Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Эффективность экстракорпоральных методов в коррекции тромбоцитарно-коагуляционного гемостаза у больных панкреонекрозом

На правшс.рукопи

ВЕЛЬСКИХ Леонид Владиславович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ В КОРРЕКЦИИ ТРОМБОЦИТАРНО-КОАГУЛЯЦИОННОГО ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ ПАНКРЕОНЕКРОЗОМ

14.01.24 - трансплантология и искусственные органы

2 8 ОКТ 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2015

005564086

Работа выполнена в государственном бюджетном учреждении здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского».

Федеральном государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук,

профессор Ватазин Андрей Владимирович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Калинин Николай Николаевич — доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением экстракорпоральных методов лечения Медицинский научно-образовательный центр Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Резник Олег Николаевич — доктор медицинских наук, руководитель отделом трансплантологии и трансплантационной нефрологии с клиникой Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт хирургии имени A.B. Вишневского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «24» ноября 2015 г. в 15 — часов на заседании диссертационного совета Д 208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»» Минздрава России по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и на сайте http://www.transpl.ru

Ученый секретарь диссертационного совета Д 2( кандидат ветеринарных наук

Автореферат разослан «_

Волкова Елена Алексеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Различные методики экстракорпоральной гемокоррекции - гемофильтрация, гемоперфузия, плазмаферез широко используются для коррекции нарушений, возникающих у больных острым панкреатитом, как в фазе эндотоксемии и эндотоксического шока, так и в фазе гнойных осложнений [5, 196]. Вместе с тем современная медицина располагает селективными методами гемокоррекции, которые способны оказывать избирательное действие на основные звенья патогенеза целого ряда заболеваний, связанных с эндотоксемией, включая панкреонекроз [180, 177].

Грозным осложнением панкреонекроза является развитие ДВС синдрома. Поэтому выявление ранних признаков прогрессирования гемостазиологических нарушений и их своевременная коррекция остаются актуальной задачей. Нарушения периферического кровообращения с развитием пролонгированной формы ДВС-синдрома существенно затрудняют тканевой метаболизм, усугубляют гипоксию, способствуют дистрофическим и некробиотическим процессам в органах и тканях [3, 110, 126,152, 156].

В 15-20% наблюдений развитие острого панкреатита носит деструктивный характер. При панкреонекрозе у 40-70% больных происходит инфицирование очагов некротической деструкции. Инфекционные осложнения составляют 80% причин смерти больных с деструктивным панкреатитом [86, 90, 185, 193].

Для некротического панкреатита, в основе которого лежит местная воспалительная реакция на ферментную агрессию, характерно развитие органных нарушений. Системная воспалительная реакция и полиорганная дисфунция/недостаточность при панкреонекрозе определяют интегральную тяжесть состояния больного, прогноз заболевания и выбор оптимальной тактики лечебных мероприятий [38,41, 106, 171,183].

Нарушения в системе гемостаза можно рассматривать в качестве маркера степени тяжести панкреонекроза и одного из критериев эффективности терапии. Известно, что важную роль в системе регуляции агрегатного состояния крови играют тромбоциты, отвечающие за начальный этап гемостаза. Широкий диапазон функциональной активности этих клеток предполагает их участие в обеспечении коагуляции, репарации сосудистой стенки, депонировании и транспорте биологически активных соединений, осуществлении защитных реакций организма [65, 126, 198].

Такая полифункциональность, высокая реактивность и возбудимость тромбоцитов позволяют рассматривать их как один из наиболее удобных и информативных объектов для тестирования тяжести эндотоксикоза и нарушений коагуляционного потенциала.

В связи с этим изучение гетерогенности тромбоцитов при данном патологическом процессе с применением новейших методов компьютерной

цитометрии является несомненно актуальным и перспективным. Исследование морфофункционального статуса тромбоцитов при панкреонекрозе может иметь важное значение в плане диагностики и оценки степени тяжести заболевания. Детализация некоторых аспектов патогенеза расстройств в системе крови и в других органах и тканях открывает пути к повышению эффективности коррекции подобных состояний.

Такие методы селективной гемокоррекции, как селективная сорбция цитокинов в сочетании с гемофильтрацией (CPFA - coupled plasmafiltration-adsorption, англ., СПФА -сочетанная плазмофильтрация и адсорбция) и обменный плазмаферез (ОП), воздействуя на основные звенья патогенеза синдрома ДВС и полиорганной недостаточности, открывают новые возможности в лечении этой крайне тяжелой категории больных, что и явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования. Повышение эффективности лечения больных панкреонекрозом путем коррекции тромбоцитаро-коагуляциокного потенциала методом сочетанной плазмофильтрации с адсорбцией цитокинов в сочетании с плазмообменом.

Задачи исследования. Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ эффективности методов экстракорпоральной гемокоррекции и общепринятых методов комплексного лечения панкреонекроза.

