Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Эффективность аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции при хирургическом лечении больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени

На правах рукописи

Л/Ьжбглга^

ТРОПИНА Анна Владимировна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ ВАСКУЛЯРНО-СТРОМАЛЬНОКЛЕТОЧНОЙ ФРАКЦИИ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ПАРОДОНТИТОМ СРЕДНЕЙ И ТЯЖЕЛОЙ СТЕПЕНИ

14.01.14 - стоматология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О ОКТ 2013

Краснодар - 2013

005534859

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России).

Официальные оппоненты:

Бондаренко Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, негосударственное образовательное частное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский медицинский институт», кафедра стоматологии, заведующий кафедрой;

Овсянников Виктор Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России), кафедра патологической физиологии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СтГМУ Минздрава России).

Защита состоится » 2013 г. в на заседании

диссертационного совета Д 208.038.02 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел.(861) 262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Перова Марина Дмитриевна;

доктор медицинских наук, профессор Гайворонская Татьяна Владимировна

Автореферат разослан « сшюжб^гъ і з г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д208.038.02, доктор медицинских наук,

доцент

апина Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопросы регенерации тканей пародонта не перестают оставаться в центре внимания исследователей, поскольку проблема качественного восстановления опорного аппарата зуба в объеме повреждения до сих пор далека от разрешения.

Результаты традиционного хирургического лечения пародонтита, в ходе которого используются, преимущественно, остеокондуктивные материалы, способны временно улучшить клинико-рентгенологическую, но не гистоморфологическую картину, и достигнуть более продолжительной ремиссии воспалительно-деструктивного процесса (М.Д. Перова, 2005; А.А. Кулаков с соавт., 2009; Е.В. Киселёва с соавт., 2009; A. Sculean et al., 2000; М.А. Reinolds et al., 2003; M.J. Hoidal et al., 2008; J.H. Fu et al., 2012; K. Sohrabi et al., 2012). Использование концепции выборочной репопуляции клеток с помощью барьерных мембран позволяет частично восстанавливать утраченные ткани пародонта в соответствии с принципами функциональной морфологии (М.Д. Перова с соавт., 2002; L. Trombelli et al., 2002; A. Sculean et al., 2008). Однако эффективность методики прямо коррелирует с объемом сохраненного опорного аппарата зуба (S.E. Lynch et al., 1999; A. Sculean с соавт., 2000; R.D. Rupprecht et al., 2001; Y.P. Tsao et al., 2006; A. Crea et al., 2008).

Длительное течение воспалительно-деструктивного процесса в тканях приводит к развитию дефицита собственного пластического материала для пролиферации и дифференцировки в клеточные линии, необходимые для регенерации. В этой связи привлекательными явились исследования в области клеточной биологии и тканевой инженерии, направленные на изучение материалов со свойствами индукции и гистогенности, обеспечиваемых включением в их состав активных компонентов: факторов роста, клеток или нуклеиновых кислот (В.Б. Карпюк с соавт., 2005; В.А. Деев с соавт., 2007; Е.А. Мельник, 2011; И.Я. Бозо с соавт., 2012; S. Raja et al., 2009; S. Hynes et al., 2012). Наши первые результаты экспериментально-клинических исследований в остеологии по аутотрансплантации васкулярно-стромалыгоклеточной фракции (ВСКФ), полученной при процессировании липоаспирата, вселили надежду на возможность восстановления значительно разрушенных тканей с возвращением им функции и объёма (В.Б. Карпюк с соавт., 2007; Е.А. Мельник, 2011).

Следует констатировать, что решение проблемы клеточной терапии различных заболеваний, в том числе пародонтита, находится в стадии поиска. В научной литературе практически отсутствуют данные о процессах, происходящих в тканях de novo, после трансплантации свежевыделенной васкулярно-стромальноклеточной фракции. Найдены лишь единичные работы об особенностях пролиферации и дифференцировки клеток после внесения ВСКФ и структурно-функциональных взаимодействиях в формирующихся тканях опорного аппарата зуба. Всё вышеозначенное определило актуальность данного исследования.

Цель исследования: повышение эффективности хирургического лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени путем аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции, выделенной из жировой ткани.

Задачи исследования:

1. Оценить клиническую эффективность аутотрансплантации ВСКФ после лечения больных ХГПСТС в ранние, ближайшие и отдаленные сроки наблюдений.

2. Обосновать значимость клинических показателей, отражающих уровень зубодесневого прикрепления, для объективной оценки степени повреждения тканей пародонта и мониторинга эффективности лечения.

3. Дать количественную оценку прироста зубодесневого прикрепления после лечения больных ХГПСТС с наличием пародонтальных дефектов разной топографии в контролируемом исследовании.

4. Представить доказательства восстановления функции опорного аппарата зубов у больных ХГПСТС с помощью периотестометрии.

5. В гистоморфологическом исследовании верифицировать структуры тканевого регенерата в группах исследования в ближайшие и отдаленные сроки наблюдений.

6. В сравнительном иммуногистохимическом исследовании с использованием молекулярного маркёра Кл-67 определить митотическую активность в тканях регенерата после лечения больных ХГПСТС.

7. Провести цитологическое исследование препаратов-отпечатков с поверхности грануляционной ткани формирующегося пародонта после применения различных методик лечения в раннем послеоперационном периоде.

Научная новизна исследования. Впервые для повышения объективности оценки пародонтального статуса и информативности результатов лечения больных пародонтитом применен комплекс клинических показателей, включающий глубину зондирования, величину рецессии десневого края, уровень остаточной потери и/или прироста зубодесневого прикрепления.

