Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Диагностическая оценка некоторых биохимических маркеров воспаления и обструкции дыхательных путей при хроническом бронхите и бронхиальной астме (клинико-экспериментальное исследование)

Кулакова Наталья Валентиновна

На правах рукописи

РГБ ОД

- 6 СЕН 1223

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА НЕКОТОРЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ И ОБСТРУКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ И ХРОНИЧЕСКОМ БРОНХИТЕ И БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.43.- пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 1999

Работа выполнена во Владивостокском государственном медицинском университете

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

Невзорова В. А. Научный консультант: кандидат химических наук

старший научный сотрудник Лукьянов П.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хасина М.А. кандидат медицинских наук Зуга М.В.

Ведущее учреждение:

Дальневосточный Государственный медицинский университет Защита состоится « /Г » С/НР/^Л-1999 Года в <(

на

заседании диссертационного Совета К 084.24.02 при Владивостокском государственном медицинском университете. (690060 г. Владивосток, проспект Острякова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «

мая 1999 года Ученый секретарь диссертационного Совета К 084.24.02

К.М.Н.

и

Список основных сокращений АК - арахидоновая кислота БА - бронхиальная астма БАВ - биологически активные вещества БАС - бронхоальвеолярный смыв БОД - болезни органов дыхания БОС - бронхообструктивный синдром

ДЦКББ - Дальневосточная центральная клиническая бассейновая больница ЖБАЛ - жидкость бронхоальвеолярного лаважа JIc - липосомы

МДА - малоновый диальдегид

ННЖК - ненасыщенные жирные кислоты

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ФБС - фибробронхоскопия

ФВД - функции внешнего дыхания

ХБ - хронический бронхит

ХНБ - хронический необструктивный бронхит

ХОБ - хронический обструктивный бронхит

ХОБЛ - хронические обструктивные болезни легких

Chol - холестерин

DCP - дицетилфосфат

ЕРС - яичный лецитин

НЕТЕ - гидрооксиэйкозатетраеновые кислоты LPL - суммарные фосфолипиды легких свиньи N0 - оксид азота

4

Введение.

Актуальность проблемы. В современной концепции хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ) рассматривают с позиций хронического воспалительного процесса дыхательных путей, который эволюционирует независимо от степени тяжести и проявлений хронического обструктивного бронхита (ХОБ) и бронхиальной астмы (БА) [А.Г. Чучалин, 1998]. В то же время характер морфологических проявлений воспаления при этих заболеваниях различен, как и подходы к лечению. К настоящему времени признается актуальной разработка биологических маркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику как внутри гетерогенной группы болезней, объединенных понятием ХОБЛ, так и позволяющих прогнозировать течение процессов воспаления и обструкции дыхательных путей и оптимизировать проводимую терапию [P. Barnes, 1998]. В последнее время в литературе обсуждается вопрос о возможности использования свободно-радикального газа оксида азота (N0) в качестве подобного маркера [С.А. Харитонов 1997; P. Barnes, 1998]. Измерение содержания газа в выдыхаемом воздухе является простым, неинвазивным, но дорогостоящим методом диагностики. В качестве альтернативы может рассматриваться относительно дешевый и высокочувствительный способ определения N0 в жидкостных средах. Исследования в этой области только начинаются [H.W.F.M. de Gouw; 1996]. Изучение содержания в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) метаболитов N0 и других биологически активных веществ (БАВ), принимающих участие в патогенезе бронхообструктивного синдрома (БОС) позволит мониторировать течение болезни и наиболее эффективно планировать программы лечения.

Активный поиск лекарственных средств, способных контролировать проходимость бронхов и воздействовать на процессы воспаления в дыхательных путях показал эффективность использования липосом для транспорта лекарств в органы-мишени [В.А. Невзорова 1998; А.Г. Чучалин 1990; K.M.G., Taylor S.J Farr. 1993]. Как установлено предыдущими исследованиями, заключение бронхолитических средств в липосомальную форму позволяет значительно уменьшить фармакологически обусловленные системные эффекты ß-агонистов с

одновременным пролонгированием их действия [И.В. Архипенко, 1996; В.А. Невзорова, 1998; Р. Harvie , A. Desormeax, 1995; Т.А. McCalden, В. Abra 1989]. В то же время возможности использования липосомальных форм |3-агонистов для коррекции процессов воспаления при БОС до конца не выяснены, что требует дальнейшего изучения.

Цель исследования состояла в оценке динамики показателей оксида азота, биогенных моноаминов (серотонина и гистамина), некоторых метаболитов арахидоновой кислоты и конечного продукта перекисного окисления • липидов (малонового диальдегида) в ЖБАЛ для определения их роли в процессах воспаления и обструкции бронхов в клинике и эксперименте и возможности коррекции имеющихся нарушений липосомальными формами фенотерола.

Задачи исследования.

1. Определить содержание метаболитов N0 при ХОБ и БА в разные периоды болезни и в зависимости от степени вентиляционных нарушений.

2. Оценить динамику изменений концентрации серотонина и гистамина в ЖБАЛ при ХОБ и БА и их значение в развитии обструктивных нарушений.

