытаний. Досье на препарат фрешнос сформировано, проведены клинические испытания на базе отоларингологического отделения Городской клинической больницы №1 им. Н.И.Пирогова г. Москвы под руководством члена-корреспондента РАН профессора В.Т. Пальчуна и на базе ФГБУ «Санкт-Петербургский НИИ ЛОР» Минздрава России под руководством члена-корреспондента РАН профессора Ю.К. Янова.

Материалы диссертации вошли в учебные программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии и

биологии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» МЗ РФ.

Методология и методы исследования

Эксперименты включали в себя разработку и валидацию новых фармакологических моделей острого шейного лимфаденита и острого риносинусита у крыс, а также оценку эффективности препаратов различных фармакологических групп в данных моделях. Методология исследования предполагала оценку показателей эффективности коррекции острого воспаления препаратами природного происхождения с помощью фармакологических, биохимических, патофизиологических и гистологических методов. Исследование выполнено с соблюдением всех правил доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана новая экспериментальная модель острого шейного лимфаденита, которая инициируется путем введения под капсулу в мезенхимапьную ткань шейных лимфатических узлов крыс растворов ЛПС в дозе 0,1 мг/кг или каррагенина в дозе 0,8 мг/кг. Экспериментальная модель острого шейного лимфаденита валидирована по показателям правильность (точность) и сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени года.

2. На разработанной и валидированной модели экспериментального острого шейного лимфаденита установлен противовоспалительный и противоотечный эффекты исследуемого противовоспалительного препарата КЛС-04.

3. Разработана новая экспериментальная модель острого риносинусита путем закапывания в носовую полость крыс раствора формалина в дозе 12 мг/кг. Экспериментальная модель острого риносинусита валидирована по показателю сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени года.

4. На разработанной и валидированной модели экспериментального острого риносинусита был установлен противовоспалительный эффект нового препарата растительного происхождения фрешнос, обусловленный входящими в состав препарата флавоноидами и терпенами.

Степень достоверности и апробация материалов исследования Степень достоверности

Степень достоверности определяется достаточным количеством экспериментальных данных, полученных с использованием 530 крыс, применением современных методов рандомизации, включением в исследование интактной, контрольной групп и групп сравнения, сроками наблюдения, достаточными для экстраполяции полученных данных в клинику, выбором адекватных методов физиологического, биохимического и патоморфологического исследования, использованием современных методов медицинской статистики.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на XIII Международном съезде «Phytopharm-2009» (Bonn, Germany, 07.2009), Межрегиональной конференции с международным участием, посвященной 100-летию кафедры биологической химии с курсом биоорганической химии (Санкт-Петербург, Россия, 2009), Научно-практической конференции СПбГМА им. И.И.Мечникова Актуальные проблемы медицины и биологии (Санкт-Петербург, Россия, 2010 г), Международном съезде «Phytopharm-2013» (Vienna, Austria, 2013), Международном съезде «Phytopharm-2014» (Санкт-Петербург, Россия, 2014 г).

По теме диссертации опубликованы 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 4 тезиса. Апробация диссертации прошла в ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Личный вклад автора в проведенное исследование и получение научных результатов

Исследования были выполнены на базе ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации». Автор лично осуществлял планирование экспериментов и их непосредственное выполнение (95%), статистическую обработку полученных результатов (100%), обсуждение (90%), написание статей, тезисов и докладов, диссертации и автореферата (95%).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 42 рисунками и 42 таблицами. Библиографический указатель содержит 172 наименования, в том числе 74 отечественных и 98 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы и описывает патофизиологию, экспериментальные модели и лечение заболеваний верхних дыхательных путей с помощью разных лекарственных средств, в том числе и природного происхождения (С.11-40).

В главе 2 отражены основные методы и экспериментальные модели исследования, а также методы статистической обработки результатов (С.40-79).

Глава 3 объединяет результаты собственных исследований автора (С.79-

138).

В главе 4 представлено обсуждение полученных результатов (С.138-152).

Далее приведено заключение (С.152-154), выводы (С.154-156), практические рекомендации (С. 156) и список литературы, использованной автором (С.157-170).

Материалы и методы исследования

Объект исследования. Объектом исследования явились новые комплексные фармакологические препараты под рабочими шифрами KJIC-04 и фрешнос. Препараты исследовали в новых лекарственных формах: KJIC-04 -спрей дозированный для местного применения и фрешнос - капли назальные.

Выбор животных. Опыты выполнены на 120 крысах-самцах и 410 крысах-самках линии Вистар массой 200±10 г. Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденными ГОСТ Р 53434—2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)» от 2 декабря 2009 г. и Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.321814 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. № 51. Выбор в качестве модельной системы данного вида и линий животных подтвержден опытом исследований в области экспериментальной фармакологии дыхательной системы.

Разработка и валидация фармакологической модели экспериментального острого шейного лимфаденита. С целью разработки фармакологической модели экспериментального острого шейного лимфаденита было протестировано 3 провоспалительных агента, вызывающих воспалительную реакцию в тканях: ЛПС 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин 0,8 мг/кг водный раствор и формалин 8 мг/кг водный раствор. Вещества вводили непосредственно в ткань лимфатического узла Inn. Cervicales superficiales. В исследовании использовали 80 крыс-самок и 80 крыс-самцов линии Вистар, в каждой экспериментальной группе по 20 животных каждого пола.

Разработанную экспериментальную модель валидировали по показателям правильность (точность) и сходимость. Было проведено 3 серии экспериментов на 60 крысах-самках линии Вистар в различные сезоны (весна, лето, осень). Формировали по 10 животных в каждой экспериментальной группе.