Впервые представлены доказательства эффективности разработанного способа аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции, выделенной из жировой ткани, при хирургическом лечении больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени (Патент РФ на изобретение №2320285). Применение ВСКФ с элементами волокнистой стромы жировой ткани, как первичного тканевого матрикса, обосновано в качестве методики выбора для замещения пародонтальных дефектов с неблагоприятной топографией - супраальвеолярных и фуркационных.

С помощью метода периотестометрии получены результаты, подтверждающие достоверное улучшение функционального состояния опорного аппарата зубов после применения ВСКФ.

Впервые в иммуногистохимическом исследовании с молекулярным маркёром Ki-67 установлено, что высокая активность клеточной пролиферации в послеоперационном периоде сопряжена с минимальным числом митозов в пародонтальном регенерате.

При использовании препаратов-отпечатков поверхности ткани-регенерата пародонта впервые получены данные о специфике клеточного поведения в ранние сроки заживления в присутствии ВСКФ.

Применение ВСКФ способствует формированию гистотипичных структур зубодесневого прикрепления с высокой степенью неоваскуляризации и наличием множественных участков тканевого ремоделирования без признаков воспалительной реакции в сроки наблюдения.

Научно-практическая значимость работы. Использование комплекса клинических показателей, включающего определение глубины зондирования, уровня рецессии десневого края, остаточной потери и прироста зубодесневого прикрепления, является высокоинформативным для объективной оценки пародонтального статуса и эффективности лечения больных пародонтитом.

Аутотрансплантация ВСКФ, содержащей недифференцированные клетки и волокна стромы жировой ткани, способна повысить эффективность лечения больных ХГПСТС за счет существенного прироста разрушенного опорного аппарата зуба, включая гистотипичное замещение пародонтальных дефектов с неблагоприятной топографией (супраальвеолярных и фуркационных).

В клиническом и гистоморфологическом исследовании доказан индуцирующий эффект ВСКФ, выделенной из жировой ткани больного, проявившийся ранним запуском пролиферативного ответа, сокращением во времени воспалительной фазы процесса заживления с переключением клеточного фенотипа на регенераторный, усиленной васкуляризацией ткани de novo.

Значимым для науки фактом является низкая митотическая активность клеток на стадии формирования молодой ткани опорного аппарата зуба, что предполагает иной паттерн пролиферации и диктует необходимость изучения на современном уровне процессов амитоза.

В цитологическом исследовании установлено, что прямое внесение ВСКФ в санированный пародонтальный дефект вызывает ускоренное последовательное созревание недифференцированных клеток трансплантата в моноциты/макрофаги и фибробласты с фиксацией их в сети сформированных коллагеновых фибрилл/волокон.

Личный вклад автора в исследовании. Автор самостоятельно провела подробный анализ современной литературы, пролечила и курировала больных

ХГПСТС в течение всего времени наблюдения, участвовала в проведении всех клинических исследований и в обсуждении полученных морфологических результатов. Результаты исследования документированы в индивидуальных картах больных. Статистический анализ полученных данных автор выполнила самостоятельно.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная методика хирургического лечения больных ХГПСТС путем аутотрансплантации свежевыделенной из жировой клетчатки васкулярно-стромальноклеточной фракции способствует статистически значимому приросту нового зубодесневого прикрепления (по отношению к группе сравнения) с существенным улучшением показателей замещения пародонтальных дефектов, имеющих неблагоприятную топографию (супраальвеолярных и фуркационных).

2. Использование комплекса клинических показателей в оценке пародонтального статуса и результатов лечения больных пародонтитом, включающих глубину зондирования, уровень рецессии десневого края, величину прироста нового ЗДП и остаточной потери опорного аппарата зуба, является объективным и высокоинформативным.

3. Прямое внесение недифференцированных клеток ВСКФ (без предварительной экспансии in vitro) в микроокружение санированного пародонтального дефекта индуцирует пролиферативный ответ и ускоряет последовательное их созревание в клетки моноцитарно-макрофагального и фибробластического ряда с формированием хорошо кровоснабженного тканевого регенерата.

Внедрение в практику результатов исследования. Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Итоговые материалы исследования внедрены в практику работы врачей стоматологов Краснодарского Центра пародонтологии и дентальной имплантации МБУЗ Стоматологической поликлиники №3 г. Краснодара и отделения челюстно-лицевой хирургии ГБУЗ «Краевой клинической больницы №1 имени профессора С. В. Очаповского» Министерства здравоохранения Краснодарского края.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в стоматологии» (Москва-Краснодар, 2007), на научно-практической конференции «Инновационные направления в теории и практике стоматологии» (Краснодар, 2009), на международных конференциях челюстно-лицевых хирургов и

стоматологов «Новые технологии в стоматологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2008, 2009, 2013).

Апробация диссертации проведена на расширенном межкафедральном совещании сотрудников профильных кафедр стоматологического факультета, кафедры общей и клинической патофизиологии, кафедры стоматологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 5 - в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук, получен патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 173 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, 2 глав собственных клинических исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (99 источников на русском и 96 на иностранном языке). Работа иллюстрирована 23 таблицами, 34 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящем исследовании приняли участие 105 больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени в возрасте от 28 до 60 лет (Мо 47,5 лет), из них 55 мужчин и 50 женщин, которые были обследованы и пролечены в Краснодарском Центре пародонтологии и дентальной имплантации в период с 2005 по 2012 годы. Сопутствующая общесоматическая патология отмечена у 37 больных, с вредными привычками (курение) - 41 больной. Со всеми больными оформлены договоры добровольного информированного согласия на лечение и проведение исследования.