3. Исследовать интенсивность перекисного окисления . липидов в дыхательных путях по результатам исследования малонового диальдегида (МДА) и его роль в формировании воспаления и обструкции бронхов у больных ХОБ и БА.

4. Выяснить состояние активности N0, серотонина, гистамина, МДА и содержание некоторых липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты

(HETE) в органах дыхания при экспериментальной БА.

5. Оценить возможности свободного фенотерола и заключенного в липосомы

различного фосфолипидного состава в коррекции проявлений экспериментальной астмы.

Научная новизна

Впервые в сравнительном аспекте выяснена динамика изменений комплекса биохимических показателей (NO, серотонина, гистамина и МДА) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных ХОБ и БА, в зависимости от активности процесса и степени вентиляционных нарушений, что позволило выделить наиболее значимые биомаркеры различных форм ХОБЛ.

Впервые исследованы биохимические показатели воспаления и обструкции бронхов при экспериментальной БА в результате воздействия липосом различного фосфолипидного состава, свободного и инкапсулированного фенотерола.

Предложены новые способы коррекции бронхообструктивного синдрома при экспериментальной астме, эффективность которых подтверждена мониторингом

установленных биомаркеров поражения дыхательных путей.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Проведенные исследования содержания в дыхательных путях N0, серотонина, гистамина, МДА и некоторых метаболитов арахидоновой кислоты при различных вариантах БОС в клинике и эксперименте позволяют выделить наиболее чувствительные и информативные тесты, сопряженные с формированием воспалительного процесса в дыхательных путях и нарушением бронхиальной проходимости. Их исследование в ЖБАЛ может быть использовано для наблюдения за активностью воспаления и эффективности проводимой терапии.

Предлагаются способы коррекции БОС с доставкой р-агонистов липосомами, обладающими оптимальными биофизическими и биохимическими свойствами.

Положения, выносимые на защиту

1. Содержание метаболитов N0 и МДА в ЖБАЛ при БА и ХОБ определяется в основном активностью воспалительного процесса, что подтверждается их повышением при обострении этих заболеваний, особенно значительным при БА. Уровень N0 сохраняется повышенным при ремиссии БА и снижается в этот же период у больных ХОБ. Эти изменения могут служить дополнительным дифференциально-диагностическим признаком для данных форм ХОБЛ.

2. Уровень концентрации биогенных моноаминов (гистамина и серотонина) в ЖБАЛ больных ХОБ и БА связан как с активностью воспаления, так и со степенью обструктивных нарушений. Он повышается при обострении этих заболеваний и снижается в период ремиссии.

3. Использование отрицательно заряженных липосом, имеющих точку фазового перехода, близкую к фосфолипидам из легких крыс, наиболее эффективно повышает возможности фенотерола в коррекции проявлений экспериментальной БА.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 1997 г.; Москва, 1998); 2 съезде Российского биохимического общества (Москва, 1997); региональных 37 и 38 естественно-научных конференциях (Владивосток, 1996,1997); восьмой конференция «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998); второй Дальневосточной региональной конференции «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке» (Владивосток, 1998), научной конференции ТИБОХ ДВО РАН «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 1998); V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998). Работа прошла апробацию на совместном заседании проблемных комиссий по внутренним болезням и пульмонологии Владивостокского государственного медицинского университета. Материалы диссертации опубликованы в 13 научных работах.

Структура'и объем работы: Диссертация состоит из введения, четырех глав, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами и 4 рисунками. Список литературы включает 139 работы отечественных и 161 работ зарубежных авторов.

Характеристика материалов и методов исследования.

Исходя из цели и задач, поставленных в работе, обследовано 125 больных ХБ и БА, находившихся на стационарном лечении в терапевтических отделениях ЦЦКББ в 1994 - 1997 г.г., из них мужчин было 85, женщин - 40. Возраст обследованных был в диапазоне от 20 до 65 лет (в среднем 43±2.5 года). Для диагностики ХБ были использованы определения ВНИИ пульмонологии, эпидемиологические критерии ВОЗ и данные Международного консенсуса по диагностике и лечению хронических обструктивных заболеваний легких (1995г.). Диагноз ХБ был установлен у 90 обследованных, среди которых хронический яеобструктивный бронхит (ХНБ) и хронический обструктивный бронхит (ХОБ) диагностированы у 20 и 70 больных, соответственно. Согласно рекомендациям

международного консенсуса была оценена степень тяжести ХОБ в зависимости oi уровня снижения ОФВ1. У всех больных установлена средняя степень тяжести ХОЕ (ОФВ1 составлял 50% - 69%).

Диагноз БА был установлен в соответствии с классификацией международного консенсуса по бронхиальной астме (1996г.). Под наблюдением было 35 больных Б А со средней степенью тяжести. При проведении спирографического исследования снижение ОФВ] составило 60 - 80% от должных величин.

Оценка функции внешнего дыхания (ФВД) у всех обследованных проводилась на спироанализаторе «Spirosift- 500» фирмы «Fucuda» (Япония) с регистрацией петли поток-объем и компьютерной обработкой результатов где фактические величины сравнивались со стандартными. Для определения обратимости бронхиальной обструкции применялась разгрузочная проба с ингаляцией 200 мкг фенотерола.