Оценка эффективности препарата КЛС-04 на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита. Для оценки эффективности КЛС-04 проводили оценку содержания С-реактивного белка, TNF-a и INF-y, биометрическую оценку разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов, патоморфологическую оценку ткани лимфатических узлов. Опыты выполнены на 100 крысах-самках линии Вистар. Формировали 10 экспериментальных групп по 10 животных в каждой. В качестве препаратов сравнения были выбраны зарегистрированные на территории РФ препараты тантум верде 1,2 мг/кг, диклофенак 11 мг/кг и дексаметазон 5 мг/кг, обладающие выраженным противовоспалительным эффектом.

Для установления эффективной дозы препарат КЛС-04 применяли в диапазоне доз: 0,4; 0,8; 1,6, 3,2 и 6,4 мг/кг. Исследуемый препарат и препараты сравнения вводили животным 1 раз в сутки на протяжении 10-ти дней до индукции лимфаденита и 3 дня после. Введение препаратов осуществляли с помощью специального аэрозоллера для эндотрахеального введения.

Интактным и контрольным (с патологией без лечения) животным вводили физиологический раствор в объеме 0,2 мл.

Разработка и валидация экспериментальной модели острого риносинусита. С целью разработки фармакологической модели острого риносинусита было протестировано 3 провоспалительных агента, вызывающих воспалительную реакцию в тканях: ЛПС 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин 1,6 мг/кг водный раствор и формалин 12 мг/кг водный раствор. В исследовании использовали 80 крыс Вистар обоего пола, в каждой экспериментальной группе по 10 животных.

Провоспалительные агенты вводили непосредственно в носовые ходы крыс путем дозированного закапывания с использованием механических дозаторов с пластиковыми наконечниками. Через 7 дней животных эвтаназировали.

Для оценки состоятельности экспериментальной модели проводили морфологическое исследование слизистой оболочки и подслизистого слоя обоих носовых ходов (дыхательная и обонятельная область) экспериментальных животных.

Разработанную экспериментальную модель валидировали по показателю сходимость. Было проведено 3 серии экспериментов на 60 крысах-самках линии Вистар в различные сезоны (весна, лето, осень). Формировали по 10 животных в каждой экспериментальной группе.

Оценка эффективности препарата фрешнос на экспериментальной модели острого риносинусита. Индукцию острого риносинусита проводили путем дозированного интраназального введения 20 мкл раствора формалина в каждый носовой ход в дозе 12 мг/кг. Препаратами сравнения были выбраны аквамарис и виброцил, как широко применяемые средства. Исследуемый препарат и препараты сравнения вводили животным 1 раз в сутки на протяжении 7-и дней с момента индукции острого риносинусита: аквамарис и виброцил в дозе 50 мкл/100 г массы тела, фрешнос - 10, 20 и 30 мкл/100 г массы тела в каждый носовой ход. Интактным и контрольным (с патологией без лечения) животным вводили физиологический раствор. Введение препаратов проводили путем дозированного закапывания с использованием механических дозаторов с пластиковыми наконечниками. В исследовании использовали 70 крыс-самок линии Вистар, в каждой экспериментальной группе по 10 животных.

Статистическая обработка результатов. Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на соответствие закону нормального распределения. Проверка на соответствие закону нормального распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего (М±т), которые вместе со значением п (число экспериментальных животных) представлены в итоговых таблицах. Для оценки данных с признаками нормального распределения был использован однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), с последующим межгрупповым сравнением (post hoc analysis) с использованием теста

Стьюдента. Различия были определены при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполнялся с помощью лицензионного программного обеспечения Statistica 6.0. (StatSoft, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты разработки новой модели экспериментального острого шейного лимфаденита

Оценка уровня С-реактивного белка (СРБ) и уровня лейкоцитов в крови экспериментальных животных проводилась через 24, 48, 72, 96 и 120 ч от момента индукции патологии. Наиболее выраженные изменения были установлены через 72 ч. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты оценки уровня СРБ и лейкоцитов через 72 ч от момента индукции патологии в крови крыс при разработке экспериментальной модели острого шейного лимфаденита (п=20)

Группа Пол СРБ, г/л Лейкоциты, 109/л

Группа 1 Интактные с? 28,5±0,6 6,7±0,1

(ложнооперированные) ¥ 27,9±1,0 7,6±0,6

Группа 2 Индукция патологии с? 34,9±1,7 16,5±0,3*

ЛПС 0,1 мг/кг 48,2±3,3*. 20,5±0,6*

Группа 3 Индукция патологии S 30,8±1,2 16,9±0,1*

каррагенин 0,8 мг/кг 2 43,0±2,5*. 18,1±0,4*

Группа 4 Индукция патологии с? 31,1±1,2 10,4±0,4*

формалин 8 мг/кг 9 28,8±1,0 10,0±0,7*

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой, • р<0,05 в сравнении с самцами идентичной группы по критерию Стьюдента.

При оценке в крови экспериментальных животных важнейших клинических показателей острого воспаления — уровня СРБ и лейкоцитов было показано, что наиболее выраженное повышение данных показателей наблюдалось при введении экспериментальным животным в качестве провоспалительных агентов - раствора ЛПС в дозе 0,1 мг/кг и раствора каррагенина в дозе 0,8 мг/кг.

Крайне важным является наличие статистически значимых отличий уровня С-реактивного белка у самцов и самок, получивших в качестве провоспалительных агентов растворы ЛПС и каррагенина. У самок воспалительный ответ статистически значимо превышал таковой у самцов (рис. !)•

Таким образом, наиболее выраженные изменения уровня СРБ были отмечены у самок крыс через 72 ч после введения растворов ЛПС и каррагенина. Повышение данного показателя составило 73% и 54 % соответственно, по сравнению с интактными животными.