2. Определить роль сочетанной плазмофильтрации с адсорбцией цитокинов и обменного плазмафереза в коррекции показателей тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза при панкреонекрозе;

3. Изучить особенности морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови больных панкреонекрозом в различные фазы заболевания и в процессе лечения с использованием методов экстракорпоральной гемокоррекции;

4. Проанализировать информационно-коррелятивные связи морфометрических показателей тромбоцитов с данными традиционной гемостазиограммы, определить их диагностическую и прогностическую значимость при оценке риска развития ДВС-синдрома;

5. Предложить комплекс информативных критериев на основе данных компьютерной морфометрии тромбоцитов, позволяющих индивидуализировать и оптимизировать тактику детоксикационного лечения больных панкреонекрозом.

Научная новизна. Проведен ретроспективный анализ эффективности экстракорпоральных методов в коррекции тромбоцитано-коагуляционного потенциала и общепринятых методов комплексного лечения панкреонекроза.

Предложены количественные критерии оценки эффективности эфферентной терапии у больных с панкреонекрозом в стадии ферментативного шока и фазе гнойных осложнений.

Определены особенности морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови больных панкреонекрозом, определена роль и значение нарушений тромбоцитарного гемостаза в патогенезе панкреонекроза в различные фазы заболевания.

Установлены клинико-морфологические параллели между степенью тяжести панкреонекроза и структурно-функциональными изменениями тромбоцитов периферической крови и коагуляционного потенциала.

Выявлены и количественно оценены закономерности изменения морфофункционального состояния тромбоцитов у больных панкреонекрозом при проведении сочетанной плазмофильтрации с адсорбцией цитокинов и обменного плазмафереза в различные фазы патологического процесса.

Практическая значимость.

Определены влияние сочетанной плазмофильтрации и адсорбции цитокинов в сочетании с обменным плазмаферезом на тромбоцитарно-коагуляционный гемостаз и роль этих методов в коррекции патогенетических нарушений на этапах хирургического лечения панкреонекроза

Полученные сведения о морфофункциональных изменениях клеточного звена гемостаза являются важными для клинической медицины, в частности для разработки и применения искусственных органов, поскольку дают дополнительную ценную информацию о патогенетических механизмах формирования и прогрессирования гемостазиологических нарушений, выявления ранних признаков синдрома ДВС и его коррекции при применении экстракорпоральных методов.

Предложенные морфометрические критерии оценки нарушений тромбоцитарно-коагуляционного потенциала позволили оптимизировать режимы проведения процедур гемокорекции, реализовать принцип патогенетической обоснованности их применения на этапах хирургического лечения панкреонекроза и улучшить результаты лечения этой тяжелой категории хирургических больных.

Внедрение результатов в практику. Полученные результаты внедрены в практическую деятельность отдела трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, отделения реанимации ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и ГБУЗ МО «Люберецкая районная больница № 2». Материалы использованы в педагогической деятельности на кафедре трансплантологии, нефрологии и искусственных органов ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Апробация материалов диссертации. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: 13th internationalconference "Highmedicaltechnologiesin XXI century" (Spain, Benidorm, October 25-November 01,

2014); «Современные конвергентные технологии в сфере науки, культуры и образования» (в рамках IX Московской научно-практической конференции «Студенческая наука» (24-25 ноября 2014, Москва); VIII Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 17-20 марта, 2015); Международной научно-практической конференции ЦФО РФ «Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокоррекции и гемафереза» (Москва-Тверь, 13-15 мая, 2015). Апробация работы проведена на совместной научной конференции отдела трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции, отделения планирования и координации научных исследований ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры трансплантологии, нефрологии и искусственных органов ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; отдела клинической трансплантологии, отделения гемодиализа, отделения иммунологического мониторинга, отдела эндотоксикозов и гнойно-септических осложнений ФГБУ «ФНЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России 23.06.2015г.

Работа выполнена в отделе трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского (руководитель, д.м.н., профессор A.B. Ватазин), отделении иммунологического мониторинга ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России (заведующая, к.м.н. O.E. Гичкун) и лаборатории медицинской цитологии Научно-исследовательского центра ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России (руководитель, д.м.н., профессор И.А. Василенко).

Публикации. Результаты исследований отражены в 8 публикациях (3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, и 5 тезисах докладов, представленных на международных и отечественных научных форумах).

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Сочетанная плазмофильтрация с адсорбцией цитокинов и обменный плазмаферез являются эффективными и патогенетически обоснованными методами коррекции показателей тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза при панкреонекрозе.

2. Исследование морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов и динамика провоспалительных цитокинов могут служить информативными критериями эффективности детоксикационной терапии при панкреонекрозе.

3. Уровень нарушений тромбоцитарного гемостаза в различные фазы панкреонекроза может быть количественно оценен с использованием показателей морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов.

Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, суммирующих собственные данные исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 198 (124 отечественных и 74 зарубежных) источников литературы. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 15 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

В работе суммированы результаты комплексного обследования и лечения 90 больных с острым деструктивным панкреатитом средней и тяжелой степени на ранней (ферментативной - 50 больных) и поздней (секвестрации и расплавления - 40 больных) фазах развития заболевания. Мужчин - 59, женщин — 31.