Жидкость бронхоальвеолярного лаважа получали во время трансназальной фибробронхоскопии (ФБС) по методу В.А. Герасина (1987 г.) при помощи бронхоскопа "BF — 20" фирмы «Olympus» (Япония). При интерпретации эндоскопической картины руководствовались классификацией I.M. Lemoine et al (1971 г.) с дополнениями Г.И. Лукомского и соавт. (1984 г.).

Клинические исследования больных и биохимический анализ БАВ в ЖБАЛ проводились при поступлении в стадию обострения и на момент выписки из стационара в ремиссию.

Модель Б А в эксперименте получали на 100 белых нелинейных половозрелых крысах-самцах с массой 180-220 г. Животных, содержащихся на стандартном пищевом рационе вивария, сенсибилизировали овальбумином по методу P. Andersson. (1980 г.).

Для коррекции проявлений экспериментальной БА использовали свободный фенотерол и его липосомальные формы. Фенотерол получали из дозированных аэрозольных баллонов фирмы "Boeringer Ingelheim". В работе использовали

.ипосомы из яичного лецитина (ЕРС) и суммарных фосфолипидов легких свиньи LPL).

Яичный лецитин и суммарные фосфолипиды легких свиньи получали согласно методике Л.Д. Бергельсон (1981г.). Концентрация фосфолипидов в юлученном растворе составила 50 мг/мл.

Липосомы (Лс) получали по методу S. Batzri, E.D. Korn (1973 г.). Конечная концентрация фосфолипидов в полученном растворе составила 28 мг/мл, |)енотерола - 1.4 мг/мл. В предыдущих исследованиях было показано, что введение з структуру Лс. холестерина и дицетилфосфата улучшает биофизические характеристики их мембран [А.Г. Корякова 1998; G. Gregoriadis, R.A. Buckland 1973]. В связи с этим в состав Лс были введены эти вещества в количестве 0.43 и 3.08 мг соответственно.

Экспериментальным путем было установлено время, скорость шгалирования и концентрация вводимого вещества: 0.1 мг/мл фенотерола и (или) 2 иг/мл фосфолипидов ингалировали в течение 2 мин. 24 сек. в течение 5 дней. !репараты вводили в дыхательные пути животных с экспериментальной БА с томощью ультразвукового ингалятора "Thomex L2", соединенного с герметичной юлиэтиленовой камерой с крысами.

Биологическим материалом для исследования явились: ЖБАЛ больных БА и и бронхоальвеолярные смывы (БАС) легких крыс до и после ингалирования кивотным ненагруженных везикул, свободного и инкапсулированного фенотерола.

Биохимические методы исследования: определение МДА в модификации З.А. Андреевой (1988); биогенных моноаминов (гистамина и серотонина) в одной тробе [С.Б. Ахмеджанова, 1991; В.Н. Соминский, И.Э. Калниня, 1983; J.F. Stobaugh 1987; К. Warren, J. Dyer, 1983]; определение количества белка по стандартной методике [Д. Бредфорд, 1989]; исследование суммы метаболитов оксида азота (NCh~ ï NO3") в присутствии реактива Грейса [L.C. Green, D.A. Wagner, 1982; М.Р. 5tainton, 1974]; идентификация липоксигеназных метаболитов арахидоновой шслоты (5;8;9;12;15 - НЕТЕ) в БАС проводили методом высокоэффективной кидкостной хроматографией [W.S. Powell, 1987].

Статистическую обработку данных осуществляли на компьютере IBM в операционных средах Windows с помощью приложения Microsoft Exell.

Результаты исследований и обсуждение.

Современный этап изучения ХБ и БА отмечается поиском чувствительных и специфических биомаркеров, позволяющих проводить раннюю диагностику болезни и максимально оптимизировать терапию. Особое внимание уделяется изучению ЖБАЛ как органоспецифической жидкости, наиболее тесно взаимосвязанной с состоянием дыхательных путей.

Интерес к изучению биохимического состава лаважной жидкости при болезнях органов дыхания (БОД) также обусловлен ее значением в формировании некоторых патохимических и патофизиологических этапов болезни. Как установлено предыдущими исследователями при ХОБ и БА происходит постепенное изменение биохимического состава ЖБАЛ, качественный и количественный анализ которого позволяет точнее судить о тяжести заболеваний [Н.В. Васькова, 1996, Е.В Соляник, 1997, В.А. Жидкова, 1996]. При этом наблюдается прямая зависимость некоторых биохимических показателей от клинических проявлений болезни [П. Деган, 1981].

Особое место в патогенезе БОД принадлежит N0, значение которого в регуляции тонуса дыхательных путей и процессах воспаления до настоящего времени полностью не определено [В.А. Невзорова, 1998; P. Barnes, F.Y. Liew,1998].

В физиологических условиях синтез газа локализован в верхних дыхательных путях и определяется активностью конститутивной NO-синтазы. Тогда как при воспалении экспрессируется индуцибельная форма фермента и количество секретируемого N0 увеличивается в 1000 и более раз [S. Archer, 1993; Q. Hamid, D.R. Springall, 1997]. При этом бронходилатирующее, противовоспалительное и в целом защитное действие NO меняется на противоположное.

