Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эффективность арбидола в коррекции нефротоксического действия противоопухолевых химиотерапевтических средств (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

МИРОШНИЧЕНКО АЛЕКСАНДР ГЕННАДЬЕВИЧ

ЭФФЕКТИВНОСТЬ АРБИДОЛА В КОРРЕКЦИИ НЕФРОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ

(экспериментальное исследование)

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 1 ФЕВ 2010

Томск-2010

003492197

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Брюханов Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Плотников Марк Борисович

доктор медицинских наук Ваизова Ольга Евгеньевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_»_2010 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН.

Автореферат разослан « 2 3 » я |! г Е Ря_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Снижение токсичности цитостатических средств является важнейшей задачей, решение которой позволяет улучшить эффективность противоопухолевой терапии (Kishi S. et al., 2007; Thakur J.S. et al., 2008).

Токсическое поражение почек является побочным эффектом применения большинства противоопухолевых средств. Вызванная химиотерапией почечная дисфункция включает в себя уремический синдром, повреждение структур нефро-на, снижение ренальной перфузии (Kintzel Р.Е., 2001). Данное грозное осложнение химиотерапии обусловливает определенный процент смертности пациентов. Кроме того, острая почечная недостаточность, вызванная применением антибластом-ных средств, вызывает необходимость в пересмотре плана лечения, так как требует снижения дозировки химиопрепарата либо его отмены (Darmon М. et al., 2006).

В качестве одного из важнейших механизмов нефротоксичности противоопухолевых средств в настоящее время рассматривается оксидативный стресс (Conklin К.А., 2000). В связи с этим перспективным направлением фармакологической коррекции данного побочного эффекта является использование препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами. Однако применение антиокси-дантов при онкологических заболеваниях затрудняет тот факт, что опухолевый процесс проходит, в основном, на повышенном уровне аптиоксидантов, и последние проявляют свое противоопухолевое действие в высоких дозах, когда выступают в роли прооксидантов (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1990). Эффективность применения противоопухолевых химиотерапевтических средств прямопро-порциональна степени интенсификации ими процессов свободнорадикального окисления (Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б., 1985). С другой стороны, опухолевая ткань, накапливая эндогенные антиоксиданты, вызывает снижение антиоксидант-ной защиты в других тканях организма, повышая, таким образом, содержание токсических продуктов окисления и способствуя дальнейшему опухолевому росту (Cheescman К.Н. et al, 1986).

В связи с этим большой интерес представляет арбидол - противовирусный препарат, обладающий антиоксидантными свойствами и угнетающий интенсивность процессов перекисного окисления липидов в большей степени, чем известный мощный синтетический антиоксидант эмоксипин (Глушков Р.Г. и соавт., 1996). Механизм антиоксидантного действия арбидола связан с перехватом ли-пидных радикалов (Васильева О.В. и соавт., 1999). Помимо этого, арбидол обладает антиканцерогенными, иммуномодулирующими, интерферониндуцирующими свойствами (Суринов Б.П. и соавт., 1995; Глушков Р.Г. и соавт., 1999), которые могут иметь большое значение при наличии онкологического заболевания и применении противоопухолевых химиотерапевтических средств, вызывающих имму-носупрессию (Гершанович М.Л., 1982) и индуцирующих канцерогенез в здоровых тканях (Curtis R.E. et al., 1992; Ellis M., Lisher M., 1993; Ferguson L.R., Pearson A.E., 1996).

Целью исследования явилось снижение нефротоксических эффектов противоопухолевых химиотерапевтических средств (цисплатина, метотрексата, док-сорубицина) с помощью арбидола.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить структурно-функциональные изменения в почках крыс под влиянием арбидола и противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат);

2) изучить влияние арбидола и противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) на процессы свободнорадикального окисления in vivo;

3) изучить нефропротективные свойства арбидола при токсическом поражении почек крыс, вызванном противоопухолевыми средствами (цисплатин, доксорубицин, метотрексат);

4) установить закономерность действия арбидола на почки крыс при применении противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) в зависимости от степени поражения ими почек, изменения уровня свободнорадикального окисления, механизмов их токсического действия;

5) установить эффективный режим введения арбидола с целью снижения нефротоксичности противоопухолевых веществ (цисплатин, доксорубицин, метотрексат).

Научная новизна исследования. Впервые исследованы антиоксидантные и нефропротективные свойства арбидола in vivo в условиях применения противоопухолевых химиотерапевтических средств - цисплатина, метотрексата, доксору-бицина. Установлено, что почечные канальцы более чувствительны к цитостати-ческим средствам (цисплатину, доксорубицину, метотрексату), а также к увеличению пероксидации по сравнению с клубочковым аппаратом. Доказано, что арби-дол системно угнетает процессы перекисного окисления липидов in vivo и устраняет нефротоксические эффекты противоопухолевых средств, обладающих выраженными прооксидантными свойствами и поражающих преимущественно почечные канальцы (цисплатин, метотрексат).

Практическая значимость диссертации. Экспериментально обоснована эффективность использования арбидола с целью снижения нефротоксического действия противоопухолевых химиотерапевтических средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат). Результаты исследования расширяют знания относительно антиоксидантной активности арбидола и возможности коррекции нефротоксиче-ских эффектов лекарственных средств с его использованием.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии и проблемной комиссии по фармакологии и фармации Алтайского государственного медицинского университета (2008, 2009 г.г.), 66-й открытой итоговой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием (Волгоград, 2008 г.), IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008 г.), Всероссийской конференции молодых ученых и III школе им. акад. Н.М. Эмануэля «Окислительный стресс, окисление и антиоксвданты» (Москва, 2008 г.), X городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием для студентов и молодых ученых «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 7 работ, из них 1 - в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель включает 194 источника, из которых 20 отечественных и 174 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 196 крысах линии Вистар в возрасте 2-2,5 месяцев и массой 140-200 г, выращенных в питомнике ГУ НИИ цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Содержание крыс соответствовало требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). В работе изучались влияние арбидола, противоопухолевых средств (циенлатан, доксорубицин, метотрск-сат) на структуру и функцию почек, а также эффективность арбидола в коррекции нефротоксического действия указанных противоопухолевых средств.

В первой серии экспериментов изучалось влияние арбидола на структуру и функцию почек крыс. Арбидол (ОАО «Фармстандарт», Россия) вводили в виде суспензии (дисперсная среда - изотонический раствор хлорида натрия) внутриже-лудочно с помощью зонда в дозе 75 мг/кг каждые сутки в течение 14 суток. Расчет дозы производился с учетом максимальных терапевтических доз для человека путем межвидового переноса (Р.У. Хабриев, 2005). Группа животных первой серии экспериментов (группа арбидола) была разделена на 2 подгруппы по 14 крыс (7 самцов и 7 самок) в каждой: опытную, получавшую арбидол, и контрольную, получавшую эквивалентный объем изотонического раствора хлорида натрия.

Во второй и последующих сериях экспериментов изучалось действие противоопухолевых химиотерапевтических средств на почки крыс и нефропротектор-ные свойства арбидола в условиях применения цитостатиков. С целью моделирования нефротоксичности химиотерапевтических средств было сформировано 3 группы (соответственно числу исследуемых цитостатиков) по 56 животных. Каждая группа была разделена на 4 подгруппы: контрольную, опытную, превентивной коррекции, постоянной коррекции (по 14 животных - 7 самок и 7 самцов - в каждой группе). Животные опытных подгрупп получали:

1) опытная подгруппа группы цисплатина - цисплатин в виде 0,05% раствора (ООО «ЛЭНС-Фарм», Россия) в дозе 3 мг/кг (Karimi G. et al., 2005);

2) опытная подгруппа группы доксорубицина - доксорубицин (Pharmacia & Upjohn, Италия) - в виде 0,2% раствора в дозе 10 мг/кг (Boonsanit D. et al., 2006);

3) опытная подгруппа группы метотрексата - метотрексат в виде 0,5% раствора (ООО «ЛЭНС-Фарм», Россия) в дозе 20 мг/кг (Jahovic N. et al., 2003).

Животным контрольных подгрупп в первый день эксперимента вводили стерильный изотонический 0,9% раствор хлорида натрия, объем которого был эквивалентен объему вводимых растворов противоопухолевых препаратов в опытных подгруппах.