Основную группу составили 67 больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени, в комплекс лечебных мероприятий которым включалось хирургическое лечение с трансплантацией свежевыделенной васкулярно-стромальноклеточной фракции, выделенной из липоаспирата больного по стандартному протоколу P. Zuk с соавт. (2001). Свежевыделенную ВСКФ, содержащую процессированную строму жировой ткани, смешивали с гранулами микрокристаллического биостекла (Биосит-Элкор, С-Пб) и использовали ex tempore, без дополнительного культивирования. Внесение аутотрансплантата в санированные пародонтальные дефекты проводилось после механической (сканирования) и химической (PrefGel, США) обработки корневых поверхностей зубов. Поверх ВСКФ укладывалась нерезорбируемая мембрана из политетрафторэтилена

(Экофлон, С-ГТб), рана ушивалась, закрывалась на первые трое суток изолирующей пародонтальной повязкой VocoPac (Voco, Германия).

В группу сравнения (контрольную) вошло 38 больных, которым в комплексе лечебных мероприятий применена традиционная методика направленной регенерации тканей пародонта (с гранулами биоситалла и нерезорбируемой мембраной из политетрафторэтилена). Группа сопоставима с основной по полу и возрасту, тяжести и распространенности пародонтита, наличию сопутствующей соматической патологии и по принадлежности к курению.

Для диагностики пародонтального статуса и оценки эффективности лечения в динамике всем больным проведено комплексное стоматологическое обследование, включающее определение упрощенного индекса гигиены (УИГР, Greene-Vermillion), индекса гингивита (ИГ, Loe, Silness), индекса кровоточивости десны (ИК, Kotzschke), пародонтального индекса (ПИ, Russel), пробы на гликоген, оценки функционального состояния тканей пародонта с помощью периотестометрии.

Оценка пародонтального статуса проведена с помощью комплекса клинических показателей. Для определения глубины зондирования (расстояния от края десны до наиболее апикальной точки пародонтального дефекта) в работе применена диагностическая электронная измерительная система Florida Probe (США). Уровень рецессии десны определяли как расстояние от десневого края до эмалево-цементной границы плюс 0.5мм (Г. Вольф с соавт., 2008). Потерю зубодесневого прикрепления подсчитывали во время операции как расстояние от наиболее апикальной точки костного дефекта до эмалево-цементной границы плюс 0.5мм (т.к. корональный уровень эпителия прикрепления в норме - дно сулькулярной бороздки) (Г. Вольф с соавт., 2008). Прирост зубодесневого прикрепления определяли как разницу между исходной и остаточной потерей зубодесневого прикрепления в сроки наблюдения.

Рентгенологическое исследование (всего 1023 рентгенограммы) -ортопантомография, цифровая радиовизиография и дентальная компьютерная томография, выполнялось у больных до лечения, в ближайшие (6 месяцев) и отдаленные (24 месяца) сроки после лечения.

Десневые биоптаты, полученные от больных до лечения, и образцы регенерата тканей пародонта после лечения в сроки наблюдений (всего 43 образца) изучали с помощью гистоморфологического,

иммуногистохимического и гистоморфометрического методов исследования. Гистоморфологическая верификация результатов проведена в окраске гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, основным коричневым по М.Г. Шубичу, толуидиновым синим (при рН 1,0) с поверхностным докрашиванием основным фуксином. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием первичных моноклональных антител Ki-67 (клон

ММ1, Dako Cytomation, Дания) для выявления и подсчета пула пролиферирующих клеток с помощью митоза. Результат положительной реакции — темно-коричневое окрашивание клеточных ядер (диаминбензидин). Индекс пролиферации рассчитывали как процент Ki-67 окрашенных ядер по следующей формуле: ИП = число Ki-67 окрашенных ядер/500 клеток изучаемой ткани (базальный и парабазальные слои эпителия, сосочковый и сетчатый слои соединительной ткани), выраженное в процентах (P. Jangietriew, S. Sukpanichnant, 2009). Подсчет клеток проводили в световом микроскопе с использованием квадратной тестовой системы, которую совмещали на экране компьютера с изображением, полученным при помощи цифровой видеокамеры микроскопа. Клетки подсчитывали на площади 144 кв. микрона с размером стороны квадрата 12 микрон при увеличении микроскопа х400.

Метод цитологического исследования использовали для изучения динамики клеточного состава тканевого регенерата на ранних этапах его формирования (до 2 недель), для чего получали препараты-отпечатки с поверхности ткани de novo, которые после высушивания и фиксации метанолом окрашивали по Май-Грюнвальду-Романовскому. Всего проанализировано 60 цитологических образцов, полученных от больных обеих групп при извлечении барьерных мембран из зоны регенерации.

Для статистического анализа данных использовали пакет программ Statistika 5.0 и Microsoft Office Excel 2007. Определяли среднее арифметическое значение (М), ошибка средней арифметической (ш) и среднее квадратичное (стандартное) отклонение (о). С целью выявления межгрупповых и внутригрупповых различий в сравнении средних величин параметров был применен однофакторный дисперсионный анализ с вычислением двухвыборочного t-критерия Стъюдента (при сравнении показателей между группами исследования), а также дисперсионный анализ повторных измерений с использованием парного t-критерия Стъюдента (при сравнении показателей в группе исследования до и после лечения). Значимыми считали различия при р<0,05. Для выявления силы связи между уровнем зубодесневого прикрепления и данными периотеста проводился корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции (г) Пирсона. При малом числе наблюдений значимость различий результатов рассчитывалась с применением одностороннего варианта точного критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В контролируемом клиническом исследовании при использовании аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции жировой ткани в хирургическом лечении больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени доказано существенное повышение эффективности в ближайшие и отдаленные сроки наблюдений (рис. 1).