Анализ кашлх данных по содержанию метаболитов NO в ЖБАЛ у больных ХОГ- и БА показал увеличение их концентрации в период обострения заболеваний

<ак при ХОБ (в 1.5 раза, р<0.001), так и БА (в 2.7 раза, относительно контроля э<0.001), с достоверно более высокими показателями в последней группе (таб. 1). К 1ериоду ремиссии активность NO оставалась выше контрольных значений при БА и 1иже при ХОБ. Прослеженная динамика активности N0 может быть связана с особенностями формирования воспаления при БА и ХОБ, а именно с аллергическим ответом и активизацией ядерного фактора карра-В, в первом случае [I.M. Adcock, D.R. Brown 1994] и формированием оксидативного стресса во втором [P. Barnes, 1998]. Наступающее при ХОБ накопление активных форм кислорода способствует быстрому неэнзиматическому удалению N0 из очага воспаления и накоплению .гощного оксиданта пероксинитрита [Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшикова, 1997]. Кроме того, различный метаболизма газа следует связать с выявленными морфологическими и гистохимическими изменениями активности NO-синтазы и трастанием необратимых морфологических изменений бронхиальной стенки при КОБ с утратой способности секретировать NO [В.А. Невзорова, 1998].

Для установления возможной функциональной связи между активностью N0 > ЖБАЛ у больных ХОБ и БА и вентиляционной функцией легких был проведен сорреляционный анализ используя непараметрические критерии рангов Спирмена. Анализ коэффициента Спирмена показал наличие слабых отрицательных сорреляционных связей между содержанием N0 и вентиляционными параметрами №Д (оцененные по ОФВ,) при обострении БА (г=-0.48, р<0.05) и ХОБ (г=-0.42, ><0.05). В стадию ремиссии между этими же показателями при БА корреляция :охраняется (г=-0.47, р<0.01), тогда как при ХОБ корреляционная взаимосвязь юлабевает (г=-0,13) и становится недостоверной (р>0.05). Такое изменение можно >бъяснить сохранением стойкой обструкции воздухоносных путей на фоне сниженной выработки N0 за счет ремоделирования стенки бронхов. Следовательно, южно считать, что выделение N0 в большей степени связано с течением юспалительного процесса, в то время как на состояние проходимости бронхов N0 гожет влиять опосредованно вследствие участия в формировании отека [ыхательных путей, нарушения регуляции секреции и мукоцилиарного клиренса [D. fates, R.A. Robbins, R. Logon-Sinclair, E. Shineboume, 1994]. Предшествующие гсследования по изучению концентрации N0 в выдыхаемом воздухе у больных БА

показали, что его содержание при обострении было в 3.1 раза выше, чем у здоровых лиц [С.А. Харитонов, 1998].

Таким образом, закономерное увеличение уровня метаболитов N0 в ЖБАЛ при активном воспалительном процессе в воздухоносных путях, его снижение в стадию ремиссии, и отсутствие выраженной зависимости от степени обструкции при ХОБ, особенно в период стихания обострения, позволяет считать N0 биомаркером воспаления, использование которого может способствовать совершенствованию .диагностики и оптимизировать лечение БА и ХОБ.

Таблица 1.

Содержание биологически активных веществ в ЖБАЛ при хроническом бронхите

и бронхиальной астме

Показатели оксид азота нмоль/мл серотонин нмольм/л гистамин нмоль/мл малоновый диальдегид нмоль/мл

Контроль п=14 0.82±0.02 0.085±0.001 0.0070±0.0002 0.016±0.001

ХНБ ремиссия п=15 - 0.087±0.003 0.0070±0.0002 -

ХНБ обострение п=20 - 0.162±0.010*** 0.0073±0.0004 -

ХОБ ремиссия п=52 0.43±0.02*** 0.092±0.002* 0.0096±0.0004* 0.019±0.0002*

ХОБ обострение п=70 1.28±0.09*** 0.194±0.020*** 0.0167±0.0004*** 0.095±0.0008***

БА ремиссия п=24 0.87±0.01* 0.093±0.001* 0.0101±0.0005* 0.020±0.001*

БА обострение п=35 2.24±0.1*** 0.149±0.008*** 0.0181±0.0001*** 0.085±0.0006***

Примечание: достоверность различий по сравнению с контрольной группой - * - прир < 0.05, ** -

прир < 0.01, *** - прир < 0.001

В ответ на выброс воспалительных цитокинов, мукополисахаридов, активных форм кислорода происходит дегрануляциия тучных клеток и выход в просвет бронхов биогенных моноаминов, одним из которых является серотонин. Он