Животным подгрупп превентивной коррекции, учитывая время наступления максимальной концентрации арбидола в крови при энтеральном введении, за 1 час до введения цитостатика внутрижелудочно однократно вводили арбидол в дозе 75 мг/кг. Животным подгрупп постоянной коррекции арбидол вводился в той же дозе при введении цитостатиков и 1 раз в сутки в течение всего эксперимента. Полученные показатели мочи и плазмы, а также гистологическую картину в коррекци-онных группах для каждого из противоопухолевых препаратов сравнивали с таковыми у соответствующих опытных и контрольных групп.

Животные помещались в индивидуальные клетки для сбора мочи. В качестве фоновых показателей, а также на 2-е и последующие четные сутки эксперимента измерялся суточный диурез, в моче определялась концентрация креатинина, общего белка, тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБРП), активность лактатде-гидрогеназы (ЛДГ), у-глутамилтрансферазы (ГГТ), К-ацетил-(Н>глюкоз-аминидазы (НАГ). По окончании экспериментов в каждой из серий животные умерщвлялись путем декапитации согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР .№ 755 от 12 августа 1977 г.), в плазме животных определяли концентрацию креатинина, ТБРП, общего белка, рассчитывали скорость клубочковой фильтрации (СКФ), забирали образцы почек для гистологического изучения.

Концентрацию креатинина определяли псевдокинетическим колориметрическим методом по реакции Яффе при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб»),

Активность ГГТ определяли колориметрическим методом по конечной точке при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб», Россия). Метод основан на колориметрическом определении концентрации 4-нитроанилина, образовавшегося в результате реакции, катализируемой ГГТ. ГТТ -фермент щеточной каймы эпителия проксимальных канальцев почек, в норме не фильтрующийся в клубочках, поэтому увеличение его активности в моче характеризует истинное поражение эпителиоцитов проксимальных канальцев (Намазова О.С., 1996; Фоменко Г.В. и соавт., 1994). Благодаря поверхностной локализации относительно других ферментов и отсутствию снижения активности ингибиторами, содержащимися в моче, ГГТ может являться ранним маркером канальцевого повреждения (Камышников B.C., 2000).

Активность ЛДГ определялась оптимизированным кинетическим методом, основанным на реакции окисления NADH в NAD+, при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб», Россия). Повышение активности в моче лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - цитозольного фермента канальцев ого эпителия -обусловлено явлениями цитолиза и может использоваться в качестве соответствующего маркера (Петрунь Н.М., 1982).

Активность НАГ определяли колориметрически по конечной точке реакции ферментативного разложения 4-нитрофенил-№ацетил-р-0-глюкозаминвда по методике Т.П. Лавреновой (1986). НАГ, по мнению ряда авторов (Лукомская И.С. и соавт., 1986), является наилучшим маркером поражения почек. Повышение активности НАГ мочи при патологических состояниях отражает скорее функциональные нарушения почек, чем нарушение клеточных структур нефрона (Simon G., Peterson S., 1988).

Концентрацию общего белка в моче для оценки протеинурии определяли колориметрическим методом при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб», Россия). Метод основан на способности белка образовывать окрашенный комплекс с красителем бромфеноловым синим в кислой среде (рН 3,0).

Концентрацию общего белка в плазме крови для оценки тяжести протеинурии определяли биуретовым методом при помощи диагностического набора (ООО «Витал Диагностике СПб», Россия). Метод основан на способности белка образовывать окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде.

Концентрацию тиобарбитурат-реактивных продуктов определяли колориметрически по интенсивности окрашивания образцов, содержащих комплексы продуктов окисления жирных кислот с тиобарбитуровой кислотой (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972). Тиобарбитурат-реактивные продукты образуются в результате перекисного окисления липидов, концентрация их в моче повышается в результате усиления процессов свободнорадикалыюго окисления (McGirr L.G. et. al., 1985).

Для гистологического изучения почки животных после окончания эксперимента извлекали, проводили поперечное рассечение центрально расположенных участков в области лоханки и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Спустя сутки материал подвергали обезвоживанию путем последовательного погружения в растворы этилового спирта возрастающей концентрации и заключали в парафин для приготовления гистологических срезов на санном микротоме МС-2 (Точмед-прибор, Украина). Полученные срезы окрашивали гематоксилином (ОАО «Реактив», Россия) и эозином (ОАО «Реактив», Россия) по стандартной методике, заключали в канадский бальзам (ООО «Компания БиоВитрум», Россия) и изучали с помощью светового микроскопа (об. 40, ок. 7, Биолам, Россия).

Гистологические исследования проводились на базе Морфологической лаборатории ГОУ ВПО АГМУ Росздрава под руководством доктора медицинских наук, профессора А.В. Лепилова.

Для расчетов и статистической обработки использовались компьютерные программы Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation, США) и SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc., США) для Windows. Статистическую обработку полученных количественных результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уигни. Данные представляли в виде медианы и интерквартильного размаха - Ме(25%;75%). Различия показателей считали значимыми при р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние арбидола на структуру и функцию почек

Почки характеризуются интенсивным кровоснабжением, высоким уровнем энергетического обмена, которые и определяют повышенную чувствительность их к нарушениям кровообращения, к воздействию различных токсических, в том числе лекарственных, веществ. В первой серии экспериментов изучалось действие арбидола на почки в режиме постоянного введения.

Активность НАГ, отражающая функциональное состояние почек, и, по мнению ряда авторов, являющаяся наилучшим маркером почечной дисфункции, у крыс опытной подгруппы, получавших арбидол ежедневно, статистически значимо не изменяется на протяжении 14 суток. Ежедневное введение арбидола не вызывает и значимого изменения активности ГГТ и ЛДГ, что свидетельствует об отсутствии токсического влияния препарата на почечные канальцы. С учетом того, что активность указанных ферментов, особенно ЛДГ, может повышаться за счет повреждения почечных клубочков и, соответственно, увеличения проницаемости, можно утверждать, что арбидол не влияет на селективность почечного фильтра. Это подтверждает также и то, что в течение всего эксперимента арбидол не вызывает увеличение концентрации общего белка в моче. На протяжении 14 суток у животных опытной подгруппы отсутствуют статистически значимые изменения суточной экскреции креатинина и суточного диуреза, что говорит об отсутствии влияния арбидола на клубочковую фильтрацию.

Измерение удельной концентрации ТБРП в моче показало ее значимое уменьшение под влиянием арбидола, начиная с 8 суток эксперимента, свидетельствуя о снижении интенсивности процессов свободнорадикального окисления (табл. 1).

На 14 сутки эксперимента измерение концентрации ТБРП в плазме крови показало значимое снижение этого показателя в опытной подгруппе: 2,06(1,85;2,37) мкмоль/л против 2,98(2Д5;3,25) мкмоль/л в контроле (Р = 0,013), на основании чего можно утверждать о системном антиоксидантном действии арбидола.

Полученные показатели плазменной концентрации креатинина и рассчитанной скорости клубочковой фильтрации по его клиренсу для опытной подгруппы

Таблица 1. Удельная концентрация ТБРП в моче крыс группы арбидола, Ме(25%;75%) мкмоль/ммоль креатинина мочи

не отличаются от таковых для контрольной подгруппы, что подтверждает отсутствие влияния арбидола на скорость клубочковой фильтрации. Измерение концентрации общего белка в плазме крови не показало значимого различия между подгруппами, что логично согласуется с отсутствием протеинурии при применении арбидола на протяжении всего эксперимента.

Анализ микрофотографий гистологических срезов почек путем световой микроскопии подтвердил данные биохимических исследований. В почках крыс опытной подгруппы, получавшей арбидол, не выявлено деформации и инфильтрации почечных клубочков, сохранена целостность и рядность канальцевых эпителиоцитов.

Таким образом, представленные результаты показали, что арбидол не влияет на структуру и функцию элементов нефрона, однако оказывает выраженный анти-оксидантаый эффект, прослеживающийся в течение хронического эксперимента по уменьшению удельной концентрации ТБРП в моче, а также по окончании эксперимента по значимому снижению концентрации ТБРП в плазме крови.

Сутки Контрольная подгруппа Опытная подгруппа

1 (фон) 1,31(1,17:2,07) 1,54(1,19;2,60)

2 1,44(1,07;2Д9) 1,41(1,13:2,47)

4 1,61(1,18:1,98) 1,28(0,97;2,08)

6 1,64(1,22:2,00) 1,43(0,90:1,59)

8 1,56(1,02:2,26) 0,96(0,86:1,29)*

10 1,41(1,12:2,35) 1,07(0,77:1,31)*

12 1,52(1,04:2,33) 1,16(0,79:1,37)*

14 1,65(1,04:2,22) 1,02(0,74:1,27)*

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (Р<0,05).