Уже в раннем послеоперационном периоде отмечены преимущества использования ВСКФ: время достижения комфортного состояния у больных ХГПСТС после операции сократилось до 3 дней (12 дней в контроле), что выражалось нивелированием болевого синдрома, снижением индекса гингивита и индекса кровоточивости в 4 раза, существенно отличаясь от показателей группы сравнения (при р<0,01). На этом фоне у больных основной группы наблюдалось появление увеличенного в объеме, безболезненного уплотнения формируемых тканей без признаков воспаления в зоне регенерации в срок до 10 дней, сохраняющегося до 1-1,5 месяцев, что, по-видимому, объясняется индуцирующим и иммуносупрессорным эффектом стромальных (стволовых) клеток жировой ткани (L. Cui et al, 2007; В. Puissant et al., 2005; R. Yanes et al, 2006). В этой связи мы предположили «переключение» клеточного фенотипа с воспалительного на регенераторный в более ранние сроки по сравнению с контролем, подтвердив наблюдаемый феномен в цитологическом исследовании.

Глубина зондирования

Величина рецессии

Прирост зубодесневого прикрепления

Потеря зубодесневого прикрепления

□основная группа ■ контрольная группа

і черм 1 NKcsa чсреї 6

кесяоев через 12

месгоев чер« 24

□основная группа ■контрольная групп:

месяцев через 24 мссяш

■контрольная групп:

лечеви*черсі 1

«ееm через б

месяцев через 12 месяцев

до

лечения через 1

vecen через 6

месящее череп 12

МЙСЯ5Є8 через 24

□основная группа ■контрольная группа

Примечание: * - значимость различий показателей до лечения и в сроки наблюдений при р< 0,05 ** - значимость различий показателей между группами исследования при р< 0,05

Рис.1. Сравнительная оценка результатов лечения больных ХГПСТС в группах исследования (М).

Выявлена тенденция к росту нового ЗДП в ближайшие сроки в обеих группах наблюдения, однако использование ВСКФ способствует увеличению значений этого показателя, составив 5,53мм через 6 мес. при минимальной

дисперсии в группе на уровне погрешности электронного зонда. Через 24 мес. достигнутые результаты отличались стабильностью — 5,66±0,16мм в сравнении с группой контроля, где уровень ЗДП снизился до 3,27мм в отдаленные сроки с 3,78±0,21мм при оценке через 6 месяцев. Показатели остаточной костной потери опорного аппарата зуба в отдаленные сроки, таким образом, сохранились в основной группе на уровне 2,14мм, что было ниже, чем в КГ в 2 раза. Применение в ходе хирургического лечения недифференцированных клеток позволило добиться 70%-го прироста ЗДП от уровня средней величины исходного разрушения структур в целом по выборке. В группе сравнения, где также использован регенеративный подход - мембранные барьеры, восстановить разрушенные опорные ткани в ближайшие сроки удалось наполовину (52%) от исходного уровня потери опорного аппарата зубов.

Применение ВСКФ позволило минимизировать уровень рецессии десневого края, что всегда сопровождает хирургическое лечение пародонтита и рассматривается как нежелательный эффект лечения. Так, в основной группе в ближайшие сроки наблюдений рецессия молодых тканевых структур уменьшилась с 2,2±0,22мм до 1,53±0,33мм при резком сокращении показателей глубины зондирования (с 5,12±0,21мм до 1,24±0,15мм). В контроле уровень десневой рецессии через 6 месяцев остался прежним (2,01±0,22мм против 2,21±0,41мм при р>0,05), но также при снижении показателей глубины зондирования (при р<0,05). По-видимому, снижение показателя десневой рецессии в основной группе объясняется тем, что кроме недифференцированных клеток в составе аутотрансплантата присутствуют волокна стромы жировой ткани в качестве первичного тканевого матрикса. Поэтому уже в ближайшие сроки наблюдений с высокой степенью достоверности мы констатировали ликвидацию пародонтальных карманов за счет прироста нового ЗДП, а не за счет десневой рецессии, как это происходит после извлечения барьерных мембран в группе сравнения. При этом наблюдалось частичное закрытие оголенных корневых поверхностей зубов, которые в течение длительного времени находились в прямом контакте с патологическим/микробным окружением.

В ходе клинического исследования установлено, что у больных ХГПСТС, выкуривающих 15 и более сигарет в день, фиксируется снижение прироста нового ЗДП в пределах 2 мм с последующим его уменьшением во времени в обеих группах. То есть, фактор курения значительно снижает эффективность лечения больных ХГПСТС.

В рентгенологическом исследовании подтвержден прирост минерализованных структур опорного аппарата зубов в основной группе исследования на 2,3мм (в контроле 1,5мм); по данным дентальной компьютерной томографии увеличение плотности кости альвеолы в отдаленные сроки произошло на 71,7±6,2% HU (в контроле на 48,8±9,3% HU). В краевых отделах альвеолярного гребня визуализировалась lamina dura, отмечено уменьшение размеров очагов остеопороза, появление равномерного

медуллярного рисунка молодой губчатой кости. Кроме того, по данным радиовизиографии, произошло восстановление связочного аппарата при проксимальном смещении точки ротации зубов с нормализацией ширины периодонтальной связки.