участвует в повреждении эпителия дыхательных путей и формировании местной воспалительной реакции, путем привлечения в очаг воспаления тромбоцитов [В.А. Переверзев, 1992]. В свою очередь дестабилизация состояния последних обеспечивает выход свободной формы моноамина в просвет бронхов и системный кровоток. Исследование содержание серотонина в лаваже больных ХБ и БА показало его резкое увеличение при обострении заболеваний. Концентрация серотонина в лаважной жидкости при ХНБ в этот период увеличивалась в 1.9 раза относительно контрольной группы (р<0.001). При достижении ремиссии уровень моноамина достигал контроля. Стойкая обструкция бронхов характеризовалась большим увеличением количества серотонина в ЖБАЛ. Так, при обострении ХОБ его содержание было в 2.3 раза выше контроля и превышало показатели больных ХНБ (р<0.001) (таб. 1). После лечения отмечается динамическое снижение концентрации серотонина при ХОБ, однако его содержание остается выше в 1.08 раза, чем у здоровых и при ХНБ (р>0.05). Возрастание уровня серотонина в ЖБАЛ наблюдается и при обострении БА в 1.8 раза (р<0.001), однако его количество меньше, чем при стойкой обструкции бронхов. Вероятно, эта закономерность объясняется сохранением более активного воспалительного процесса в сочетании с необратимой обструкцией и стойкой гипоксией при ХОБ по сравнению с БА. Длительная гипоксия приводит к нарушениям в системе дезактивации серотонина, которая усугубляется за счет утраты эндотелиальными клетками способности к экстракции моноамина в условиях повышенного давления в системе легочной фтерии, с одной стороны, и преобладанием анаэробного пути энергетического >бмена - с другой [З.В. Уразева, П.В. Дубилей, 1977]. В результате лечения 1роисходит снижение активности воспалительного процесса в бронхиальной :тенке, что приводит к уменьшению уровня серотонина в лаважной жидкости. В >емиссии содержание моноамина, однако, оставалось выше, чем у здоровых р<0.05) и было сравнимо с показателями при ХОБ.

Аналогичная динамика изменений уровня серотонина у больных БА была юказана при его исследовании в конденсате выдыхаемом влаги, крови и мокроте В.А. Гончарова, 1996; Г.Л. Кац, 1987; НЛ. Рабинович, 1985]

Для установления связи между вентиляционными нарушениями и концентрацией серотонина проведен анализ непараметрических критериев Спирмена. Его результаты показали наличие умеренных отрицательных корреляционных связей между содержанием моноамина и ОФВ1 при обострение БА (г=-0.62, р<0.01) и ХОБ (г=-0.б3, р<0.05), и слабых - при ХНБ (г=-0.3, р<0.05). В стадию ремиссии БА, ХОБ и ХНБ прослеженные корреляционные взаимоотношения сохраняются. Таким образом, отрицательные корреляционные связи между концентрацией серотонина в ЖБАЛ и ОФВ i могут быть проявлением участия моноамина в воспалении бронхов и связанной с ним бронхообструкции.

Исследование содержания гистамина в ЖБАЛ больных ХБ продемонстрировало увеличение его концентрации, которая имела взаимосвязь со степенью обструкции и активностью воспаления. Так, при обострении ХНБ наблюдалось незначительное увеличение моноамина, тогда как при ХОБ в этот же период его концентрация была в 2.3-2.5 раз выше контроля (р<0.001) и достоверно больше, чем в первом случае, свидетельствуя о значимости моноамина в формировании БОС (таб. 1). К периоду ремиссии заболеваний его уровень значительно снижался и при ХНБ практически не отличался от здоровых. Максимальное увеличение содержания гистамина отмечено у больных БА в стадию обострения, когда оно превышало показатели здоровых в 2.5-2.7 раза и было выше, чем при ХОБ в эту же стадию (р<0.05). После лечения концентрация моноамина в ЖБАЛ при БА закономерно снижается, но остается несколько выше контрольных значений и уровня моноамина в ЖБАЛ больных ХОБ (р<0.05). Корреляционный анализ между ОФВ] и концентрацией гистамина в ЖБАЛ продемонстрировал наличие сильных отрицательных связей между снижением ОФВ1 и возрастанием содержания моноамина в ЖБАЛ при БА (г=-0.78, р<0.001) и ХОБ (г=-0.68, р<0.001) с максимальным значением в первом случае. При ХНБ показатели коэффициента корреляции были низкими и недостоверными (г=-0.25, р>0.05).

Как установлено, гистамин высвобождающий из тучных клеток приводит к спазму гладких миоцитов бронхов [М.С. Liu, 1992; К. Tasaka, 1990]. При этом его выброс, знаменуя развитие гиперреактивности бронхов к различным стимулам, является следствием воспалительного процесса в дыхательном эпителии, особенно

го ранних этапов [J.A.M. Raaij makers, 1996]. Прослеженная нами динамика вменений содержания гистамина при различных формах ХБ и БА подтвердили юзможность исследования моноамина в ЖБАЛ в качестве одного из критериев юспадения и обструкции, особенно ее обратимого компонента.

В современной молекулярно-биологической концепции ХОБЛ значительное лесто отводится оксидативному стрессу, развитие которого происходит в >езультате дисфункции оксидантных и антиоксидантных систем. В результате исгивации первых и торможении вторых значительно возрастает перекисное жисление липидов (ПОЛ) с развитием последующей серии событий, запускающих I поддерживающих воспаление дыхательных путей.