Рис. 1. Сравнительная оценка уровня С-реактивного белка в динамике в крови экспериментальных животных

Для характеристики раннего этапа индукции экспериментального острого воспаления была проведена оценка основных провоспалительных цитокинов Т№-а и ЮТ-у в крови экспериментальных животных через 4 и 16 ч, соответственно. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты оценки уровня ТЫР-а и ЮТ-у в крови крыс при разработке экспериментальной модели острого шейного лимфаденита (п=20)

Группа Пол ТЫР-а, пг/мл ЮТ-у, нг/мл

через 4 ч через 16 ч

Группа 1 Интактные с? 18±2,1 0,0±0,0

(ложнооперированные) ? 20±1,8 0,0±0,0

Группа 2 Индукция патологии с? 255 ± 11,2* 56,7±6,3*

ЛПС 0,1 мг/кг 9 27 8± 9,5* 61,5±7,4*

Группа 3 Индукция патологии с? 119±6,0* 25,6±4,2*

каррагенин 0,8 мг/кг 122±4,5* 32,7±3,4*

Группа 4 Индукция патологии с? 41 ±2,7 3,6±0,3*

формалин 8 мг/кг ? 36±1,3 2,0±0,Г

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой по критерию Стьюдента.

Представленные в таблице 2 данные демонстрируют статистически значимое повышение уровня основного провоспалительного цитокина ТЫР-а в сыворотке крови экспериментальных животных на фоне введения в качестве провоспалительных агентов ЛПС и каррагенина. В ответ на введение внутрь лимфатического узла раствора каррагенина увеличение данного показателя составило 6,6 раза для самцов и 6,8 раза для самок. На фоне введения раствора ЛПС увеличение составило 14 раз для самцов и 15 раз для самок. На фоне введения в лимфатический узел формалина выраженного воспалительного ответа отмечено не было. Таким образом, максимально выраженная картина

воспаления при оценке ТТЧР-а наблюдалась на фоне введения в лимфатические узлы раствора ЛПС.

№N-7 также является важнейшим провоспалительным медиатором, продуцируется, в основном, Т-лимфоцитами и выполняет ряд важных функций в регулировании патологического процесса воспаления, в том числе стимулирует эффекторные функции макрофагов. В группе животных, которым вводили ЛПС, уровень этого медиатора, подобно ТОТ-а, вырос наиболее значимо.

После эвтаназии половины каждой экспериментальной группы через 72 ч и оставшейся половины через 120 ч у животных были выделены поврежденный и интактный лимфатические узлы с целью их взвешивания для оценки степени выраженности отека пораженных лимфатических узлов.

Полученные результаты оценки разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов экспериментальных животных в мг (п=10)

72 ч после 120 ч после

Группа Пол индукции индукции

воспаления воспаления

Группа 1 Интактные (ложнооперированные) с? 11,3±1,1 9,9±1,1 10,8±1,0 10,9±0,8

?

Группа 2 Индукция патологии ЛПС 0,1 мг/кг <? 39,7 ± 2,0* 42,4 ± 3,9* 28,5 ± 1,9* 32,1 ±2,8*

?

Группа 3 Индукция патологии каррагенин 0,8 мг/кг с? 21,1±1,2* 23,2±1,4* 18,2±0,9* 20,2±1,1*

?

Группа 4 Индукция патологии формалин 8 мг/кг с? 15,3±1,7 14,2±1,8 13,4±1,3 11,6±2,0

¥

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой по критерию Стьюдента.

Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют о том, что через 72 ч от момента введения в ткань лимфатических узлов растворов ЛПС и каррагенина наблюдался ярко выраженный отек пораженного лимфатического узла, так как разница веса пораженного и интактного лимфатических узлов статистически значимо превышала данный показатель интакгных животных.

Для дополнительной оценки отека лимфатические узлы от 5 животных из каждой группы высушивали лиофильно при температуре -56°С. Процент потери массы пораженного лимфатического узла при высушивании дополнительно характеризует вероятность воспалительного отека лимфатической ткани. Полученные данные представлены на рис. 2.

Представленные данные свидетельствуют о развитии значительного отека пораженного лимфатического узла у животных, которым в ткань

лимфатического узла вводили ЛПС и каррагенин. Наиболее выраженные изменения были выявлены у животных, которым вводили ЛПС. Через 72 ч от момента индукции патологии показатель потери массы пораженного лимфатического узла после лиофильного высушивания был в 2,9 раза выше данного показателя интактной группы.

Рис. 2. Процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании через 72 ч (А) и 120 ч (Б)

Через 120 ч было показано схожее распределение данного показателя для всех экспериментальных групп, при этом аналогично показателю разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов наблюдалась тенденция к снижению выраженности отека лимфатических узлов.

Учитывая приведенные выше данные о наиболее выраженном воспалительном ответе у животных через 72 ч от момента введения провоспалительных агентов, для оценки гистологических изменений в ткани лимфатического узла при введении провоспалительных агентов были использованы лимфатические узлы от 5-ти животных из каждой экспериментальной группы, умерщвленных через 72 ч от момента индукции воспаления.

Гистологически было подтверждено, что при экспериментальном моделировании острого шейного лимфаденита в группах крыс, получавших разные провоспалительные агенты, в регионарных лимфатических узлах развивалась картина острого неспецифического лимфаденита, которая характеризовалась увеличением площади герминативных центров лимфоидных фолликулов в пораженных лимфатических узлах и увеличением выраженности гистиоцитоза синусов. Полученные данные представлены в таблице 4.