Для определения морфометрических показателей нормы тромбоцитов была обследована группа (20) соматически здоровых лиц обоего пола (11 женщин и 9 мужчин) в возрасте 22 - 54 лет (средний возраст- 47,8±4,6 лет).

У 30 больных в ферментативной фазе в комплексе лечебных мероприятий был применен обменный плазмаферез (ПА); 20 больных, поступивших в ферментативной фазе, получали общепринятую консервативную терапию и составили группу сравнения. У 20 больных в фазе гнойных осложнений панкреонекроза была применена сочетанная плазмофильтрация и адсорбции цитокинов (СПФА). Еще у 20 больных в фазе секвестрации была выполнена гемофильтрация (ГФ). Процедуру ПА проводили на аппарате PCS 2 «Haemonetics».06beM плазмафереза составлял 1115,0+120 мл. за одну процедуру. Плазмопотерю компенсировали адекватным количеством свежезамороженной донорской плазмы и альбумином. Проводили от 2-х до 5-ти сеансов плазмафереза с интервалом не более 2-х суток между процедурами.20 больным с деструктивным панкреонекрозом в фазе секвестрации и расплавления проводились процедуры (СПФА). У каждого больного проведено от 1-ой до 3-х процедур с интервалом 24-48 часов и более. СПФА проводили на аппарате Lynda (Bélico, Италия) с использованием картриджа Mediasorb (рисунок 1).

Помимо этого еще у 20 больных проводили изолированную гемофильтрацию (ГФ) в режиме постдилюции. Доза гемофильтрации подбиралась индивидуально в интервале 35- 45 мл/кг/час.

Для витальной оценки морфофункционального состояния клеток периферической крови (тромбоцитов) использовали метод лазерной фазометрии клеток крови. Исследования проводили на базе отечественного компьютерного лазерного фазово-интерференционного микроскопа "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва), представляющего собой интерферометр Линника на базе модифицированного и автоматизированного МИИ-4 (ЛОМО, Ленинград).

е.; у Оститу»!

Гемофимыр

П---------ТГЬ

Фильтрат кГ Плэзмофильтр —

''-1—1Г-гг - - Ф- -

» -

, ' . Картридж Амтикоягупямт V ' "Мек^айОгЬ

Рисунок 1. Схема сочетанной плазмофильтрации с селективной адсорбцией цитокинов.

Количественный анализ данных производили отдельно с помощью программных средств, разработанных в среде МАТЬАВ. Схема КФМ представлена на рисунке 2.

Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды МаЛаЬ и математического пакета '^а^БЙса 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратического отклонения и анализа асимметричности распределения.

В

льозо-лреобраэоеагель

И!'\л/ I_,

эпяюронный блок ]

1 г

Рисунок 2. Метод витальной компьютерной фазовой морфометрии (КФМ) А - концепция КФМ; В - принцип действия фазово-интерференционного комплекса «Цитоскан»

Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Вилкоксона-Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова или Стъюдента Уровень значимости устанавливался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.Морфофункциональные особенности тромбоцитарного звена гемостаза у больных с панкреонекрозом в различные фазы заболевания

Развитие дисфункции системы гемокоагуляции у больных с панкреонекрозом представляют собой один из узловых патогенетических звеньев данного заболевания. В связи с этим изучение гетерогенности тромбоцитарного звена при данном

патологическом процессе с применением новейших методов компьютерной цитометрии является несомненно актуальным.

Морфофункциональное состояние тромбоцитов периферической крови больных с панкреонекрозом в ферментативной фазе заболевания.

Данные рутинных гемостазиологических исследований суммированы в таблице 1. У обследованных на момент их поступления в стационар были обнаружены нарушения в системе гемостаза, свидетельствующие о признаках увеличения потенциала свертывания крови (гиперкоагуляции).

Таблица 1

Результаты гемостазиологических исследований периферической крови

больных панкреонекрозом в ферментативной фазе (М±5)

Показатель, (норма) Группы

Здоровые добровольцы Больные панкреонекрозом в ферментативной фазе

Плазменное звено

АЧТВ, сек(30-40) 32,5 ±2,7 27,3 ± 0,5*

Фибриноген, г/л(2-4) 2,1 ±0,5 4,4 ±0,1*

ПТИ,% (90-105) 93,2 ±7,1 79,1 ± 1,6*

Антитромбин III, г/л 113,5 ±0,05 137,2 ±3,3*

Тромбоцитарное звено

Агрегация тромбоцитов (АДФ),% (30-50) 33,2 ±5,8 49,5 ± 6,9*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

Компьютерный анализ фазово-интерференционных изображений живых функционирующих тромбоцитов позволили выделить и идентифицировать 4 морфологических типа живых тромбоцитов, характеризующих ту или иную степень их активации.

Различные функциональные типы живых тромбоцитов периферической крови, идентифицированные методом real-time визуализации, приведены на рисунке 3.