Эффективность арбидола в коррекции нефротоксического действия цисилатина

Во второй серии экспериментов мы изучали нефропротективную активность арбидола в условиях применения цисплатина - широко используемого средства, обладающего в своем классе наибольшим нефротоксическим эффектом.

Таблица 2. Изменение активности ферментов и удельной концентрации ТБРП в моче крыс, получавших цисплатин и арбидол

Сутки Контрольная подгруппа (п = 14): 0.9% р-р ЫаС1 Опытная подфуппа (п = 14): раствор цисплатина Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор цисплатина + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор цисплатина + арбидол ежедневно

Активность НАГ, Ме(25%;75%) И/ммоль креатинина

1 (фон) 2,04(1,33; 3,24) 2,32(1,10;3,39) 1,30(0,74;4,19) 1,84(1,44;2,59)

2 2,14(1,26;3,23) 3,12(2,46;4,35)* 3,04(2,26;4,23)* 2,49(1,30;3,60)

4 1,83(1,61;2,87) 9,01(7,73;13,53)* 6,68(5,66;10,07)* 3,00(2,15;9,65)*'**

6 1,90(1,28;3,19) 8,20(7,81 ;9 Д 3)* 5,67(4,52;8,15)*'** 2,06(1,15,6,34)**

8 2,12(1,44;3,14) 3,34(3,24;3,65)* 2,55(2,18;3,19)** 1,59(1,07,2,68)**

Активность ГГТ, Ме(25%;75%) и/ммоль креатинина

1 (фон) 92,96(74,30; 147,84) 98,44(61,51 ;128,39) 81,44(67,05; 164,67) 95,96(65,35; 137,05)

2 99,63(77,80;148,52) 129,51(85,46;149,28) 105,39(69,25;55,84) 118,07(47,54; 166,33)

4 106,63(78,21;126,69) 213,41(187,01;260,47)* 159,76(129,15;205,29)*'** 78,40(72,11;201,19)**

6 97,75(69,32; 134,67) 125,63(98,21;179,66)* 154,57(59,31;201,55) 75,33(65,40; 195,49)

8 108,19(56,70;! 59,48) 63,57(56,17,90,! 8) 48,25(40,53;85,97)*'** 47,68(40,98;74,14)*'**

Активность ЛДГ, Ме(25%;75%) и/ммоль креатинина

1 (фок) 1,31(1,11;1,68) 0,99(0,55;1,96) 1,23(0,72;2,53) 1,04(0,62:1,52)

2 1,23(1,10;1,50) 1,68(1,11;2,43) 1,15(0,56;1,73)** 0,87(0,49;1,41)**

4 1,25(1,02;1,69) 8,36(5,17;! 1,65)* 5,9б(4,65;14,81)* 4,03(3,07,9,67)*

6 1,3 8(1,01;!,66) 8,87(6,78;14,27)* 3,56(2,34;6,49)*'** 3,82(2,31;5,35)*'**

8 1,31(0,93;!,76) 1,66(0,85;3,44) 1,99(0,55,3,05) 0,71(0,46;1,30)*

Удельная концентрация ТБРП, мкмоль/ммоль креатинина

1 (фон) 1,60(1,14;2,08) 1,55(1,24;1,92) 1,64(1,30;2,04) 1,25(1,02;1,77)

2 1,48(0,86; 1,96) 1,20(0,63; 1,86) 2,16(1,33:2,67)*,** 1,41(1,15;1,80)

4 1,59(1,17,1,95) 2,35(1,94,2,49)* 1,91(1,66 ;2,11)** 1,23(1,09:1,81)**

6 1,50(0,64;2,08) 2,21(1,77;2,46)* 1,79(1,69;1,87)** 1,62(1,26;2,04)**

8 1,32(0,95;2,17) 1,58(1,48;!,63) 1,38(1,25;1,75) 1,15(0,99;1,45)**

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05); ** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

Функциональные изменения почек после однократного введения цисплатина, определяемые по повышению активности НАГ в моче, определяются уже на вторые сутки и сохраняются до конца эксперимента (табл. 2). Арбидол уменьшает данные нарушения, особенно эффективно - при ежедневном введении. Исходя из профиля активности ГГТ в моче, минимальная канальцевая деструкция в канальцах после однократного введения цисплатина наблюдается уже на 4-е сутки. Арбидол уменьшает таковую при превентивном однократном введении и предотвращает ее развитие при постоянном применении. Похожая картина наблюдается

также и в отношении еще одного ферментного маркера цитолиза канальцевых эпителиоцитов - ЛДГ (табл. 4).

По полученным данным, однократное введение цисплатина уже на 2-е сутки вызывает повышение суточного диуреза - 6,50(3,80; 1,05) мл против 4,00(3,55;5,60) мл в контроле (Р = 0,029), максимум которого приходится на 6 сутки эксперимента - 12,75(7,40;15,00) мл (контроль - 4,40(4,00;5,10) мл, Р < 0,001). В коррекцион-ных подгруппах на 2-е сутки суточный диурез значимо не отличается от контроля, а в подгруппе постоянной коррекции на 6-е сутки становится меньше опытного показателя - 5,50(4,80;6,20) мл (Р = 0,002).

В опытной подгруппе на 4-е сутки наблюдается снижение суточной экскреции креатинина (34,08(30,34;38,73) мкмоль/сутки, Р = 0,014 в сравнении с контрольным значением 43,62(35,28;49,37) мкмоль/сутки), которое, однако, не сохраняется до конца эксперимента. В коррекционных группах значимого снижения этого показателя не наблюдается.

У крыс опытной подгруппы, начиная с 4-х суток, наблюдается увеличение суточной протеинурии, которое носит транзиторный характер (на 4-е сутки 5,53(2,81;6,75) мг/сутки против контроля 2,50(1,92;2,95) мг/сутки, Р = 0,002; на 6-е сутки 4,75(3,42; 12,97) мг/сутки против контроля 2,48(2,10;2,82) мг/сутки, Р < 0,001). Исходя из динамики суточной экскреции белка с мочой в подгруппах превентивной и постоянной коррекции, арбидол значимо не влияет на цисплатин-индуцируемую протеинурию.

Повышение удельной концентрации ТБРП в моче опытной подгруппы является проявлением усиления процессов свободнорадикального окисления циспла-тином, обладающим выраженной прооксидантной активностью (табл. 2). В связи с этим вполне логичным является предположение о том, что липидная пероксида-ция является одной из основных причин нарушения структуры и функции почечных канальцев, что подтверждается данными Уегтеи1еп М.Р., Ва1ёеу/ О.Б. (1992). Ожидаемо, что арбидол снизил рассматриваемый показатель в группе превентивной, и, особенно, в группе постоянной коррекции.

9 т-----

=; 8

Контрольная Овьгтяая Подгруппа Подгруппа

подгруппа подгруппа превентивной постоянной

коррекции коррекции

Рис. I. Концентрация тиобарбитурат-реактивных продуктов в плазме крыс группы цисплатина иа 8-е сутки эксперимента.

* - значимое различие по сравнению с показателем контрольной подгруппы; **- значимое различие по сравнению с показателем опытной подгруппы.

Как видно из рис. 1, у крыс опытной подгруппы наблюдается повышенная концентрация ТБРП в плазме крови в последние сутки эксперимента, несмотря на нормализацию показателя удельной концентрации ТБРП в моче. Такое кажущееся несоответствие может быть объяснено тем, что ТБРП попадают в мочу как из плазмы крови, так и из почек. Поэтому, учитывая липофильность продуктов пере-кисного окисления липидов и связанную с этим высокую способность к реабсорб-ции, удельная концентрация ТБРП в моче не является высокочувствительным тестом. Однако значимое повышение этого показателя может говорить о системном усилении процессов свободнорадикального окисления, в том числе и в почках.