В работе проанализированы результаты замещения пародонтальных дефектов с учетом исходной неоднородности их строения (табл. 1).

В подгруппе внутрикостных пародонтальных дефектов (ВКД) зарегистрирован высокий процент замещения, составивший 89% от исходной потери опорного аппарата зубов (в контроле 70%), что соответствует приросту ЗДП 7,06мм (в контроле 5,3мм) при величине исходной потери до лечения 7,95мм (в контроле 7,51мм) при высоком уровне значимости различий - р<0,01. Замещение супраальвеолярных пародонтальных дефектов (САД) произошло на 62% (в контроле на 32%), прирост ЗДП составил 4,83мм против 2,31мм в группе сравнения (при р<0,01). Потенции к замещению фуркационных дефектов (ФД) также ограничены и требуют роста нового ЗДП на поверхностях оголенных корней в межкорневых зонах боковых зубов. С помощью использования ВСКФ удалось оптимизировать и стабилизировать во времени результаты замещения ФД на 65% против 30% в группе сравнения.

Прирост ЗДП в вертикальном направлении составил в основной группе 5,02мм (против 2,20мм в группе сравнения) при р<0,05, статистически незначимо изменяясь в отдаленные сроки наблюдений (при р>0,05).

Таким образом, использование ВСКФ с внесением волокнистого компонента соединительнотканной стромы жировой ткани для достижения желаемой консистенции трансплантата и поддержания полезного объема под барьерной мембраной, способно повысить прогноз лечения больных ХГПСТС при наличии неблагоприятных для замещения пародонтальных дефектов с отсутствием вертикальных костных стенок. Функциональное состояние зубов контролировалось периотестометрией после установления умеренной обратной корреляционной зависимости данных с величиной ЗДП у больных ХГПСТС (i=0,408). Показатели периотеста в основной группе статистической выборки имели стойкую тенденцию к снижению: с исходных 24,4±7,6 баллов до 10,4±4,2 баллов в ближайшие сроки и до 3,8±1,1 баллов в отдаленные сроки наблюдений при минимальной дисперсии (в группе сравнения - до 18,6±7,4 и до 15,6±6,2 баллов, соответственно), что демонстрирует нормализацию основной функции опорного аппарата зубов — способность выполнять жевательную нагрузку. Гистологическое исследование тканевых образцов, взятых у больных ХГПСТС после лечения в ближайшие и отдаленные сроки, продемонстрировало восстановление гистоархитектоники десны и появление нового зубодесневого прикрепления в группах исследования.

Таблица 1

Результаты замещения пародонтальньи дефектов различной топографии в ближайшие и отдаленные сроки наблюдений (М±т)

Показатели и сроки наблюдения Основная группа Контрольная группа

внугрикостные дефекты супраальвеолярные дефекты фуркационные дефекты внугрикостные дефекты супраальвеолярные дефекты фуркационные дефекты

До лечения п=)80 л=134 л=88 л=113 л=62 л=53

глубина зондирования 5,8б±0,015 4,90±0,0 4,54±0,023 5,28±0,021 5,32±0,031 5,36±0,026

рецессия 2,09±0,015 2,21+0,019 2,32+0,024 1,98+0,021 1,85+0,028 2,20+0,029

исходная потеря зубодесневого прикрепления 7,95±0,013 7,69±0,012 7,77±0,017 7,51±0,019 7,28±0,020 7,26±0,019

Через 6 месяцев после лечения л=157 п=109 л=73 л=106 л=42 л=40

глубина зондирования 0,74±0,012* 1,43±0,017* 1,49±0,014* 0,80±0,033* 2,41±0,039*;** 2,27±0,033*;**

¡щессия 0,80±0,012* 2,02±0,041 1,75±0,048* 1,5б±0,021 * * 2,45±0,068* 2,64±0,055**

прирост зубодесневого прикретения 6,96+0,015* 4,73±0,024* 5,02+0,020* 5,58±0,020*;** 2,91±0,031*;** 2,85±0,035*;**

остаточная потеря зубодесневого прикретения 0,99+0,015* 2,96±0,014* 2,75±0,015* 1,86±0,021*;** 4,37±0,037*;** 4,41±0,036*;**

Через 24 месяца после лечения л=145 л=101 л=64 л=99 л=54 л=53

глубина зондирования 0,60+0,015* 1,85+0,020* 1,75±0,025* 0,96±0,034* 2,06+0,033* 2,06±0,049*;**

рецессия 0,79і0,019* 1,5010,056* 1,48±0,048* 1,68±0,031** 3,41±0,056*;** 3,05±0,050*;**

прирост зубодесневого прикретения 7,06+0,014* 4,83±0,017* 5,03+0,020* 5,30±0,020*;** 2,31±0,013*;** 2,20±0,017*;**

остаточная потеря зубодесневого прикретения 0,89+0,016* 2,86±0,014* 2,73±0,018* 2,14±0,032*;** 4,97±0,011*;** 5,06±0,021*;**

Примечание: * - значимость различий показателей до лечения и в сроки наблюдений при р< 0,05 ** - значимость различий показателей между группами исследования при р< 0,05