Исследование одного го конечных продуктов ПОЛ малонового диальдегида [ри обострении ХОБ и БА показало достоверное увеличение его концентрации в 1аважной жидкости больных при обоих заболеваниях в 5.8 и 5.3 раза, оответственно (таб. 1). Более выраженная активизация ПОЛ при ХОБ связана как с [егрануляцией нейтрофилов и накоплением активных форм кислорода, так и с [меющим место у всех больных курения табака, продукты которого являются ющными оксидантами. После лечения в ремиссию отмечается достоверное иижение концентрации МДА при ХОБ и БА (р<0.05). Показатель МДА у больных [ОБ и БА в данную стадию существенно не отличается, доказывая значение оспаления дыхательных путей в патогенезе данных заболеваний. Некоторое овышенное содержание МДА у этих больных в ремиссию, можно объяснить едостаточной активностью антирадикальной защиты легких при длительно екущих заболеваниях органов дыхания [В.Г. Аматуни, 1993;С. Болевич, И.Г. [аниляк, 1997].

Для выявления возможной функциональной связи между содержанием в аважной жидкости МДА и показателями вентиляционной функцией легких был роведен соответствующий корреляционный анализ.

го результаты свидетельствуют о слабой достоверности прослеженных гаимосвязей при ХОБ (г=-0.26, р<0.05) и БА (г=-0.29, р<0.05). Таким образом, инамика содержания конечного продукта ПОЛ зависит в большей степени от сгивности воспаления в бронхах и не имеет прямой связи с проходимостью

воздухоносных путей, что подтверждает возможность определения уровня МДА для контроля динамики воспалительных изменений.

В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, способных контролировать проходимость бронхов при БОС. Использование широко известных бронходилататоров р-агонистов лимитировано выраженными системными изменениями в виде тахикардии, тремора, гипокалиемии и гипоксемии [И.М. Скрипский, 1995]. Как установлено предыдущими исследователями заключение р-агонистов в липосомальную форму позволяет оптимизировать доставку препарата, что сопровождается увеличением продолжительности пребывания их в легких, более выраженной бронходилатацией и одновременным уменьшением проявлений побочных действий препаратов [И.В. Архипенко, 1996].

Широко известный препарат фенотерол активно используется в практической медицине. В силу своего действия на Р-адренорецепторы, расположенные на пресинаптической мембране ацетилхолиновых синапсов, мембране тучных клеток и гладких миоцитов дыхательных путей, препарат обладает мощным бронходилатирующим действием, но и имеет выраженные побочные эффекты. Поэтому перед нами стояла задача улучшить возможность использования известного р-агониста, заключив его в липосомальную форму и определить влияние инкапсулированного препарата на содержание БАВ в лаважных смывах при экспериментальной БА.

Для определения эффективности действия фенотерола как в свободной, так и инкапсулированной форме с использованием липосом из ЕРС и ЬРЬ первоначально была создана экспериментальная модель БА по методу Апёегезоп Р. В БАС животных определяли концентрации метаболитов N0 и липоксигеназного цикла АК, а также гистамина, серотонина и МДА. При этом исследования БАС экспериментальных животных подтверждали раннее полученную динамику БАВ > больных ХОБ и БА. В искусственно созданной модели раннего астматического ответа у крыс наблюдалась увеличение всех исследуемых показателей (таб. 2,3).

Таблица 2.

Изменение показателей биологически активных веществ при экспериментальной модели Б А в результате лечения липосомальными формами фенотерола.

показатели оксид азота нмоль/мл сер ото нин нмоль/мл гистамин нмоль/мл МДА нмоль/мл

контроль 0.369±0.020 0.154±0.009 0.054±0.002 0.038±0.002

БА 2.789Ю.001 0.381±0.020 0.118±0.009 0.181±0.004

ЕРС 2.65+0.002* 0.261+0.018*** 0.108+0.008** 0.08±0.002***

ЬРЬ 2.55Ю.002* 0.348±0.010* 0.08б±0.006*** 0.091±0.003***

фенотерол 2.874+0.011* 0.376+0.017 0.099±0.001* 0.232±0.013***

ЕРС+Ф ?..459±0.140** 0.362Ю.002* 0.087±0.004* 0.118±0.003***

ЬРЬ+Ф 1.938М.080*** 0.339Ю.002** 0.064±0.003*** 0.104±0.002***

ЕРС+сЬо1+ ' ЭСР+Ф 1.825±0.011*** 0.297+0.002*** 0.075+0.002** 0.074±0.004***

Таблица 3.

Динамика изменений гидрооксиэйкозатетраеновых кислот под влиянием инкапсулированного фенотерола в БАС крыс с моделью БА (нмолу/Ил).

показатели 15-НЕТЕ 12 - НЕТЕ 9- НЕТЕ 8-НЕТЕ 5-НЕТЕ

контроль 62.92±3.8 1.7+0.09 16.97±0.09 69.9±2.1 2.1±0.15 .