Рисунок 3. Фазово-интерференционные портреты живых тромбоцитов периферической крови (I - тромбоцит «покоя»; II - тромбоцит с низким уровнем активности; III - высоко активированный тромбоцит; IV - дегенеративно-измененные тромбоцит).

Установлено, что у соматически здоровых лиц, составивших контрольную группу, 63% тромбоцитов представлены клетками «покоя», 21% - тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип).Количество клеток с длинными отростками-«антеннами» составляет 12% (III тип), а дегенеративно-измененных (IV тип) - всего 4% (Таблица 2.).

Таблица 2

Морфологические типы (I, И, III, IV) тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев и больных с панкреонекрозом в ферментативной фазе (М±5)

Группы Морфологические типы тромбоцитов (%)

I II III IV

Здоровые добровольцы 63,1 ±4,7 20,9±2,1 12,3±1,8 3,7±1,1

Больные панкреонекрозом в ферментативной стадии 51,3±4,3* 25,1±3,2 15,5±2,1 8,1±1,9*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

У больных с панкреонекрозом в ферментативной фазе (Таблица 2) процент тромбоцитов «покоя» составил 51,3, что практически на 12% ниже контрольных значений.

Увеличилось число активированных тромбоцитов: при этом 25,1% клеток были представлены тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип); 15,5% -высоко активированных клеток (III тип). В 2 раза возросло количество

дегенеративно-измененных тромбоцитов - 8,1%.Увеличилось число активированных тромбоцитов: при этом 25,1% клеток были представлены тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип); 15,5% - высоко активированных клеток (III тип).Увеличилось число активированных тромбоцитов: при этом 25,1% клеток были представлены тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип); 15,5% - высоко активированных клеток (III тип). В 2 раза возросло количество дегенеративно-измененных тромбоцитов - 8,1%.

Таблица 3

Размерные параметры тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев и больных с панкреонекрозом в ферментативной фазе

заболевания (М±5)

Группы (D), мкм (Р), мкм (Н), мкм (S), мкм2 (V), мкм3

Здоровые добровольцы 2,6 ± 0,8 8,2 ±3,4 1,2 ±0,5 4,6 ±2,1 1,8 ± 1,3

Больные панкреонекрозом в ферментативной стадии 3,2±1,1* 9,7±3,6* 1,0±0,4* 5,9±2,1* 2,2±1,1*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

В таблице 3 суммированы средние в популяции размерные показатели тромбоцитов периферической крови. Обращает внимание увеличение средних по популяции значений диаметра (на 30% и более), периметра (на 19,5%) и площади (на 41,3%) циркулирующих тромбоцитов. По-видимому, выявленные изменения связаны с появлением высокого процента активированных тромбоцитов и дегенеративно-измененных пластинок.

Таким образом, по данным КФМ при ферментативной фазе панкреонекроза наблюдается перестройка тромбоцитарного звена гемостаза, которая проявляется как в изменении морфологии клеток, так и в изменении их функциональной активности. Полученные результаты вполне закономерны и объясняются патофизиологическими механизмами развития воспаления. Триггерные факторы патологического процесса запускают не только коагуляционную систему, но и фибринолитическую.

Морфофункциональнов состояние тромбоцитов периферической крови больных с панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложнений

Данные рутинных гемостазиологических исследований у больных с панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложнений суммированы в таблице 4.

Полученные результаты отражают признаки стадии декомпенсированной активации системы гемостаза и стадии коагулопатии потребления у данной

категории больных: удлинение АЧТВ; увеличение ПТИ; снижение уровня тромбоцитов и фибриногена.

Таблица 4

Результаты гемостазиологических исследований периферической крови больных панкреонекрозом в фазе секвестрации (М±5)

Группы

Показатель, Здоровые Больные

(норма) добровольцы панкреонекрозом в фазе секвестрации

Плазменное звено

АЧТВ, сек(30-40) 32,5 ± 2,7 45,7 ±3,5*

Фибриноген, г/л(2-4) 2,1 ±0,5 1,2 ±0,1*

ПТИ, %(90-105) 93,2 ±7,1 109,3 ±4,3*

Антитромбин III, г/л 113,5 ±0,05 96,9 ± 4,7*

Тромбоцитарное звено

Агрегация тромбоцитов 33,2 ±5,8 25,7 ±4,1*

(АДФ),% (30-50)

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05 Агрегационная способность тромбоцитов в данной группе оказалась достоверно ниже. Зарегистрированные признаки развившейся коагулопатии потребления проявились на фоне клинических признаков ДВС-синдрома.

Соответствующие изменения зарегистрированы при КФМ (Таблица 5).

Таблица 5

Морфологические типы (I, II, III, IV) тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев и больных с панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложнений (М±8)

Группы Морфологические типы тромбоцитов (%)

I II III IV

Здоровые добровольцы 63,1 ±4,7 20,9±2,1 12,3±1,8 3,7±1,1

Больные панкреонекрозом в фазе гнойных осложнений 42,3±3,8* 34,2±3,2* 11,0±1,9 12,5±1,7*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

Процент тромбоцитов «покоя» составил всего 42,3, что практически в 1,5 раза ниже контрольных значений. 34,2% клеток были представлены тромбоцитами с низким уровнем активации (II тип); 11,0% - высоко активированных клеток (III тип). Количество дегенеративно-измененных тромбоцитов превысило 12,5%.