В большинстве случаев выявлялся короткий, как в норме, эпителий прикрепления, под которым визуализировались разнонаправленные по отношению к корневой поверхности коллагеновые волокна прикрепления подлежащей соединительной ткани. Гистологическая картина тканевых образцов в отдаленные сроки наблюдений мало отличалась в группах исследования, в то время как при оценке ближайших результатов был выявлен ряд морфологических особенностей после использования ВСКФ. Так, обратил на себя внимание факт усиленной васкуляризации подэпителиальной соединительной ткани как в сосочковом, так и в более глубоком, сетчатом слое, даже у курящих пациентов и при наличии сопутствующей соматической патологии, включая общие сосудистые нарушения. Количество сосудистых элементов в биоптатах основной группы было увеличено в 3-5 раз по сравнению с контрольной группой. Другой отличительной особенностью гистоморфологической картины в основной группе исследования стало отсутствие проявлений воспалительной реакции при наличии довольно плотных скоплений клеток в глубоких слоях основной пластинки соединительной ткани, граничащей с минерализованными структурами молодой костной альвеолы. В этих зонах, по-видимому, участках перестройки (ремоделирования) тканей, идентифицировалось появление аморфного вещества соединительной ткани пурпурного цвета в окраске толуидиновым синим, дающего реакцию с гликозаминогликанами. Эти зоны окружены значительным количеством гистиоцитов, фибробластов, многоядерных клеток (фиброкластов, остеокластов), гранулоцитов и мелких, плохо дифференцируемых округлых базофильных элементов; также наблюдалось формирование новых кровеносных капилляров, а также артериол с толстыми стенками. У трети больных группы сравнения, даже при положительном клиническом результате, в области воспалительных инфильтратов, состоящих преимущественно из лимфоидных клеток, плазмоцитов и небольшого количества гистиоцитов, обнаруживался межклеточный отек соединительнотканной стромы с соответствующей сосудистой реакцией и локальной деградацией коллагеновых волокон в виде гиалиноза и склероза. Такие проявления характерны, преимущественно, для лиц с сопутствующими соматическими заболеваниями. То есть можно заключить, что местное использование ВСКФ способно оптимизировать процесс роста молодых структур опорного аппарата зуба путем усиления неоваскуляризации (по отношению к группе сравнения) и поддержания в течение длительного времени процессов тканевой перестройки без признаков воспалительной реакции.

В ходе иммуногистохимического исследования с применением моноклонального антитела Кь67, маркирующего клетки биоптата в состоянии митоза, выявлены существенные различия значений индекса пролиферации (ИП) до и после хирургического лечения больных ХГПСТС. В основной группе отмечено резкое падение ИП: в базальном и парабазальном слоях эпителия десны показатель снизился с 61,2±12,4% до 10,3±2,6% (в группе сравнения - до

27,4±5,6%; в нормальном пародонте 9,6±1,7%), в собственной пластинке соединительной ткани - с 15,2±2,6% до 3,5±0,6% (в группе сравнения - до 8,7±1,2%; в нормальном пародонте 2,8±0,4%) (рис.2).

Отмечено, что снижение митотической активности в регенерате, более выраженное в основной группе исследования, где произошла нормализация ИП после хирургического лечения с использованием недифференцированных клеток ВСКФ, по времени совпадает с мощным пролиферативным ответом в участке заживления пародонта, отмеченным клинически в виде объемного уплотнения околозубных тканей и сохраняемым около месяца. Мы предположили в этой связи, что рост тканей пародонта de novo происходит не только за счет митотической активности клеток, но и посредством иного паттерна пролиферации, по-видимому, амитоз.

Рис.2. Иммуногистохимическое исследование биоптатов десны, Кл-67 антиген: а) до операции, после инициальной терапии; б) после операции с ВСКФ; в) в нормальной десне.

Первичные эффекты, связанные с прямым внесением в зону регенерации дополнительного пластического материала (недифференцированных клеток) изучены в работе с применением цитологического метода исследования. Образцы были получены с внутренней поверхности мембранных барьеров, извлеченных из зоны регенерации в ранние сроки. Для изучения использованы мазки-отпечатки поверхностного слоя грануляционной ткани, который, как известно (М.С. Макаров, 1975), отражает клеточное поведение на начальных этапах регенераторного процесса.

Учитывая, что в составе ВСКФ находится множество недифференцированных клеток, несущих маркеры стволовых (В.Б. Карпюк с соавт., 2009), полинуклеаров с большим количеством цитоплазмы, окрашенной в оттенки синего цвета, и фибробластов разной степени зрелости, можно думать о высоких потенциальных биосинтетических способностях трансплантата, поскольку базофильное окрашивание указывает на наличие РНК (рис. За).

Внесенные в санированный пародонтальный дефект клетки трансплантата активно пролиферируют и быстро дифференцируются в моноцитарно-макрофагальные и фибробластические элементы со свойственными им фагирующими и синтетическими функциями, фиксируясь в сети коллагеновых фибрилл/волокон (рис. Зв). Первыми с клетками ВСКФ контактируют стимулированные нейтрофилы, рекрутированные из крови окружающих пародонтальный дефект костномозговых структур, в большинстве из которых уже в первые сутки изменяется структура ядерного хроматина и состояние цитоплазмы, приводя к появлению большого количества макрофагов, включая полинуклеары, и фибробластов (рис. 36).

Рис. 3. Цитологическое исследование пародонтального регенерата в ранние сроки: а) свежевыделенная ВСКФ с элементами стромы жировой ткани; б) нейтрофильные гранулоциты с измененной морфологией; в) фиксация в ткани регенерата дифференцированных клеточных форм. Окраска по Май Грюнвальду-Романовскому, ув. х400.