Как и предполагалось, измерение концентрации креатинина в плазме крови и расчет скорости клубочковой фильтрации не показал значимых отличий между изучаемыми подгруппами животных, что говорит о незначительном влиянии цн-тостатика на клубочковую фильтрацию. Хотя и, по данным Buamah P.K. et al. (1982), снижение СКФ является первичным проявлением нефротоксичности цисплатина, основным патогенетическим звеном ее клинических проявлений является некроз эпителиоцитов проксимальных канальцев (Gonzales-Vitale J.C. et.al., 1977). По-видимому, изученная в нашем исследовании модель с однократным введением цисплатина не позволила в полной мере наблюдать снижение СКФ, но показала, что наиболее чувствительными к токсическому действию цисплатина являются канальцы почек, а не клубочковый аппарат.

Измерение концентрации общего белка в крови также показало сохранение нормальных величин у изучаемых подгрупп. Отсюда следует, что протеинурия, наблюдавшаяся у получавших препараты животных, не нарушает белковый го-меостаз.

Путем световой микроскопии обнаружено, что на 8-е сутки у животных, получавших только цисплатин (опытная подгруппа) наблюдается дилатация почечных канальцев, слущивание эпителия. В клетках канальцевого эпителия, целостность которых сохранена, наблюдается выраженная дистрофия. В подгруппе превентивной коррекции наблюдаются аналогичные явления, однако обращает на себя внимание меньшее количество свободных эпителиоцитов, находящихся в просвете канальцев. В подгруппе постоянной коррекции отсутствует слущивание эпителия, канальцы расширены несущественно, но сохраняются дистрофические явления. Гистологические картины почечных телец в подгруппах не отличаются между собой.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод: за счет антиоксидант-ных свойств арбидол уменьшает степень цисплатин-индуцированного повреждения почечных канальцев, и, соответственно, оказывает нефропротективный эффект, особенно выраженный при постоянном введении корректора.

Эффективность арбидола в коррекции нефротоксического действия

метотрексата

Обратимся к результатам третьей серии экспериментов, в которой изучалась нефропротективная активность арбидола в условиях применения метотрексата. По аналогии с цисплатином токсическое действие этого цитостатика на почки также направлено преимущественно на канальцы. Однако выраженная ферментурия, по сравнению с группой цисплатина, наблюдается только по НАГ - маркеру функ-

11

ционироваиия почечных канальцев (табл. 3). Отсюда следует, что деструктивный компонент в действии на канальцы менее выражен по сравнению с цисплахином. Это подтверждается данными Condit Р.Т. et al. (1969), согласно которым этиология поражения почек метотрексатом связана, прежде всего, с отложением препарата и его менее растворимых метаболитов в эпителии канальцев (кристаллический гидронефроз). Это приводгл- к уменьшению предклубочкового сосудистого давления и прямому уменьшению СКФ (Jacobs S.A. et al., 1976).

Таблица 3. Изменение активности ферментов в моче крыс, получавших метотрексат и арбидол

1 Сутки Контрольная подгруппа (п - 14): 0.9% р-р NaCI Опытная подгруппа (п = 14): раствор метотрексата Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор метотрексата + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор метотрексата + арбидол ежедневно

Активность НАГ, Ме(25%;75%) U/ммоль креатинина

1 (фон) 2,07(1,64;3,13) 2,46(1,53;3,01) 2,45(1,59:2,97) 1,89(1,57:2,94)

2 2,14(1,52:3,31) 2,91(2,38;3,89)* 2,80(2,07:3,59) 2,26(1,49;3,14)

4 2,35(1,54:3,36) 6,27(5,57:7,28)* 5,24(4,73:6,96)* 3,21(2,31:4,17)*'**

6 2,16(1,49:3,31) 6,44(5,40:10,09)* 7,47(4,63;9,16)* 5,51(5,04:7,12)*

8 2,10(1,35:3,24) 6,09(4,82;8,75)* 4,86(3,45:6,57)* 4,97(4,43:5,76)*.

10 2,18(1,43:3,19) 5,56(4,94;7,08)* 3,43(2,63;4Д6)*'** 3,22(2,87:4,41)*-**

12 2,24(1,46:2,82) 3,21(2,83:4,84)* 2,55(2,12:3,02)** 2,44(2,00;3,18)**

14 2,11(1,46:2,87) 2,25(1,91:2,82) 2,21(2,06;3,16) 2,29(1,82^,50)

Активность ГГТ, Ме(25%;75%) U/ммоль креатинина

1 (фон) 101,91(87,11;138,51) 97,03(80,65:128,83) 94,77(81,15:127,53) 107,27(79,39:136,19)

2 113,11(84,44:143,90) 103,40(88,28;136,29) 111,70(95,21:139,28) 130,51(97,86:143,68)

4 116,25(84,86:148,46) 147,66(132,29;206,95)* 137,44(117,89;167,28) 135,44(125,66:151,22)

6 104,89(82,24:147,37) 159,88(121,96:238,18)* 155,81(139,20;203,72)* 134,01(122,29; 179,80)*

101,59(73,92:139,79) 133,47(Ю2,90;171,76)* 158,23(96,73:187,97)* 148,53(123^5;182,41)*

10 103,32(78,08:146,95) 126,16(102,98:145,94) 108,21(90,70; 126,42) 120,14(102,46;151,69)

12 111,14(78,13:143,41) 113,07(89,09:137,41) 106,60(84,48:133,23) 124,97(93,93:144,14)

14 107,22(74,10;139,58) 115,66(78,19:143,42) 108,04(82,51:130,90) 108,96(80,36:132,79)

Активность ЛДГ, Ме(25%;75%) U/ммоль креатинина

I (фон) 1,18(1,09:1,46) 1,37(1,03;1,72) 1,29(1,12;1,66) 1,31(1,03;1,57)

2 i,i9(i,oo;i,6i) 1,45(1,20;!,69) 1,50(1,26,1,69) 1,49(1,23;1,71)

4 1,18(1,04:1,40) 1,46(1,33;1,83)* 1,63(1,47;2,05)* 1,78(1,53^,08)*

6 1,19(1,00:1,35) 2,67(2,36;3,44)* 2,38(1,91;3,25)* 2,15(1,90;3,00)*

8 1,18(1,02;1,41) 2,43(1,79;2,90)* 2,29(1,98;2,68)* 2,58(1,67;2,93)*

10 1,23(1,05:1,48) 1,67(1,33;2,05)* 1,63(1Д6;2,15) 1,55(1,33:1,78)*

12 1,18(1,05:1,48) 1,11(0,91;1,62) 1,31(1,14,1,66) 1,03(0,88;1,45)

14 1,25(1,08;!,46) 1,34(0,86;1,40) 1,40(0,95;!,93) 1,38(1,02;1,64)

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05); ** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

В связи с вышеописанным обратимся к данным суточных диуреза и экскреции креатинина. Прогрессирующее снижение обоих показателей в опытной подгруппе наблюдается уже с 4-х суток эксперимента, что говорит о снижении СКФ, представляет собой олигурическую стадию острой почечной недостаточности и

согласуется с приведенными данными других исследователей. Результаты измерения концентрации креатинина в плазме крови на 14-с сутки эксперимента показали значимо высокие значения для опытной подгруппы и подгруппы превентивной коррекции. Однако расчет СКФ по клиренсу креатинина доказал, что в группе превентивной коррекции СКФ восстанавливается до контрольных значений, а в опытной подфуппе остается низким. В подгруппе постоянной коррекции плазменная концентрация креатинина достигает контрольных значений, по-видимому, за счет увеличения СКФ.