В таблице 6 суммированы средние в популяции размерные показатели тромбоцитов периферической крови. Обращает внимание увеличение средних по

популяции значений диаметра (на 30% и более), периметра (на 19,5%) и площади (на 41,3%) циркулирующих тромбоцитов у обследованных больных. По-видимому, выявленные изменения связаны с появлением высокого процента активированных тромбоцитов и дегенеративно-измененных пластинок.

Таблица 6

Размерные параметры тромбоцитов периферической крови соматически здоровых лиц и больных с панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных

осложнений(М±6)

Группы (Б), мкм (Р), мкм (Н), мкм (Б), мкм2 (V), мкм3

Здоровые добровольцы 2,6 ± 0,8 8,2 ± 3,4 1,2 ±0,5 4,6 ±2,1 1,8 ± 1,3

Больные панкреонекрозом в фазе гнойных осложнений 3,7 ±1,2* 10,4±5,8* 0,8±0,4* 6,9±3,1* 2,6±1,2*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

Полученные результаты свидетельствуют, что морфометрические параметры циркулирующих тромбоцитов могут рассматриваться в качестве информативных критериев уровня нарушений в системе гемостаза.

Корреляционный анализ результатов витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов и данных гемостазиограммы

В результате корреляционного анализа выявлены достоверные корреляционные взаимоотношения между морфометрическими параметрами тромбоцитов, содержанием различных морфологических типов клеток и наиболее важными показателями агрегатограммы (Рисунок 4).

Для I морфологического типа - тромбоциты «покоя» (дискоциты) - характерно наличие достоверных отрицательных корреляций с величиной максимального наклона амплитуды агрегатограммы при использовании в качестве индуктора АДФ (г=-0,75, р<0,05), а положительных - с активностью факторов протромбинового комплекса (АПК) (г=0,61, р<0,05). Для II типа - клетки с низкой степенью активации (эхиноциты 1 уровня) установлены достоверные положительные корреляции с максимальной амплитудой агрегатограммы при использовании в качестве индуктора АДФ ((=-0,57, р<0,05).Для тромбоцитов IV морфологического типа — дегенеративно-измененные клетки — коэффициенты корреляции с величинами максимальной амплитуды, максимального наклона амплитуды агрегатограмм, максимального среднего радиуса агрегата при спонтанной агрегации (г=0,61, 0,65, 0,68 соответственно).

Диаметр Периметр Высота Площадь Объем 1тип

+ +

+ + +

2тип

Зтип

4тип

+ + D + + + +

А макс НА макс макс макс макс НА макс Р макс А макс НА макс АПК

АДФ Коллаген

Рисунок 4. Корреляционный анализ результатов морфометрии и данных агрегатограммы. Ама„ - максимальная амплитуда агрегатограммы; НАМ„С - максимальный наклон амплитуды агрегатограммы; Рмаке - максимальный средний радиус агрегата; С„„с - максимальная скорость образования агрегата; АПК - активность факторов протромбинового комплекса. (Красные-положительные и отрицательные достоверные корреляции; зеленые-положительные - и отрицательные недостоверные корреляции)

Процент дегенеративных, исчерпавших свой функциональный резерв, клеток положительно коррелирует с максимальной скоростью образования агрегата при использовании в качестве индуктора коллагена (г=0,59, 0,61, 0,65, 058, соответственно). При анализ средних в циркулирующей популяции морфометрических показателей тромбоцитов выявлены достоверные корреляции с рядом параметров агрегатограммы. Для величины среднего диаметра и площади тромбоцитов установлены отрицательные достоверные связи с АПК - активностью факторов протромбинового комплекса (г=0,75 и 0,63, соответственно).Фазовая высота и объем клеток отрицательно коррелируют с величинами максимальной амплитуды и максимального наклона амплитуды агрегатограмм при использовании в качестве индуктора коллагена (г=0, 65 и 0,63; 0,65 и 0,68, соответственно).

Представленные результаты дают основание сделать вывод, что использование экспресс метода real-time визуализации тромбоцитов в условиях клинического стационара является целесообразным и оправданным, поскольку позволяет в рамках одного метода оперативно оценить индивидуальные изменения размерных показателей каждого тромбоцита, проанализировать структуру популяционного состава клеточного звена гемостаза, выявить уровень функциональной

полноценности циркулирующих клеток и косвенно оценить возможные изменения показателей тромбоцитов в традиционных функциональных тромбоцитарных тестах.

2. Динамика морфометрических параметров тромбоцитов и профиля цитокинов при проведении плазмообмена и СПФА.