Об особенностях активационного потенциала ядер нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии, а также изменении структуры хроматина ранее уже сообщалось (A.A. Евглевский с соавт., 1997; И.В. Нестерова с соавт., 2004). Изменение генной экспрессии гранулоцитов и их синтетическая деятельность является к настоящему времени установленным фактом (X. Zhang et al, 2004). В этой связи важным представляется наличие мелких, резко базофильных клеточных форм ядерного типа, предположительно появившихся в процессе не изученного с помощью современных методик амитотического деления гранулоцитов. Сравнение с цитологическими образцами группы сравнения продемонстрировало идентичную направленность поведения гранулоцитов, но смещённое (отсроченное) во времени фибробластообразование на фоне сниженной плотности клеток с биосинтетической активностью у больных ХГПСТС.

Таким образом, проведенное исследование позволяют заключить о целесообразности использования индуктивных методик хирургического лечения больных ХГПСТС с целью искусственной аккумуляции и прямого взаимодействия пластического материала (недифференцированных клеточных форм) в тканевом микроокружении для роста гистотипичных структур опорного аппарата зубов и сохранения долговременного достигнутого эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Применение аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции жировой ткани повышает эффективность лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени, способствуя значительному приросту нового зубодесневого прикрепления в сравнении с контролем и сохранению достигнутых результатов в отдаленные сроки наблюдений.

2. Наличие в составе аутотрансплантата элементов волокнистой стромы жировой ткани как первичного матрикса для ранней фиксации клеточных форм позволяет добиться существенного снижения остаточной потери зубодесневого прикрепления в пародонтальных дефектах, не имеющих вертикальных костных стенок — супраальвеолярных и фуркационных.

3. Оценка пародонтального статуса с применением комплекса клинических показателей, включающего глубину зондирования, величину рецессии десневого края, уровень остаточной потери и/или прироста зубодесневого прикрепления, является объективной и высоко информативной для получения сравнимых результатов лечения больных пародонтитом.

4. Использование васкулярно-стромальноклеточной фракции жировой ткани обусловливает сокращение времени реактивного воспаления в послеоперационном периоде у больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени.

5. По результатам периотестометрии констатировано статистически достоверное улучшение функционального состояния тканей пародонта у больных хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени основной группы через 2 года после лечения.

6. В гистоморфологическом исследовании после лечения с ВСКФ подтверждено восстановление гистоархитектоники десны, образование нормального эпителиального и соединительнотканного зубодесневого прикрепления, высокая степень васкуляризации регенерата, наличие множественных участков тканевого ремоделирования на фоне околососудистых клеточных скоплений без признаков воспалительной реакции.

7. В иммуногистохимическом контролируемом исследовании с применением молекулярного маркёра митоза Кь67 установлено многократное снижение митотической активности после хирургического лечения больных пародонтитом, сопряженное с активным формированием молодых тканей опорного аппарата зуба, что предполагает участие иного, чем митоз, паттерна пролиферации.

8. Цитологическое исследование поверхностного слоя грануляционной ткани в первые несколько суток после операции показало, что недифференцированные клетки, внесенные в санированный пародонтальный дефект, запускают активную, в сравнении с контролем, пролиферацию и

быстрое их последовательное созревание в клетки моноцитарно-макрофагального и фибробластического ряда с дальнейшей фиксацией в сети коллагеновых фибрилл/волокон.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения эффективности лечения больных ХГПСТС целесообразно использовать аутотрансплантацию ВСКФ, выделенную из жировой ткани.

2. Прямое внесение в пародонтальный дефект ВСКФ при хирургическом лечении больных ХГПСТС следует использовать как методику выбора при наличии супраальвеолярных и фуркационных пародонтальных дефектов с неблагоприятной для замещения топографией.

3. Использование в практике комплекса клинических показателей, включающего оценку глубины зондирования, уровня рецессии десневого края, подсчет значения остаточной потери опорного аппарата зуба и величины прироста зубодесневого прикрепления позволяет получать сравнимые результаты в клинике пародонтологии и является высоко информативным.

4. Данные периотестометрии, коррелирующие с уровнем зубодесневого прикрепления, уместно использовать для характеристики пародонтального статуса и в оценке динамики восстановления функции опорного аппарата зуба.

5. Поверхность грануляционной ткани, формирующейся в зоне пародонтального дефекта, является подходящим объектом для изучения раннего клеточного поведения в тканевом микроокружении. Цитологические препараты для этой цели легко изготавливаются путем перенесения на предметное стекло прикрепившихся клеточных форм с внутренней стороны биосовместимой нерезорбируемой барьерной мембраны.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Перова, М.Д. Использование клеточных технологий в современной пародонтологии / М.Д. Перова, A.B. Тропина, Е.А. Мельник, В.Б. Карпюк // Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2006. - № 4. — С.3-9.

2. Перова, М.Д. К вопросу о важности объективной регистрации парод онтологического статуса / М.Д. Перова, A.B. Тропина // Новые технологии в стоматологии: сборник научных трудов. — Москва — Краснодар: Советская Кубань, 2007.-С. 141-144.

3. * Перова, М.Д. Оценка роста нового зубодесневого прикрепления после аутотрансплантации стромальных клеток, выделенных из жировой ткани / М.Д. Перова, A.B. Тропина, Е.А. Фомичева, В.Б. Карпюк // Пародонтология. -2006.- №4. — С.28-31.

4. Карпюк, В.Б. Замещение больших дефектов нижней челюсти путем остеогенной трансформации аутотрансплантированных стромальных клеток жировой ткани (экспериментальное исследование) / В.Б. Карпюк, М.Д. Перова, В.А. Козлов, A.B. Тропина // Материалы 12-й Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов, СПб (МАПО), 24-26 мая 2007 г. -СПб, 2007.-С. 103-104.