Таблица 4. Изменение суточного диуреза и суточной экскреции креатинина у крыс, получавших метотрексат и арбидол

2 £ о Контрольная подгруппа (п=14): 0.9% р-р N30 Опытная подгруппа (п= 14): раствор метотрексата Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор метотрексата + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор метотрексата + арбидол ежедневно

Суточный диурез, Ме(25%;75%) мл/сутки

1 (фон) 3,80(3,55;4,25) 4,50(3,75;5,15) 4,00(3,55;5,20) 4,20(3,60;5,15)

2 3,90(3,60;4,25) 4,40(3,85;5,50) 4,10(3,60;4,40) 4,10(3,55;4,65)

4 3,80(3,55;4,30) 2,10(1,50;3,05)* 2,70(2,35;2,85)* 2,80(2,60;3,05)*'**

6 3,70(3,40;4,00) 1,20(0,75;1,50)* 2,20(1,35;2,40)*'** 2,50(2,15;2,85)*'**

8 3,70(3,55;4,25) 1,90(1,40;2,50)* 2,60(2,30:3,05)*-** 3,50(2,85;4,40)**

10 3,80(3,40;4,60) 7,80(6,35;10,45)* 4,50(3,60;5,30)** 5,10(4,20;6,30)*'**

12 3,60(3,55;4,10) 4,80(3,90;5,95)* 5,30(4,80;6,35)* 4,50(3,90;5,00)*

14 3,70(3,40;4,30) 4,30(3,00;4,65) 4,30(3,75;5,10) 4,60(4,15;5,25)*

Суточная экскреция креатинина, Ме(25%;75%) мкмоль/сутки

1 (фон) 37,98(36,04;41Д5) 38,60(36,47;44,89) 42,74(38,33;45,63) 42,68(37,75;44,89)

2 39,65(37,03;42,45) 39,28(37,29;43,5б) 40,42(37,73;44,74) 46,77(37,03;50,74)

4 38,82(37,22;40,85) 21,67(13,59;27,80)* 30,22(27,40;31,80)*'** 33,46(29,98;35,47)*'**

6 3 8,73(36,51 ;40,55) 12,81(8,54;18,08)* 25,45(18,29;28,74)*'** 35,71(29,36;37,33)*'**

8 37,78(36,37;42,56) 18,75(16,00;30,58)* 30,79(27,56;33,83)*'** 36,49(33,51 ;43,70)* *

10 38,97(36,38;42,45) 43,09(38,06;48,99) 44,45(37,94;48,67) 42,98(40,83;47,60)*

12 37,96(36,36;39,93) 41,58(40,23:47,43)* 45,04(41,84;47,71)* 42,31(38,51;45,72)*

14 38,02(36,15;41,04) 38,44(35,40;46,39) 43,01(37,73;46,61) 44,27(40,43;48,38)*

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05); ** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

На 8-е сутки суточная экскреция белка с мочой у крыс опытной подгруппы значимо возрастает (Р < 0,001), достигает своего пика на 10 сутки (Р < 0,001) и к 14 суткам не отличается от контрольного показателя. В подгруппе превентивной коррекции суточная протеинурия увеличивается несколько раньше - на 4-е сутки (Р < 0,001), однако носит менее выраженный характер и приближается к норме уже на 12-е сутки. В подгруппе постоянной коррекции повышение суточной экскреции белка наступает позднее - на 6-е сутки (Р < 0,001), но уже на 8-е сутки не отличается от контроля. С учетом того, что в коррекционных группах протеинурия выражена слабее, а также того, что токсическое действие метотрексата направлено, прежде всего, на канальцы, можно сделать вывод о преимущественном тубулопротективном действии арбидола. Данный вывод подтверждает также и то, что в коррекционных подгруппах активность НАГ в моче меньше, чем в опытной

подгруппе. Кроме того, измерение концентрации общего белка в плазме крови на 14-е сутки эксперимента не показало различий между изучаемыми подгруппами, что может говорить об отсутствии массивной протеинурии, а также о преимущественно канальцевой природе нарушения мочевой экскреции белка.

Слабое влияние препарата на активность других ферментов обусловлено, по-видимому, тем, арбидол не влияет на отложение метотрексата и его метаболитов в почечных канальцах, но, снижая интенсивность свободнорадикального окисления и препятствуя токсическому действию активных форм кислорода, обладает некоторым нефропротективным эффектом.

Для подтверждения этого обратимся к динамике изменения удельной концентрации ТБРП в моче (табл. 5). В опытной подгруппе она значимо возрастает и сохраняет высокие значения на протяжении 6 суток, что говорит о выраженном про-оксидантном действии метотрексата. В подгруппе превентивной коррекции наблюдается аналогичная картина, и только в подгруппе постоянной коррекции ежедневное введение арбидола значимо снижает этот показатель. Отсюда, принимая во внимание профиль ферментов мочи, может следовать, что усиление процессов свободнорадикального окисления не играет решающей роли в патогенезе токсического поражения канальцев метотрексатом, а на отложение цитостатика и его метаболитов в эпителиоцитах арбидол влияет слабо, либо практически не влияет.

Таблица 5. Изменение удельной концентрации ТБРП в моче крыс, получавших метотрексат и арбидол

Сутки Контрольная подгруппа (п = 14): 0.9% р-р ИаС1 Опытная подгруппа (п = 14): раствор метотрексата Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор метотрексата + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор метотрексата+ арбидол ежедневно

Удельная концентрация ТБРП, Ме(25%;75%) мкмоль/ммоль креатинина

1 (фон) 1,54(!,1б;2,18) 1,50(1,20:2,24) 1,58(1,37:1,90) 1,65(1,31:1,93)

2 1,54(1,14;2,08) 1,59(1,23:2,01) 1,72(1,61:2,27) 1,51(1,32:2,00)

4 1,51(1,16:2,09) 2,67(1,82;3,50)* 2,20(1,83:2,76)* 1,73(1,51:2,27)**

6 1,62(1,13:2,14) 2,45(2,08:4,87)* 2,51(2,38:3,95)* 2,19(1,23:2,42)*

8 1,51(1,12:2,22) 2,36(1,98;2,99)* 2,50(1,90:3,49)* 1,79(1,23:2,42)**

10 1,43(1,01:2,18) 2,36(1,57;2,91)* 2,06(1,51:2,66)* 1,49(1,31:1,96)**

12 1,44(1,10:2,15) 1,58(1,14:1,95) 1,47(1,08:2,23) 1,45(1,35;2,00)

14 1,44(1,02:2,24) 1,30(0,98;2,15) 1,28(0,87:2,69) 1,39(1,24:1,75)

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05); ** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

При анализе данных о концентрации ТБРП в плазме крови на 14-е супси эксперимента видно, что метотрексат оказывает выраженное системное прооксидант-ное действие, которое значимо предотвращается арбидолом только при постоянном ежедневном введении.

Морфологически выявленные деформация почечных телец, отложение белка в области капсулы клубочка, значительное набухание и цитолиз клеток почечных канальцев подтверждают смешанную природу протеинурии. Но, принимая во внимание отсутствие отложения белка в области капсулы клубочков почек крыс

коррекционных подгрупп при большей сохранности почечных канальцев, можно сделать вывод о том, что повышение проницаемости клубочкового фильтра может

Рис. 2. Концентрация тиобарбитурат-реактивных продуктов в плазме крыс группы метотрексата на 14-е сутки эксперимента.

* - значимое различие по сравнению с показателем контрольной подгруппы; ** - значимое различие по сравнению с показателем опытной подгруппы.

иметь вторичный характер и может не проявляться при сохраненной структуре и функции канальцев. Кроме того, морфологически подтверждается предположение о слабом влиянии арбидола на отложение метотрексата и его метаболитов в эпителии канальцев, который, однако, за счет антиоксидантного действия препятствует массивному цитолизу и способствует сохранению структуры почечных канальцев в условиях применения цитостатика.

I

Эффективность арбидола в коррекции нефротоксического действия

доксорубицина.

Измерение ферментурии показало длительное повышение активности НАГ, а также ЛДГ в опытной подгруппе (табл. 6), В коррекционных подгруппах, особенно в подгруппе постоянной коррекции, активность ферментов более низкая, однако выше контрольных значений. Активность ГГТ в моче крыс опытной подгруппы значимо выше лишь в 8-12 сутки эксперимента, а в коррекционных группах практические не отличается от соответствующих показателей в контрольной подгруппе.

Явление изолированного повышения маркера цитолиза (ЛДГ) без соответствующего повышения активности ГТТ можно объяснить, исходя из патогенеза нефротоксического действия доксорубицина. Известно, что токсический эффект ,

цитостатика реализуется за счет стимулирующего влияния на клубочковый мета- ,

болизм, ведущий к повышению клубочковой проницаемости (Kastner S. et al., 1991). Это подтверждается высокой протеинурией, наблюдаемой у крыс опытной подгруппы, начиная с 4-х суток эксперимента (табл. 7). Известно также, что одним из серьезных побочных эффектов доксорубицина и других антрациклиновых антибиотиков является кардиотоксичность. Поражение миокарда ведет к цитолизу кардиомиоцитов и попаданию большого количества ЛДГ в кровь (Коровкин Б.Ф.,

1,5

Контрольная Опытная Подгругшл Подгруппа

подгруппа пшпууши превентивной постоянной

коррекции коррекции

1966). Таким образом, повышение активности ЛДГ в моче крыс опытной подгруппы объясняется попаданием плазменного фермента в мочу за счет снижения проницаемости клубочков.