В ходе разработки экспериментальной модели острого шейного лимфаденита было установлено, что наиболее выраженный воспалительный ответ по гистологическим показателям был показан при введении в ткань лимфатического узла самок крыс растворов ЛПС 0,1 мг/кг и каррагенина 0,8 мг/кг, площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов возросла по сравнению с интактными животными в 2 раза, а гистиоцитоз синусов превышал данный показатель интактных животных в 16 и 10 раз, соответственно.

В ходе разработки новой экспериментальной модели острого шейного лимфаденита была выбрана наиболее подходящая тест-ситема - крысы-самки линии Вистар. Были определены оптимальные провоспалительные агенты -

растворы ЛПС 0,1 мг/кг и каррагенина 0,8 мг/кг. Сформирован перечень наиболее информативных показателей, характеризующих данную экспериментальную патологию с точки зрения дальнейшей оценки эффективности лекарственных средств:

1. Концентрация С-реактивного белка в плазме крови через 72 ч.

2. Уровень лейкоцитов в крови через 72 ч.

3. Уровень медиаторов воспаления в сыворотке крови: ЮТ-а через 4 ч и ЮТ-у через 16 ч.

4. Оценка степени отека пораженных лимфатических узлов через 72 ч (разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании).

5. Гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и степени гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов.

Таблица 4

Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов и гистиоцитоз синусов в пораженных лимфатических узлах шеи крыс через 72 ч от момента _индукции патологии (п=5)__

Группа Пол Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов в пораженных лимфатических узлов, мм2 хЮ"3 Гистиоцитоз синусов пораженных лимфатических узлов, баллы

Группа 1 Интакгные (ложнооперированные) с? 47 ±2 41 ±4 0,2 ± 0,2 0,2 ± 0,2

2

Группа 2 Индукция патологии ЛПС 0,1 мг/кг 6 89 ± 10* 85 ±5* 3,2 ± 0,4* 3,2 ± 0,5*

9

Группа 3 Индукция патологии каррагенин 0,8 мг/кг с? 79 ±7* 69 ±5* 2,4 ± 0,5* 2,0 ± 0,4*

2

Группа 4 Индукция патологии формалин 8 мг/кг в 73 ±9 68 ±6* 1,8 ±0,4* 1,8 ±0,4*

9

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой по критерию Стьюдента.

Разработанная экспериментальная модель была валидирована по показателям правильность (точность) и сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени года по основным показателям экспериментальной патологии: уровень СРБ и лейкоцитов через 72 ч от момента индукции патологии, уровень ПМР-а через 4 ч и ЮТ-у через 16 ч, степень отека пораженных лимфатических узлов через 72 ч (разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент потери массы пораженного

лимфатического узла при лиофильном высушивании), гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и степень гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов. По результатам статистической обработки показателей экспериментальной патологии методом АИОУА было показано, что по всем исследованным показателям дисперсионный анализ не выявил статистически значимых отличий между серями экспериментов. Таким образом, можно утверждать, что при соблюдении стандартных условий содержания лабораторных животных фактор времени года не влияет на результаты исследования.

Результаты изучения специфической фармакологической активности КЛС-04 на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита

Для оценки системного влияния препаратов на организм в крови экспериментальных животных оценивали уровень ТОТ-а через 4 ч и ЮТ-у через 16 ч от момента индукции патологии, уровень СРБ и лейкоцитов оценивали через 72 от момента введения провоспалительных агентов. Полученные данные представлены в таблице 5.

Таблица 5

Оценка ТОТ-а, ЮТ-у, СРБ и лейкоцитов в крови экспериментальных животных

Группа ТОТ-а, пг/мл ЮТ-у, нг/мл СРБ, мг/л Ьеу, х109/л

Интактная, п=10 22±1,9 0,0 ± 0,0 18,3±2,6 6,6±0,4

Контрольная, п=10 242± 9,5* 65 ±5* 32,9±3,2* 18,2±0,4*

Тантум верде 1,2 мг/кг, п=10 105±12,0*.. 59±3* 21,4±0,4 9,2±0,6*..

Диклофенак 11 мг/кг, п=7 45±3,2.. о,о±о,о.. 23,0±2,4 12,2 ±0,6*..

Дексаметазон 5 мг/кг, п=4 24±2,4.. о,о±о,о.. 22,6±1,6 8,3 ± 1,2..

КЛС-04 0,4 мг/кг, п=10 210±9%. 68±5* 27,6±1,4 13,6±0,5*..

КЛС-04 0,8 мг/кг, п=10 150±15*.. 51±4* 25,0±5,2 11,2±0,5*..

КЛС-04 1,6 мг/кг, п=10 123±16*.. 39±5%. 19,1±2,4.. 10,5±0,4*..

КЛС-04 3,2 мг/кг, п=10 85±6*.. 33±2*.. 16,8±1,4.. 8,9±0,4..

КЛС-04 6,4 мг/кг, п=10 78±8*.. 32±3*.. 15,2±2,0.. 7,9±0,6..

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой, ** р<0,05 - в сравнении с контрольной группой по критерию Стьюдента.

Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что по всем исследованным показателям в экспериментальных животных наиболее выраженная картина воспаления была отмечена в контрольной группе.

Максимально выраженное противовоспалительное действие по показателям уровня СРБ и лейкоцитов было показано для исследуемого препарата КЛС-04 в максимальных дозах 3,2 и 6,4 мг/кг.