5. Перова, М.Д. Характеристика первых результатов лечения развившегося пародонтита методом аутотрансплантации васкулярной клеточной фракции / М.Д. Перова, A.B. Тропина, В.А. Козлов, В.Б. Карпюк // Материалы 12-й Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов, СПб (МАПО), 24-26 мая 2007 г. - СПб, 2007. - С. 160-161.

6. Перова, М.Д. Оценка восстановления тканей пародонта при использовании белков эмалевого матрикса с барьерной мембраной и без нее при тяжелом пародонтите / М.Д. Перова, A.B. Тропина, Е.А. Фомичева // Материалы 12-й Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов, СПб МАПО, 24-26 мая 2007г. - СПб, 2007. - С. 161-162.

7. *Перова, М.Д. Возможности стволовых стромальных клеток для регенерации тканей пародонта и их взаимодействие с тканевым микроокружением / М.Д.Перова, М.Г.Шубич, В.Б.Карпюк, А.В.Тропина // Морфология.-2007.- Том 131, №3-С. 7-15.

8. *Перова, М.Д. Клинико-гистологические результаты клеточной терапии при тяжелом пародонтите / М.Д. Перова, A.B. Тропина, В.Б.Карпюк // Кубанский научный медицинский вестник. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 142-146.

9. Перова, М.Д. Влияние расщепления мукопериостального лоскута на прирост зубодесневого при-крепления / М.Д. Перова, A.B. Тропина // Материалы 13-й Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов, СПб МАПО, 22-24 мая 2008 г. - СПб, 2008. - С.173-174.

10. Тропина, A.B. Применение аутогенной клеточной терапии для восстановления поврежденных тканей пародонта / A.B. Тропина, М.Д. Перова // Инновационные направления в теории и практике стоматологии: сборник научных трудов. — Краснодар, 2009. - С.130-136.

11. Мельник, Е.А. Особенности постэкстракционной инволюции альвеолярного гребня в норме и при повреждении тканей пародонта / Е.А. Мельник, A.B. Тропина II Инновационные направления в теории и практике стоматологии: сб. науч. тр. — Краснодар, 2009. — С. 79-84.

12. Перова, М.Д. Оценка возможностей периотестометрии в трактовке изменений структур пародонта / М.Д. Перова, A.B. Тропина, Н.В. Бессарабов // Материалы 14-й Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов, СПб МАПО, 12-14 мая 2009г. - СПб, 2009. - С.143-144.

13. *Перова, М.Д. Результаты аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции при пародонтите и особенности формирования

раннего тканевого регенерата / М.Д. Перова, М.Г. Шубин, В.А. Козлов,

A.B. Тропина // Институт стоматологии. - 2010. - №2. - С. 62-64.

14. Перова, М.Д. Могут ли недифференцированные клетки уравнять способность к регенерации при различных видах пародонтальных дефектов? / М.Д. Перова, В.А. Козлов, A.B. Тропина // Материалы 18-ой Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии». - С-Пб, 2013. - С.168-169.

15. Некоторые аспекты клеточного поведения после аутотрансплантации васкулярно-стромальной фракции процессированного липоаспирата у больных пародонтитом средней и тяжелой степени / М.Д. Перова, Т.В. Гайворонская, В.Б. Карпюк, A.B. Тропина // Актуальные вопросы в теории и практике стоматологии (юбилейный сборник научных трудов). - Москва-Краснодар, 2013. - С. 266-271.

16. *Перова, М.Д. Характеристика степени замещения пародонтальных дефектов разной топографии после аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции липоаспирата / М.Д. Перова, Т.В. Гайворонская,

B.Б. Карпюк, A.B. Тропина // Кубанский научный медицинский вестник. — 2013. — С.142-148.

* - работа, опубликована в журнале, включенном в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации.

Патенты на изобретения

1. Пат. 2320285 Российская Федерация, МПК А61В 17/24. Способ восстановления кости альвеолярного гребня челюсти и тканей пародонта с редуцированным регенераторным потенциалом [Текст] / Перова М.Д., Карпюк В.Б., Тропина A.B., Фомичева Е.А., Шубич М.Г.; заявитель и патентообладатель Перова М.Д. (RU). № 2006116152/14; заявл. 10.05.2006; опубл. 27.03.2008, Бюл. №9. - 7с. URL: www.freepatent.ru/patents/2320285

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

хгпстс - хронический генерализованный пародонтит средней и

тяжелой степени

ог — основная группа

кг - контрольная группа

ммск - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

ВСКФ — васкулярно-стромальноклеточная фракция

жт - жировая ткань

ВКД - внутрикостные пародонтальные дефекты

САД — супраальвеолярные пародонтальные дефекты

ФД - фуркационные пародонтальные дефекты

НРТП - направленная регенерация тканей пародонта

здп - зубодесневое прикрепление

гз - глубина зондирования

УИГР — упрощенный индекс гигиены рта

иг — индекс гингивита

пи - пародонтальный индекс

птм - периотестометрия

Тропина Анна Владимировна АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 25.09.13. Печать трафаретная. Формат 60x84 Vi6. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 955 . Отпечатано в ООО «Издательский Дом-ЮГ» 350072, г. Краснодар, ул. Московская 2, корп. «В», оф. В-120, Тел. 8 918-41-50-571

e-mail: olfomenko@yandex.ru

Сайт: http://id-yug.com