Таблица 6. Изменение активности ферментов в моче крыс, получавших доксорубицин и арбидол

Сутки Контрольная подгруппа (п = 14): 0.9% р-р N301 Опытная подгруппа (п = 14): раствор доксорубицина Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор доксорубицина + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор доксорубицина+ арбидол ежедневно

Активность НАГ, Ме(25%;75%) 11/ммоль креатиншга

1 (фон) 2,05(1,45;2,86) 1,98(1,49;2,65) 2,02(1,47;2,73) 2,01(1,48;2,49)

2 2,18(1,53;2,90) 2,08(1,36:2,69) 2,10(1,79;2,61) 2,21(1,73;2,86)

4 2,06(1,53:2,98) 2,79(2,00;3,68) 2,43(1,82;3,56) 2,77(2,19;3,30)

6 1,99(1,39;2,77) 2,69(2,30:4,35)* 2,58(2,32;3,92)* 3,33(2,50;3,93)*

8 2,08(1,36:2,84) 3,69(3,19:6,13)* 3,84(3,43;5,54)* 3,79(3,01 ;4,69)*

10 1,98(1,27:2,68) 4,32(3,22:6,03)* 4,74(3,28;5,92)* 2,79(2,30;3,78)*'**

12 1,81(1,27:2,85) 4,22(2,63:5,76)* 4,18(2,77:5,55)* 3,02(2,32;3,55)*

14 1,87(1,25:2,68) 3,79(1,97;4,93)* 3,16(2,38;4,66)* 2,58(1,81;3,38)

16 1,90(1,34;2,77) 3,24(1,97;4,93)* 2,91(1,64:3,81) 2,95(2,31;3,52)*

18 1094(1,26:2,89) 3,01(1,71:4,58)* 2,02(1,26;2,68) 1,94(1,68;2,59)

20 1,89(1,31:2,94) 2,27(1,48;4,03) 2,06(1,37;2,70) 2,19(1,37;2,69)

Активность ГГТ, Ме(25%;75%) и/ммоль креатинина

1 (фон) 103,72(80,30;136,92) 104,72(67,45:148,96) 107,82(68,61:139,95) 109,25(71,70:144,63)

2 109,69(82,55;151,27) 109,10(76,13:155,54) 102,79(74,95:142,11) 115,30(83,57:143,90)

4 109,33(79,59:139,64) 112,38(77,26:156,20) 115,52(78,84:149,84) 122,05(90,81;157,81)

6 109,41(81,00:133,26) 123,46(92,58:167,65) 118,39(79,38:165,38) 129,08(92,91:166,91)

8 105,65(74,47:147,90) 140,77(92,32;206,50)* 110,18(90,27:181,63) 135,22(101,19;171,84)

10 105,12(70,20:134,22) 141,69(104,47;189,24)* 140,49(98,27;181,26)* 121,74(94,85;150,11)

12 104,38(78,25:129,90) 142,85(95,69:183,60)* 142,95(83,63:176,08) 116,90(92,72;159,56)

14 100,80(70,38:127,76) 120,80(83,83;166,96) 128,91(88,30:167,16) 119,04(79,33;155,72)

16 101,80(75,50:131,20) 117,12(91,67:154,48) 117,10(80,69:148,34) 127,79(91,81:160,27)

18 107,09(76,88,130,85) 108,75(84,86,155,70) 98,60(88,26;143,17) 102,61(75,48; 144,25)

20 98,63(74,78:134,42) 101,02(80,28;132,02) 93,22(73,68:130,83) 94,56(69,38;138,44)

Активность ЛДГ, Ме(25%;75%) и/ммоль креатинина

1 (фон) 1,19(0,92;1,57) 1,12(0,81;1,59) 1,12(0,84:1,54) 1,06(0,81;1,62)

2 . 1,04(0,85:1,50) 1,37(1,15;2,01) 1,01(0,71:1,59)** 1,11(0,88;1,65)

4 1,22(0,92:1,39) . 2,21(1,65;2,88)* 1,61(1,28:2,15)*'** 1,60(1,10;!,92)**

6 1,13(1,00;1,46) 2,79(1,72:3,28)* 2,05(1,66;2,57)* 1,77(1,55;1,96)*'**

8 1,31(1,12;1,58) 2,46(1,53:2,92)* 2,15(1,46:2,73)* 1,73(1,58^,52)*

10 1Д 8(0,86; 1,56) 2,27(1,27;2,65)* 2,04(1,32:2,43)* 1,95(1,45:2,62)*

12 1,23(1,02;1,39) 2,44(4,66;3,26)* 1,86(1,31;2,57)* 1,81(1,33:2,46)*

14 1,09(0,81:1,41) 1,88(1,42;2,81)* 1,84(1,21;2,39)* 1,49(1,04;!,90)*'**

16 1,21(0,87:1,56) 1,64(1,15:2,14)* 1,57(1,20;2,09)* 1,49(1,05:1,89)

18 1,23(0,78:1,54) 1,37(0,94:1,66) 1,35(0,84; 1,84) 1,30(0,90,1,82)

20 1,27(0,91; 1,51) 1,31(0,83:1,67) 1,20(0,75;1,69) 1,29(0,84:1,64)

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05); ** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

Активность НАГ в моче значимо приближается к контрольным показателям только при ежедневном введении арбидола, при этом активность ЛДГ снижается слабо. Это подтверждает гипотезу о внепочечном происхождении избытка ЛДГ, а также о протективной направленности действия арбидола преимущественно в отношении канальцев.

Таблица 7. Изменение суточной протеинурии у крыс, получавших доксорубицин и арбидол

Сутки Контрольная подгруппа (п=14): 0.9% р-р ЫаС1 Опытная подгруппа (п = 14): раствор доксорубицина Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор доксорубицина + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор доксорубицина + арбидол ежедневно

Суточная протеинурия, Ме(25%;75%) мг/сутки

1 (фон) 2,24(1,80;2,54) 2,26(2,17;2,45) 2,15(2,01:2,29) 2,17(2,02:2,31)

2 1,98(1,83;2,23) 2,05(1,91;2,16) 2,39(2,16:2,57)*'** 2,42(2,20;2,51)*'**

4 2,11(1,95;2,49) 2,98(2,71;3,16)* 2,46(2,17;2,73)*'** 2,57(2,20:2,94)*

6 2,15(2,04;2,22) 6,77(5,32; 12,17)* 6,83(5,40;8,99)* 5,04(4,33:6,38)*'**

8 2,06(1,83;2Д7) 12,18(9,96:19,13)* 17,29(16,64:18,81)*'** 9,70(8,57;10,68)*'**

10 2,15(1,90;2,40) 13,53(10,60;18,87)* 14,89(14,40;18,25)* 15,49(14,11:16,66)*

12 1,93(1,71;2,24) 10,77(9,41:14,48)* 11,72(9,71:16,37)* 11,01(10,24:12,64)*

14 2,23(2,15;2,35) 9,01(4,16:13,02)* 10,18(9,32:10,79)* 5,68(5,30;6,22)*

16 2,11(1,89;2,26) 4,53(3,94:5,67)* 4,43(4,03 ;4,88)* 3,18(3,00 ;3,90)*'**

18 2,03(1,92;2,07) 3,08(2,69:4,01)* 2,57(2,36:3,03)*'** 2,41(2,20;2,55)*'**

20 2,24(1,80; 2,54) 2Д6(2,17;2,45) 2,15(2,01;2,29) 2,17(2,02;2,31)

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05);

** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

После введения доксорубицина на 4-е сутки наступает олигурическая стадия почечной недостаточности, которая сменяется полиурией, продолжающейся до 18-х суток эксперимента. Для того чтобы понять причину, обратимся к данным о суточной экскреции креатинина. В день наблюдения олигурии в опытной подгруппе экскреция ожидаемо снижена. Однако в дальнейшем этот показатель значимо не отличается от контрольных цифр. Из этого следует, что наблюдаемая по-лиурия развивается вследствие замедления канальцевой реабсорбции и не связана с повышением СКФ. Отметим также, что динамика суточного диуреза и суточной экскреции креатинина у крыс подгруппы превентивной коррекции практически не отличается от таковой у крыс опытной подгруппы. Слабое отличие по рассматриваемым показателям наблюдается у животных подгруппы постоянной коррекции. В дополнение отметим, что концентрации плазменного креатинина и скорость клубочковой фильтрации, рассчитанные на 20-е сутки эксперимента, статистически значимо не отличаются друг от друга у изучаемых подгрупп.