В отношении провоспалительных цитокинов наиболее выраженной активностью обладали препараты сравнения диклофенак и дексаметазон, однако абсолютное подавление уровня ЮТ-а и ЮТ-у свидетельствует о выраженном иммуносупрессивном эффекте данных препаратов. В отличие от диклофенака и дексаметазона исследуемый КЛС-04 снижал уровень ТОТ-а и ЮТ-у в среднем в два раза по сравнению с контрольными животными.

Для исследуемого препарата КЛС-04 была показана выраженная дозозависисмость по всем исследованным показателям, при этом максимально выраженный терапевтический эффект был показан в дозе 3,2 мг/кг.

Была проведена сравнительная гистологическая и морфометрическая оценка влияния на стимуляцию макрофагов, гистиоцитов и В-лимфоцитов пораженных лимфатических узлов шеи у крыс исследуемого препарата КЛС-04 в различных дозах в сравнении с препаратами тантум верде, диклофенак и дексаметазон. Полученные данные представлены в таблице 6.

Таблица 6

Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов и гистиоцитоз синусов в пораженных лимфатических узлах шеи крыс различных групп

Группа Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов в пораженных лимфатических узлов, мм2 хЮ"3 Гистиоцитоз синусов пораженых лимфатических узлов, баллы

Интактная, п=5 45 ±3 0,2±0,2

Контрольная, п=5 91 ±7* 3,2±0,4*

Тантум верде 1,2 мг/кг, п=5 63 ±6 2,0±0,3

Диклофенак 11 мг/кг, п=3 79 ±7* 2,7 ±0,3*

Дексаметазон 5 мг/кг, п=2 12 ±3.. 2,5 ± 0,5

КЛС-04 0,4 мг/кг, п=5 53 ± 9.. 2,2±0,6

КЛС-04 0,8 мг/кг, п=5 48 ± 8.. 2,4±0,5*

КЛС-04 1,6 мг/кг, п=5 69 ±9 2,2±0,6

КЛС-04 3,2 мг/кг, п=5 50 ±6.. 1,8±0,6

КЛС-04 6,4 мг/кг, п=5 47 ± 8.. 2,3±0,8

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой, ** р<0,05 в сравнении с контрольной группой по критерию Стьюдента.

Гистологически было установлено, что при лечении экспериментального острого шейного лимфаденита препаратом КЛС-04 в регионарных

лимфатических узлах наблюдалось предупреждение патологического увеличения герминативных центров, что не было отмечено при лечении диклофенаком. Напротив, при использовании в качестве терапии дексаметазона была показана выраженная инволюция герминативных центров.

Таким образом, в ходе эксперимента было показано, что наиболее выраженным противовоспалительным действием обладает KJIC-04 в дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, не оказывая при этом иммуносупрессивного действия. Такие данные позволяют рекомендовать новый препарат KJIC-04 для применения в терапии заболеваний верхних дыхательных путей в качестве противовоспалительного средства.

Результаты разработки новой модели экспериментального острого

риносинусита

Для оценки экспериментальной патологии были использованы гистологические методы: определение количества бокаловидных клеток, степени выраженности инфильтрации мононуклеарами (лимфоциты, плазматические клетки и гистиоциты) и лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя носовых ходов.

Форма и число бокаловидных клеток зависит от функционального состояния слизистой оболочки. При катаральном воспалении слизистой носа увеличивается число бокаловидных клеток, вследствие чего изменяется их нормальное соотношение с мерцательными клетками эпителия. Это приводит к нарушению работы мукоцилиарной транспортной системы, обеспечивающей перемещение продуктов секреции слизистой оболочки и оседающих на ее поверхности микроорганизмов и различных чужеродных частиц в сторону носоглотки, т.е. ее очищение — клиренс. Данные представлены в таблице 7.

Представленные в таблице 7 данные свидетельствуют о наличии воспалительного процесса у животных всех экспериментальных групп, так как у всех животных, которым вводили провоспалительные агенты, эпителий обонятельной части носовых ходов был гиперплазирован за счет увеличения рядности клеток, железы подслизистого слоя были расширены, количество бокаловидных клеток, содержащих кислую слизь, было статистически значимо увеличено по сравнению с группой интактных животных. При введении экспериментальным животным ЛПС и каррагенина количество бокаловидных клеток увеличилось вдвое по сравнению с интактными животными, а при введении формалина увеличение данного показателя произошло в 2,9 раза для самцов и в 3,3 раза для самок. Схожие данные были получены Нуо Won Jung et al. на экспериментальной модели аллергического риносинусита (Нуо Won Jung et al., 2013).

Во всех экспериментальных группах, которым были введены провоспалительные агенты, слизистая оболочка и подслизистый слой имели выраженную инфильтрацию клеточными элементами. Наиболее выраженная инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами была отмечена у самок, которым в качестве провоспалительного агента был введен формалин. Аналогичные данные были показаны Masashi Yamasaki et al. в 2002

году на экспериментальной модели аллергического риносинусита. Показатель инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя мононуклеарами оказался не информативен при данной экспериментальной модели.