БА 132.5+0.2 58.5±2.10 30.0±1.50 390±16.1 12.9+0.80

ЕРС 60.1±3.1*** 11.5+1.0*** 12.5±0.94*** 190.7+16.9*** 7.25±0.52**

ЬРЬ 46.5±2.8*** 6.85±0.2*** 5.5±0.41*** 115.0±9.8*** 5.1+0.39**

фенотерол 130.5±5.7 56.4+3.40 28.7+2.60 384.5±6.1 11.4±2.10

ЕРС+Ф 53.0±0.4*** 8.6±0.10*** 21.5±0.60*** 201.5±18.3*** 9.1±0.78**

ЬРЬ+Ф 43.5+2.7*** 4.1+0.32*** 18.7±0.01*** 153.2±2.7*** 8.1±0.60**

Примечание в таблицах 2 и 3 * - различия достоверны при р < 0.05, ** - при р<0.01, *** - прир<0.001 по сравнению с показателями при Б А

В предыдущих экспериментах уже было доказано приоритетное влияние фосфолипидных везикул из LPL на процессы дегрануляции тучных клеток [В.А Невзорова, 1998] и снижение токсичности фенотерола в 15 раз и более npt заключении его в ЕРС [И.В. Архипенко, 1996], что и привело к необходимое™ изучения биофизических показателей используемых носителей [А.Г. Корякова, Н.В Кулакова, 1998]. В сравнительном аспекте изучены действия свободногс фенотерола и заключенного в липосомы из ЕРС, LPL, и искусственно созданны> везикул на основе ЕРС с добавлением в них холестерина и дицетилфосфата, чте приблизило их биофизические свойства к действию LPL. Искусственно созданные везикулы и LPL объединяет общая точка фазового перехода (40°С), оба вид: липосом отрицательно заряжены, что способствует усилению жесткости мембран i переходу в жидко-кристалическое состояние [Г.Грегориадис, А. Алисон, 1983] Введение свободной формы препарата приводило к повышению уровня МДА дс 28.3% относительно исходного уровня и не влияло на метаболизм АК и NO, чте можно объяснить особенностями действия р-агонистов первой генерации способных при длительном применении дестабилизировать клеточные мембрань [А.Н. Цой, 1998}. После ингалирования фенотерола в обычной форме отмеченс также некоторое снижение серотонина и гистамина (на 13.1% и 16°/ соответственно). Установленная динамика изменений моноаминов связана < действием фенотерола на Р-рецепторы тучных клеток, с последующа торможением их дегрануляции, что подтверждено в предыдущих исследования) морфологически [В.А. Проценко,1987; V. Brusasco; N. Ringdal, 1995; G.V. Cochrane 1990].

В то же время наши исследования показали, что использование свободны) фосфолипидных везикул при экспериментальной БА приводит к уменьшении концентрации метаболитов N0, торможению липоксигеназного пути АК биогенных моноаминов и продуктов ПОЛ (таб 2,3). Более заметное снижение БА! наблюдается при ингалировании аутологичных липосом (полученных и фосфолипидов легких свиньи), за исключением концентрации серотонина в БАС Колее выраженное снижение содержания этого моноамина под влиянием липосои из ЕРС можно объяснить особенностями состава везикул. Наличие ненасыщенны:

кирных кислот (ННЖК) в яичном лецитине обуславливает более эффективное взаимодействие с фосфатидилхоликом мембран тромбоцитов и серотониновыми »ецепторами дыхательных путей, приводя к более сильному снижению уровня юноамина в БАС у крыс с БА, по сравнению в везикулами из ЬРЬ.

Включение фенотерола в липосомы способствует снижению концентрации ТО, 15-, 12-, 9-, 8-,5-НЕТЕ, биогенных моноаминов и МДА в БАС при кспериментальной БА (р<0.05). Из липосомальных комплексов препарата наиболее ффективными являются соединения, состоящие из ЬРЬ+фенотерол, :РС+СЬо1+ОСР+фенотерол. Их общие биофизические свойства обеспечивают (еленаправленный транспорт лекарственных веществ к клеткам и улучшает юзможность препарата в коррекции процессов воспаления и обструкции (ыхательных путей.

Большая эффективность инкапсулированого р-агониста над свободной юрмой и пустыми липосомами объясняется физико-химическими свойствами [спользуемых фосфолипидов и улучшением кинетики фенотерола. Высокая емпература фазового перехода у ЬРЬ и ЕРС+СЬоМЭСР, обеспечивая оптимальную жесткость мембраны, определяет эффективное взаимодействие фенотерола с леточными рецепторами [Б.Я. О'ОоплеП, 1987]. Кроме того, полученные езультаты при использование аутологичных липосом объясняются сродством их юсфолипидов к таковым цитоплазматической мембраны клеток органов дыхания.

Итак, наши исследования показали повышение активности биогенных юноаминов, конечного продукта ПОЛ и метаболитов N0 в ЖБАЛ больных БА и Ж. В процессе лечения содержание изученных БАВ снижается, но остается выше, ем в контрольной группе обследованных, за исключением концентрации N0 при ЮБ, когда его уровень становится даже ниже, чем у здоровых. Установлено, что уществует взаимосвязь между уровнем гистамина и серотонина, активностью оспалительного процесса и степенью бронхиальной обструкции при БА и ХОБ. 'удя по результатам наших исследований, концентрация МДА и метаболитов N0 в ольшей степени отражают активность воспаления в дыхательных путях, чем ыраженность бронхиальной обструкции.

Использование липосом для целенаправленной доставки лекарственнь

препаратов в клетку значительно повышает возможности (5-агонистов в коррекщ

биохимических проявлений обструкции и воспаления при экспериментальной БА.

Выводы.

1. Динамика изменений комплекса биохимических показателей (метаболитов N( серотонина, гистамина, малонового диальдегида) в жидкости БАЛ у больных Б указывает на то, что их уровень максимален в период обострения заболевания, снижается в период ремиссии. Это позволяет использовать данные параметры качестве биомаркеров БА.