Как было обозначено ранее, доксорубицин вызывает массивную протеину-рию, связанную с повышением проницаемости клубочкового фильтра. Следует отметить, что арбидол незначительно уменьшает протеинурию как в превентивном, так и в постоянном режиме введения, что еще раз доказывает слабое влияние препарата на клубочковый аппарат. С другой стороны, в результате измерения концентрации общего белка плазмы на 20-е сутки вьиснено, что арбидол предотвращает развитие гипопротеинемии, наблюдаемой в опытной подгруппе.

Таблица 8. Изменение удельной концентрации ТБРП в моче крыс, получавших доксорубицин и арбидол

Сутки Контрольная подгруппа (п = 14): 0.9% р-р ЫаС1 Опытная подгруппа «а =14): раствор доксорубицина Подгруппа превентивной коррекции (п = 14): раствор доксорубицина + арбидол однократно Подгруппа постоянной коррекции (п = 14): раствор доксорубицина + арбидол ежедневно

Удельная концентрация ТБРП, Ме(25%;75%) мкмоль/ммоль креатинина

1 (фон) 1,35(0,85;2,08) 1,33(0,79:2,11) 1,27(0,72;2,29) 1,26(0,77:2,32)

2 1,50(0,88:2,28) 1,18(0,74;1,99) 1,33(0,74:1,90) 1,34(0,85;2,13)

4 1,68(0,80;2,51) 1,43(0,82:2,30) 1,40(0,94;2,28) 1,57(0,94;2,37)

6 1,64(0,86;2,22) 2,13(1,56;2,68)* 1,91(0,83:2,49) 1,55(0,95:2,40)

8 1,48(0,82;2,25) 2.20(1,55:2,92)* 1,64(0,90;2,28)** 1,35(0,65;2,36)**

иЛ 1,55(0,82;2,46) 1,54(0,95:2,27) 1,42(0,87:2,16) 1,27(0,63;2,44)

12 1,67(0,88;2,54) 1,45(0,81:2,27) 1,28(0,82;2,28) 1,40(0,72; 1,99)

14 1,54(0,82;2,50) 1,52(0,80:2,30) 1,23(0,78;1,83) 1,45(0,93;2,12)

16 1,63(0,84;2,71) 1,47(0,89:1,87) 1,60(0,81;1,87) 1,27(0,77:1,93)

18 1,53(0,84;2,47) 1,39(0,96;1,91) 1,38(0,86;1,75) 1,34(0,87;1,89)

20 1,60(0,70;2,68) 1,33(0,83:1,87) 1,33(0,87;1,92) 1,41(0,91,1,95)

* - значимое различие по сравнению с контрольной подгруппой (р<0,05); ** - значимое различие по сравнению с опытной подгруппой (р<0,05).

Как видно из табл. 8, повышение удельной концентрации ТБРП в моче наблюдается только у крыс опытной подгруппы на 6-е и 8-е сутки. Несмотря на отсутствие выраженного повышения удельной концентрации ТБРП в моче крыс опытной подгруппы, при измерении плазменной концентрации ТБРП на 20-е сутки эксперимента наблюдается значимое ее повышение по сравнению с контролем (рис. 3). В подгруппе превентивной коррекции показатель также повышен, однако ниже, чем в опытной подгруппе. В подгруппе постоянной коррекции концентрация ТБРП в плазме значимо не отличается от контрольной.

5,5 -

„ 5,0

Контрольная Ошлтуая Подфушта Подгруппа

подгру.-птл подгруппа превентивной постазпшой

коррекдии коррекция

Рис. 3. Концентрация тиобарбитурат-реактивных продуктов в плазме крыс группы доксорубицина на 14-е сутки эксперимента.

* - значимое различие по сравнению с показателем контрольной подгруппы; ** - значимое различие по сравнению с показателем опытной подгруппы.

На основании вышеизложенного следует охарактеризовать нефропротектив-ное действие арбидола в условиях применения доксорубицина как слабое. Считая антиоксидантпое действие арбидола основным, можно предположить, что причина этого заключается либо в незначительной роли усиления процессов пероксида-ции в патогенезе нефротоксического действия доксорубицина, либо в недостаточном антиокислительном действии препарата-корректора. Для установления причины обратимся к динамике изменения удельной концентрации ТБРП в моче. Как видно, опытной подгруппе повышение показателя носит транзиторный характер, а в коррскционных группах отсутствует. Таким образом, слабая нефропротективная активность арбидола в условиях применения доксорубицина является первая из обозначенных вероятных причин. Тем не менее, доксорубицин, исходя из высокой плазменной концентрации ТБРП у крыс опытной подгруппы в последние сутки эксперимента, вызывает усиление процессов пероксидации, эффективно снижаемое арбидолом в коррекционных подгруппах.

Гистологически в опытной подгруппе доксорубицина наблюдается грубая деформация почечного тельца с выраженной инфильтрацией сосудистого клубочка и паракапсулярным отложением белка. Эпителиоциты канальцев дистрофически изменены, некоторые из клеток слущены. В подгруппе превентивной коррекции значительные отличия от опытной подгруппы отсутствуют. В группе постоянной коррекции имеегся менее выраженная деформация почечного тельца, однако инфильтрация клубочка и кжстагломерулярного пространства сохраняется. Патологические изменения канальцев представлены только дистрофией.

Морфологическая картина почек крыс группы доксорубицина подтвердила преимущественную токсическую направленность цитостатика на клубочковый аппарат. Вместе с тем обращает на себя внимание явная протективная активность арбидола в отношении почечных канальцев в режиме постоянного введения.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить высокую нефпропротективнуга эффективность арбидола, особенно при постоянном введении, проявляемую преимущественно в отношении почечных канальцев. Причем указанная активность проявляется тем сильнее, чем больше роль процессов пероксидации в патогенезе токсического действия цитостатиков на почечные канальцы.

ВЫВОДЫ

1. Арбвдол при многократном применении не оказывает значимого влияния на структуру и функцию ингактных почек, вызывает системное снижение уровня свободнорадикального окисления.

2. Противоопухолевые препараты (цисплатин, метотрексат, доксорубицин) при однократном введении вызывают повышение уровня свободнорадикального окисления в почках и других органах. Токсическое действие цис-платина и метотрексата направлено преимущественно на канальцы почек, доксорубицина - на клубочковый аппарат.

3. Превентивное однократное введение арбидола перед однократным введением противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) снижает уровень свободнорадикального окисления в почках и других органах, а также уменьшает нефротоксичность химиопрепаратов, оказываю-

щих токсическое влияние на канальцы (цисплатин, метотрексат). Превентивное однократное введение арбидола практически не оказывает нефро-протективного эффекта при токсическом поражении почек доксорубици-иом.

4. Ежедневное введение арбидола после инъекции противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) снижает уровень свобод-норадикального окисления и степень токсического поражения почек более эффективно по сравнению с однократным превентивным введением, причем более значимо снижается нефротоксическое действие цисплатина и метотрексата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мирошниченко, А.Г. Эффективность арбидола в коррекции нефротоксиче-ского действия цисплатина // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины: материалы 66-й открытой итоговой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. - с. 169-171.

2. Мирошниченко А.Г. О возможности использования антиоксидантных свойств арбидола в условиях применения противоопухолевых химиотера-певтических средств // Науки о человеке: материалы IX международного конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича.-Томск: СибГМУ.. 2008. - с. 116-117.

3. Мирошниченко А.Г. Влияние некоторых противоопухолевых средств на процессы свободнорадикального окисления в почках // Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и III школа им. академика Н.М. Эмануэля: Доклады и тезисы. - М.: РУДН, 2008.-с. 256-258.

4. Мирошниченко А.Г. Нефропротективные свойства арбидола в условиях применения противоопухолевых средств // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2009. - № 3. - с. 267-268.

5. Мирошниченко А.Г., Брюханов В.М., Госсен И.Е. Морфологическая оценка нефропротекгивной активности арбидола в условиях применения противоопухолевых химиотерапевтических средств // Академический журнал Западной Сибири.-2009.-№ 1.-е. 24-25.