Таблица 7

Количество бокаловидных клеток, инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя мононуклеарами и лейкоцитами (п=10)

Количество Слизистая оболочка Подслизистый слой

Группа Пол бокаловидных Моно- Лейко- Моно- Лейко-

клеток/мм2 нуклеары циты нуклеары циты

Группа 1 6 8,3±0,6 0,1±0,1 0,0±0,0 0,1±0,1 0,0±0,0

Интактные ? 7,3±0,2 0,2±0,1 0,0±0,0 0,2±0,1 0,0±0,0

Группа 2 в 13,8±0,9* 0,1 ±0,1 2,1 ±0,3* 0,2±0,1 1,8±0,4*

Индукция ? 14,6±0,7* 0,1 ±0,1 1,9±0,3* 0,1±0,1 1,7±0,3*

патологии

ЛПС 0,1

мг/кг

Группа 3 с? 14,9±0,5* 0,1 ±0,1 1,6±0,4* 0,1±0,1 1,7±0,3*

Индукция $ 14,0±0,7* 0,2±0,1 1,6±0,4* 0,2±0,1 2,(Ш),3*

патологии

каррагенин 1,6 мг/кг

Группа 4 с? 23,9±1,0* 0,1±0,1 2,1 ±0,2* 0,1±0,1 1,8±0,3*

Индукция $ 24,2±0,7* 0,1±0,1 1,9±0,3* 0,0±0,0 2,1 ±0,4*

патологии

формалин 12 мг/кг

Примечание: Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой по критерию Стьюдента.

В ходе разработки экспериментальной модели острого риносинусита было показано, что наиболее выраженный воспалительный ответ был показан при введении в носовые ходы самок крыс водного раствора формалина 12 мг/кг.

Был выделен перечень показателей, характеризующих данную экспериментальную патологию:

1. Макроскопические признаки воспаления носовых ходов.

2. Количество бокаловидных клеток.

3. Инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что была получена адекватная экспериментальная модель острого риносинусита у крыс линии Вистар, путем развития асептического воспаления носовых ходов. Сформирован перечень показателей для оценки терапевтической эффективности лекарственных средств на данной модели.

Показано, что под действием формалина у экспериментальных животных развивается острый риносинусит по типу: катарального, серозного и серозно-гнойного воспаления. Такие данные свидетельствуют о возможности изучения эффективности препаратов на полученной модели острого риносинусита. Благодаря своей дешевизне и относительной простоте исполнения модель может быть применима для исследований препаратов, нацеленных на лечение острых риносинуситов, а также для оценки противовоспалительного, сосудосуживающего и других эффектов препаратов, применяемых в ЛОР-практике.

Разработанная экспериментальная модель была валидирована по показателю сходимость в зависимости от времени года. Были валидированы основные показатели экспериментальной патологии: количество бокаловидных клеток и выраженность инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами. По результатам статистической обработки показателей экспериментальной патологии методом АЫОУА было показано, что по всем исследованным показателям дисперсионный анализ не выявил статистически значимых отличий между серями экспериментов. Таким образом, можно утверждать, что при соблюдении стандартных условий содержания лабораторных животных фактор времени года не влияет на результаты исследования и новая экспериментальная модель острого риносинусита воспроизводима.

Результаты изучения специфической фармакологической активности препарата фрешнос на модели экспериментального острого риносинусита

На восьмые сутки после введения в носовые ходы формалина 12 мг/кг у экспериментальных животных контрольной группы были отмечены выраженные клинические проявления острого риносинусита: затрудненное дыхание, чихание, покраснение слизистой оболочки и кожи вокруг наружных носовых ходов, мокнутие шерсти вокруг носовых ходов, выделения из носа серозного или гнойного характера.

Для оценки специфической фармакологической активности препарата фрешнос в дозах 10, 20 и 30 мкл/100 г массы тела в сравнении с препаратами аквамарис (50 мкл/100 г массы тела) и виброцил (50 мкл/100 г массы тела) была проведена макроскопическая оценка изменений слизистой оболочки носовых ходов и гистологическая и гистохимическая оценка влияния препаратов на количество бокаловидных клеток, а также оценка степени выраженности инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя мононуклеарами и лейкоцитами.

Носовые ходы интактных животных не имели макроскопических признаков воспаления, были свободны от содержимого, слизистая бледно-розовая, блестящая, гладкая. В контрольной группе у 20% животных из группы наблюдался слизистый катар, а у 80% животных - более тяжелая форма воспаления, слизисто-гнойный катар носовых ходов, что характеризует картину острого гнойного ринита (таблица 8).

Таблица 8

Сравнительная макроскопическая характеристика изменений слизистой носовых ходов у крыс различных групп в % (п=10)

Группа Нет изменений Слизистый катар Слизисто-гнойный катар

Интактные 100 0 0

Контроль 0 20 80

Аквамарис 50 мкл/100 г массы тела 0 40 60

Виброцил 50 мкл/100 г массы тела 0 20 80

Фрешнос 10 мкл/100 г массы тела 20 40 40

Фрешнос 20 мкл/100 г массы тела 30 40 30

Фрешнос 30 мкл/100 г массы тела 80 20 0

Для исследуемого препарата фрешнос был показан наиболее выраженный из всех экспериментальных групп дозозависимый противовоспалительный эффект в отношении экспериментальной патологии. Максимальный эффект был отмечен при использовании препарата фрешнос в дозе 30 мкл/100 г массы тела.

При микроскопическом исследовании слизистой оболочки носовых ходов у крыс различных групп было показано, что носовые ходы интактных животных не имели микроскопических признаков воспаления. Основные процессы, характеризующие поражение носовых ходов (полнокровие слизистой оболочки, очаговый некроз эпителия), были четко представлены у крыс контрольной группы.

Гистологическая картина слизистой носовых ходов у животных, получавших исследуемый препарат фрешнос, не отличалась от таковой у интактных животных. При этом применение препарата в дозе 30 мкл/100 г массы тела оказало наиболее выраженное действие, ввиду уменьшения инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки, что говорит о завершении воспалительного процесса.

При микроскопической оценке экссудативных форм катарального воспаления, которые развивались у животных при остром риносинусите, оценивалось количество бокаловидных клеток, содержавших кислую слизь, а также инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами (таблица 9).