Эффективное лечение острого панкреатита помимо базисного лечебного комплекса подразумевает активное применение методов позволяющих выводить эндотоксины из внутренней среды организма, т.е. методы экстракорпоральной гемокоррекции

Влияние обменного плазмафереза на показатели тромбоцитарного гемостаза у больных с панкреонекрозом в фазу эндотоксикоза (эндоферментной интоксикации)

Больные были разделены на 2 группы: 30 пациентам с панкреонекрозом в ферментативной фазе проводились сеансы плазмафереза, 20 больных составили ретроспективную группу сравнения, которым плазмаферез не применялся.

Количество ТР

^^Норма -СНДо плазмафереза »■^■После курса плазмафереза

Рисунок 5. Динамика показателей гемостаза у больных панкреонекрозом в

ферментативной фазе до и после курса плазмафереза

Эффективность проводимого лечения оценивали по результатам гемостазиологических исследований и компьютерной морфометрии тромбоцитов периферической крови.

На рисунке 5 представлена динамика показателей гемостаза у больных панкреонекрозом до и после курса плазмафереза. Исследования показали, что после плазмафереза большинство показателей приблизилось к значениям нормы.

Анализ морфологической структуры популяции тромбоцитов выявил, что благодаря включению эфферентной терапии в комплекс лечебных мероприятий

больных с панкреонекрозом наблюдается нормализация активационного статуса тромбоцитарного звена гемостаза (Таблица 7).

Таблица 7

Морфологические типы (I, II, III, IV) тромбоцитов периферической крови в

Группы Морфологические типы тромбоцитов (%)

I II III IV

После ПА 53,8±5,1 28,2±2,9 13,3±1,9 4,7±1,3

Группа сравнения (без ПА) 48,1±4,6 26,3±3,1 15,1±2,1 10,5±2,1*

» —------1---- - им^^инии ' При

Является очевидным, что у пациентов, которым плазмаферез не применялся, в циркуляции оставался не только высокий процент активированных клеток, но и большое количество дегенеративных, исчерпавших свой функциональный резерв тромбоцитов (10,5%). Морфометрические показатели циркулирующих клеток в группе больных с плазмаферезом в среднем уменьшились на 10-15% по отношению к исходным данным. В то время как у пациентов, не получавших ПА, размерные показатели клеток оставались практически на первоначальных значениях.

Таблица 8

Морфометрические параметры тромбоцитов периферической крови больных до

Группы Диаметр (Б), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (8), мкм2 Объем (V), мкм3

До ПА 3,2±1,1 9,7±3,6 1,0±0,4 5,9±2,1 2,2±1,1

После ПА 2,9±0,9* 8,2±3,1* 1,1±0,3 5,1±2,5* 2,1±0,8*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

Таким образом, плазмаферез оказывает нормализующее влияние на функцию тромбоцитарного звена гемостаза у больных с панкреонекрозом: приближаются к нормальным размерные параметры клеток, снижается содержание активированных тромбоцитов, уменьшается процент дегенеративно-измененных клеток, нормализуются показатели гемостазиограммы (Таблица 8). Полученные данные коррелируют с летальностью. Так, в группе сравнения летальность составила 45%. в основной группе - 13,3%.

Морфометрические показатели тромбоцитов и уровни цитокиновкак критерии эффективности СПФЛ у больных с панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложнений

40 больных основной группы с панкреонекрозом в фазе секвестрации переведены в МОНИКИ им. М.Ф. Владимирскогоиз других медицинских организаций Московской области в связи с прогрессирующим течением перитонита,

гнойными осложнениями панкреонекроза и др. В комплексное лечение всех больных были включены операции СПФА (20 больных) и изолированная ГФ (20 больных).На рисунке 6 представлена динамика показателей гемостаза у больных панкреонекрозом до и после СПФА. Исследования продемонстрировали эффективное влияние операций сочетанной плазмофильтрации с селективной адсорбции цитокинов.

тв

—Норма —О—До СПФА —^После СПФА

Рисунок 6. Динамика показателей гемостаза у больных панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложнений до и после СПФА, ТВ - тромбиновое время (с); ПТВ - протромбиновое время (с); ПТИ - протромбиновый индекс (%); ФА -фибринолитическая активность (мин).

Полученные нами данные продемонстрировали также высокую чувствительность и информативность морфометрических показателей тромбоцитов при оценке эффективности СПФА (Таблица 9).

Таблица 9

Морфологические типы (I, II, III, IV) тромбоцитов периферической крови больных с панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложнений до и после

СПФА (М±5)

Группы Морфологические типы тромбоцитов (%)

I II III IV

до СПФА 42,3±4,4 34,2±3,1 11,0±1,8 12,5±1,4

после СПФА 51,2±4,7* 27,3±3,1 * 15,4±2,1 * 6,1±2,1 *

Примечание: * - достоверно относительно показателей до КПФиАЦ, при р< 0,05

Как видно из таблицы 9 в циркуляции наблюдалось изменение морфологической структуры популяции тромбоцитов: увеличение форм покоя практически на 10%, и снижение количества дегенеративных, исчерпавших свой функциональный резерв тромбоцитов (6,1%). При анализе морфометрических показателей клеток (Таблица 10) наиболее информативной оказалась динамика средне-популяционного диаметра тромбоцитов. Однако внутригрупповые изменения этого клеточного показателя были далеко не однозначны: у 5 (25%) пациентов

наблюдалась нормализация среднепопуляционного диаметра клеток. Эти больные продемонстрировали положительную клиническую динамику. У 15 пациентов величина диаметра циркулирующих клеток или оставалась на прежних значениях, или продолжала прогрессивно увеличиваться. В этой подгруппе у 9 больных развились гнойные осложнения, летальность составила 35%.