2. У больных ХОБ аналогичная динамика содержания БАВ сохраняется аз серотонина, гистамина и МДА, в то время как уровень метаболитов N0 г сравнению с БА в период обострения повышается незначительно, а в перис ремиссии он ниже, чем у здоровых лиц. Указанные изменения отражай особенности биогенеза N0 в условиях воспаления и могут использоваться к; дополнительные дифференциально-диагностические критерии ХОБЛ.

3. Анализ корреляционных отношений между биохимическими параметрами ОФВ1 показал, что серотонин и гистамин имеют более тесные отрицательнь связи с изучаемым параметром, чем метаболиты N0 и МДА. В связи с эти серотонин и гистамин можно отнести к биомаркерам воспаления и обструкщ дыхательных путей, в то время как МДА и N0 к биомаркерам воспаления.

4. Использование свободных фосфолипидных везикул при экспериментальной Б уменьшает активность N0, МДА, серотонина, гистамина и HETE, свидетельств; об умеренном противовоспалительном действии липосом. Снижение тр< последних показателей демонстрирует опосредованный бронхолитическ! эффект липосом при остром астматическом ответе.

5. Заключение фенотерола в липосомальную форму значительно интенсивн< нормализует биохимические показатели воспаления и обструкции n¡ экспериментальной астме по сравнению с ненагруженными фосфолипиднык везикулами и свободной формой препарата.

Наибольшей эффективностью относительно проявлений экспериментальной астмы обладает фенотерол, инкапсулированный в липосомы из суммарных фосфолипидов легких свиньи и искусственно созданные везикулы с добавлением холестерина и дицетилфосфата, которые объединяет общая точка фазового перехода, близкая к фосфолипидам легких крыс.

Практические рекомендации.

1. Использование комплекса биохимических показателей в ЖБАЛ (метаболитов оксида азота, серотонина, гистамина, малонового диальдегида) позволяет оценить активность воспаления и степень обструкции дыхательных путей при основных формах ХОБЛ: бронхиальной астме и хроническом обструктивном бронхите. Динамика изменений этих показателей дает возможность использовать их в качестве биохимических маркеров хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы и дополнительных дифференциально-диагностических критериев ХОБЛ.

2. Принимая во внимание эффективность воздействия липосомальных форм фенотерола относительно проявлений экспериментальной БА, целесообразно дальнейшее изучение этой проблемы с учетом полученных данных о влияние липосом различного состава на биохимические показатели воспаления и обструкции дыхательных путей.

Список работ опубликованных по теме диссертации. Кулакова Н.В. Исследование жидкости бронхоальвеолярного лаважа для диагностики хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы // Проблемы эксперим., клинич. и профилактической медицины Дальнем Востоке. Тезисы докладов 37 научно-практической конференции. Владивосток. 1996. С. 78.

Кулакова Н.В., Гельцер Б.И., Рубашек И.А. Влияние свободной и липосомальных форм фенотерола на содержание биогенных аминов при бронхообструктивном синдроме // Тезисы докладов 7 Конгресса пульмонологии июль 1997. Москва. С.23. № 63.

3. Кулакова Н.В., Лукьянов П.А., Невзорова В.А., Рыбин В.Г. Рол липоксигеназных метаболитов арахидоиовой кислоты в патогенез бронхообструктивного синдрома и их коррекция липосомальными формам фенотерола.// Тезисы сообщений 2 съезда Биохимического общества. Москва. 19 23 мая. 1997. С. 449.

4. Кулакова Н.В. Биохимические показатели терапетической эффективност липосомальной формы фенотерола. // Тезисы докладов. Региональна естественнонаучная конференция. Владивосток. 3-5 декабря. 1997. С. 99.

5. Кулакова Н.В., Лукьянов П.А., Невзорова В.А., Корякова А.Г. Нова лекарственная форма фенотерола р2-агониста, применяемого при терапии астм: // Тезисы докладов 8 Конференция «Новые направления биотехнологии». Апрел 1998. Москва. С.79.

6. Кулакова Н.В., Лукьянов П.А., Невзорова В.А., Корякова А.Г, Гельцер Б.Р Использование липосомального фенотерола в терапии экспериментально бронхиальной астмы // Материалы 2 Дальневосточной регионально конференции. «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке». 27-2 апреля. Владивосток, 1998. С.21-22.

7. Кулакова Н.В., Лукьянов П.А., Невзорова В.А. и др. Биофизические биохимические показатели терапевтической эффективности липосомально формы фенотерола // Материалы научной конференции ТИБОХ ДВО РА «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии Владивосток: Дальнаука. 1998. С. 5-7.

8. Кулакова Н.В., Гельцер Б.И. Коррекция уровня метаболитов оксида азот липосомальными формами фенотерола при бронхообструктивном синдроме Тезисы докладов 8 Конгресса пульмонологии. Москва, октябрь 1998. С.ЗО. №

94.

9. Кулакова Н.В., Гельцер Б.И. Эффективность ингаляционного введен! липосомальных форм фенотерола при экспериментальной бронхиальной астме. Тезисы докладов 8 Конгресса пульмонологии. Москва, октябрь 1998. С.ЗО. №

95.