Таблица 9

Количество бокаловидных клеток на 1 мм2 слизистой оболочки носовой перегородки, инфильтрация лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого

слоя (п=10)

Группа Количество бокаловидных клеток слизистой оболочки носа на 1 мм2 Лейкоциты слизистой оболочки, количество клеток на 1 мм2 Лейкоциты подслизистого слоя, количество клеток на 1 мм2

Интактная 7,5±0,5 0,1±0,1 0,0±0,0

Контрольная 21,3±0,6* 2,0±0,4* 1,8±0,4*

Аквамарис 50 мкл/100 г массы тела 13,8±0,7*.. 0,5±0,2.. 0,5±0,2..

Виброцил 50 мкл/100 г массы тела 14,5±0,6*.. 0,5±0,2.. 0,4±0,2..

Фрешнос 10 мкл/100 г массы тела 10,4±0,8%. 0,4±0,2.. 0,6±0,3..

Фрешнос 20 мкл/100 г массы тела 7,9±3,8.. 0,6±0,2.. 0,7±0,3..

Фрешнос 30 мкл/100 г массы тела 7,5±2,6.. 0,7±0,3.. 0,6±0,2..

Примечание: * р<0,05 в сравнении с интактной группой, ** р<0,05 в сравнении с контрольной группой по критерию Стьюдента.

Представленные в таблице 9 данные свидетельствуют о том, что на фоне применения препаратов сравнения аквамарис и виброцил терапевтического эффекта отмечено не было. Количество бокаловидных клеток осталось на уровне контрольных животных. При использовании в качестве терапии исследуемого препарата фрешнос был показан выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект в отношении количества бокаловидных клеток. Наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдался при использовании исследуемого препарата в дозах 20 и 30 мкл/100 г массы тела, количество бокаловидных клеток было идентично уровню интактных животных.

Инфильтрация клеточными элементами при воспалении характеризует неспецифические факторы защиты слизистых. На фоне применения всех исследуемых препаратов во всех дозах было показано выраженное снижение инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами. Во всех группах данный показатель был одинаково статистически значимо снижен по сравнению с контрольными животными. Такие данные свидетельствуют о наличии у всех исследуемых препаратов способности снижать лейкоцитарную инфильтрацию слизистой оболочки и подслизистого слоя.

Таким образом при гистологическом исследовании носовых ходов крыс был выявлен выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект препарата фрешнос, что характеризовалось регенерацией эпителия, снижением количества бокаловидных клеток и степени выраженности инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами. Установлено, что препарат значимо превосходил по своему противовоспалительному эффекту препараты сравнения, что нашло отражение в результатах проведенного клинического исследования.

Полученные данные об эффективности исследуемого препарата фрешнос обусловлены его многокомпонетным составом и подтверждаются многочисленными литературными данными, свидетельствующими об эффективности его компонентов в отношении различных признаков воспаления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили установить эффективность применения новых препаратов природного происхождения KJIC-04 и фрешнос, обладающих выраженными противовоспалительными свойствами на новых разработанных и валидированных экспериментальных моделях заболеваний верхних дыхательных путей - острого шейного лимфаденита и острого риносинусита соответственно.

Были выявлены механизмы реализации препаратами фармакологических эффектов. Так, при остром шейном лимфадените противовоспалительное действие препарата КЛС-04 реализуется за счет влияния на неспецифический каскад воспалительных реакций, что отражается в снижении уровня провоспалительных цитокинов, С-реактивного белка и лейкоцитов. Также на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита был показан выраженный противоотечный эффект КЛС-04, что отражалось в снижении показателя разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов, а также в проценте потери массы пораженного лимфатического узла после лиофильного высушивания. Столь выраженный терапевтический эффект КЛС-04 обусловлен торможением синтеза простагландинов и лейкотриенов из арахидоновой кислоты, и инициацией образования резолвинов, протектинов и марезинов, участвующих в разрешении воспалительного процесса (Рыбакова A.B., 2012, Крышень К.Л. 2013).

При оценке эффективности противовоспалительного эффекта исследуемого препарат фрешнос на основе растительного сырья было показано выраженное снижение количества бокаловидных клеток в носовых ходах экспериментальных животных и значительное снижение инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами. Данный противовоспалительный эффект обусловлен входящими в состав каждого компонента препарата флавоноидами, обладающими выраженными антиоксидантными свойствами и нашел подтверждение в ходе проведения клинических исследований.

ВЫВОДЫ

1. При разработке экспериментальной модели асептического острого шейного лимфаденита выбрана наиболее подходящая тест-система для формирования данной патологии (крысы-самки линии Вистар по причине их наибольшей чувствительности), определены оптимальные повреждающие агенты (водные растворы ЛПС 0,1 мг/кг и каррагенина 0,8 мг/кг), установлен срок максимально выраженного процесса острого воспаления лимфоидной ткани после введения провоспалительных агентов (72 ч), сформулирован перечень клинико-диагностических показателей для оценки новой экспериментальной модели асептического острого шейного лимфаденита.

2. Новая экспериментальная модель асептического острого шейного лимфаденита валидирована по показателям правильность (точность) и сходимость. Определено отсутствие влияния времени года на показатели асептического воспаления регионарных лимфатических узлов при стандартных условиях содержания экспериментальных животных.

3. Сопоставление эффективности нового отечественного противовоспалительного препарата КЛС-04 в форме спрея в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном в экспериментальной модели острого шейного лимфаденита подтвердило выраженное дозозависимое противовоспалительное и противоотечное действие препарата КЛС-04. Предполагаемым механизмом его действия является инициация образования резолвинов, протектинов и марезинов, а также торможение синтеза простагландинов. Наибольший терапевтический эффект препарата КЛС-04 достигается в дозах 3,2-6,4 мг/кг.