Таблица 10

Морфометрические параметры тромбоцитов периферической крови больных с синдромом ПОН до и после проведения СПФА

Группы Диаметр (Э), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (Б), мкм2 Объем (V), мкм3

До СПФА 3,7±1,2 10,4±5,8 0,8±0,4 6,9±3,1 2,6±1,2

После СПФА 3,5±1,2 10,0±5,6 0,9±0,3 7,2±5,5 2,7±1.8

5 сутки после СПФА 3,1 ±0,9* 9,5±4,1* 1,0±0,3 6,3±4,1* 2,1±1,1*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р< 0,05

Не исключено, что у этих пациентов прогрессирующее увеличение морфометрических параметров связано с необратимыми патологическими изменениями морфологического субстрата клеток и нарушением их функциональной полноценности. Регистрация таких изменений показывает отсутствие эффективности проводимого лечения и является неблагоприятным прогностическим признаком.

Помимо динамики морфометрических показателей тромбоцитов мы изучили также влияние процедуры на концентрацию цитокинов в ходе лечения. При проведении СПФА наиболее выраженным было снижение концентрации провоспалительных цитокинов - ФНОа и ИЛ-6 (Рисунок 7)

400 350 300 250 200 150 100 50 0

I I ГI

до 2ч 4ч йч 8ч 10ч :12ч ■ СПФА ИГФ

350 300 250 200 150 100 50 0

Н+н1

до 2ч 4ч 6ч 8ч 10ч 12ч ■СПФА «ГФ

Рисунок 7. Динамика концентрации ФНОа(слева) и ИЛ-6 (справа) до и после СПФА и ГФ

Видно, что концентрации ФНОа и ИЛ-6 снижаются значительно более интенсивно при селективной адсорбции цитокинов. При этом в первые часы гемофильтрации отмечался даже небольшой рост концентрации ФНОа, что может быть обусловлено дренированием внесосудистой жидкости в сосудистое русло. Весьма важно, что в процессе СПФА не отмечено существенного снижения концентрации противовоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-4 (Рисунок 8)

до 2ч 4ч 6ч 8ч 10ч 12ч яСПФА «ГФ

■ СПФА «ГФ

Рисунок 8. Динамика концентрации ИЛ-Ю(слева) и ИЛ-4 (справа) при СПФА и

ГФ.

Таким образом, снижение концентрации провоспапительных цитокинов в ходе СПФА и менее выраженная динамика концентрации противоспалительных цитокинов может свидетельствовать о снижении активности системной воспалительной реакции, что безусловно благоприятно влияет на эффективность лечения панкреонекроза в фазе гнойных осложнений.

Представленные результаты позволяют заключить, что использование в комплексе лечебных мероприятий у больных панкреонекрозом в фазе секвестрации и гнойных осложненй СПФА с целью обеспечения высокоэффективной детоксикации организма больного является патогенетически обоснованным. Исследование позволило предложить для практического использования количественные критерии оценки эффективности детоксикационных мероприятий и прогнозирования неблагоприятного исхода полиорганной недостаточности в режиме реального времени. Полученные результаты компьютерной морфометрии тромбоцитов позволяют оперативно оценить эффективность проводимых процедур и могут быть использованы в качестве прогностических критериев исхода заболевания, т.е. вероятности развития осложнений и летальности.

ВЫВОДЫ

1. Активное использование методов экстракорпоральной гемокоррекции, в сравнении с общепринятыми методами комплексного лечения, позволяет повысить эффективность лечения панкреонекроза; снизить летальность в 2 раза, а частоту гнойных осложнений в 2,75 раза

2. Сочетанная плазмофильтрация с адсорбцией цитокинов и обменный плазмаферез являются эффективными методами коррекции тромбоцитарно-коагуляционного потенциала у больных панкреонекрозом в фазе эндотоксемии и фазе гнойных осложнений.

3. Уровень нарушений тромбоцитарного гемостаза в различные фазы панкреонекроза может быть количественно оценен с использованием показателей морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов. При коагуляционном варианте ДВС синдрома отмечается выраженная гетерогенность популяции тромбоцитов, увеличение их размерных параметров на 15-20% и рост числа активированных клеток до 40% и более. При развитии коагулопатии потребления характерно прогрессирующее увеличение дегенеративных тромбоцитов до 10% и более. В случае использования экстракорпоральных методик отмечается нормализация морфометрических показателей и активационного статуса тромбоцитов.