6. Мирошниченко А.Г. Антиоксидантные свойства арбидола in vivo // Молодежь - Барнаулу: материалы X городской научно-практической конференции молодых ученых (17-21 ноября 2008 г.): в 2 т. / отв. ред. Б.А. Черничен-ко. - Барнаул : Изд-во Алт. ун-та, 2009. - Т. 2. - с. 96-97.

7. Мирошниченко А.Г. О роли оксидативного стресса в патогенезе нефроток-сического действия противоопухолевых средств // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2009. - с. 267-269.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГГТ - гамма-глутамилтрансфераза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАГ - К-ацетил-Р-О-глюкозаминидаза

СКФ - скорость клубочковой фильтрации

ТБРП -тиобарбитурат-реактивные продукты

Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Гарнитура Тайме Нью Роман Тираж 100 экз. Объем 1,2 п.л.

Типография

Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Барнаул, пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы. Снижение токсичности цитостатических средств является важнейшей задачей, решение которой позволяет оптимизировать эффективность противоопухолевой терапии и предотвратить развитие осложнений [117, 172].

Токсическое поражение почек является побочным эффектом применения большинства противоопухолевых средств. Вызванная химиотерапией почечная дисфункция включает в себя уремический синдром, повреждение структур нефрона, снижение ренальной перфузии [116]. Данное грозное осложнение химиотерапии обусловливает определенный процент смертности пациентов. Кроме того, острая почечная недостаточность, вызванная применением антибластомных средств, вызывает необходимость в пересмотре плана лечения, так как требует снижения дозировки химио-препарата либо его отмены [62].

В качестве одного из важнейших механизмов нефротоксичности противоопухолевых средств в настоящее время рассматривается оксидатив-ный стресс [57]. В связи с этим перспективным направлением фармакологической коррекции данного побочного эффекта является использование препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами. Однако применение антиоксидантов при онкологических заболеваниях затрудняет тот факт, что опухолевый процесс проходит, в основном, на повышенном уровне антиоксидантов, и последние проявляют свое противоопухолевое действие в высоких дозах, когда выступают в роли прооксидантов [1]. Эффективность применения противоопухолевых химиотерапевтических средств прямо пропорциональна степени интенсификации ими процессов свободнорадикального окисления [14]. С другой стороны, опухолевая ткань, накапливая эндогенные антиоксиданты, вызывает снижение анти-оксидантной защиты в других тканях организма, повышая, таким образом, содержание токсических продуктов окисления и способствуя дальнейшему опухолевому росту [53].

В связи с этим большой интерес представляет арбидол - противовирусный препарат, обладающий антиоксидантными свойствами и угнетающий интенсивность процессов перекисного окисления липидов в большей степени, чем известный мощный синтетический антиоксидант эмоксипин. Механизм антиоксидантного действия арбидола связан с перехватом липидных радикалов [2]. Помимо этого, арбидол обладает антиканцерогенными, иммуномодулирующими, интерферониндуцирующими свойствами [5, 18], которые могут иметь большое значение при наличии онкологического заболевания и применении противоопухолевых химиотерапевтических средств, вызывающих иммуносупрессию [4] и индуцирующих канцерогенез в здоровых тканях [61, 72, 79].

Целью исследования явилось снижение нефротоксических эффектов противоопухолевых химиотерапевтических средств (цисплатина, метот-рексата, доксорубицина) с помощью арбидола.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить структурно-функциональные изменения в почках крыс под влиянием арбидола и противоопухолевых средств (цисплатин, доксо-рубицин, метотрексат);

2) изучить влияние арбидола и противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) на процессы свободнорадикального окисления in vivo;

3) изучить нефропротективные свойства арбидола при токсическом поражении почек крыс, вызванном противоопухолевыми средствами (цисплатин, доксорубицин, метотрексат);

4) установить закономерность действия арбидола на почки крыс при применении противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) в зависимости от степени поражения ими почек, изменения уровня свободнорадикального окисления, механизмов их токсического действия;

5) установить эффективный режим введения арбидола с целью снижения нефротоксичности противоопухолевых веществ (цисплатин, доксо-рубицин, метотрексат).

Научная новизна исследования. Впервые исследованы антиокси-дантные и нефропротективные свойства арбидола in vivo в условиях применения противоопухолевых химиотерапевтических средств - цисплати-на, метотрексата, доксорубицина.

Установлено, что почечные канальцы более чувствительны к цитоста-тическим средствам (цисплатину, доксорубицину, метотрексату), а также к увеличению пероксидации по сравнению с клубочковым аппаратом.

Доказано, что арбидол системно угнетает процессы перекисного окисления липидов in vivo и устраняет нефротоксические эффекты противоопухолевых средств, обладающих выраженными прооксидантными свойствами и поражающих преимущественно почечные канальцы (цисплатин, метотрексат).

Практическая значимость диссертации. Экспериментально обоснована эффективность использования арбидола с целью снижения нефро-токсического действия противоопухолевых химиотерапевтических средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат).

Результаты исследования расширяют знания относительно антиокси-дантной активности арбидола и возможности коррекции нефротоксиче-ских эффектов лекарственных средств с его использованием.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Усиление процессов свободнорадикального окисления имеет большее значение при поражении почечных канальцев по сравнению с поражением почечных клубочков.

2. Арбидол обладает антиоксидантными и нефропротективными эффектами в условиях токсического поражения почек противоопухолевыми химиотерапевтическими средствами.

3. Нефропротективная активность арбидола в условиях применения противоопухолевых химиотерапевтических средств выражена преимущественно при токсическом повреждении почечных канальцев.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии и проблемной комиссии по фармакологии и фармации Алтайского государственного медицинского университета (2008, 2009 г.г.), 66-й открытой итоговой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием (Волгоград, 2008 г.), IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008 г.), Всероссийской конференции молодых ученых и III школе им. акад. Н.М. Эмануэля «Окислительный стресс, окисление и антиоксиданты» (Москва, 2008 г.), X городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием для студентов и молодых ученых «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009 г.).

Внедрение результатов. Материалы диссертации используются в преподавании на кафедрах фармакологии, патологической анатомии с секционным курсом, патологической физиологии, функциональной и ультразвуковой диагностики Алтайского государственного медицинского университета.

выводы

1. Арбидол при многократном применении не оказывает значимого влияния на структуру и функцию интактных почек, вызывает системное снижение уровня свободнорадикального окисления.

2. Противоопухолевые препараты (цисплатин, метотрексат, доксорубицин) при однократном введении вызывают повышение уровня свободнорадикального окисления в почках и других органах. Токсическое действие цисплатина и метотрексата направлено преимущественно на канальцы почек, доксорубицина - на клубочковый аппарат.

3. Превентивное однократное введение арбидола перед однократным введением противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) снижает уровень свободнорадикального окисления в почках и других органах, а также уменьшает нефротоксичность хи-миопрепаратов, оказывающих токсическое влияние на канальцы (цисплатин, метотрексат). Превентивное однократное введение арбидола практически не оказывает нефропротективного эффекта при токсическом поражении почек доксорубицином.

4. Ежедневное введение арбидола после инъекции противоопухолевых средств (цисплатин, доксорубицин, метотрексат) снижает уровень свободнорадикального окисления и степень токсического поражения почек более эффективно по сравнению с однократным превентивным введением, причем более значимо снижается нефротоксическое действие цисплатина и метотрексата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

По результатам диссертационной работы выполнены практические рекомендации, подтверждающие ценность научного исследования.

1. Предложения автора, касающиеся нефропротективного эффекта арбидола в условиях применения противоопухолевых химиотерапевтических средств (цисплатина, доксорубицина, метотрексата) используются в учебном процессе на кафедре фармакологии ГОУ ВПО АГМУ Росздрава (акт внедрения № 28 от 15.01.2010 г, приложение №1).

2. Предложения автора, касающиеся роли оксидативного стресса в патогенезе токсического поражения почек противоопухолевыми хи-миотерапевтическими средствами (цисплатином, доксорубицином, метотрексатом), используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии, функциональной и ультразвуковой диагностики ГОУ ВПО АГМУ Росздрава (акт внедрения № 27 от 15.01.2010 г, приложение №2).

3. Предложения автора, касающиеся морфологических изменений почек в условиях применения противоопухолевых химиотерапевтических средств (цисплатина, доксорубицина, метотрексата), используются в учебном процессе на кафедре патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО АГМУ Росздрава (акт внедрения № 26 от 15.01.2010 г, приложение №3).