4. При разработке экспериментальной модели асептического острого риносинусита на основании патофизиологических и патоморфологических параметров выбрана наиболее подходящая тест-система для данной патологии (крысы-самки линии Вистар), определен оптимальный повреждающий агент (водный раствор формалина в дозе 12 мг/кг), установлен срок максимально выраженного процесса острого риносинусита после введения провоспалительного агента (7 суток), сформулирован перечень клинико-диагностических показателей для оценки новой экспериментальной модели асептического острого риносинусита.

5. Новая экспериментальная модель асептического острого риносинусита валидирована по показателю сходимость. Определено отсутствие влияния времени года на показатели асептического воспаления носовых ходов при стандартных условиях содержания экспериментальных животных.

6. Сравнение эффективности нового отечественного противовоспалительного препарата фрешнос на основе травы тысячелистника обыкновенного, листьев шалфея лекарственного, травы зверобоя продырявленного, побегов багульника болотного, тимола и масла мяты перечной в сравнении с виброцилом и аквамарисом в экспериментальной модели острого риносинусита подтвердило выраженное

противовоспалительное дозозависимое действие фрешноса. Механизм действия препарата связан с противовоспалительными, противоотечными и антиоксидантыми свойствами компонентов препарата фрешнос. Максимально выраженный терапевтический эффект нового препарата фрешнос достигается при его применении в максимальной дозе 30 мкл/100 г массы тела.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные и валидированные модели острого риносинусита и острого шейного лимфаденита рекомендуются для внедрения в доклинические исследования противовоспалительной активности новых лекарственных средств для JIOP-практики.

Результаты экспериментального исследования нового комплексного противовоспалительного препарата КЛС-04 оформлены в виде досье на препарат для получения разрешения на проведение клинических испытаний. На этом основании препарат КЛС-04 может быть рекомендован для клинической апробации в качестве противовоспалительного и противоотечного средства для лечения заболеваний верхних дыхательных путей, таких как острый тонзиллит (ангина), ларингит, фарингит с учетом выявленых эффективных доз.

Установленная противовоспалительная активность нового растительного препарата фрешнос позволяет рекомендовать его для применения в ЛОР-практике для лечения острых и хронических ринитов и риносинуситов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крышень, К.Л. Оценка противовоспалительного действия лекарственных препаратов на основе шалфея / К.Л. Крышень, С.И. Гусева, C.B. Тесакова, A.A. Ацапкина, М.Н. Макарова, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров, Г.И. Дьячук // Цитокины и воспаление. — 2009. - Т.8. - № 4 - С. 67-72.

2. Makarova, M.N. Efficacy of phytopreparations in experimental model of cervical lymphadenitis in rats / M.N. Makarova, S.V. Tesakova, S.I. Guseva, K.L. Kryshen, T.V. Abrashova, V.G. Makarov // Phytopharm-2009. 13th Int. Congr. -2009. - P. 75.

3. Pozharitskaya, O.N. Anti-inflammatory activity of a HPLC-fingerprinted aqueous infusion of aerial part of Bidens tripartite L. / O.N. Pozharitskaya, A.N. Shikov, M.N. Makarova, V.M. Kosman, N.M. Faustova, S.V. Tesakova, V.G. Makarov, B. Galambosi // Phytomedicine. - 2010. - Vol. 17. - P.463-468.

4. Гусева, С.И. Разработка экспериментальной модели острого воспаления лимфатического узла у крыс / С.И. Гусева, М.Н. Макарова, C.B. Тесакова, К.Л. Крышень, A.A. Ацапкина, П.Н. Буркина // Актуальные проблемы медицины и биологии. Матер, науч.-практич. конф. СПбГМА им. И.И. Мечникова. - СПб., 2010. - С. 371-372.

5. Khodko, S.V. Antiinflammatory effect of complex herbal extract in the model of acute phinosinusitis in rats / S.V. Khodko, O.N. Pozharitskaya, M.N.

Makarova, A.N. Shikov, V.G. Makarov // Обз. по клин, фармакол. и лек. терапии. -2013.-Т. 11, спецвыпуск.-С. 50-51.

6. Макаренко, И.Е. Возможные пути и объемы введения лекарственных средств лабораторным животным / И.Е. Макаренко, О.И. Авдеева, Г.В. Ванатиев, A.B. Рыбакова, C.B. Ходько, М.Н. Макарова, В.Г. Макаров // Меяедунар. вестн. ветеринарии. - 2013. - № 3. - С. 78-84.

7. Ходько, C.B. Экспериментальная модель острого риносинусита у крыс для оценки терапевтической эффективности препаратов / C.B. Ходько, М.Н. Макарова, В.Г. Макаров, И.А. Самусенко, М.Г. Ширунова // Профилактич. и клин, медицина. - 2013. - Т. 46, № 1. - С. 57-62.

8. Ходько, C.B. Изучение специфической фармакологической активности нового препарата «FN» на экспериментальной модели острого риносинусита у крыс / C.B. Ходько, М.Н. Макарова, В.Г.Макаров, B.C. Михайлова // Профилактич. и клин, медицина. - 2013. - Т. 48, № 3. - С. 5864.

9. Khodko S.V. Pathomorphology characteristics of a new experimental model of acute rhinosinusitis in rats / S.V. Khodko // Обз. по клин, фармакол. и лек. терапии. - 2014. - Т. 12, спецвыпуск. - С. 32.

Подписано в печать 16.10.2015 Формат 60x84 1/1б Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 100 экз. Заказ №29/10 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, сайт: faIconprint.ru)