4. Существуют достоверные корреляции между морфометрическими параметрами тромбоцитов, содержанием различных морфологических типов клеток и показателями агрегатограммы: содержание форм покоя отрицательно коррелирует с АДФ-агрегацией (г=-0,75, р<0,05), положительно - с активностью факторов протромбинового комплекса (г=0,61, р<0,05). Количество активированных форм положительно коррелирует АДФ-агрегацией (i=-0,57, р<0,05).

5. Морфометрические показатели тромбоцитов являются информативными и объективными критериями состояния тромбоцитарного гемостаза, обладают диагностической и прогностической значимостью при оценке тяжести гемостазиологических нарушений, степени эндогенной интоксикации, развития гнойно-септических осложнений и риска летальных исходов заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с панкреонекрозом в ферментативной фазе патологического процесса рекомендуется проводить от 2 до 5 сеансов плазмафереза с интервалом не более 48 часов между процедурами.

2. Пациентам с деструктивным панкреонекрозом в фазе секвестрации и расплавления показаны операции сочетанной плазмофильтрации с адсорбцией цитокинов (СПФА) от 1 до 3 процедур с интервалом 24-48 часов и более.

3. Критериями эффективности проводимых лечебных мероприятий могут служить морфометрические параметры циркулирующих тромбоцитов, полученные экспресс-методом real-time визуализации. Преимуществами такого подхода

являются минимальный объем крови (до 0,5 мл), отсутствие необходимости применения реактивов и дополнительного оборудования, оперативная количественная оценка нарушений морфологии и функциональной активности тромбоцитов, тонко реагирующих на любые изменения гомеостаза.

4. Контроль морфометрических показателей тромбоцитов целесообразно осуществлять как на начальном этапе лечения в фазе эндотоксемии, так и в ходе проведения процедур экстракорпоральной гемокоррекции с целью контроля тяжести и прогрессирования эндотоксикоза и оценки эфективности лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ватазин A.B., Василенко И.А., Фомин A.M., Вельских Л.В., Матвеева A.B. Витальные показатели тромбоцитов как критерии эффективности методов детоксикации у больных с панкреонекрозом И Альманах клинической медицины. — 2014. -№30. - С.76-82.

2. Вельских Л.В., Зулькарнаев А.Б., Василенко И.А., Ватазин A.B. Сочетанная плазмофильтрация, селективная адсорбция цитокинов с гемофильтрацией и плазмообмен в коррекции тромбоцитарно-коагуляционного гемостаза при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2015. - Том 17., №2. -С.51-59.

3. Вельских Л.В., Василенко И.А., Ватазин A.B. Real-time визуализация тромбоцитов в оценке нарушений гемостаза тромбоцитарно-коагуляционного потенциала при панкреонекрозе. // Глобальный научный потенциал. - 2015. - №8 (53). - С. 30-34

4. Василенко И.А., Метелин В.Б., Вельских Л.В., Насыров М.Р., Кузнецов А.Б., Беляков В.К., Агаджанян Б.Я. Клетка как биосенсор в диагностике социально-значимых заболеваний. // VIII Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития"/ Сборник тезисов. (Москва, 1720 марта, 2015).-С. 27.

5. Vasilenko I.A., Metelin V.B., Belskih L., Nasirov M.R., Kuznetsov A.B., Real-time visualization - new capabilities of cell diagnosis. // Book of abstracts «The 13th international conference "High medical technologies in XXI century" (Spain, Benidorm October 25-November 01, 2014) - P.35

6. Вельских Л.В. Новые возможности в оценке нарушений тромбоцитарного гемостаза. Сборник «Современные конвергентные технологии в сфере науки, культуры и образования» (в рамках IX Московской научно-практической конференции «Студенческая наука» (24-25 ноября 2014, Москва). — С. 75.

7. Вельских JI.B., Василенко И.А., Ватазин A.B., Федулкина В.А. Лазерная компьютерная витальная фазометрия тромбоцитов в оценке тяжести эндотоксикоза и коагуляционного потенциала при панкреонекрозе //Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокорекции и гемафереза/Сборник тезисов Международной научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ совместно с 23 конференцией Московского общества гемафереза, Москва, Тверь, 2015. — С. 6-7.

8. Вельских Л.В., Василенко И.А., Смоляков A.A., Федулкина В.А., Пасов A.C. Сочетанная плазмофильтрация, селективная адсорбция цитокинов с гемофильтрацией и плазмаферез в коррекции тромбоцитарно-коагуляционного гемостаза при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания при панкреонекрозе// Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокорекции и гемафереза/ Сборник тезисов Международной научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ совместно с 23 конференцией Московского общества гемафереза (Часть 2), Москва, Тверь, 2015. - С.4.

Подписано в печать: 05.10.2015 г. Объём: 1,0 печ. л. Тираж: 100 шт. Заказ № 23701 Отпечатано в типографии ООО "Графиком" 117279, г. Москва, д. 32, корп. 1 Тел.: +7 (499) 713-98-28